Eenvoudig en Computer-assisted Olfactorische testen voor Muizen
15 juni 2015
We presenteren een eenvoudige en onbevooroordeelde olfactorische test bij muizen. Met dit protocol kunnen olfactorische discriminatie, voorkeur, vermijding en gevoeligheid voor een nieuwe geur in vergelijking met water worden beoordeeld in sessies van enkel gedrag. Deze methode is geïndiceerd voor een enkele experimentator en de analyse is gebaseerd op computerondersteunde videoverwerking.
Het algemene doel van het volgende experiment is om aangeboren olfactorische discriminatie, olfactorische voorkeur of vermijding en olfactorische gevoeligheid bij muizen te testen. Dit wordt bereikt door de muis bloot te stellen aan een nieuwe aantrekkingskracht of aantrekkelijkheid, en een neutrale geur, namelijk water. Ondertussen neemt een videocamera de gedragssessie op.
Vervolgens wordt de video geanalyseerd in Image J met behulp van de meegeleverde macro's om de tijd die is besteed aan de geur- en waterparameters te verkrijgen. De resultaten tonen het voorkeur- of vermijdingsgedrag ten opzichte van geuren in vergelijking met water bij verschillende genotypen op basis van de post hoc computerondersteunde analyse. Het belangrijkste voordeel van de olfactorische test ten opzichte van het gebruik van een speciale arena en olfactorisch is dat het een vertrouwde arena gebruikt en daarom snel kan worden voltooid en eenvoudig kan worden ingesteld.
Bovendien gebruikt het goedkoop hardware dat de procedure zal demonstreren, Emmanuel Abry, een student die in mijn lab werkt. Voor dit experiment worden drie tot vijf maanden oude mannelijke C 57 zwarte, zes wild type en transgene muizen gebruikt. Deze demonstratie maakt gebruik van twee knockout-lijnen en nestgenootcontroles.
Gebruik voor de experimentele arena's schone gesteriliseerde muizenkooien met drie centimeter strooisel. Bereid vervolgens de camera-opstelling voor. Plaats deze 58 centimeter boven de kooibodem op een aangepaste statiefbevestiging.
Maak enkele markeringen op het aanrecht om aan te geven waar de positie van de kooi zou moeten zijn. Voor een centraal beeld, stel de camera in om een video van 320 bij 240 pixels op te nemen met ongeveer 15 frames per seconde. Om de testdoel voor te bereiden, heb wanneer mogelijk concentraten van elke geur opgeslagen in oplosmiddel.
Voor de voorkeurtest, maak een oplossing van 10% gewicht per volume van pindenootboter in pindaolie. Voor de vermijdingstest, heb een oplossing van 98% methylbutyreenzuur. Voor de gevoeligheidstest, verzamel vrouwelijk urine van een muis van dezelfde stam een tot twee dagen voor de test.
Houd een vrouwtje vast met haar buik boven de kooirooster en verzamel druppels van haar urine in een plastic schaal. Verzamel monsters van verschillende vrouwtjes om te normaliseren. Voor individuele variabiliteit, trek alle monsters in een buisje van 1,5 milliliter en bewaar het bij min 20 graden Celsius.
Om te beginnen, plaats de dieren in een schoongemaakte kooi en laat ze onderzoeken. Gedurende vijf minuten zou de omgeving van de testkooi moeten zijn zoals die van de thuiskooi. Herhaal de habituatiefase eenmaal op elke testdag, wanneer de habituatieperiode voorbij is, begint u met de opname en pipet 60 microliters van een aangename geur.
In dit geval, pindenootboter op één muur aan de andere muur, pipet dezelfde hoeveelheid water. Een neutrale geur, breng de druppels ongeveer 10 centimeter omhoog langs elke muur. Laat het dier nu twee minuten onderzoeken en stop vervolgens de opname en breng de muis terug naar zijn thuiskooi.
Herhaal het proces met elke muis die getest moet worden. Gebruik altijd nieuwe testkooien. Drie tot vijf dagen na het uitvoeren van alle voorkeurtests, voer de vermijdingstest uit met behulp van een nieuwe testkooi.
Voer voor elke muis de vermijdingstest uit. Net als de attractietest, vervang alleen de aangename geur door de vermijdingsgeur, namelijk methylbutyreenzuur. Voor de gevoeligheidstest kan één kooi tussen de proeven voor dezelfde muis worden hergebruikt.
Dus markeer de waterzijde van de kooi en bereid je voor om de korte wanden schoon te maken met 70% ethanol-gedrenkt papier tussen de proeven. Op de dag van het experiment, maak vier concentraties van de urine met de tienvoudige verdunningsreeks. Gebruik dubbel gedestilleerd water zoals de vermijdingstest, gewennen elk dier gedurende vijf minuten aan zijn testkooi.
Blootstel vervolgens elke muis eerst aan urine met de hoogste verdunning, namelijk een op 10.000. Terwijl u opneemt, brengt u de urineverdunning aan op de testkooi en brengt u water aan op de tegenovergestelde muur. Zoals voor andere tests, laat het dier onderzoeken.
Gedurende twee minuten. Breng daarna het dier over naar een schone muizenkooi. Nadat alle dieren de laagste concentratie hebben ervaren, maak alle testkooi-wanden schoon en herhaal de test op elke muis met de volgende meest geconcentreerde urine.
Ga zo door totdat de pure urine is getest. Na het verzamelen van alle gegevens voor een experiment, open de video's in Image J voor aanpassing en verwerking waarvan de details in het tekstprotocol worden gegeven met behulp van de beschreven protocollen. Twee verschillende knockout-lijnen.
Groepen B en C werden vergeleken met nestgenootcontroles van groep A. Een niet-richtingsgebonden student T-test met gelijke of ongelijke variantie vergelijkt de tijd die is besteed aan de geur en water binnen genotypen. Vergelijk het gedrag tussen genotypen met een eenrichtings-inova. Beide experimentele groepen, B en C, vertoonden geen voorkeur voor de aantrekkelijke geur. In de vermijdingstest was de reactie op de afstotende geur van twee methylbutyreenzuur zoals verwacht voor groepen A en B, maar groep C vertoonde geen vermijdingsgedrag ten opzichte van deze geur.
In de gevoeligheidstest werd de aantrekkingsdrempel verkregen door de tijd die met urine is doorgebracht van de tijd die met water is doorgebracht, de voorkeursurine tot water bij een verdunning van één op duizend. Terwijl beide experimentele groepen, B en C, een 100 keer hogere concentratie nodig hadden om een voorkeur te tonen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in een paar uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd, dan kunnen volgens deze procedure andere methoden zoals olfactorisch leren en extinctie worden uitgevoerd om olfactorische plasticiteit en leren te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een eenvoudige olfactorische test ontworpen voor muizen, waarmee de beoordeling van olfactorische discriminatie, voorkeur, vermijding en gevoeligheid voor een nieuwe geur in vergelijking met water mogelijk is. De methode is efficiënt voor een enkele onderzoeker en is gebaseerd op computerondersteunde videoanalyse.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsanalyse
- Olfactorisch testen
Achtergrond
- Het experiment is bedoeld om aangeboren olfactorische gedragingen bij muizen te evalueren.
- Het omvat blootstelling aan een nieuwe geur en een neutrale controle (water).
- Gedrag wordt geregistreerd en geanalyseerd om voorkeuren of aversies te bepalen.
- Deze methode gebruikt een vertrouwde omgeving voor de muizen, waardoor de betrouwbaarheid van de resultaten wordt verbeterd.
Doel van het onderzoek
- Om olfactorische discriminatie bij muizen te beoordelen.
- Om olfactorische voorkeur en vermijdingsgedragingen te evalueren.
- Om olfactorische gevoeligheid voor nieuwe geuren te meten.
Gebruikte methoden
- Muizen worden blootgesteld aan een nieuwe attractant of aantrekkelijke stof en water.
- Gedragssessies worden geregistreerd met behulp van een videocamera.
- Videoanalyse wordt uitgevoerd met Image J-software met macros.
- Resultaten worden geanalyseerd om de tijd te bepalen die met elke geur wordt doorgebracht.
Belangrijkste resultaten
- Resultaten geven voorkeur of vermijdingsgedragingen naar geuren in vergelijking met water aan.
- Gedragsreacties variëren tussen verschillende genotypen.
- De methode maakt snelle opstelling en voltooiing van experimenten mogelijk.
- Computerondersteunde analyse verbetert de nauwkeurigheid van de resultaten.
Conclusies
- De olfactorische test is een betrouwbare methode voor het beoordelen van olfactorisch gedrag bij muizen.
- Het gebruik van een vertrouwde arena vereenvoudigt het experimentele proces.
- Deze aanpak kan nuttig zijn voor verschillende gedragsstudies in de neurowetenschappen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Olfactory dysfunction is an early biomarker in neurodegenerative disease models, making reliable rodent olfaction assays critical for target validation in CNS drug discovery. This method enables rapid, reproducible assessment of innate odor perception and sensitivity without food/water restriction, supporting high-throughput screening of genetic or pharmacological interventions. By quantifying behavioral responses to attractants, aversants, and sensitivity thresholds, it provides mechanistic de-risking for targets implicated in olfactory network dysfunction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking genotype to olfactory behavior, enabling functional validation of targets in olfactory pathways.
- Operational Value: Uses familiar environments and minimal habituation, reducing stress-induced variability and improving assay reproducibility across genotypes.
- Predictive Value: Detects altered odor preference or avoidance in knockout models, supporting early de-risking of targets associated with neurodegenerative or psychiatric indications.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative time-spent metrics via computer-assisted ImageJ analysis, enabling objective comparison of odor responses across experimental groups.
- Operational Value: Requires only standard cages, bedding, scents, and a video camera, allowing scalable implementation in discovery labs without specialized equipment.
- Predictive Value: Supports dose-response characterization in sensitivity testing, informing lead optimization by defining effective concentration ranges for odorant-evoked behaviors.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with human olfactory deficits as prodromal biomarkers, enhancing translational relevance of mouse models in neurodegenerative disease research.
- Operational Value: Enables longitudinal sensitivity testing through serial dilution series, supporting progression tracking in preclinical efficacy studies.
- Predictive Value: Identifies genotype-specific thresholds for odor detection, aiding in patient stratification and biomarker-aligned target selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing behavioral readouts that inform go/no-go decisions prior to compound investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring innate olfactory discrimination and preference, clarifying gene function in sensory processing pathways.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (time in odor vs. water zones) that enable reliable comparison of compound or genotype effects.
- Analytics: Computer-assisted analysis provides reproducible, threshold-based measurements that support statistical comparison across treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling olfactory sensitivity loss, a feature predictive of clinical neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Reusable across multiple test types (preference, avoidance, sensitivity) and mouse strains, functioning as a platform capability rather than a single-use assay.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in olfactory circuit function.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through fixed exposure times, blinded video analysis, and internal water controls.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid triage of targets using low-cost, high-reproducibility behavioral phenotyping.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying targets whose modulation rescues or recapitulates olfactory phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent handling, behavioral observation, and basic video tracking software (ImageJ).
- Dependent on consistent lighting, camera positioning (58 cm above cage), and odorant preparation (e.g., peanut butter oil dilutions, urine dilution series).
- Necessitates cross-team standardization of habituation protocols and blind analysis to minimize operator bias.
- Adaptation across model systems requires validation of odorant relevance (e.g., species-specific pheromones or aversants).
- Practical limitation: Assay sensitivity depends on accurate odorant delivery and cleanup between trials to prevent cross-contamination, particularly in sensitivity testing.
