Name: Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer hoe u vloeistofchromatografie en selected reaction monitoring (SRM) gebruikt voor absolute proteïnekwantificering in complexe biologische monsters. Deze methode biedt een snel en kosteneffectief alternatief voor immunoassays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van de NIH, Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Absolute eiwit kwantificering is essentieel voor een zeer divers aanbod van biomedische toepassingen zoals biomarker validatie en signaaltransductiepad modellering. Onlangs, gerichte proteomics met behulp van LC-SRM heeft geprofiteerd van verbeteringen in tal van technologieën, waaronder peptide standaard voorbereiding, HPLC, QqQ-MS en LC-SRM data-analyse. Bijgevolg is het uitgegroeid tot een krachtig alternatief voor immunoassays. Immunoassays kunnen zeer gevoelig en high-throughput, maar ontwikkeling van een robuust i...

Proteomische experimenten massaspectrometrie (MS) gebruikt kan worden ontworpen om hetzij niet-gerichte (shotgun) of gerichte methoden. Discovery proteomics in het algemeen via bottom-up shotgun MS, hetzij een traditionele data-afhankelijke acquisitiemodus, of door één van de recent ontwikkelde data-onafhankelijke technieken (bijvoorbeeld MS E, SWATH) 1,2. Shotgun proteomics is een krachtig hulpmiddel voor high-throughput peptide identificatie en relatieve kwantificatie, maar het is doorgaans ongeschikt voor absolute kwantificering of targeting kleine gedefinieerd sets (~ tientallen) van eiwitten. De MS methode meestal gebruikt voor gerichte proteomics is selected reaction monitoring (SRM) vanwege zijn hoge gevoeligheid, snelheid en dynamisch bereik 3-5. Alternatieven voor SRM omvatten parallelle reactie monitoring, die gebruik maakt van een hoge resolutie, volledige MS scannen 6. SRM wordt gewoonlijk uitgevoerd met een nano-flow galmsed-phase high-performance liquid chromatography (nano-RP-LC) instrument gekoppeld met een nano-electrospray ionisatie (nano-ESI) ion source verbonden met een drievoudige quadrupool massaspectrometer (QqQ-MS). In een typisch experiment worden monstereiwitten proteolytisch geknipt en de resulterende peptiden chromatografisch gescheiden gedesorbeerd en geïoniseerd. De resulterende voorloper ionen m / z gefilterd door de eerste quadrupool (Q1) en gefragmenteerde in de tweede quadrupool (Q2) door botsing ze met een botsing gas. Het resulterende fragment ionen m / z-gefilterd in de derde quadrupool (Q3) en gekwantificeerd met een dynode. Elke precursor en fragment ionenpaar wordt aangeduid als een overgang, en elke overgang wordt gecontroleerd op een bepaalde periode (de wachttijd; meestal 2-50 msec). In LC-SRM, de QqQ-MS wordt naar het vooraf gedefinieerde lijst van overgangen (de duty cycle typisch ≤3 sec) en een chromatogram van elke overgang wordt geproduceerd. Alternatieve strategven voor eiwithoudende kwantificering maken gewoonlijk gebruik van immunoassays zoals dot blots, Western blots, ELISA&#39;s, antilichaam microarrays, omgekeerde fase proteïne microarrays, microfluïdische immunoassays, digitale ELISA en microbolletjes gebaseerde immunoassays 7. De beste immunoassays kunnen aanzienlijk gevoeliger dan LC-SRM en monsterdoorvoer immunoassays aanzienlijk hoger dan die van LC-SRM 5 zijn. Echter, de ontwikkeling immunoassays duur en / of tijdrovend en de resulterende assays kunnen kwetsbaar voor kruisreactiviteit en / of interferentie, onverenigbaar met cel / weefsel lysis / homogeniseren methoden en / of niet vatbaar multiplexen 5,8. Sommige van deze problemen kunnen worden aangepakt door het koppelen van antilichaam en MS-gebaseerde technieken. Zo kunnen doeleiwitten worden verrijkt met behulp van immunoprecipitatie voorafgaand aan proteolyse en LC-SRM 9-12. Als alternatief kan de SISCAPA techniek maakt gebruik van immunoprecipitatie na proteolyse in het peptide level 13,14. Naast strategieën immunoenrichment, kan immunodepletie hoge overvloed eiwitten worden gebruikt om LC-SRM gevoeligheid te verhogen door het verminderen van interferentie door coeluting analyten 15,16. MS-eiwitten gekwantificeerd kan worden onderverdeeld in relatieve en absolute kwantificatie en eveneens in-label vrij en stabiele isotopen (bijvoorbeeld metabolisch merken, chemische labeling en zware-gemerkt eiwit en peptide interne standaarden). Label-free technieken kunnen nuttig zijn voor de relatieve eiwit kwantificatie zijn, maar zijn niet geschikt voor nauwkeurige absolute kwantificatie. Ter vergelijking zijn labeltechnieken foutenbronnen bij monstervoorbereiding en MS variantie verminderd en worden vaak gebruikt voor relatieve kwantificatie eiwit 17. Bijvoorbeeld, stabiele isotoop gemerkte proteoom (SILAP) standaarden bereid met een gekweekte menselijke cellijn ingeschakeld relatieve kwantificering van potentiële biomarkers via LC-SRM van humaan serum 18. Accurate absolute eiwit kwantificering door MS vereist dat gezuiverd, gekwantificeerd, isotopisch gemerkt eiwit of peptide interne standaarden worden spiked-in biologische monsters voorafgaande aan MS. De opname van zware isotoop gelabelde interne standaarden in een LC-SRM workflow maakt absolute kwantificatie waarvan is aangetoond zeer reproduceerbare en overdraagbaar laboratoria 16,19 zijn. Stabiele isotopen gelabelde interne standaarden voor de absolute kwantificering van eiwit MS omvatten peptide standaarden bereid met vaste fase synthese 20, eiwitten uit aaneengeschakelde protease splitsbare peptide standaarden 21 en full-length eiwitstandaards 22. Doelproteïne covalente modificatie en onvolledige monstervoorbereiding (dwz onvolledige sample lysis en homogenisering, en onvolledige eiwit oplosbaar, denaturatie, alkylering en proteolyse) kan accurate kwantificering ondermijnen. Interne pProtein normen het minst waarschijnlijk worden beïnvloed door de meeste van deze potentiële problemen, maar deze zijn meestal de meest moeilijk te bereiden. Een alternatief is om elk doelwit eiwit met meerdere interne peptide standaarden die zijn ontworpen om amino- en carboxy-eindstandige natieve flankerende resten omvatten analyseren. Ongeacht welk type interne standaard wordt gebruikt, moet worden spiked-in biologische monsters in een zo vroeg punt tijdens de voorbehandeling mogelijk. Ook moet meerdere monstervoorbereiding technieken (bijvoorbeeld verschillende denaturatie omstandigheden) worden getest. Het gebruik van meerdere orthogonale experimentele technieken (experimentele cross-validatie) is een haalbare strategie voor het overwinnen van de meeste potentiële kwantificering daagt 23-25. LC-SRM kwantificering van eiwitten is een zeer flexibele techniek die is gebruikt in vele verschillende toepassingen. Met name is het gebruikt om peptide en proteïne biomarkers studie binnenklinische monsters zoals serum, kern biopsies en naaldopzuigingen 5. LC-SRM is ook gebruikt om de stoichiometrie van eiwitcomplexen 5,26 meten, botulinum neurotoxinen 27 detecteren, te kwantificeren proteïne fosforylatie dynamiek binnen signaalwegen 5 en wijzigingen in eiwitconformatie 28 kwantificeren. Ons laboratorium gebruikt LC-SRM de signalering eiwitten die chemotaxis van macrofagen mediëren de ontwikkeling van chemotaxis traject simulaties ondersteunen kwantificeren. De algemene regeling van het protocol (figuur 1) begint met de rangschikking van de voorlopige targetpeptiden. Vervolgens worden ruwe peptide externe standaarden gesynthetiseerd en LC-SRM assays voor kwalitatieve analyses van biologische monsters te ontwikkelen. Als het biologisch monster afgeleid doelwit peptide wordt gedetecteerd, worden gezuiverd heavy-gelabelde interne peptide normen opgesteld voor de kwantitatieve LC-SRM. Dit protocol kan worden gebruikt om ACcurately kwantificeren eiwitten uit diverse biologische monsters, en onderzoeken van diverse eiwit targets ondersteunen.

```html
<table><tbody><tr><td>Acetonitrile (ACN), LC-MS grade</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit</td><td>Fisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1 mm</td><td>BioSpec Products</td><td>11079101z</td><td></td></tr><tr><td>Bestatin hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>B8385-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture DMEM (met glucose, zonder L-glutamine)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture EDTA, 500 mM, pH8</td><td>Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture fosfaat gebufferde saline (PBS) pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture Trypan Blue levensvatbaarheidskleurstof, 0,4% w/v</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4 celteller</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4 wegwerp telkamers</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100-014</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid, LC-MS grade, ampullen</td><td>Fisher</td><td>A117-10X1AMP</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer, vernieuwde Neubauer, 0,1 mm diep</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0640030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M, pH 7,2</td><td>Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur, 37% w/w</td><td>VWR</td><td>BDH3028-2.5LG</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>Laser gebaseerde micropipet aantrekkruik</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>LC gecoat silica capillair, 50 µm id</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>LC vial, autosampler, 12 mm x 32 mm polypropyleen</td><td>SUN SRI</td><td>200-268</td><td></td></tr><tr><td>LC vial schroefdop, autosampler, voorgesneden PTFE/silicone</td><td>SUN SRI</td><td>500-061</td><td></td></tr><tr><td>Luciferase, van Photinus pyralis</td><td>Sigma</td><td>L9506-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatine A</td><td>EMD Millipore</td><td>516481-25MG</td><td></td></tr><tr><td>pH strips colorpHast (pH 0,0-6,0)</td><td>EMD Chemicals</td><td>9586-1</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop fosfataseremmercocktail</td><td>Roche</td><td>04906837001</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg cartridge</td><td>Waters</td><td>WAT023590</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, extractie manifold, 20 posities</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, plat oppervlak rubberen zuiger</td><td>Fisher</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide (NaOH)</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac vacuüm concentrator</td><td>Fisher</td><td>SPD111V</td><td></td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur (TFA), LC-MS grade</td><td>Fisher</td><td>A116-50</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, sequencing grade, gemodificeerd</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Buisjesontstopper voor Micronic buisjes</td><td>USA Scientific</td><td>1765-4000</td><td></td></tr><tr><td>Buisjes, 2 ml microcentrifuge, o-ring schroefdop, steriel</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U0631-500g</td><td></td></tr><tr><td>Water, LC-MS grade</td><td>Fisher</td><td>W6-1</td><td></td></tr></tbody></table>
```

geselecteerde reaction monitoring massaspectrometrie voor absolute protein kwantificering

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute kwantificering van doeleiwitten in complexe biologische monsters is cruciaal voor een breed scala aan onderzoeks- en klinische toepassingen. Dit protocol biedt stapsgewijze instructies voor de ontwikkeling en toepassing van kwantitatieve bepalingen met behulp van geselecteerde reactiebewaking (SRM) massaspectrometrie (MS). Eerst worden waarschijnlijke quantotypische doelpeptiden geïdentificeerd op basis van talrijke criteria. Dit omvat het identificeren van proteotypische peptiden, het vermijden van plaatsen van posttranslationele modificatie en het analyseren van de uniciteit van het doelpeptide ten opzichte van het doeleiwit. Vervolgens worden ruwe externe peptidestandaarden gesynthetiseerd en gebruikt om SRM-bepalingen te ontwikkelen, en de resulterende bepalingen worden gebruikt om kwalitatieve analyses van de biologische monsters uit te voeren. Ten slotte worden gezuiverde, gekwantificeerde, met zware isotopen gelabelde interne peptidestandaarden bereid en gebruikt om isotopenverdunningsreeks SRM-bepalingen uit te voeren. Analyse van alle resulterende MS-gegevens wordt gepresenteerd. Dit protocol werd gebruikt om nauwkeurig de absolute abundantie van eiwitten van de chemotaxis-signaleringsroute binnen RAW 264.7-cellen (een muis monocyte/macrofagencellijn) te meten. De kwantificering van Gi2 (een heterotrime G-eiwit α-subeenheid) wordt in detail beschreven.

De ontwikkeling van voorspellende computationele modellen van signaaltransductieroutes is een van de fundamentele doelstellingen van de systeembiologie 53. Jammer genoeg, zelfs voor signaalroutes die uitgebreid bestudeerd en hebben een hoge klinische significantie is nog niet algemeen mogelijk voorspellingen te pathway gedrag in reactie op verstoringen (bijv Dit geldt voor de MAPK / ERK-route 54). Onlangs, een onderzoek in dienst gerichte proteomics, transcriptomics en computationele model...

Dit protocol beschrijft hoe absolute kwantificeringsanalyses van doeleiwitten binnen complexe biologische monsters kunnen worden uitgevoerd met behulp van geselecteerde reactiebewaking. Het werd gebruikt om eiwitten van de muis macrofaag chemotaxis signaleringsroute nauwkeurig te kwantificeren. Selectie van doelpeptiden, ontwikkeling van analyses en kwalitatieve en kwantitatieve analyses worden in detail beschreven.

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Het algemene doel van deze procedure is om vloeistofchromatografie met geselecteerde reactiemonitoring, oftewel L-C-S-R-M, te gebruiken om de absolute hoeveelheid van doeleiteiwitten in complexe biologische monsters te kwantificeren. Na de selectie van peptide-doelen worden ruwe externe peptidestandaarden gesynthetiseerd en gebruikt om SRM-assays te ontwikkelen middels vloeistofchromatografie en massaspectrometrie, of LCM ms. De resulterende assays worden gebruikt voor de kwalitatieve lc-SRM-analyse van geprepareerde biologische monsters.Indien het uit het biologische monster afgeleide doelpulpide wordt gedetecteerd, worden de biologische monsters geanalyseerd met kwantitatieve lc SRM-assays door een stabiele isotopenverdunningsreeks van interne peptide-standaarden toe te voegen. Uiteindelijk kan lc SRM worden gebruikt om eiwitten uit een breed scala aan biologische monsters nauwkeurig te kwantificeren en om onderzoek naar uiteenlopende eiwitdoelen te ondersteunen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals immunoassays, is dat de assayontwikkeling relatief snel en goedkoop is, en dat de resulterende assays geschikt zijn voor multiplexin

selected-reaction-monitoring-mass-spectrometry-for-absolute-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Stabiele Isotopen Normen en Capture door Anti-peptide antilichamen (SISCAPA) paren affiniteit verrijking van peptiden met stabiele isotoop verdunning massaspectrometrie (MRM-MS) voor kwantitatieve meting van peptiden te bieden als surrogaat voor hun respectievelijke eiwitten. Hier beschrijven we het protocol met behulp van magnetische deeltjes in een deels geautomatiseerde formaat.

Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

We presenteren een protocol voor het identificeren en kwantificeren van de componenten in mengsels van soorten met vergelijkbare eiwitten. Massaspectrometrie detecteert peptiden voor identificatie en geeft relatieve kwantificering door middel van piekoppervlakteratio's. Als hulpmiddel voor voedsel om fraude te detecteren, kan de methode 1% paard detecteren in rundvlees.

Soorten Bepaling en kwantificering in mengsels met behulp van MRM Massaspectrometrie van peptiden Applied to Meat Authentication

Hier beschrijven we een chromatografische test in combinatie met de ion mobiliteit scheiding van peptide precursoren gevolgd door de hoge resolutie (~ 30.000) MS-detectie van peptide fragmenten voor de kwantificering van puntige peptide normen in een monoclonal antilichaam Digest.

Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie

Een protocol voor de uitgebreide extractie van lipiden, metabolieten en eiwitten uit biologische weefsels met behulp van een monster wordt gepresenteerd.

Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Hier presenteren we een robuust protocol voor het kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij het centrale koolstof-en energiemetabolisme in celvrije eiwitsynthese reacties. Het celvrije synthese mengsel wordt met aniline gekwantificeerd voor effectieve scheiding met behulp van omgekeerde-fase vloeistofchromatografie en vervolgens door massaspectrometrie met behulp van isotopisch gelabelde interne normen.

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Het beschreven protocol biedt een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-analyse van weefselmonsters met behulp van twee benaderingen: labelgebaseerde en labelvrije kwantificering. Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten, terwijl een labelvrije aanpak kosteneffectiever is en wordt gebruikt om honderden monsters van een cohort te analyseren.

Uitgebreide workflow van op massaspectrometrie gebaseerde Shotgun Proteomics van weefselmonsters

Het protocol is bedoeld om het gebruik van een triple quadrupole mass spectrometer voor Multiple Reaction Monitoring (MRM) van eiwitten uit klinische monsters in te voeren. We hebben een systematische workflow voorzien, van monstervoorbereiding tot gegevensanalyse voor klinische monsters met alle nodige voorzorgsmaatregelen die moeten worden genomen.

Kwantitatieve Proteomics Workflow met behulp van multiple reaction monitoring gebaseerde detectie van eiwitten uit menselijk hersenweefsel

Er wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van biomarkers met een lage abundantie uit gedroogde serummonsters, geïllustreerd met de biomarker progastrine-releasing peptide (ProGRP). Antilichaam-gecoate magnetische kralen worden gebruikt voor de selectieve reiniging en verrijking van een proteotypisch ProGRP-peptide. Het gevangen peptide wordt vervolgens geanalyseerd met vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie.

Microsampling in gerichte massaspectrometrie-gebaseerde eiwitanalyse van eiwitten met een lage abundantie

Leer hoe u vloeistofchromatografie en selected reaction monitoring (SRM) gebruikt voor absolute proteïnekwantificering in complexe biologische monsters. Deze methode biedt een snel en kosteneffectief alternatief voor immunoassays.

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Meer video's verkennen