Name: Fabricage van een gefunctionaliseerd Magnetic Bacterial Nanocellulose met ijzeroxide Nanodeeltjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Leer magnetisch bacterieel nanocellulose (BNC) te synthetiseren met ijzeroxide nanodeeltjes voor vasculaire toepassingen. Deze methode biedt een minimaal invasieve behandeling voor hersenaneurysma's en verbetert celretentie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door het Department of Defense onder contractnummer W81XWH-11-2-0067

1. Bereiding van Bacteriële Nanocellulose (BNC) Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden, tenzij anders aangegeven. <ol><li> Bereid kweekmedium. <ol><li> Bereid 500 ml vloeibaar kweekmedium door het combineren van 25 g gistextract, 15 g pepton, 125,0 g mannitol en 500 ml zuiver water. Autoclaaf dit mengsel bij 120 ° C gedurende 20 min en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Bereid 100 ml halfvaste media door het toevoegen van 15 g agar 5,0 g gistextract, 3,0 g pepton, 25,0 g mannitol en 100 ml zuiver water. Autoclaaf dit mengsel bij 120 ° C gedurende 20 min. Eenmaal geautoclaveerd depot 5 ml van het mengsel in een 90 mm x 16 mm plastic petrischaal. Laat de oplossing gel bij 4 ° C en bewaar bij deze temperatuur tot verder gebruik. </li></ol></li><li> Rehydrateren G. xylinus stam bewaard in gevriesdroogde vials door toevoeging van 1 ml vloeibaar kweekmedium en pipetteren enomlaag, zoals aangegeven door de instructies van de fabrikant. </li><li> Inoculeer de platen met semi-vaste media met kleine druppeltjes van bacteriële suspensie met behulp van een entnaald. Zorg ervoor dat het inoculum omvat het gehele petrischaal in door de lus in een zigzag richting vanaf de rand naar het midden van de schaal. </li><li> Incubeer de Petrischalen bij 26 ° C gedurende 72 uur in een incubator zonder CO 2. Zodra de incubatietijd is voltooid, kleine witte kolonies zichtbaar. Indien de kolonies worden niet onmiddellijk wordt gebruikt, slaan de petrischaaltjes bij 4 ° C door het afdichten van het deksel met Parafilm en het plaatsen van de gerechten op zijn kop. De kolonies kunnen worden opgeslagen op die manier tot 6 maanden. </li><li> Overdracht 2 ml van het kweekmedium vloeistof bereid in stap (1.1.1) in elk putje van een 24-well weefselkweek plaat. Neem twee kolonies met het enten naald uit de geënte petrischaaltjes in stap (1.3) en plaats ze in het eerste putje van de weefselkweek plaat. Repeat, herhaal dezelfde procedure voor de resterende 23 putten. </li><li> Incubeer de weefselkweekplaat bij 30 ° C gedurende 7 dagen. Dit zal een totaal 24 BNC pellicles met diameter van 16 mm en een dikte van ongeveer 2-3 mm diameter werd verkregen als weergegeven in figuur 1. Opmerking: de bacteriecultuur niet storen op enig moment tijdens de incubatietijd, bijvoorbeeld door schudden van de platen. Tijdens de incubatieperiode G. xylinus extrudeert glucopyranose suikermoleculen een polymeer kristallijn maas in de lucht-vloeistof-grensvlak, waarbij de vorm en grootte van de kolf onder statische kweekomstandigheden vaststelt vormen. Deze polymère matrix, bekend als bacteriële nanocellulose (BNC), valt op aan het einde van de incubatieperiode. </li><li> Verzamel de BNC pellicles de groeimedia en steriliseren in 200 ml 1% NaOH-oplossing gedurende 1 uur bij 50 ° C, teneinde alle sporen te verwijderen G. xylinus. Eventueel roer deze oplossing bij 300 rpm met een magneetstaafen een bewogen plaat. Gooi de NaOH-oplossing en voeg 200 ml vers bereide 1% NaOH-oplossing. Herhaal hetzelfde proces nog een keer of totdat de BNC pellicles in oplossing krijgt een doorschijnend uiterlijk. </li><li> Spoel de BNC pellicles met water drie keer en bewaar ze in zuiver water bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de BNC pellicles worden volledig ondergedompeld in het water en het is niet toegestaan ​​om te drogen op elk moment. </li><li> Autoclaaf de BNC pellicles bij 121 ° C gedurende 20 min. Let op: Een in vivo subcutane studie in de rat uitgevoerd door Märtson en collega&#39;s toonden aan non-degradatie tekenen van de BNC na 60 weken implantatie. Inderdaad, BNC afbreekbaar karakter door microbiële en fungale enzymen, die afwezig zijn in zoogdieren. Aan de andere kant kan de biologische afbreekbaarheid van de BNC het resultaat van mechanische, chemische en biologische processen die de microfibril netwerk in vivo 4 verzwakken. </li></ol> 2. Synthese van polymeer-gecoateIjzeroxide Nanodeeltjes en haar Deposition in een bacteriële Nanocellulose Membrane <ol><li> Bubble 1000 ml van zuiver water met stikstofgas om eventuele opgeloste zuurstof in het water te verwijderen en te vervangen door stikstof. </li><li> Gebruik een driehals rondbodem kolf die een oplossing bereid in een 2: 1 molaire verhouding van ijzer (III) chloride hexahydraat (FeCl3 · 6H 2 O) en ijzer (II) chloride-tetrahydraat (FeCl2 · 4H 2 O) verdund met de gedeoxygeneerd zuiver water. Gebruik bijvoorbeeld 5,4 g FeCl3 · 6H 2 O en 1,98 g FeCl2 · 4H 2 O in 10 ml gedeoxygeneerd zuiver water. Als dit preparaat wordt te viskeus en moeilijk te roeren, gebruiken 0,54 g FeCl3 · 6H 2 O en 0,198 g FeCl2 · 4H 2 O in 20 ml gedeoxygeneerd zuiver water. Opmerking: Verminder de belichtingstijd van de FeCl2 · 4H 2 O in de lucht door weging deze chemical verbinding zo snel mogelijk. Eenmaal geïntroduceerd in de drie-hals rondbodemkolf sluit de drie-hals rondbodemkolf met septum stoppen totdat het is verbonden met het stikstofatoom gastoevoer en de koeler. </li><li> Gebruik twee halzen van het vaartuig naar een constante ingang en uitgang van stikstofgas te verschaffen door de stikstof verbindt gastoevoer naar een naaldvilt in een septum stop en bevestigd aan hals van het vaartuig. </li><li> Plaats 1 BNC vlies dat was bereid eerder in stap 1,5 (15,6 mm diameter en 2-3 mm dikte) in het vat met de reactanten. Controleer het monster volledig ondergedompeld in de vloeistof. </li><li> Sluit de resterende hals van het vaartuig naar een condensor buis. Bovendien gebruikt een droogbuis wordt gevuld met watervrij calciumsulfaat bovenop de koeler. Laat water door de condensor buis. </li><li> Dicht alle van de glazen voegen met vacuüm vet. </li><li> Verwarm de oplossing in een silicone oliebad tot 80 ° C onder toepassing van een geroerdekookplaat en houd deze temperatuur totdat stap 2.10. Gebruik een kleine magnetische roerstaaf om de reactanten te mengen bij 350 rpm gedurende 5 minuten. Controleer de BNC op geschikte wijze geïmpregneerd met het ijzerhoudende oplossing en de reactanten volledig opgelost. Blijf roeren het mengsel tot het einde van het experiment. Opmerking: Gebruik een thermometer om de temperatuur van de siliconenolie controleren. Het moet constant 80 ° C. </li><li> Verhoging van de roersnelheid tot 700 rpm en voeg (druppelsgewijs), in een tijdsinterval van 5 minuten, 5 ml ammoniumhydroxide (NH4OH, 14%) aan de 10 ml van ijzerhoudende oplossing met een pipetteren naald, die is ook geperforeerd in een septum stopper. Na toevoeging van ammoniumhydroxide, de kleur van de oplossing verandert van geel / oranje naar zwart. </li><li> Zet roeren van de oplossing bij 80 ° C gedurende nog 5 min. Vermijd snelle stirrings om de integriteit van het monster te handhaven. Hoge snelheden, dat wil zeggen hoger dan 1000 rpm, kan vernietigenhet voorbeeld. </li><li> Verlaag de temperatuur van de oplossing tot 30 ° C met de temperatuur onderaan het roeren kookplaat en blijf roeren nog eens 5 minuten. Schakel dan de hete plaat. Op dit punt zijn de IONP opgenomen in de BNC-mesh. </li><li> Koel het mengsel af tot kamertemperatuur en scheiden van de magnetische nanodeeltjes (MNP) en BNC behulp van een sterke permanente magneet (bijvoorbeeld 1 Tesla). Om dit te doen, breng het mengsel aan een kolf vat en vervolgens, terwijl de magneet in de buurt van het schip, houdt het MNP en de BNC in plaats terwijl decanteren van de bovenstaande vloeistof. Opmerking: Wees voorzichtig bij het hanteren van sterke magneten, omdat ze schadelijk kunnen zijn bij onjuist gebruik. Voor stappen (2.12) - (2.14) en (2.16) gebruik maken van de zuurstofarme hoge zuiverheid water eerder bereid in (2.1) om deeltjes van oxidatie te voorkomen. </li><li> Resuspendeer de MNP en BNC in 100 ml water. Schud de oplossing voor al het MNP die niet sterk in het BNC zijn opgenomen te verwijderen. Schenk de supernatant weer door het houden van het MNP en de BNC in plaats met behulp van de magneet. </li><li> Was de MNP&#39;s en de BNC meerdere malen met water tot de bovenste neutrale pH (pH ~ 7) bereikt, zoals gemeten met een colorimetrische strip. </li><li> Scheid de magnetische-gefunctionaliseerde BNC of magnetische bacteriële nanocellulose (MBNC) uit het MNP met een pincet en spoel de MBNC meerdere malen met water tot het water helder is. </li><li> Steriliseer de MBNC door het blootstellen van de MBNC O / N UV (110-280 nm). </li><li> Autoclaaf 500 ml gedeoxygeneerd zuiver water bij 120 ° C gedurende 20 min en bewaar de MBNC in 20 ml van het water. </li><li> Aseptisch dompel het monster in 1% PEG en roer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (37 ° C). Deze werkwijze verbetert de biocompatibiliteit en de stabiliteit van het ijzeroxide nanodeeltjes afgezet in de BNC, in het bijzonder die blootgesteld aan het oppervlak 5-7. De PEG-coating wordt verdeeld over de MBNC 3D-netwerk. Opmerking: Naked IONP zijn gemakkelijk geoxideerd in luchtvanwege hun hoge chemische activiteit 8. Hoewel PEG wordt beschouwd als een niet-biologisch afbreekbaar materiaal, de chemische stabiliteit afhankelijk van de toegepaste biologische omstandigheden zoals vochtgehalte, pH, temperatuur, aanwezigheid van enzymen, reactieve zuurstof species, reactieve stikstof species en anderen 9. </li></ol> 3. Karakterisering van de BNC en MBNC Pellicles <ol><li> Mechanische eigenschappen <ol><li> Voer normaal laden en lossen nanoindentation test met een Berkovich indringlichaam. De straal van Berkovich diamant indringlichaam is 20 nm. </li><li> Gebruik gesmolten silica en wolfraam contactgebied calibreren als functie van de indrukking diepte RT. Tijdens de test, monteer de monsters op de inspringen gebruik van lijm. Het indringlichaam benaderde de monsters in de dikterichting. </li><li> Willekeurig inspringen locaties op monsters oppervlakken. Houd de afstand tussen 2 streepjes tussen de 200-300 mm. </li><li> Kan de last naar demonsters stappen en vermelden de overeenkomstige verplaatsing van het druklichaam. Analyseer de plot van lading vs diepte aan de Young&#39;s modulus te vinden. </li><li> Voer de nanoindentation test van de monsters in de aanwezigheid van gedemineraliseerd water (DI-water), en test door het toepassen van de belasting tarieven tussen 0,0001 mN / sec en 0,005 mN / sec, met een piek belasting tussen 0,01 Mn en 0,60 mN. </li><li> Gebruik een vloeibare cel en houdt monsters in het kader van het milieu vloeistoffen. Deze unieke opstelling voor nanomechanical karakterisering ondergedompeld in een vloeibare omgeving is ideaal om effectief simuleren het bereik biomechanische functionaliteit van BNC en MBNC membranen. </li></ol></li><li> Structurele karakterisering door SEM <ol><li> Karakteriseren nanocellulose vezelstructuur door scanning elektronenmicroscopie (SEM). </li><li> Lyofiliseren de monsters gedurende 24 uur bij -80 ° C. Monteer vervolgens op SEM studs, sputteren met Au-Pd film voor 10 sec en te analyseren met behulp van SEM. </li><li> Neemt foto&#39;s bij een vergroting van 22,000Xen 60,000X, met een versnellingsspanning van 5 kV. </li></ol></li><li> magnetische domeinen <ol><li> Laat de MBNC pellicles om volledig droog bij kamertemperatuur, en vervolgens blootgesteld gedurende 5 minuten naar een permanente magneet (1 Tesla). </li><li> Onmiddellijk, het uitvoeren van de magnetische kracht metingen met behulp van een bio-AFM volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Voor elke meting vast te leggen voor het eerst de topografie functies en het verwerven van de magnetische domeinen in een tweede pass. Verkrijgen van beide metingen met de bio-AFM in non-contact mode. </li><li> Magnetische karakterisering van de nanopartikels wordt met behulp magnetometer met vibrerend monster (VSM) in de fysische eigenschappen metingen systeem (PPM) van Quantum Design, bij kamertemperatuur (300 K), met een magnetisch veld in het bereik van -10.000 10.000 Oe. </li></ol></li><li> Cytocompatibility <ol><li> Zaad humane aortische gladde spiercellen (HASMC) in een 6-well weefselkweek plaat bij een dichtheid van 1.0x10 <sup&gt; 3 cellen / cm2 en incubeer 24 uur in aanwezigheid van de testmonsters: BNC en MBNC pellicles (elk met een 15,6 mm diameter). </li><li> Gebruik populaties van onbehandelde en waterstofperoxide behandelde cellen als negatieve en positieve controles, respectievelijk. </li><li> Voer de Comet assay volgens de protocollen van de fabrikant en de richtlijnen die door A. Azqueta &amp; AR Collins 10 voorgesteld. </li><li> Gebruik de nucleïnezuur kleurstof SYBR Gold in dit assay te intercaleren en fluorescent labelen van de DNA in de elektroforese monsters volgens protocol van de fabrikant. Opmerking: Cellen die geen DNA schade in aanwezigheid van BNC en MBNC monsters ondergaan, een fluorescent ronde groene nucleoid tonen dat DNA beschadigde cellen lang kometen moet - positieve monsters nucleoiden (de kop van het comet) hebben, gevolgd door staarten die gefragmenteerd DNA-materiaal (percentage van DNA in de staart) bevatten. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Saxena, I. M., Brown, R. M. Biosynthesis of bacterial cellulose. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxena%2C+IM+%22Bacterial+Nanocellulose%3A+A+Sophisticated+Multifunctional+Material%22">Bacterial Nanocellulose: A Sophisticated Multifunctional Material</a>. , 1-18 (2012).</li>
<li>Chan-Park, M. B., Shen, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+control+of+vascular+smooth+muscle+cell+morphology+and+phenotype+for+functional+tissue-engineered+small-diameter+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomed.Mater.Res.A%22%5BJournal%5D)">Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels.</a> J.Biomed.Mater.Res.A. 88, 1104-1121 (2009).</li>
<li>Barud, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocellulose-based+flexible+magnetic+paper%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Biocellulose-based flexible magnetic paper.</a> J. Appl. Phys. 117, (2015).</li>
<li>Märtson, M., Viljanto, J., Hurme, T., Laippala, P., Saukko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+cellulose+sponge+degradable+or+stable+as+implantation+material%3F+An+in+vivo+subcutaneous+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat.</a> Biomaterials. 20, 1989(1999).</li>
<li>Illésa, E., Tombácza, E., Szekeresa, M., Tótha, I., Szabób, Á, Iván, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+carboxylated+PEG-coating+on+magnetite+nanoparticles+designed+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Magn.+Mater%22%5BJournal%5D)">Novel carboxylated PEG-coating on magnetite nanoparticles designed for biomedical applications.</a> J. Magn. Magn. Mater. 380, 132(2015).</li>
<li>Torrisi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+corona+effects%3A+multiphosphonic+acid+poly%28ethylene+glycol%29+copolymers+for+stable+stealth+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Preventing corona effects: multiphosphonic acid poly(ethylene glycol) copolymers for stable stealth iron oxide nanoparticles.</a> Biomacromolecules. 15, 3171(2014).</li>
<li>Cai, Z., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cellulose%2Fpoly%28ethylene+glycol%29+composite%3A+characterization+and+first+evaluation+of+biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cellulose%22%5BJournal%5D)">Bacterial cellulose/poly(ethylene glycol) composite: characterization and first evaluation of biocompatibility.</a> Cellulose. 17, 83(2010).</li>
<li>Wu, W., He, Q., Jiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+iron+oxide+nanoparticles%3A+synthesis+and+surface+functionalization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Res.+Lett%22%5BJournal%5D)">Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and surface functionalization strategies.</a> Nanoscale Res. Lett. 3, 397-415 (2009).</li>
<li>Ulbricht, J., Jordan, R., Luxenhofer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+biodegradability+of+polyethylene+glycol%2C+polypeptoids+and+poly+%282-oxazoline%29s%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">On the biodegradability of polyethylene glycol, polypeptoids and poly (2-oxazoline)s.</a> Biomaterials. 35, 4848(2014).</li>
<li>Azqueta, A., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+comet+assay%3A+a+comprehensive+guide+to+measuring+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair.</a> Arch. Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).</li>
<li>Scherner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+application+of+tissue-engineered+blood+vessels+of+bacterial+cellulose+as+small+arterial+substitutes%3A+proof+of+concept%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo application of tissue-engineered blood vessels of bacterial cellulose as small arterial substitutes: proof of concept.</a> J. Surg. Res. 189, 340(2014).</li>
<li>Bodin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cultivation+conditions+on+mechanical+and+morphological+properties+of+bacterial+cellulose+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes.</a> Biotechnol Bioeng. 97, 425(2007).</li>
<li>Zaborowska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bacterial+cellulose+as+a+potential+scaffold+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 6, 2540(2010).</li>
<li>Karimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+mechanical+properties+of+the+umbilical+vein+and+umbilical+artery+under+uniaxial+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Artery+Res%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the mechanical properties of the umbilical vein and umbilical artery under uniaxial loading.</a> Artery Res. 8, 51(2014).</li>
<li>Lina, F., Ping, Z., Shengmin, Z., Guang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+bacterial+nanocellulose-based+uniform+wound+dressing+for+large+area+skin+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+C%22%5BJournal%5D)">Evaluation of bacterial nanocellulose-based uniform wound dressing for large area skin transplantation.</a> Mater. Sci. Eng. C. 33, 2995(2013).</li>
<li>Olsson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+flexible+magnetic+aerogels+and+stiff+magnetic+nanopaper+using+cellulose+nanofibrils+as+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Making flexible magnetic aerogels and stiff magnetic nanopaper using cellulose nanofibrils as templates.</a> Nature Nanotech. 5 (8), 584-588 (2010).</li>
<li>Torre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+force+microscopy+and+energy+loss+imaging+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Magnetic force microscopy and energy loss imaging of superparamagnetic iron oxide nanoparticles.</a> Sci. Rep. 1 (202), 1-8 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De dikte en afmeting van de BNC vlies kan eenvoudig worden gemanipuleerd door het veranderen van de incubatietijd en de grootte van de kolf waarin zij gekweekt in statische kweek. De microproperties van de BNC, zoals poreusheid, kan worden gewijzigd door het veranderen van de zuurstof verhouding in de statische kweek. Hogere zuurstofconcentraties opleveren taaiere BNC 11. A. Bodin en medewerkers geproduceerde buizen BNC met een barstdruk tot 880 mm Hg door verandering van de zuurstof verhouding van zuurstof t...

De bacterian nanocellulose (BNC) wordt gesynthetiseerd door Acetobacter xylinum stam, ook bekend als Gluconacetobacter xylinus en in de vorm van films of pellicles op de lucht-water grensvlak afgezet tijdens stationaire kweek. Deze BNC pellicles nemen de vorm van de container waar zij worden gekweekt, en de dikte is afhankelijk van het aantal dagen in kweek. A. xylinus gebruikt de glucose in het medium voor de synthese van de cellulose microfibrillen door een proces van polymerisatie en daaropvolgende kristallisatie. De polymerisatie van de glucose residuen bij de bacteriële extracellulaire membraan wanneer glucanketens geëxtrudeerd uit één poriën verdeeld over de celenvelop uitgevoerd. De kristallisatie van de cellulose microfibrillen plaatsvindt in de extracellulaire ruimte onder vorming van glucaanketen vellen door van der Waals binding, gevolgd door het stapelen van de vellen door H-binding 1. Magneetic nanodeeltjes geïntegreerd zijn BNC matrix kan gemakkelijk worden gemanipuleerd door een extern magnetisch veld om de kracht die nodig is om directe en beperken gladde spiercellen (SMC) met magnetische nanodeeltjes, toenemen met de aangetaste locatie van de vaatwand. Deze strategie houdt de SMC buurt van andere weefsels, en houdt de cellen in plaats tegen de kracht uitgeoefend door de bloedstroom. Het is aangetoond dat SMC&#39;s een belangrijke rol spelen bij de vasoelasticity van het bloedvat, wanneer zij deel overvloedige lagen voornamelijk in de tunica media 2. De werkwijze voor de synthese van MBNC omvat BNC vlies ondergedompeld en geroerd in een oplossing van ijzer (III) chloride hexahydraat en ijzer (II) chloride-tetrahydraat bij 80 ° C. Ammoniumhydroxide toegevoegd ijzeroxide nanodeeltjes binnen de BNC maas vormen. De toevoeging van ammoniumhydroxide verandert de kleur van de oplossing van oranje naar zwart. De IONPs compact bij elkaar langs de BNC fibrils met een niet-uniforme verdeling. Dit protocol is gericht op het ontwerp van een bacteriële nanocellulose nanodeeltje vlies, die wij genoemd magnetisch bacteriële nanocellulose (MBNC), die bedoeld is om te gebruiken als vervanging voor ontbrekende, beschadigd of verwond kleine diameter bloedvaten. HS Barud en collega&#39;s hebben onlangs een soortgelijke werkzaamheden van een BNC-gebaseerde flexibele magnetische papier te produceren door het mengen van BNC pellicles in een stabiele waterige dispersie van PEG en superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes 3 gepubliceerd. Hier beschrijven we de productie van bacterieel cellulose en impregnering in situ met magnetische nanodeeltjes. Een cytotoxiciteit-assay gebaseerd op detectie van enkelvoudige DNA breuken werd gebruikt om de biocompatibiliteit van de BNC en MBNC pellicles testen.

<table><tbody><tr><td>Glucoacetobacter xylinus</td><td>ATCC</td><td>700178</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296-500G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol Bioxtra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9546-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gist Extract</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriologisch Pepton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide, 50% Oplossing In Water</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127-100G</td><td></td></tr><tr><td>Iron(III) Chloride Hexahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236489-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Hydroxide&nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>6665-46</td><td></td></tr><tr><td>Poly(Ethylene Glycol), Gemiddelde Mn 400</td><td>Sigma Aldrich</td><td>202398-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Iron (II) chloride tetrahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44939-250G</td><td></td></tr><tr><td>Beschikbare Petri-schaal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR452000</td><td></td></tr><tr><td>Beschikbare Inoculating Loop</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-604&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Watervrij Calciumsulfaat</td><td>W.A. Hammond Drierite&nbsp;</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorium pipeting naald met 90&deg; stompe uiteinden</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CAD7937-12EA</td><td></td></tr><tr><td>pH test strips&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4786-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Rond-bodem drie hals hoek type destillatiekolf</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4965250</td><td></td></tr><tr><td>Silicone olie voor oliebaden</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85409-250ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Droogbuis</td><td>Chemglass</td><td>CG-1295-01</td><td></td></tr><tr><td>Septum Stopper, Sleeve Type</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-98</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische roerbar</td><td>Chemglass</td><td>CG-2001-05</td><td></td></tr><tr><td>Condenser</td><td>Chemglass</td><td>CG-1218-01</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuurregelaar</td><td>BriskHeat</td><td>SDC120JC-A</td><td></td></tr><tr><td>Roerende Hotplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-49SH&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Comet Assay Kit</td><td>Trevigen</td><td>4250-050-K</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>bio-AFM</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard 4a BioScience AFM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoindenter</td><td>Micro Materials Ltd</td><td>Multi-module mechanische tester&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Scanning electron microscopy (SEM)</td><td>Hitachi High Technologies America</td><td>Hitachi S-4800</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricage van een gefunctionaliseerd magnetic bacterial nanocellulose met ijzeroxide nanodeeltjes

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In deze studie wordt bacteriële nanocellulose (BNC) geproduceerd door de bacteriën Gluconacetobacter xylinus gesynthetiseerd en geïmpregneerd in situ met ijzeroxide nanodeeltjes (IONP) (Fe 3 O 4) een magnetische bacteriële nanocellulose (MBNC) werd verkregen. De synthese van MBNC is nauwkeurig en specifiek meerstapsproces. Kort samengevat, bacteriële nanocellulose (BNC) pellicles zijn gevormd uit bewaard G. xylinus stam volgens onze experimentele eisen van de grootte en morfologie. Een oplossing van ijzer (III) chloride hexahydraat (FeCl3 · 6H 2 O) en ijzer (II) chloride-tetrahydraat (FeCl2 · 4H 2 O) met een 2: 1 molaire verhouding wordt bereid en verdund in gedeoxygeneerd zuiver water. Een BNC vliesje wordt vervolgens ingebracht in het vat met de reactanten. Dit mengsel wordt geroerd en bij 80 ° C in een silicone oliebad en ammoniumhydroxide (14%) verhit wordt vervolgens druppelsgewijs toegevoegd aan het precipitaatferro-ionen in de BNC-mesh. Deze laatste stap maakt het vormen van in situ magnetiet nanodeeltjes (Fe 3 O 4) in de bacteriële nanocellulose gaas om magnetische eigenschappen te BNC vlies te verlenen. Een toxicologisch assay werd gebruikt om de biocompatibiliteit van het BNC-IONP vliesje evalueren. Polyethyleenglycol (PEG) werd gebruikt om de IONPs dekken om hun biocompatibiliteit te verbeteren. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) foto&#39;s toonden aan dat de IONP voorkeur waren in het fibril interlacing ruimten van de BNC matrix, maar sommige van hen werden ook gevonden langs de BNC linten. Magnetic Force Microscopy metingen uitgevoerd op de MBNC gedetecteerde aanwezigheid magnetische domeinen met een hoge intensiteit en zwak magnetisch veld, de bevestiging van de magnetische aard van de MBNC vlies. Young&#39;s modulus waarden verkregen in dit werk zijn ook in redelijke overeenstemming met die gerapporteerd voor verschillende bloedvaten in eerdere studies.

De incubatietijd van G. xylinus was een totaal van 9 dagen, maar de pellicles begon vroegere vorm en waren duidelijk na ongeveer 2 dagen. Het macroscopische uiterlijk van de BNC wordt weergegeven in figuur 1, waarvan de vorm nabootst die van de schaal gekweekt kweek. Figuur 2 beschrijft de werkwijze voor het produceren BNC-IONP pellicles, die de belangrijkste stappen van de bovenstaande protocol en samenvattingen de configuratie...

Hier presenteren we een protocol om bacteriële nanocellulose (BNC) magnetisch te maken voor toepassingen bij de reconstructie van beschadigde bloedvaten. De BNC werd gesynthetiseerd door de G. xylinus-stam. Aan de andere kant werd de magnetisatie van de BNC gerealiseerd door in situ precipitatie van Fe2+ en Fe3+ ijzerionen binnenin het BNC-maashek.

Fabricage van een gefunctionaliseerd Magnetic Bacterial Nanocellulose met ijzeroxide Nanodeeltjes

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Het algemene doel van deze procedure is het synthetiseren van bacteriële nanocellulose, oftewel BNC, en deze magnetisch maken door in situ impregnatie met ijzeroxide-nanodeeltjes. Magnetische BNC-membranen zijn ontworpen om gemagnetiseerde cellen lokaal aan te trekken en vast te houden tegen de hemodynamische stroom in. Het belangrijkste voordeel van de magnetische BNC die in deze procedure wordt gesynthetiseerd, is dat het een minimaal invasieve behandeling nabij hersenaneurysma's mogelijk maakt.Conventionele behandelingen van hersenaneurysma's, zoals clipping en neurale en vasculaire kernemulisatie, zijn invasief en traumatisch en niet geschikt voor de meeste patiënten met verhoogde risico's. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van vasculaire aandoeningen, omdat vasculaire grafts, gemaakt van magnetische scaffolds, de genezing kunnen versnellen door de celretentie op de plek van het letsel te verbeteren. Begin deze procedure met de bereiding van het vloeibare kweekmedium zoals beschreven in het tekstprotocol.Breng twee milliliters van het vloeibare kweekmedium over in elke put van een 24-wells weefselkweekplaat. Neem met een entnaald twee kolonies uit de in de vorige stap geënt petrischalen en plaats deze in de eerste put van de weefselkweekplaat. Herhaal dezelfde procedure voor de resterende 23 putten.Incubeer de weefselkweekplaat gedurende zeven dagen bij 30 °C. Dit levert in totaal 24 BNC-pellikels op met een diameter van 16 mm en een dikte van ongeveer 2 tot 3 mm. Verzamel de BNC-pellikels uit het groeimedium en steriliseer deze gedurende één uur bij 50 °C in 200 ml van een één procent natriumhydroxide-oplossing om alle sporen van G.Xylinus te verwijderen.Gooi de oplossing weg en voeg 200 milliliters vers bereide een procent natriumhydroxide-oplossing toe. Herhaal hetzelfde proces nogmaals of totdat de BNC-pellikels in de oplossing een doorschijnend uiterlijk krijgen. Spoel de BNC-pellikels drie keer af met water en bewaar ze in ultrapuur water bij kamertemperatuur.Zorg ervoor dat de BNC-pellikels volledig ondergedompeld zijn in het water en op geen enkel moment mogen uitdrogen. Autoclaveer vervolgens de BNC-pellikels bij 121 °C gedurende 20 minuten. Om met de synthese te beginnen, wordt 1000 mL ultrapuur water gespoeld met stikstofgas om alle opgeloste zuurstof in het water te verwijderen en te vervangen door stikstof.Gebruik een driehalsronde kolf om een oplossing te bereiden met een molaire verhouding van 2:1 van ijzer(III)chloride-hexahydraat en ijzer(II)chloride-tetrahydraat, verdund met zuurstofvrij water van hoge zuiverheid. Gebruik twee halzen van het vat om een constante instroom en uitstroom van stikstofgas te waarborgen door de stikstofgasvoorziening aan te sluiten op een naald die door een septumstop is gestoken en in de hals van het vat is bevestigd. Plaats één BNC-pellikel bij de reagentia in het vat.Zorg ervoor dat het monster volledig ondergedompeld is in de vloeistof. Vul vervolgens alle glasverbindingen met vacuümvet. Verbind de resterende hals van het vat met een condensatorbuis die is voorzien van een droogbuis gevuld met watervrij calciumsulfaat.Laat water door de condensatorbuis stromen. Verwarm vervolgens de oplossing in een siliconenoliebad tot 80 °C met een roerplaat en handhaaf deze temperatuur. Gebruik een kleine magnetische roervis om de reactanten 5 minuten lang te mengen bij 350 R.P.M.Zorg ervoor dat de BNC voldoende is geïmpregneerd met de ijzer(II)-oplossing en dat de reactanten volledig zijn opgelost. Verhoog de roersnelheid naar 700 R.P.M. Voeg gedurende een tijdsinterval van vijf minuten vijf milliliter ammoniumhydroxide toe aan de 10 milliliter ijzer(II)-oplossing met behulp van een pipetteernaald die door een septumstop is gestoken. Na toevoeging van de ammoniumhydroxide verandert de kleur van de oplossing van geeloranje naar zwart.Blijf de oplossing nog vijf minuten roeren bij 80 °C. Vermijd roeren op hoge snelheid om de integriteit van het monster te waarborgen. Verlaag de temperatuur van de oplossing naar 30 °C met de temperatuurregeling aan de onderzijde van de roerplaat en blijf nog vijf minuten roeren.Zet vervolgens de warmteplaat uit. Op dit punt zijn de ijzeroxide-nanodeeltjes in het BNC-netwerk geïncorporeerd. Laat het mengsel daarna afkoelen tot kamertemperatuur en breng het over naar een kolf om de magnetische nanodeeltjes, of MNPs, en BNC te scheiden met een sterke permanente magneet.Houd hiervoor de magneet dicht bij het vat om de MNPs en BNC op hun plaats te houden terwijl het supernatant wordt afgegoten. Resuspendeer de MNPs en BNC in 100 milliliters water. Schud de oplossing voorzichtig om alle MNPs te verwijderen die niet sterk in de BNC zijn geïncorporeerd.Decanteer vervolgens het supernatant opnieuw door de MNPs en de BNC op hun plaats te houden met behulp van de magneet. Was de MNPs en de BNC meerdere keren met water totdat het supernatant een neutrale PH bereikt, gemeten met een colorimetrische strip. Scheid de magnetisch gefunctionaliseerde BNC, of MBNC, met een pincet van de MNPs en spoel de MBNC's meerdere keren met water uit totdat het water helder is.Steriliseer de MBNC door deze gedurende de nacht bloot te stellen aan UV-straling. Bewaar de MBNC in 20 milliliters gedeoxideerd water van hoge zuiverheid dat gedurende 20 minuten is geautoclaveerd bij 120 degrees Celsius. Dompel het monster aseptisch onder in één procent polyethyleenglycol, of PEG, en roer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Coating met PEG verbetert de biocompatibiliteit en stabiliteit van de ijzeroxide-nanodeeltjes die in de BNC zijn afgezet, aangezien deze over het driedimensionale netwerk van de MBNC worden verdeeld.Het macroscopische uiterlijk van de BNC wordt hier getoond. Het kweekvat bepaalt de vorm van de pellikels. Scanning elektronenmicroscopie onthult dat fijne linten de microstructuur van de BNC vormen met een diameter van ongeveer 50 nanometers, welke open poriën creëren over het gehele netwerk.Magnetische functionalisering van de BNC resulteert in een minder compacte fibrilstructuur vergeleken met de BNC. De ijzeroxide-nanodeeltjes bevinden zich bij voorkeur tussen de poriën die zijn gevormd door de verstrengeling van de fibrillen. Topografie via atoomkrachtmicroscopie detecteerde de magnetische krachtgradiënt, gekenmerkt door twee domeinen over het MBNC-oppervlak.Een magnetisch veld met een hoge intensiteit, in het geel weergegeven, en een magnetisch veld met een lage intensiteit, in het groen weergegeven. De aanwezigheid van magnetische domeinen, waargenomen met MFM, wordt bevestigd door gegevens van een vibrating sample magnetometer, waaruit blijkt dat de ijzeroxide-nanodeeltjes superparamagnetisch zijn, waardoor de BNC magnetisch wordt. De integriteit van het DNA in menselijke gladde spiercellen van de aorta blijft behouden na een incubatieperiode van 24 uur, bij kweek in afwezigheid en aanwezigheid van BNC of MBNC, zoals blijkt uit de vergelijking met cellen die een behandeling met waterstofperoxide hebben ondergaan.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u bacteriële nanocellulose magnetisch kunt maken voor toepassingen bij de reconstructie van beschadigde bloedvaten. We kregen het idee voor deze methode toen we een dichtheidsgradiënt van magnetische nanodeeltjes wilden induceren die gedispergeerd moesten worden binnen de complexe matrix van het netwerk van bacteriële nanocellulose. Om de ijzeroxide-nanodeeltjes in dit netwerk te integreren, was het noodzakelijk dat we een specifieke methode toepasten tijdens de synthese van de BNC.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat er een aantal complexe stappen zijn om ijzeroxide-nanodeeltjes in BNC te impregneren.

fabrication-functionalized-magnetic-bacterial-nanocellulose-with-iron

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Source: Arias, S. L., et al. Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the in situ synthesis of magnetite nanoparticles within a bacterial nanocellulose pellicle produced by Gluconacetobacter xylinus. It explains how magnetic bacterial nanocellulose is generated through iron ion infusion, alkaline precipitation, and purification.

Generation of Magnetite-Embedded Bacterial Nanocellulose Pellicles

Source: Arias, S. L., et al. Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates the production of nanocellulose by culturing cellulose-producing bacteria in a nutrient medium containing mannitol. The bacteria metabolize mannitol into glucose, which is then polymerized and extruded as glucan chains that crystallize into cellulose sheets, forming a three-dimensional matrix at the air–liquid interface. The...

Preparation of Bacterial Nanocellulose Pellicles from Cellulose-Producing Bacteria

Gerichte celbezorging is nuttig in een verscheidenheid aan biomedische toepassingen. Het doel van dit protocol is om superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes (SPION) te gebruiken om cellen te labelen en daardoor magnetische celaanpakbenaderingen mogelijk te maken voor een hoge mate van controle over celbezorging en -lokalisatie.

Cel Labeling en Targeting met superparamagnetische ijzeroxide Nanodeeltjes

Er wordt een protocol voor de synthese en kationisatie van kobalt-gedopeerd magnetoferritine gepresenteerd, evenals een methode om stamcellen snel te magnetiseren met gekationiseerd magnetoferritine.

Synthese van gekationiseerde Magnetoferritin voor ultrasnelle magnetisatie van Cells

In dit werk beschrijven we een protocol om ijzer nanodraden te fabriceren, met inbegrip van de vorming van het poreuze aluminiumoxide dat wordt gebruikt als de sjabloon, elektrodepositie in sjablonen met behulp van elektrolytoplossing, en de afgifte van de nanodraden in de oplossing.

Ijzer-Nanodraad fabricage door nano-poreus geanodiseerd aluminium en de karakterisering ervan

Dit werk beschrijft protocollen voor de bereiding van magnetische nanodeeltjes, de coating met SiO2, gevolgd door de amine functionalisatie met (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) en de vermenging met deferoxamine met behulp van een succinyl moiety als linker. Een diepe structurele karakteriseringsbeschrijving en een vangstbacteriëntest met behulp van Y. enterocolitica voor alle tussenliggende nanodeeltjes en de uiteindelijke conjugaat worden ook in detail beschreven.

Synthese van gefunctionaliseerde magnetische nanodeeltjes, hun vervoeging met de Siderophore Feroxamine en de evaluatie voor bacteriën detectie

IJzeroxide nanodeeltjes worden gesynthetiseerd via een nonaqueous sol gel procedure en bedekt met anionische korte moleculen of polymeer. Het gebruik van magnetometrie voor het monitoren van de integratie en biotransformaties van magnetische nanodeeltjes in menselijke stamcellen wordt aangetoond met behulp van een trillende monstermagnetometer (VSM).

Magnetometrie gebruiken om cellulaire integratie en daaropvolgende biologische afbraak van chemisch gesynthetiseerde ijzeroxide nanodeeltjes te monitoren

In dit werk bieden we een protocol om magnetische nanomaterialen te biofunctionaliseren met antilichamen voor specifieke celtargeting. We gebruiken bijvoorbeeld ijzeren nanodraden om kankercellen aan te pakken.

Biofunctionalisering van magnetische nanomaterialen

Dit werk presenteert een bottom-up benadering van de engineering van lokale magnetische krachten voor controle van neuronale organisatie. Neuron-achtige cellen geladen met magnetische nanodeeltjes (MNP's) worden bovenop geplateerd en bestuurd door een micro-patroon platform met loodrechte magnetisatie. Ook beschreven zijn magnetische karakterisering, MNP cellulaire opname, cel levensvatbaarheid, en statistische analyse.

Fabricage van magnetische platforms voor micronschaalorganisatie van onderling verbonden neuronen

Dit protocol benadrukt een methode om snel de biocompatibiliteit van een kristallijne nanocellulose (CNC) / agarose composiet hydrogel biomateriaal inkt met muis beenmerg-afgeleide mestcellen te beoordelen in termen van cel levensvatbaarheid en fenotypische expressie van de celoppervlak receptoren, Kit (CD117) en hoge affiniteit IgE receptor (FcεRI).

Fabricage van een kristallijne nanocellulose ingebedde agarose biomateriaal inkt voor beenmerg-afgeleide mestcelkweek

Leer magnetisch bacterieel nanocellulose (BNC) te synthetiseren met ijzeroxide nanodeeltjes voor vasculaire toepassingen. Deze methode biedt een minimaal invasieve behandeling voor hersenaneurysma's en verbetert celretentie.

Fabricage van een gefunctionaliseerd Magnetic Bacterial Nanocellulose met ijzeroxide Nanodeeltjes

Meer video's verkennen