Eenvoudig en Computer-assisted Olfactorische testen voor Muizen
15 juni 2015
We presenteren een eenvoudige en onbevooroordeelde olfactorische test bij muizen. Met dit protocol kunnen olfactorische discriminatie, voorkeur, vermijding en gevoeligheid voor een nieuwe geur in vergelijking met water worden beoordeeld in sessies van enkel gedrag. Deze methode is geïndiceerd voor een enkele experimentator en de analyse is gebaseerd op computerondersteunde videoverwerking.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de aangeboren olfactorische discriminatie, olfactorische voorkeur of vermijding en de olfactorische gevoeligheid bij muizen te testen. Dit wordt bereikt door de muis bloot te stellen aan een nieuwe attractant of repellent, en een neutrale geur, namelijk water. Ondertussen legt een videocamera de gedragssessie vast.
Vervolgens wordt de video geanalyseerd in Image J met behulp van de verstrekte macro's om de tijd die in de geur- en waterparameters wordt doorgebracht te bepalen. De resultaten tonen, op basis van de post hoc computerondersteunde analyse, het voorkeurs- of vermijdingsgedrag ten opzichte van geuren in vergelijking met water bij verschillende genotypen. Het belangrijkste voordeel van de olfactorische test boven het gebruik van een specifieke arena en olfactometrie is dat er een bekende arena wordt gebruikt, waardoor de opstelling eenvoudig is en de uitvoering snel verloopt.
Bovendien maakt het gebruik van goedkope hardware; de procedure zal worden gedemonstreerd door Emmanuel Abry, een student in mijn laboratorium. Gebruik voor dit experiment mannelijke C 57 black, six wild-type en transgene muizen in de leeftijd van drie tot vijf maanden. Deze demonstratie maakt gebruik van twee knockout-lijnen en nestgenootcontroles.
Gebruik voor de experimentele arena's schone, gesteriliseerde muizenkooien met drie centimeter strooisel. Bereid vervolgens de camera-opstelling voor. Plaats deze op een aangepaste statiefhouder 58 centimeter boven de bodem van de kooi.
Maak markeringen op de tafel om aan te geven waar de kooi geplaatst moet worden. Voor een gecentreerd beeld stelt u de camera in om een video van 320 bij 240 pixels op te nemen met ongeveer 15 frames per seconde. Bereid de test voor door concentraten van elke geur, indien mogelijk, in oplosmiddel te bewaren.
Maak voor de voorkeurstest een 10% gewicht-volume oplossing van pindakaas in pindaolie. Gebruik voor de vermijdingsonderzoek een oplossing van 98% methylboterzuur. Verzamel voor de gevoeligheidstest één tot twee dagen voor de test urine van een vrouwelijke muis van dezelfde stam.
Fixeer een vrouwtje met de buik boven het kooigrid en vang druppels urine op in een plastic schaaltje. Verzamel monsters van meerdere vrouwtjes om te normaliseren. Vanwege individuele variabiliteit kunnen alle monsters in een buisje van 1,5 milliliter worden samengevoegd en worden bewaard bij minus 20 graden Celsius.
Om te beginnen met de habituatie van de dieren, plaatst u één dier in een schone kooi en laat u dit verkennen. Gedurende vijf minuten moet de omgeving van de testkooi gelijk zijn aan die van de thuiskooi. Herhaal de habituatiefase één keer op elke testdag; zodra de habituatieperiode is afgelopen, start u de opname en pipetteert u 60 µL van een aangename geur.
Breng in dit geval pindakaas aan op de ene wand en pipetteer dezelfde hoeveelheid water op de tegenoverliggende wand. Gebruik een neutrale geur en breng de druppels ongeveer 10 centimeter boven elke wand aan. Laat het dier nu twee minuten verkennen, stop vervolgens de opname en breng de muis terug naar de thuiskooi.
Herhaal dit proces voor elke muis die getest moet worden. Gebruik hierbij altijd nieuwe testkooien. Voer drie tot vijf dagen na het voltooien van alle preferentietesten de vermijdingsproef uit in een nieuwe testkooi.
Voer voor elke muis de vermijdingsproef uit. Net als bij de attractietest wordt enkel de aangename geur vervangen door de vermijdingsgeur, namelijk 2-methylboterzuur. Voor de gevoeligheidstest kan één kooi tussen de proeven door opnieuw worden gebruikt voor dezelfde muis.
Markeer dus de waterzijde van de kooi en bereid u voor om de korte wanden tussen de proeven door te reinigen met in 70% ethanol gedrenkt papier. Maak op de dag van het experiment vier concentraties van de urine met behulp van een tienvoudige verdunningsreeks. Laat elk dier, zoals bij de vermijdingsproef, vijf minuten wennen aan de testkooi met behulp van dubbel gedestilleerd water.
Stel vervolgens elke muis eerst bloot aan urine met de hoogste verdunning, namelijk 1:10.000. Breng tijdens de registratie de urineverdunning aan in de testkooi en breng water aan op de tegenoverliggende wand. Laat het dier, zoals bij andere tests, het gebied verkennen.
Gedurende twee minuten. Verplaats het dier daarna naar een schone muizenkooi. Nadat alle dieren aan de laagste concentratie zijn blootgesteld, moeten alle wanden van de testkooien worden gereinigd en de test op elke muis worden herhaald met de urine met de volgende hoogste concentratie.
Zet dit proces voort totdat de pure urine is getest. Nadat alle gegevens voor een experiment zijn verzameld, worden de video's geopend in ImageJ voor aanpassing en verwerking; de details hiervan zijn te vinden in het tekstprotocol via de beschreven protocollen. Twee verschillende knockout-lijnen.
Groepen B en C werden vergeleken met controle-groep A, bestaande uit nestgenoten. Een niet-directionele student t-toets met gelijke of ongelijke variantie vergelijkt de tijd die binnen genotypes werd doorgebracht tussen de geur en het water. Vergelijk het gedrag tussen genotypes met behulp van een eenweg- ANOVA. Beide experimentele groepen, B en C, vertoonden geen voorkeur voor de aantrekkende geur. In de vermijdingsproef was de respons op de afstotende geur van 2-methylboterzuur zoals verwacht voor groepen A en B, maar groep C vertoonde geen vermijdingsgedrag ten opzichte van deze geur.
Bij de sensitiviteitstest werd de attractiedrempel bepaald door de tijd die met water werd doorgebracht af te trekken van de tijd die met urine werd doorgebracht, waarbij urine de voorkeur had boven water bij een verdunning van 1 op 1000. Beide experimentele groepen, B en c, hadden echter een 100 maal hogere concentratie nodig om een voorkeur te tonen. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in een paar uur worden uitgevoerd mits correct uitgevoerd; na deze procedure kunnen andere methoden, zoals olfactorisch leren en extinctie, worden toegepast om de olfactorische plasticiteit en het leervermogen te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een eenvoudige reuktest ontworpen voor muizen, waarmee reukdiscriminatie, voorkeur, vermijding en gevoeligheid voor een nieuwe geur ten opzichte van water kunnen worden beoordeeld. De methode is efficiënt voor een enkele experimentator en maakt gebruik van computerondersteunde videoanalyse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsanalyse
- Olfactorisch onderzoek
Achtergrond
- Het experiment heeft als doel het evalueren van aangeboren olfactorisch gedrag bij muizen.
- Het omvat blootstelling aan een nieuwe geur en een neutrale controle (water).
- Het gedrag wordt geregistreerd en geanalyseerd om voorkeuren of aversies vast te stellen.
- Deze methode maakt gebruik van een vertrouwde omgeving voor de muizen, wat de betrouwbaarheid van de resultaten verhoogt.
Doel van de studie
- Om olfactorische discriminatie bij muizen te beoordelen.
- Om olfactorisch preferentie- en vermijdingsgedrag te evalueren.
- Om de olfactorische gevoeligheid voor nieuwe geuren te meten.
Gebruikte methoden
- Muizen worden blootgesteld aan een nieuwe attractant of repellent en water.
- Gedragssessies worden vastgelegd met een videocamera.
- Videoanalyse wordt uitgevoerd met Image J-software en macro's.
- De resultaten worden geanalyseerd om de tijd te bepalen die aan elke geur is besteed.
Belangrijkste resultaten
- Resultaten duiden op voorkeurs- of vermijdingsgedrag ten opzichte van geuren in vergelijking met water.
- Gedragsrespons varieert tussen verschillende genotypen.
- De methode maakt een snelle opzet en voltooiing van experimenten mogelijk.
- Computerondersteunde analyse verbetert de nauwkeurigheid van de resultaten.
Conclusies
- De reuktest is een betrouwbare methode voor het beoordelen van het reukgedrag bij muizen.
- Het gebruik van een bekende arena vereenvoudigt het experimentele proces.
- Deze aanpak kan nuttig zijn voor diverse gedragsstudies binnen de neurowetenschappen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Olfactorische dysfunctie is een vroege biomarker in modellen van neurodegeneratieve ziekten, waardoor betrouwbare olfactie-assays bij knaagdieren cruciaal zijn voor targetvalidatie bij de ontdekking van geneesmiddelen voor het centraal zenuwstelsel. Deze methode maakt een snelle, reproduceerbare beoordeling van de aangeboren geurperceptie en gevoeligheid mogelijk zonder voedsel- of waterrestrictie, wat high-throughput screening van genetische of farmacologische interventies ondersteunt. Door gedragsrespons op attractanten, aversanten en gevoeligheidsdrempels te kwantificeren, biedt het mechanistische risicoreductie voor targets die betrokken zijn bij dysfunctie van het olfactorische netwerk.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door genotype te koppelen aan olfactorisch gedrag, waardoor functionele validatie van targets in olfactorische routes mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van vertrouwde omgevingen en minimale habituatie, waardoor stress-geïnduceerde variabiliteit wordt verminderd en de reproduceerbaarheid van de assay over verschillende genotypes verbetert.
- Voorspellende waarde: Detecteert veranderde geurvoorkeur of vermijding in knockout-modellen, wat bijdraagt aan vroege risicoreductie van targets die geassocieerd zijn met neurodegeneratieve of psychiatrische indicaties.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve statistieken over de bestede tijd via computergestuurde ImageJ-analyse, waardoor een objectieve vergelijking van geurresponsen tussen experimentele groepen mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Vereist enkel standaard kooien, nestmateriaal, geuren en een videocamera, wat een schaalbare implementatie in onderzoekslaboratoria mogelijk maakt zonder gespecialiseerde apparatuur.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de karakterisering van de dosis-responskurve bij sensitiviteitstests, wat bijdraagt aan lead-optimalisatie door effectieve concentratiebereiken voor door geurstoffen opgewekkt gedrag te definiëren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij menselijke olfactory-deficiënties als prodromale biomarkers, waardoor de translationele relevantie van muismodellen in onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten wordt vergroot.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale gevoeligheidstesten mogelijk via seriële verdunningsreeksen, wat de monitoring van de ziekteprogressie in preklinische efficiëntiestudies ondersteunt.
- Voorspellende waarde: Identificeert genotype-specifieke drempelwaarden voor geurdetectie, wat helpt bij patiëntenstratificatie en de selectie van targets die zijn afgestemd op biomarkers.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van targethypothesen tot lead-identificatie, door gedragsmatige read-outs te leveren die go/no-go-beslissingen informeren voorafgaand aan investeringen in verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door aangeboren olfactorische discriminatie en voorkeur te meten, waardoor de genfunctie in sensorische verwerkingspaden wordt verduidelijkt.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten (tijd in geurzones versus waterzones) die een betrouwbare vergelijking mogelijk maken van de effecten van verbindingen of genotypen.
- Analytics: Computergestuurde analyse biedt reproduceerbare, op drempelwaarden gebaseerde metingen die statistische vergelijkingen tussen behandelingscondities ondersteunen.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door het modelleren van verlies van olfactorische gevoeligheid, een kenmerk dat voorspellend is voor klinische neurodegeneratie.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Herbruikbaar voor meerdere testtypes (voorkeur, vermijding, gevoeligheid) en muizenstammen, waardoor het fungeert als een platformcapaciteit in plaats van een eenmalige assay.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitvalidatie door mechanistische ambiguïteit in de functie van olfactorische circuits te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid door vaste blootstellingstijden, geblindeerde videoanalyse en interne watercontroles.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door snelle triage van doelwitten mogelijk te maken middels kosteneffectieve, hoog-reproduceerbare gedragsfenotypering.
- Impact op portfolio: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door doelwitten te identificeren waarvan modulatie olfactorische fenotypen herstelt of nabootst.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van knaagdieren, gedragsobservatie en basissoftware voor videotracking (ImageJ).
- Afhankelijk van consistente verlichting, camerapositionering (58 cm boven de kooi) en de bereiding van geurstoffen (bijv. verdunningen van pindakaasolie, verdunningsreeksen van urine).
- Vereist standaardisatie van habituatieprotocollen tussen teams en blinde analyse om operator-bias te minimaliseren.
- Adaptatie naar andere modelsystemen vereist validatie van de relevantie van de geurstof (bijv. soortspecifieke feromonen of aversanten).
- Praktische beperking: De sensitiviteit van de assay is afhankelijk van een nauwkeurige toediening van de geurstof en grondige reiniging tussen de trials om kruiscontaminatie te voorkomen, met name bij sensitiviteitstesten.
