Fase Diagram Analyse Met behulp van Magnetic Beads als vloeibare dragers

Het algemene doel van het volgende experiment is het analyseren van het overdrachtsvolume tussen aangrenzende vloeistofsegmenten binnen een lab-on-a-chip-apparaat met behulp van magnetische kralen. Dit wordt bereikt door het apparaat te vervaardigen met hydrofobe slang, gevuld met een spuitenpomp om meerdere vloeistofsegmenten te creëren die gescheiden zijn door een luchtklep, waarbij zowel magnetische kralen als een fluorescerende kleurstof in een van de vloeistoffen zijn opgenomen. Als tweede stap wordt de fluorescentie-intensiteit van de aangrenzende vloeistofsegmenten gemeten met een microscoop nadat elke overdracht van de magnetische kralen is uitgevoerd met een externe magneet.

Vervolgens wordt een numerieke analyse uitgevoerd op deze fluorescentie-intensiteitsmetingen om het overdrachtsvolume van de magnetische beads te berekenen. De resultaten laten zien dat de analyse van de faseovergang in een multi-component systeem bestaande uit twee vloeistoffen haalbaar is, dankzij de mogelijkheid om magnetische beads te gebruiken als methode voor het overbrengen van vloeistofvolumes in microliter-grootte tussen aangrenzende reservoirs. Zoals ik hoop dat u vandaag zult zien, werken we met deze zeer boeiende en eenvoudige techniek waarbij magnetische beads worden gebruikt voor het overbrengen van vloeistoffen binnen een eenvoudige buis, in plaats van complexere conventionele microfluïdische circuits.

We hebben deze techniek aanvankelijk toegepast voor het onderzoek naar interface-effecten tussen toegelaten vloeistoffen, en we breiden dit nu uit naar andere toepassingen, waaronder diagnostische analyse van volbloed, het scheiden van eiwitten van rode bloedcellen, urineanalyse, immunoassays en dergelijke. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals het gebruik van microfluïdische kanalen, is dat deze eenvoudig is en een kosteneffectieve fabricage kent. Het biedt een hoge gebruikersvariabiliteit tussen verschillende soorten experimenten en levert consistente resultaten op.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in toepassingen die de verplaatsing van minimale, piekvolumes vereisen, kan ze ook worden toegepast op andere systemen zoals bloedscheiding, drugtargeting en contrastmiddelen. Om de buis voor te bereiden, snijd eerst de slang in segmenten van 15 centimeter, hang de buissegmenten verticaal op met tape en plaats een papieren handdoek onder de buizen om de overtollige fluorpolymeeroplossing op te vangen. Injecteer 100 µL van de fluorpolymeeroplossing met een pipet in de bovenste opening van elk buissegment, zodanig dat de oplossing in contact komt met de gehele omtrek van de binnenwand.

Laat de buissegmenten één uur hangen om eventuele overtollige hoeveelheden fluorpolymeeroplossing te verwijderen. Plaats de buissegmenten vervolgens gedurende één uur in een oven op 100 graden Celsius om de fluorpolymeercoatingslaag te harden. Bereid daarna de verdunde magnetische bolletjesoplossing voor door een monsterbuisje van 20 milliliter op een microbalans te plaatsen en de balans nul te stellen.

Schud de container met de magnetische bolletjesoplossing en neem vervolgens 0,6 milliliters op met een micropipet. Breng de opgezogen oplossing over in het monsterbuisje op de balans en voeg 0,4 milliliters gedestilleerd water toe aan het monsterbuisje. Bereid daarnaast de fluorescente kleurstof voor door 0,02 gewichtsprocent kleurstof op te lossen in gedeïoniseerd water en de oplossing gedurende één minuut te vortexen.

Om het slangmechanisme voor te bereiden, plaatst u een female lure lock-connector op één uiteinde van de slang. Plaats de slang in een lure lock-spuit met een volume van 3 ml en een schaalverdeling van 0,1 ml. Plaats de spuit in de spuitpomp en stel de toevoersnelheid in op 2 ml per uur.

Vortex de container met de magnetische kraal-oplossing voordat er 20 µL in de buis wordt aangebracht met een spuitpompsysteem. Nadat de vloeistofinjectie in de testkamer is voltooid, wordt er 6 µL lucht uit de buis teruggetrokken. Dit luchtvolume zal later een klep vormen tussen de twee vloeistofsegmenten.

Zodra de invoeging van de luchtspleet is voltooid, begin met het opzuigen van 180 µL vloeistof met fluorescerende kleurstof. Plaats een tweede vrouwelijke Luer-lock-connector op het andere uiteinde van de buis en verwijder het buisapparaat uit de spuit. Plaats vervolgens Luer-lock-doppen op beide uiteinden van het apparaat.

Meet de initiële fluorescentie-intensiteit van de testkamer en het reservoir met behulp van de omgekeerde microscoop. Plaats het apparaat bovenop de kubusmagneet zodanig dat de magnetische kralen zich allemaal verzamelen in één gebied in de testkamer. Verplaats de kralen naar het reservoir door het apparaat over de magneet heen te bewegen.

Zodra de cluster magnetische kraaltjes door de luchtspleet naar het reservoir is overgebracht, worden de magnetische kraaltjes bewogen door het apparaat bovenop de magneet te plaatsen en te draaien om de vloeistof die in de cluster gevangen zit vrij te maken, totdat de homogenisatie van het reservoir is voltooid. Plaats het apparaat vervolgens bovenop de magneet zodanig dat alle magnetische kraaltjes in het reservoir zich in één gebied concentreren. Breng de cluster magnetische kraaltjes terug naar de testkamer.

Zodra de cluster de testkamer bereikt, worden de magnetische kralen geagiteerd door het apparaat bovenop de magneet te plaatsen en te draaien. Laat de vastgehouden fluorescerende vloeistof vrij totdat de homogenisatie van de testkamer is voltooid. Meet de fluorescentie-intensiteit van zowel de testkamer als het reservoir met behulp van de omgekeerde microscoop.

Herhaal deze stappen totdat beide vloeistofsegmenten convergeren naar vergelijkbare fluorescentie-intensiteiten. Om het buisjesapparaat voor te bereiden, plaatst u een female lure lock op één uiteinde van de buis en plaatst u de buis in een lure lock-spuit. Plaats vervolgens de spuit in de spuitpomp en stel de toevoersnelheid in op 2 mL per uur.

Voeg 20 µL van een één-op-één mengsel van magnetische beads in water met C 12 E 5 toe aan de buis met behulp van een spuitpompaanzuiging. Nadat de vloeistofinjectie in de testkamer is voltooid, worden er 6 µL lucht in de buis aangezogen voor de invoering van een luchtspleet. Begin met het aanzuigen van 180 µL pure C 12 E 5 surfactant om de optiek in te stellen.

Verplaats eerst de spuitpomp met het slangmechanisme zodanig dat de testkamer met magnetische kralen in focus is met de stereomicroscoop, waarbij kruispolarisatoren worden gebruikt. Plaats ter verbetering van het contrast tussen de neergeslagen vaste fase en de vloeibare fase een vel polarisatiefolie bovenop een LED-lichtbron. Schuif de LED-lichtbron onder de aan de spuitpomp bevestigde buis.

Bevestig een tweede polarisatiefilm met tape aan de lens van de stereomicroscoop en zorg ervoor dat de twee polarisatiefilms een hoek van 90 graden ten opzichte van elkaar hebben. Plaats de kubusmagneet naast de testkamer terwijl de magneet op een standaard is gemonteerd. Zodra de magnetische kralen een cluster vormen, begin dan met het pompen van vloeistoffen in de buis met een stroomsnelheid van twee milliliters per uur, zodat het cluster magnetische kralen vanuit de testkamer over de luchtspleet naar de reservoirkamer voor surfactanten wordt verplaatst.

Wanneer de cluster van magnetische kralen het midden van de reservoirkamer bereikt, wordt het pompen met de spuitenpomp gestopt. Verplaats de kubusmagneet weg van de buis, zodat de magnetische kralen scheiden en de diffusietijd van de vloeistof die in de cluster van magnetische kralen gevangen zit, wordt verminderd. Zodra de diffusie en faseovergang van de vloeistof voltooid zijn, wordt de magneet teruggeplaatst op de oorspronkelijke positie bij het reservoir, zodat de magnetische kralen weer een cluster vormen.

Trek met de spuitenpomp de vloeistoffen zodanig op dat de cluster van magnetische kraaltjes vanuit het surfactantreservoir over de luchtspleet wordt verplaatst en terugkeert in de testkamer. Zodra de cluster magnetische kraaltjes het middenpunt van de testkamer heeft bereikt, wordt de spuitenpomp gestopt en de kubusmagneet van de buis weg bewogen. Wanneer de diffusie en faseovergang van de vloeistof voltooid zijn, wordt de magneet teruggeplaatst op de oorspronkelijke positie bij het reservoir, zodat de magnetische kraaltjes zich weer tot een cluster vormen.

Herhaal deze stappen totdat de testkamer een faseovergang vertoont. Hier is een afbeelding te zien van de magnetische korrels in water en het niet-ionische surfactant C 12 E five binnenin de hydrofobe buis. Tijdens het initiële overdrachtsproces van de magnetische korrels worden de korrels op hun plaats gehouden met behulp van een externe kubusmagneet.

Terwijl de vloeistoffen hier naar links worden gepompt, verlaten de beads de testkamer en treden ze het C 12 E 5 binnen. Zodra de magnetische beads binnenkomen, begint het surfactantwater weg te diffunderen van de structuur van de magnetische beads. Nadat de magnetische beads vijf seconden in de surfactantkamer zijn geweest, is er bij het tien-secondenmerk slechts een kleine hoeveelheid faseovergang zichtbaar.

De magnetische kralen zijn volledig omgeven door het surfactant. De faseovergang gaat door tot het 92ste markeerpunt bij vier minuten. De faseovergang neemt toe bij negen minuten.

De horizontale faseovergang begint af te nemen terwijl de structuur verticaal groeit. Waar de faseovergang na 17 minuten drastisch in omvang is gekrompen, is na 25 minuten nog slechts een kleine hoeveelheid van de faseovergang zichtbaar. Hier is de beginconditie van een water C 12 V vijf testkamer met magnetische kralen in het apparaat voordat de surfactant werd overgebracht.

Na zes roundtrip-transfers trad er een faseovergang op. Omgekeerd werd er geen faseovergang waargenomen wanneer er geen magnetische beads in het apparaat zaten, wat bewijst dat de geobserveerde resultaten het gevolg waren van carry-over van magnetische beads en niet van de vloeistof. Het vastplakken aan de binnenwanden van de buis tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Het is belangrijk om voldoende tijd in te ruangen voor het diffusieproces wanneer vloeistoffen tussen aangrenzende reservoirs worden overgebracht volgens deze procedure. Andere opties, zoals het gebruik van een elektromagnetische agitatie, kunnen in ons systeem worden geïntegreerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe het diffusieproces kan worden versneld en hoe de handmatige manipulatie kan worden geminimaliseerd. Om dit in context te plaatsen: deze zeer eenvoudige techniek, die in essentie bestaat uit een plastic buis, magnetische kralen en een externe magneet, is toegepast op de scheiding van verschillende vloeistoffen en het verkennen van hun fasediagramruimte.

De veelzijdigheid en eenvoud van de techniek zullen echter van pas komen bij veel andere toepassingen, voornamelijk op het gebied van diagnostische analyse van verschillende vloeistoffen. Door magnetische kralen te gebruiken om kleine volumes te transporteren, hetzij direct of via functionalisering van de magnetische kralen, kunnen we de componenten van de vloeistofmonsters analyseren. En dit is toepasbaar in uiteenlopende gebieden.

Bijvoorbeeld de scheiding en analyse van eiwitten uit rode bloedcellen in volbloed, op dezelfde wijze in urine en vele andere vloeistoffen die op deze manier geanalyseerd kunnen worden met een eenvoudige techniek, zonder de complexiteit en kosten die verbonden zijn aan de conventionele fabricage van microfluïdische apparaten.