Planar Gradient Diffusion System Chemotaxis onderzoeken in een 3D collageenmatrix

Het algemene doel van deze procedure is om een planaire gradiënt diffusiekamer te maken om chemotaxis in een 3D collageenmatrix te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst een 3D siliconen mal te fabriceren met behulp van een live celbeeldvormingskamer. De tweede stap is het maken van hydrofiele en hydrofobe deksels en deze te gebruiken om de 3D siliconen mal samen te stellen.

Vervolgens wordt de collageen-celmengsel toegevoegd aan het centrale compartiment en laat men het polymeriseren. De laatste stap is het verwijderen van de hydrofobe deksels uit de mal na incubatie en het toevoegen van gewoon medium aan de ene reservoir en medium met chemo-attractant aan de andere reservoir. Uiteindelijk wordt confocale microscopie gebruikt om celchemotaxis in de loop van de tijd te volgen en de celbewegingsverplaatsing binnen de collageenmatrix te visualiseren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken zoals de boin-kamer en micro-atletiek, is dat het een eenvoudige setup toestaat om migratie in 3D-ruimte te onderzoeken met een eenvoudige diffusiegradiënt, zonder gebruik van een wegwerppipet. Meet 150 microliter van de amino seline A-P-T-M-S en giet het in een 50 milliliter buis. Voeg vervolgens 30 milliliter van 100%ethanol toe aan de buis met een tweede wegwerppipet, en sluit het deksel.

Vortex de oplossing gedurende twee minuten om volledige menging te garanderen. Giet vervolgens de oplossing in een glazen petrischaal en zet deze opzij. Giet vervolgens 15 milliliter van 100%ethylalcohol in een tweede petrischaal en plaats deze samen met de eerste schaal met behulp van een nieuwe wegwerppipet.

Meet 30 milliliter gedeïoniseerd water en giet de oplossing in een 50 milliliter buis. Gebruik vervolgens een nieuwe wegwerppipet om 1,875 milliliter van glu aldehyde aan de buis toe te voegen en sluit het deksel. Vortex de oplossing gedurende twee minuten en giet vervolgens het mengsel in een derde petrischaal.

Gebruik pincetten om 1 22 millimeter ronde glazen deksel eruit te halen en spoel beide kanten met 100%ethanol mengsel. Gebruik een wegwerppipet om de gespoelde glazen deksel in de eerste schaal met amino seline te plaatsen en laat deze vijf minuten in de oplossing zitten met behulp van pincetten. Neem het glazen deksel eruit en spoel het opnieuw met 100%ethanol.

Laat vervolgens het gespoelde glazen deksel vallen in de schaal met glutaraldehyde en laat het 30 minuten staan. Verwijder na 30 minuten het glazen deksel met behulp van pincetten en spoel het met gedeïoniseerd water. Plaats het gespoelde deksel op een tissue om 's nachts bij kamertemperatuur te drogen.

Om hydrofobe deksels te bereiden, voegt u eerst 500 microliter van TTS 100 microliter azijnzuur en 19,4 milliliter van heane toe in een 50 milliliter buis en vortex deze gedurende twee minuten. Giet vervolgens de oplossing in een glazen petrischaal en gebruik schone pincetten om een glazen deksel in de bereide oplossing te laten vallen en laat deze daar twee minuten staan. Neem na twee minuten het glazen deksel eruit met behulp van pincetten en spoel het met gedeïoniseerd water met behulp van een wegwerppipet, plaats het deksel op een tissue en laat het 's nachts bij kamertemperatuur drogen.

Bewaar de gedroogde deksels in een plastic petrischaal totdat ze nodig zijn om te beginnen, assembleer de live celbeeldvormingskamer zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Meng vervolgens de siliconen elastomeroplossingen volgens de instructies van de fabrikant om vijf milliliter van elastomeer te maken. Gebruik vervolgens een wegwerp laboratoriumspatel om de siliconen elastomeroplossing langzaam in de live celbeeldvormingskamer setup te gieten, zodat de malcomponenten niet worden verstoord.

Zet de mal opzij op een veilige plaats om de kamertemperatuur 's nachts te laten drogen. De volgende ochtend trekt u de mal eruit met behulp van pincetten en haalt u voorzichtig de gemaakte aluminium metalen kubus uit de mal. Ga vervolgens naar de gootsteen en spoel de mal af met gedeïoniseerd water en plaats de mal op een papieren handdoek om te drogen.

Eenmaal droog, gebruikt u een hobbymes om sleuven te snijden met een afstand van 2,34 millimeter vanaf elk longitudinaal uiteinde binnenin de siliconen mal. Zorg ervoor dat de mal op een veilige en droge plaats blijft totdat deze nodig is voor het experiment vóór gebruik. Spoel de mal met 90%ethanol en plaats de mal in een petrischaal gevuld met gedeïoniseerd water om 's nachts te staan.

De volgende ochtend brengt u de mal over naar een papieren handdoek en laat u deze aan de lucht drogen terwijl de mal droogt. Gebruik een diamantschrijfgereedschap met hoge precisie om het vierkant. Hydrofiele deksels in twee rechthoeken te snijden, iets groter dan 3,95 millimeter bij 5,99 millimeter.

Schuif vervolgens elk van de gesneden rechthoekige deksels in de sleuven, gesneden in de siliconen mal, draai de mal ondersteboven en breng smeringsvet langs de onderkant van de siliconen mal aan met behulp van een wegwerppipet. Draai vervolgens de mal terug met de rechterkant naar boven en druk de onderkant van de mal op de ronde hydrofiele glazen deksel. Om een afdichting te creëren, bereidt u een mengsel van media en chemo-attractant voor in een 15 milliliter buis op de gewenste concentratie, pipet vijf milliliter van het mengsel in een nieuwe milliliterbuis en vijf milliliter van gewoon medium in een tweede buis.

Plaats beide buizen in een waterbad verwarmd tot 37 graden Celsius. Pipet vervolgens 30 microliter van 10 XPBS in een micro centrifugebuis. Voeg zes microliter van een een normaal natriumhydroxideoplossing toe aan dezelfde micro centrifugebuis en vortex gedurende 15 seconden.

Voeg vervolgens 18 microliter van geel-groen fluorescerend carboxylaat, gemodificeerde microspheres toe aan een micro centrifugebuis en