Name: Planar Gradient Diffusion System Chemotaxis onderzoeken in een 3D collageenmatrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Leer een planaire gradiëntdiffusiekamer maken om chemotaxis te bestuderen in een 3D-collageenmatrix. Deze methode maakt het volgen van celmigratie met confocale microscopie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Drs. Jonathan Reichner en Angle Byrd graag bedanken voor hun inzichten in celexperimenten. Dit werk werd ondersteund door het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP).

1. 3D-Mold ontwerp en Onderdelen <ol><li> Schimmel <ol><li> Voor het werken, het verkrijgen van een siliconenelastomeer kit, een live-cell imaging kamer, een 22 mm glazen dekglaasje en een bewerkte aluminium metalen kubus met afmetingen 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Bereid de live cell imaging kamer te vormen door het plaatsen van het dekglaasje in de onderste houder en monteren van de rest van de kamer overeenkomstig de door de leverancier. </li><li> Vervolgens, met behulp van een tang, plaatst u de bewerkte aluminium kubus in het midden van het live-cell imaging kamer huisvesting en op de top van het dekglaasje, en stel vervolgens opzij. </li><li> Meng siliconenelastomeer oplossingen volgens het protocol van de fabrikant tot 5 ml van elastomeer te maken. </li><li> Met behulp van een wegwerp lab spatel, giet siliconenelastomeer oplossing in live cell imaging kamer Setup en niet geplaatst gefreesd aluminium metalen kubus bewegen. Plaats het systeem op het lab bank, op een veilige plaats O / N voor het genezen. </li><li> De volgende ochtend, deconstruerende live-cell imaging kamer, zoals aanbevolen door de fabrikant en trek mal met behulp van een tang. Met behulp van een tang, voorzichtig pak het bewerkte aluminium metalen kubus van schimmels. Ga naar de gootsteen en spoel de mal met gedemineraliseerd water. Plaats de vorm op keukenpapier gedroogd. </li><li> Eenmaal droog, met een hobby mes, snijd spleten door de schimmel, afstand van 2,34 mm van elkaar langseinde, binnen de siliconen mal. Zorg ervoor dat de mal blijft op een veilige en droge plaats tot u klaar bent om het systeem te bouwen voor een experiment zijn. </li></ol></li><li> Hydrofiele en hydrofobe dekglaasjes Bereiding <ol><li> Om de collageen matrix te hechten aan een oppervlak hydrofiel maakt dekglaasjes: <ol><li> Met behulp van een wegwerp pipet, te meten uit 150 ul van 3-aminopropyl-trimethoxysilaan en giet oplossing in een 50 ml buis. Voeg 30 ml 100% ethanol aan de 50 ml buis met een tweede wegwerppipet en sluit het deksel. Vortex de oplossing gedurende 2 minuten, zodat een volledige menging. Ponze oplossing in een glazen petrischaal en zet apart. </li><li> Giet 15 ml van 100% ethylalcohol in een tweede petrischaal en zet opzij (zorg ervoor om gerechten te labelen). </li><li> Met behulp van een nieuwe disposable pipet, te meten uit 30 ml gedemineraliseerd water en giet oplossing in een 50 ml buis. Dan worden op een nieuwe wegwerpbare pipet handeling uit 1875 gl glutaaraldehyde en giet oplossing in dezelfde 50 ml buis en sluit het deksel. Vortex de oplossing gedurende 2 minuten, zodat een volledige menging. Giet het mengsel in de derde petrischaal, en zet apart. </li><li> Met behulp van een tang, neem een ​​22 mm ronde glazen dekglaasje en spoel beide kanten met 100% ethanol mengsel met behulp van een wegwerp pipet. </li><li> Plaats gespoeld glazen dekglaasje in 3-aminopropyl-trimethoxysilaan met 30 ml 100% ethanol oplossing schaal en laat zitten in oplossing gedurende 5 min. </li><li> Met een pincet, neem glas dekglaasje en spoel opnieuw met 100% ethanol-oplossing met wegwerp pipet. </li><li> Drop gespoeld glas dekglaasje in 1875pl glutaaraldehyde en 30 ml gedeïoniseerd water mengsel en laat gedurende 30 min. </li><li> Na 30 minuten, verwijder glazen dekglaasje met een pincet en spoelen met gedeïoniseerd water en plaats op droge tissue O / N drogen bij kamertemperatuur. </li><li> Herhaal dekglaasje dompelen en bewegen voor zoveel als nodig dekglaasjes met dezelfde gegenereerde oplossingen. </li></ol></li><li> Maak hydrofobe dekglaasjes door het gegeven protocol. <ol><li> Voeg 500 ul van tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, 100 gl azijnzuur en 19,4 ml hexaan in een 50 ml buis en vortex gedurende 2 min. Giet oplossing in een glazen petrischaal en zet apart. </li><li> Met behulp van schone tang, neem een ​​glas dekglaasje en neerzetten in bereide gemengde oplossing gedurende 2 minuten. Na 2 minuten zijn verstreken, neem glas dekglaasje met een pincet en spoelen met gedemineraliseerd water met behulp van een wegwerp pipet en plaats dekglaasje op het droge tissue O / N drogen bij kamertemperatuur. WINKEL dekglaasje in plastic Petrischalen tot gebruik. </li><li> Herhaal dekglaasje DIPPing en bewegen voor zoveel als nodig dekglaasjes met dezelfde gegenereerde oplossingen. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. vormstelsel <ol><li> Voor het gebruik van mallen, met behulp van een wegwerp pipet spoel de mal met 90% ethylalcohol over een chemisch afval container. Vervolgens plaatst de vorm in een petrischaal gevuld met gedemineraliseerd water en laten zitten O / N. </li><li> Neem de schimmel uit de oplossing met behulp van een tang en leg ze op een handdoek aan de lucht drogen voordat u de vormstelsel. </li><li> Terwijl de mal is de lucht drogen, snijd het plein hydrofiele dekglaasjes in twee rechthoeken iets groter dan 3,95 mm x 5,99 mm met een hoge precisie-diamant schrijvende tool. Schuif elke snede rechthoek dekglaasje in de sleuven gesneden in de siliconen mal. </li><li> Draai de mal ondersteboven en breng vacuüm vet langs de bodem van de siliconen mal met een wegwerpbare pipet. Vervolgens, draai de mal rechts achter-kant naar boven en druk op de bodem van de vorm op de cirkelvormige hydrofiele glas coverslip een afdichting. </li><li> Met wegwerphandschoenen, pak de samengestelde mal en plaats in een wegwerp petrischaal en vervolgens in een bio-kap. Schakel UV Bio-kap lamp voor 1 uur te steriliseren de mal voordat experimenten optreedt. </li></ol> 3. Collageen mengsel en 3D Matrix <ol><li> Voor het bereiden van het mengsel collageen, kleurstof en cellen te bereiden voor beeldvorming volgens standaardprotocollen 28. </li><li> Met behulp van standaard laboratoriumtechnieken en protocollen 29,30, in een bio-kap, meng cel media en chemoattractant in een 15 ml buis chemoattractant gewenste concentratie. Pipetteer 5 ml specifieke celmedium-chemoattraetantconcentratie oplossing in een 15 ml buisje en zet de oplossing in een verwarmd waterbad. </li><li> Met behulp van een pipet, extract 5 ml van alleen mobiele media in een tweede 15 ml buis en plaats in een verwarmd waterbad op te warmen de oplossing voor microscopie experimenten. </li><li> In een bio-kap, pipet 30 ui 10X fosfaatbuffered oplossing (PBS) in microcentrifuge buis. Voeg 6 pi van 1 N natriumhydroxide (NaOH) in dezelfde micro centrifugebuis en vortex gedurende 15 seconden. </li><li> Verkrijgen van collageen I staart rat oplossing uit de koelkast en te verplaatsen naar de bio-kap met behulp van standaard laboratoriumtechnieken en protocollen 29. Zorg ervoor dat het collageen nog koud is. Pipet 168.3 ul van collageen in dezelfde micro centrifugebuis. </li><li> Voeg vervolgens 18 ul van geel-groen fluorescent-carboxylaat gemodificeerde microsferen met een pipet aan dezelfde micro-centrifugebuis. Vortex de microcentrifuge buis met alle oplossingen voor 30 sec. </li><li> Voeg 77,7 ul van gewenste cel media-cel-mengsel (ongeveer 2 x 10 6 cellen / ml concentratie) in micro centrifugebuis toe en meng met een pipet tip voor 20 sec. Zonodig weg matrixdichtheid door de aangepaste collageen mengsel aangepast aan de toevoeging van fluorescerende kralen en cellevensvatbaarheid tabel (Tabel 1). </li><li> Pipetteer 300 &amp; #181; l van collageen-cel mengsel in het centrum goed (goed # 2) van de bereide vormstelsel. Plaats de vorm op een wegwerp petrischaaltje verplaatsen in een standaard incubator gedurende 20 minuten bij 37 ° C met 5% CO 2. </li><li> Verwijder het systeem uit incubator en plaats terug in de bio-kap. Behulp van een tang, verwijder beide hydrofobe dekglaasjes door klemmen op de bovenkant van elk dekglaasje en trekken omhoog en van de matrijs. </li><li> Verplaats het hele systeem om de gewenste microscopie en image te zorgen collageen schimmel kanten zijn nog steeds rechtstreeks naar zorgen voor een vlakke diffusie verloop. </li><li> Met het systeem nog onder de microscoop, telkens met 100 ul enkel-kanaals pipet, voeg 100 pl celmedium in well 1. Vervolgens, telkens met 100 gl enkelkanaals pipet voeg 100 pl celmedium met chemoattractant gewenste concentratie in well 3. </li><li> Onmiddellijk na het toevoegen van oplossingen in zowel putjes begonnen imaging. </li></ol> 4. Imaging en DiffusionModellering <ol><li> Als men wil de diffusiecoëfficiënt voor de specifieke collageen dichtheid aan de specifieke concentratie te berekenen vinden, volg dan de onderstaande protocol: <ol><li> Volg de gegeven protocol bovenstaande titel &quot;Collageen mengsel en 3D Matrix,&quot; in plaats van het genereren van mobiele media met chemoattractant gewenste concentratie, maken 5 uM rhodamine in een 15 ml buis met behulp van standaard berekeningen en protocollen 30. </li><li> Afbeelding 3D collageen matrices met een confocale gemonteerd op een omgekeerde microscoop met een argon laser (488 nm) om de fluorescentie te vangen. Afbeelding elke 2 of 3 seconden tot 7 uur. </li></ol></li><li> Voor Diffusion Modeling: Het gebruik van het wiskundige model hieronder weergegeven, schrijven computational software code voor de verwerking en analyse van deze algemene stappen. <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" /><ol><li> Importeer afbeeldingen in computational software voor herschalen en het normaliseren van de maximale Intendiversiteit. Zet beelden naar een grijze kleur-kaart van het beeld om de rand te selecteren. Kies een as langs het midden van de afbeelding, rechts van het midden en links van het midden. </li><li> De computationele softwarecode, trek de genormaliseerde intensiteit samen met de werkelijke intensiteit en het verschil tussen de twee. </li><li> Vervolgens, het invoeren van de parameters die nodig zijn voor de montage (concentratie, tijd en lengte). </li><li> Zet de genormaliseerde concentratie versus tijd en concentratieprofiel over de x-as met de kromme aan de gegevens. </li><li> Bereken de coëfficiënt van diffusie met behulp van de computationele softwarecode. </li></ol></li></ol> 5. Experimentele Metingen <ol><li> Terugverwijzend naar de diffusievergelijking, herschrijven van de vergelijking om de specifieke concentratie vinden op iedere plaats binnen het systeem als getoond in onderstaande. <img alt="Vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" /> Waar: L = lengte van the collageenmatrix x = locatie in onderzoek D = coëfficiënt van diffusie t = verstreken tijd </li><li> Tijdens chemotaxis experimenten zorgen voor de specifieke tijd dat moment chemokine toegevoegd aan het systeem op te nemen. Zodra celmigratie beweging wordt gevonden, ervoor te zorgen dat confocale time-lapse-opname op te nemen en noteer de specifieke tijd en locatie van de rand waar de beeldvorming voorgedaan. </li><li> Tijdens data-analyse, sluit de bekende verstreken tijd, plaats en diffusie coëfficiënt voor de specifieke cel in de vergelijking met de genormaliseerde specifieke concentratie op enig punt in het collageen voor zowel diffusie celexperimenten vinden. </li></ol> 6. Tracking Cell Migratie Gebruik makend van TFM <ol><li> Om celmigratie volgen met behulp van TFM / DVC technieken Volg de onderstaande protocol: <ol><li> Na toevoeging van chemoattractant gewenste concentratie in well 3, start de 3D beeldvorming van collageen matrices met een confocale gemonteerd op een omgekeerde microscope te vinden een cel te onderzoeken. </li><li> Zodra een bewegende cel wordt gevonden, plaatst de cel in het midden van het gezichtsveld en gebruiken een piëzo-elektrische motor (om de afbeelding in de z-as), het elke 1 of 2 min. </li><li> Voor de berekening van de cel troepenmacht en vervorming, het genereren van een computationeel code om de verplaatsingen van de fluorescentie kralen na de TFM / DVC protocollen 31 te vinden. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Adzick, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+and+Cellular+Biology+of+Wound+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair.</a> Ann Surg. 225 (2), 236(1997).</li>
<li>Reddi, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+an+unconventional+approach+to+isolation+of+first+mammalian+morphogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+F.+R%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens.</a> Cytokine Growth F. R. 8 (1), 11-20 (1997).</li>
<li>Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cancer.</a> Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).</li>
<li>Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+effect+of+chemotaxis+on+glioblastoma+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression.</a> AIChE J. 57 (3), 778-792 (2011).</li>
<li>Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+gradient+sensing%3A+towards+building+predictive+models+of+chemotaxis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 284-291 (2012).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Cristini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+Instability+and+Cancer+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Morphologic Instability and Cancer Invasion.</a> Clin. Cancer Res. 11 (19), 6772-6779 (2005).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell%27s+sense+of+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell's sense of direction.</a> Science. 284 (5415), 765-770 (1999).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+under+agarose%3A+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li>
<li>Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+controlled+molecular+gradients+in+3D+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generating controlled molecular gradients in 3D gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 91 (6), 754-759 (2005).</li>
<li>Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor-induced+cell+motility+in+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Growth factor-induced cell motility in tumor invasion.</a> Acta Oncol. 41 (2), 124-130 (2002).</li>
<li>Wilkinson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+leukocyte+locomotion+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 216 (1-2), 139-153 (1998).</li>
<li>Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multichamber+fluidic+device+for+3D+cultures+under+interstitial+flow+with+live+imaging%3A+development%2C+characterization%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications.</a> Biotechnol. Bioeng. 105 (5), 982-991 (2010).</li>
<li>Noo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotechnol. 20 (8), 826-830 (2002).</li>
<li>Shao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab Chip. 9 (21), 3118-3125 (2009).</li>
<li>Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+agarose-based+microfluidic+platform+with+a+gradient+buffer+for+3D+chemotaxis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies.</a> Biomed. Microdevices. 11 (4), 827-835 (2009).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat. Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Sixt, M., Lammermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+chemotactic+leukocyte+migration+in+3D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments.</a> Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).</li>
<li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J. Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell. Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).</li>
<li>Gilbert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+diffusion+through+collagen+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Macromolecular diffusion through collagen membranes.</a> Int. J. Pharm. 47 (1-3), 79-88 (1988).</li>
<li>Ramanujan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+and+convection+in+collagen+gels%3A+implications+for+transport+in+the+tumor+interstitium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium.</a> Biophys. J. 83 (3), 1650-1660 (2002).</li>
<li>Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusivity+of+125I-calmodulin+through+collagen+membranes%3A+effect+of+source+concentration+and+membrane+swelling+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio.</a> Biomaterials. 7 (4), 263-267 (1986).</li>
<li>Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. dL. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+modifications+of+collagen+gels%3A+impact+on+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion.</a> Biopolymers. 89 (2), 135-143 (2008).</li>
<li>Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-stimulated+chemotaxis+of+human+neutrophils+in+a+3-D+conjoined+fibrin+gel+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay.</a> J. Immunol. Methods. 180 (2), 193-211 (1995).</li>
<li>Sundd, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+paxillin+in+rolling+neutrophils+by+dual-color+quantitative+dynamic+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting.</a> Microcirculation. 18 (5), 361-372 (2011).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Volume+Transfers+with+Serological+Pipettes+and+Micropipettors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors.</a> J. Vis. Exp. (63), 2754(2012).</li>
<li>Stephenson, F. H. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. , Elsevier Science. (2010).</li>
<li>Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fast+Iterative+Digital+Volume+Correlation+Algorithm+for+Large+Deformations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mech%22%5BJournal%5D)">A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations.</a> Exp. Mech. In press, (2014).</li>
<li>Shenoy, V., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+Macromolecules+in+Collagen+and+Hyaluronic+Acid%2C+Rigid-Rod-Flexible+Polymer+Composite+Matrixes%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes.</a> Macromolecules. 28 (26), 8751-8758 (1995).</li>
<li>Leddy, H., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Molecular+Diffusion+in+Articular+Cartilage+Measured+using+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Ann. Biomed. Eng. 31 (7), 753-760 (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De meest kritische stappen voor een succesvolle diffusie experimenten met of zonder cellen zijn: juist het opzetten van de mal vergadering; ontwikkeling van de benodigde handigheid om schade tijdens de extractie van hydrofobe dekglaasjes voorkomen; zorgen voor een zeer goede lineair startlijn te kunnen berekenen van de diffusiecoëfficiënt vinden; experimentele berekeningen van zowel collageen en chemoattractant corrigeren; correct gebruik van live cell imaging systeem om matrix zorgen niet uitdroogt; en onderhouden van ...

De geprefereerde beweging van cellen naar een concentratiegradiënt, bekend als chemotaxis, speelt een belangrijke rol bij pathologische en fysiologische processen in het lichaam. Dergelijke voorbeelden zijn huid en slijmvliezen wondgenezing 1, morfogenese 2, 3 ontsteking en tumorgroei 4,5. Ook is aangetoond dat kankercellen kunnen migreren door zowel individuele als collectieve cel migratiestrategieën 6. Bovendien kan instabiliteit diffusie mechanismen scheiding van enkele of geclusterde cellen van een tumor die / object induceren en dan kan immigratie naar een bron van voedingsstoffen en dus binnendringen grotere gebieden en weefsels 7. Bovendien is aangetoond dat diverse migratiemechanismen actief kunnen zijn in 2D en 3D, vanwege verschillende rollen van adhesiemoleculen 8. Daarom is een verhuizing naar fysiologisch relevante in vitro assays om celbeweeglijkheid te onderzoeken in een measureable en eenvoudige manier van belang is bij het ​​begrijpen van de cel beweging verschijnselen 9. Helaas, de moeilijkheid bij het analyseren van celmigratie, een uitgebreide kwantificeerbare chemotaxis assay vereist meestal een lange moeizame methode, gebaseerd op de meting van onpartijdig celmotiliteit en transport verschijnselen modellen. Past experimentele benaderingen naar cel chemotaxis onderzoeken onder meer de Boyden kamer 10 en de onder agaroseanalyse 11. Echter, in deze vroege assays, celmigratie experimenten niet de beweging met betrekking tot tijd te controleren. More, belangrijker, de concentratie gradiënten voor de experimenten waren niet goed gedefinieerd of volledig begrepen terwijl slechts het behoud van de signalering niet meer dan een paar uur. Bovendien vroeg chemotaxis kamer pogingen beperkt cel migratie naar twee dimensies en niet toestaan ​​dat de ene naar de kinetiek van migratie 12 bewaken. Kijkend naar de Boyden kamer, een eindpunt assayzou niet toestaan ​​dat de onderzoeker migratie visueel observeren en kon niet direct onderscheid chemotaxis (directionele beweging) van chemokinesis (random beweging). Bovendien zijn een aantal variabelen-verschillen in de porie grootte en dikte van de membranen-maakte de kamer zeer moeilijk om gemakkelijk te reproduceren en verborgen de migrant reactie van cellen om chemokines 13,14. Met het nieuwe begrip van microfluidics, hebben nieuwe kamers en micro-apparaten onderzocht als een instrument om mobiele motoriek onder interstitiële stroom omstandigheden te onderzoeken of chemotaxis 15,16. Onder deze nieuwe apparaten, werden nieuwe cel metrics geïntroduceerd en onderzocht, zoals het effect van shear stress op een mobiele 17,18. Helaas, het verleden en de huidige microfluïdische chemotaxis kamers beperkt studies van de cel migratie naar 2D-substraten een belangrijke tegenslag omdat veel biologische processen, met inbegrip van de tumorcel invasie en metastase, en immune celmigratie, betrekken 3D migratie. Directe observatie-kamers waar chemoattractant oplossing in contact met een 3D gel met cellen zijn eveneens ook gemeld 19,20. Deze kamers hebben twee compartimenten, een met een chemoattractant en één bevattende cellen zijn verbonden naast elkaar horizontaal 21 of concentrische ringen 22. Deze systemen worden aangegeven in de juiste richting, maar geen chemotaxis systeem houdt gedurende langere tijd. Daarnaast hebben onderzoekers ook onderzocht door middel van diffusie collageenmembranen in dialyse-cellen, alsook de diffusie van tracer moleculen door collageen monsters onderworpen aan hydrostatische druk 23-25. Sommige diffusie experimenten collageen gels afhankelijk fysische en chemische modificaties van de gel met behulp van magnetische velden en chemische incorporatie 26. Een populaire methode voor het modelleren van diffusiviteit in collaGenous weefsels gebaseerd op de fluorescentie beeldvorming van continue punt fotobleken. Deze werkwijze is geopenbaard anisotropie in de diffusie coëfficiënten van macromoleculen in georiënteerde collagene weefsels. Toch is fotobleken gebruikt in gewrichtskraakbeen en niet-collageen matrices. Terwijl soortgelijke dienen de nodige modelleren experimenten doorgevoerd specifiek begrip van de diffusiecoëfficiënt van collageen gels. Wat nog belangrijker is, zijn de systemen niet een methode voor het meten van mobiele troepenmacht benutten. Helaas zijn de meeste systemen lijken te ontbreken een of twee belangrijkste elementen voor een ideaal systeem: het toestaan ​​van cell tracking, een diffusie gradiënt begrip met een chemotactische factor door de matrix, een relatief eenvoudige set-up met een gemak van de reproduceerbaarheid, het minimaliseren van cel-cel interacties, en het vermogen om dimensionele eenheden voor het kwantificeren (bijvoorbeeld snelheid, kracht, specifieke concentratie) te meten. Møghe et al. </em&gt; 27 voorgesteld een systeem dat de meeste van deze eisen waarbij cellen oorspronkelijk werden gedispergeerd door de gel in plaats gericht op het filteroppervlak voldaan, maar was moeilijk krachten die de cel genereert meten. Hiervoor presenteren we een vlakke gradiënt diffusiesysteem chemotaxis onderzoeken 3D collageenmatrix, waarmee men moderne diffusiekamer beperkingen van bestaande assays, die is gebaseerd op time-lapse microscopie, samen met beeldanalyse technieken om cellen te meten overwinnen krachten in een 3D-omgeving. Dit protocol is een eenvoudige, maar innovatieve manier om een ​​eenvoudige 3D diffusiekamer die kunnen worden gebruikt om 3D chemotaxis in verschillende cellen te onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>Silicone elastomer kit</td><td>Dow Corning Corp</td><td>182 SIL ELAST KIT.5KG</td><td>een twee-onderdeel mix met een 10:1 mix</td></tr><tr><td>Live cell imaging chamber</td><td>Live Cell Instrument</td><td>CM-B18-1</td><td>CMB voor 18&nbsp;mm ronde dekglasjes</td></tr><tr><td>22&nbsp;mm Glass Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0180281</td><td>Neuvitro Corp. dekglasje 22&nbsp;mm 1.5</td></tr><tr><td>Machined aluminum metal cube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hobby utility knife</td><td>X-Acto</td><td>X3201</td><td></td></tr><tr><td>3-(aminopropyl) trimethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00216A-10</td><td>Glutaraldehyde, EM Grade, 8%</td></tr><tr><td>50 ml tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Standaard vloermodel en tafelcentrifuges</td></tr><tr><td>Glass Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td><td>Herbruikbare Petri-schalen: Compleet (60 x 15&nbsp;mm)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td>Fine Point Forceps</td></tr><tr><td>Cover glasses</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-105A</td><td>Rechthoek; 30 x 22&nbsp;mm; Dikte nr. 1</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Azijnzuur ACS reagens, &ge;99,7%</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td>watervrij, 95%</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof, voor moleculaire biologie</td></tr><tr><td>High-precision diamond scribing tool</td><td>Lunzer</td><td>PV-081-3</td><td>Straalschrijver met rechte verlengde punt,.020" (.50&nbsp;mm) diameter door.200" (5.0&nbsp;mm) puntlengte</td></tr><tr><td>Vacuum grease</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5C</td><td>High-Vacuum Grease</td></tr><tr><td>15 ml tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>15 ml conische centrifugeerbuizen met hydrofobe, biologisch inert oppervlak</td></tr><tr><td>10x phosphate buffered solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td>1,37 M natriumchloride, 0,027 M kaliumchloride en 0,119 M fosfaatbuffer</td></tr><tr><td>1&nbsp;N sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38215</td><td>Natriumhydroxide concentraat</td></tr><tr><td>Collagen I, rat tail</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>Rat tail&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro centrifuge tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-332</td><td>Volume: 2,0 ml; O.D. x L: 13&nbsp;x&nbsp;40&nbsp;mm; steriele; eenvoudig verpakt</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Carboxylate-modified microspheres</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;F-8813</td><td>Carboxylaat-gemodificeerde microspheren, 0,5 &micro;m, geel-groen fluorescerend (505/515), 2% vaste stof</td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83689</td><td>Rhodamine B voor fluorescentie</td></tr></tbody></table>

planar gradient diffusion system chemotaxis onderzoeken in een 3d collageenmatrix

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

De belangrijkheid van celmigratie is te zien aan de ontwikkeling van het menselijk leven. Wanneer cellen migreren, genereren ze krachten en brengen deze krachten over naar hun omgeving, wat leidt tot beweging en migratie van cellen. Om de mechanismen die celmigratie kunnen veranderen en/of beïnvloeden te begrijpen, kan men deze krachten bestuderen. In theorie bevat het begrijpen van de fundamentele mechanismen en krachten die ten grondslag liggen aan celmigratie, de belofte van effectieve benaderingen voor de behandeling van ziekten en het bevorderen van cellulaire transplantatie. Helaas zijn moderne chemotaxiskamers die zijn ontwikkeld meestal beperkt tot twee dimensies (2D) en hebben ze complexe diffusiegradiënten die het experiment moeilijk te interpreteren maken. Daarom hebben we een direct-viewing kamer ontwikkeld voor chemotaxisstudies, die wordt beschreven in dit artikel, die het mogelijk maakt om moderne chemotaxiskamer obstakels te overwinnen, in staat om celkrachten en specifieke concentratie binnen de kamer in een 3D-omgeving te meten om 3D celmigratie te bestuderen. Wat nog overtuigender is, is dat deze aanpak het mogelijk maakt om diffusie door 3D collageen matrices met succes te modelleren en de diffusie coëfficiënt van een chemoattractant door meerdere verschillende concentraties van collageen te berekenen, terwijl het systeem eenvoudig en gebruiksvriendelijk blijft voor tractiekrachtmicroscopie (TFM) en digitale volumecorrelatie (DVC) analyse.

Het vermogen van de test om de migratie van de cellen nauwkeurig te beoordelen vertrouwt op een goede opzet van het systeem. Daarom is het essentieel voor zorgen dat het diffusiesysteem matrijs nauwkeurig ontwerpen en grote zorg in het plaatsen van hydrofobe en hydrofiele dekglaasjes, zie figuur 1. Als het systeem goed ontworpen en tijdens de diffusie modelleringsfase zorgen voor een voorbeeld goede lineaire startlijn, men in staat fijn bereiken fluoresceert beelden, zoals weergegeven in figuur ...

Celmigratie is een belangrijk onderdeel van de menselijke ontwikkeling en het leven. Om de mechanismen te begrijpen die celmigratie kunnen veranderen, presenteren we een planar gradient diffusiesysteem om chemotaxis in een 3D collageenmatrix te onderzoeken, waardoor men de moderne diffusiekamerbeperkingen van bestaande assays kan overwinnen.

Planar Gradient Diffusion System Chemotaxis onderzoeken in een 3D collageenmatrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een vlakke gradiëntdiffusiekamer om chemotaxis in een 3D collagenmatrix te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst een 3D-siliconenvorm te vervaardigen met behulp van een live-cell imagingkamer. De tweede stap is het maken van hydrofiele en hydrofobe dekglasplaatjes en deze te gebruiken voor de assemblage van de 3D-siliconenvorm.Vervolgens wordt het collageen-celmengsel aan het middencompartiment toegevoegd en krijgt het de tijd om te polymeriseren. De laatste stap is het verwijderen van de hydrofobe dekglasjes uit de mal na incubatie, gevolgd door het toevoegen van gewoon medium aan het ene reservoir en medium met chemoattractant aan het andere reservoir. Tot slot wordt confocale microscopie gebruikt om de chemotaxis van cellen in de tijd te volgen en de verplaatsing van de cellen binnen de collageenmatrix te visualiseren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals de boin-kamer en micro-atletiek, is dat het een eenvoudige opstelling mogelijk maakt om migratie in een 3D-ruimte te onderzoeken met een eenvoudige diffusiegradiënt, met behulp van een wegwerppipet. Meet 150 µL van de amino-seline A-P-T-M-S af en giet dit in een buis van 50 mL. Voeg vervolgens met een tweede wegwerppipet 30 mL 100% ethanol toe aan de buis en sluit het deksel.Vortex de oplossing gedurende twee minuten om volledige menging te garanderen. Giet de oplossing vervolgens in een glazen Petrischaal en zet deze opzij. Giet daarna 15 milliliters 100% ethylalcohol in een tweede Petrischaal en plaats deze bij de eerste schaal met behulp van een nieuwe wegwerppipet.Meet 30 milliliters gedeïoniseerd water af en giet de oplossing in een buis van 50 milliliter. Gebruik vervolgens een nieuwe wegwerppipet om 1,875 milliliters glucoaldehyde aan de buis toe te voegen en sluit het deksel. Vortex de oplossing gedurende twee minuten en giet het mengsel vervolgens in een derde Petri-schaal.Neem met een pincet één rond glazen dekglas van 22 millimeter en spoel beide zijden met een 100% ethanolmengsel. Plaats het gespoelde dekglas met een wegwerppipet in het eerste schaaltje met amino-seline en laat het vijf minuten in de oplossing liggen. Neem het dekglas met de pincet eruit en spoel het opnieuw met 100% ethanol.Laat vervolgens het gespoelde glazen dekglas in het schaaltje met glutaraldehyde vallen en zet dit 30 minuten apart. Verwijder na 30 minuten het glazen dekglas met een pincet en spoel het af met gedeïoniseerd water. Plaats het gespoelde dekglas op een tissue om overnight bij kamertemperatuur te drogen.Om hydrofobe dekglasjes voor te bereiden, voegt u eerst 500 microliters TTS, 100 microliters azijnzuur en 19,4 milliliters hepaan toe aan een buis van 50 milliliter en mengt u dit twee minuten met een vortex. Giet vervolgens de oplossing in een glazen Petrischaal en plaats met een schone pincet één glazen dekglasje in de bereide oplossing; laat dit twee minuten inwerken. Haal na twee minuten het glazen dekglasje met de pincet uit de oplossing, spoel het met gedeïoniseerd water met behulp van een wegwerppipet, plaats het dekglasje op een tissue en laat het gedurende de nacht drogen bij kamertemperatuur.Bewaar de gedroogde dekglasjes in een plastic Petrischaal tot ze nodig zijn om te beginnen; stel de kamer voor live-celimaging in zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Meng vervolgens de silicone-elastomeeroplossingen volgens de instructies van de fabrikant om vijf milliliter elastomeer te maken. Gebruik daarna een wegwerpspatel voor in het laboratorium om de silicone-elastomeeroplossing langzaam in de opstelling van de live-celimagingkamer te gieten, zodat de componenten van de mal niet worden verstoord.Zet de mal op een veilige plek om deze een nacht op kamertemperatuur te laten uitharden. Haal de volgende ochtend de mal eruit met een pincet en verwijder voorzichtig de bewerkte aluminiumkubus uit de mal. Ga vervolgens naar de spoelbak en spoel de mal af met gedeïoniseerd water, en plaats de mal daarna op een papieren handdoek om te drogen.Zodra het droog is, gebruikt u een hobbymes om inkepingen te maken met een tussenruimte van 2,34 millimeter vanaf elk longitudinaal uiteinde binnen de siliconenmal. Zorg ervoor dat de mal op een veilige en droge plaats blijft tot deze nodig is voor het experiment voorafgaand aan het gebruik. Spoel de mal met 90% ethanol en plaats de mal in een petrischaal gevuld met gedeïoniseerd water om een nacht te laten weken.Verplaats de mal de volgende ochtend naar een papieren handdoek en laat deze aan de lucht drogen. Gebruik een diamantrijskrachtige kraspen met hoge precisie om het vierkant op de hydrofiele dekglasplaatjes te snijden in twee rechthoeken, die iets groter zijn dan 3,95 millimeters bij 5,99 millimeters.Schuif vervolgens elk van de rechthoekige gedecuteerde dekglasjes in de sleuven die in de siliconen mal zijn gesneden, keer de mal om en breng met een wegwerppipet vacuümvet aan langs de onderzijde van de siliconen mal. Keer de mal daarna weer om en druk de onderzijde van de mal op het cirkelvormige hydrofiele glazen dekglasje. Om een afdichting te creëren, bereidt u in een buis van 15 milliliter een mengsel van medium en chemoattractant in de gewenste concentratie; pipetteer vijf milliliter van het mengsel in een nieuwe milliliterbuis en vijf milliliter puur medium in een tweede buis.Plaats beide buisjes in een waterbad dat is verwarmd tot 37 °C. Pipetteer vervolgens 30 µL 10 XPBS in een microcentrifugebuisje. Voeg zes µL van een 1 N natriumhydroxide-oplossing toe aan hetzelfde microcentrifugebuisje en vortex dit gedurende 15 seconden.Voeg vervolgens 18 µL geelgroen fluorescent carboxylaat-gemodificeerde microsferen toe aan een microcentrifugebuis en 168,3 µL ijskoud type I rattenstaartcollageen. Vortex het mengsel gedurende 30 seconden.Voeg vervolgens 77,7 µL van de gewenste cel toe, met een concentratie van 2 × 10⁶ cellen per milliliter in medium, aan de microcentrifugebuis en meng dit. Pipetteer met een pipetpunt gedurende 20 seconden 300 µL van het collageen-celmengsel in de centrale put van de voorbereide malassemblage.Plaats de mal vervolgens op een wegwerppetri-schaal en zet deze 20 minuten lang in een standaard incubator bij 37 °C met 5% CO2. Gebruik na de incubatieperiode een pincet om beide hydrofobe dekglasjes te verwijderen door de bovenkant van elk dekglasje vast te klemmen en deze vervolgens omhoog en weg van de mal te trekken. Verplaats het gehele systeem naar de microscoop en controleer de kamer om er zeker van te zijn dat de zijkanten van de collageenmal nog recht zijn, zodat er een vlakker diffusiegradiënt ontstaat terwijl het systeem zich nog onder de microscoop bevindt. Voeg 100 µL celmedium toe aan de eerste put.Voeg vervolgens 100 µL celmedium met de gewenste concentratie chemo-attractant toe aan het putje aan de andere zijde van de matrix. Volg de celmigratie ten opzichte van de fluorescentieel gelabelde microsferen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. De hier gepresenteerde reeks beelden toont de diffusie van rumine door een collageengel van 1 mg/mL.Dit voorbeeld toont de werkelijke planaire diffusiegradiënt van het systeem, wat ook verwacht kan worden van elke geïntroduceerde chemo-attractant. In het hier getoonde voorbeeld werd de intensiteit van het rumine-signaal in de tijd gemeten op de locaties die zijn aangegeven met de rode vierkantjes. De concentratie op elk van deze locaties wordt in deze grafiek weergegeven als een aparte lijn, die bij meting in steady state een lineaire concentratiegradiënt produceert op basis van de positie in de gel.Deze relatie blijft lineair over een reeks concentraties van de collageenmatrix, waardoor dit systeem zeer nuttig is voor celexperimenten. In deze afbeelding is een neutrofiel, rood gekleurd, te zien binnen een collageenmatrix waarin fluorescerende groene microsferen zijn verspreid die als positiereferenties dienen. De volgende drie afbeeldingen tonen de gerichte migratie van het neutrofiel terwijl het zich verplaatst in de richting van een gradiënt van chemo-attractanten, wat wordt weergegeven door de witte pijl.Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u een eenvoudige diffusiekamer maakt om celmigratie in een 3D-collageenmatrix te onderzoeken.

planar-gradient-diffusion-system-to-investigate-chemotaxis-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Werkwijze voor de montage van lijm en oplosbaar gradiënten in een kamer microscopie voor levende celmigratie studies beschreven. De kunstmatige omgeving combineert aangroeiwerende oppervlakken en lijm tracks met oplossing hellingen en daarom maakt het mogelijk om te bepalen van het relatieve belang van begeleiding cues.

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Celmigratie is een biologisch verschijnsel dat betrokken is bij een overvloed aan fysiologische, zoals wondgenezing en immuunreacties en pathofysiologische processen, zoals kanker. De 3D-matrix van collageen migratie assay is een veelzijdig instrument om de trekkende eigenschappen van verschillende celtypes te analyseren binnen in een 3D-fysiologische-achtige omgeving.

Analyse van cel-migratie binnen Driedimensionale Collagen Matrix

De mechanische eigenschappen en de microstructuur van de extracellulaire matrix sterk beïnvloeden 3D migratie van cellen. Een in vitro werkwijze om de tijdruimtelijk celmigratie gedrag biofysisch variabele omgevingen zowel bevolking en afzonderlijke cel niveaus, gaande beschreven.

Concentrische Gel Systeem om de biofysische rol van matrix Microenvironment op 3D-Cell Migratie Bestudeer

Collageen is een essentieel onderdeel van de ECM en biedt essentiële signalen verscheidene cellulaire processen gaande van migratie differentiatie en proliferatie. Er wordt hier een protocol voor het inbedden van cellen in 3D collageen hydrogels, en een meer geavanceerde techniek voor het genereren van gerandomiseerde of uitgelijnd collageen matrices gebruikt PDMS microkanalen.

Voorbereiding van de 3D Collageen Gels en Microkanalen voor de Studie van 3D-Interacties<em&gt; In Vivo</em

Visual chemotaxis assays zijn essentieel voor een beter begrip van hoe eukaryotische cellen te controleren-chemoattractant gemedieerde directionele cel migratie. Hier beschrijven we gedetailleerde methoden voor: 1) real-time, hoge-resolutie controle van meerdere chemotaxis assays, en 2) tegelijkertijd het visualiseren van de chemoattractant gradiënt en de spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in neutrofielen-achtige HL60 cellen.

Imaging G-eiwit-gekoppelde receptor-gemedieerde Chemotaxis en de signalering evenementen in neutrofielen-achtige HL60 Cells

Dit artikel geeft de gedetailleerde methode om een ​​snelle neutrofiele chemotaxis-analyse te verrichten door de integratie van de on-chip neutrofiele isolatie uit volledig bloed en de chemotaxis-test op een enkele microfluïdische chip.

Een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed

Dit protocol beschrijft een omgekeerde verticale invasie-bepaling die kan worden gebruikt om het kwantificeren van de mogelijkheden voor migratie en invasie van cellen in een driedimensionale omgeving met behoud van de cel-communicatie. Deze test is geschikt voor zeldzame en/of gevoelige cellen.

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

We beschrijven een methode om apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids. Dit apparaat maakt analyse van cellulaire reacties op oplosbare signalen in 3D-micromilieus met gedefinieerde chemoattractant gradiënten. Organoids zijn beter dan enkele cellen bij de opsporing van zwakke luidruchtige ingangen.

3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten

Hier bieden wij een methode voor het analyseren van het gedrag van de groeiende axonen in 3D-matrices, het nabootsen van hun natuurlijke ontwikkeling.

Generatie van 3-D collageen-based hydrogels om axonale groei en gedrag te analyseren tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel

Collectieve Celmigratie in ontwikkeling, wondgenezing en kanker metastasen wordt vaak geleid door de gradiënten van groeifactoren of signalering van moleculen. Hier beschreven is een experimenteel systeem dat tractie microscopie combineert met een microfluïdisch systeem en een demonstratie van het kwantificeren van de mechanica van collectieve migratie onder biochemische gradiënt.

Tractie microscopie geïntegreerd met microfluïdica voor Chemotactische collectieve migratie

Hier beschrijven we methoden met behulp van time-lapse, fase-contrast microscopie om de muis ingezetene peritoneale macrofagen beeld in een chemotactische aanvulling C5a gradiënt. De protocollen kunnen worden uitgebreid naar andere immuuncellen.

Time-lapse Beeldvorming van muis macrofaag Chemotaxis

Leer een planaire gradiëntdiffusiekamer maken om chemotaxis te bestuderen in een 3D-collageenmatrix. Deze methode maakt het volgen van celmigratie met confocale microscopie mogelijk.

Planar Gradient Diffusion System Chemotaxis onderzoeken in een 3D collageenmatrix

Meer video's verkennen