Name: Kwantificering van cytosolische vs. vacuole Salmonella In het Primair macrofagen door Differential Permeabilisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Leer hoe je cytosolische en vacuolaire Salmonella typhimurium kwantificeert in beenmergmacrofagen met differentiële digitoninepermeabilisatie. Deze methode onderscheidt bacteriële lokalisatie met FACS-analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Mathias S. Dick, Roland F. Dreier en Sebastian Rühl erkennen voor discussie. Dit werk werd ondersteund door een SNSF lectoraat PP00P3_139120 / 1 en een universiteit van Basel projectsubsidie ​​ID2153162 naar PB

1. Digitonine Assay met mCherry-expressie Salmonella (FACS-gebaseerde analyse) <ol><li> Voorbereiden van bacteriën Opmerking: Salmonella wildtype SL1344 (streptomycineresistente) tot expressie mCherry uit een plasmide (pFPV codeert mCherry onder RPSM promoter) wordt gebruikt in deze test. Bacteriële fagocytose en proliferatie indien niet gewijzigd door de constitutieve expressie van mCherry (gegevens niet getoond) 16. <ol><li> Inoculeer de stam 1 dag vóór de infectie in 3 ml LB medium aangevuld met streptomycine (90 gg / ml) en ampicilline (100 ug / ml, mCherry expressie vector) in een schudder bij 37 ° CO / N. </li></ol></li><li> Plating cellen voor infectie. <ol><li> Seed wildtype BMDMs in een 24 wells plaat met een dichtheid van 1,25 x 10 5 cellen / putje in 1 ml primaire macrofagen medium (DMEM gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum (FCS, door warmte geïnactiveerd, 56 ° C, 30 min ), 1% HEPES, 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 1% L-glutamine en 10% L929 supernatant (geconditioneerd medium van macrofaag-koloniestimulerende factor (M-CSF) producerende L929-cellen). Seed putjes volgens tabel 1 overeenkomt met het individuele omstandigheden. Dekglaasjes Aan de putjes als controles (tabel 1). </li><li> Incubeer de cellen een nacht in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Permeabilisatie </td><td colspan="3"> Kleuring </td></tr><tr><td></td><td> Glas dekglaasje </td><td> Salmonella </td><td> Digitonine </td><td> Saponine </td><td> anti-Salmonella </td><td> anti-calnexin </td><td> anti PDI- </td></tr><tr><td> A1 (monster) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A2 (monster) </td><td> - / + * </td><td> + </td&gt; <td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A3 (monster) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A4 (zonder permeabilisatie controle) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A5 (complete permeabilisatie control) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> B1 (gekleurd voor calnexin) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B2 (gekleurd voor calnexin) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B3 (gekleurd voor calnexin) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> C1 (gebrandschilderdvoor PDI) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C2 (gekleurd voor PDI) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C3 (gekleurd voor PDI) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Plating regeling voor beenmerg afgeleide macrofagen (BMDMs) in een 24-well formaat voor daaropvolgende infectie met Salmonella, permeabilisatie en kleuring * Naargelang protocol 1 of 2 protocol wordt uitgevoerd.. <ol start="3"><li> Voorbereiding van de bacteriën op infectie. <ol><li> De volgende dag, het gehalte van Salmonella in de overnacht kweek door verdunning van de kweek 1:10 in PBS en het meten van de OD 600 tegen een enkel PBS controle. Hierdoor wordt de OD 600 wordt gemeten in het linear bereik van de spectrofotometer. </li><li> Bereken de concentratie van Salmonella per ml. Een OD600 van 1 komt overeen met 1 x 10 9 bacteriën. </li><li> Verdun de bacteriën in macrofagen medium tot een concentratie van Salmonella 1,25 x 10 6 cellen / ml bereiken. </li></ol></li><li> Infectie van cellen met Salmonella. <ol><li> Verwijder medium uit BMDMs. Voeg 1 ml medium geïnfecteerde macrofaag controleputjes (B1-B3, C1-C3). Voeg 1 ml van Salmonella suspensie aan putjes A1 - A5 een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 bacteriën per cel bereikt. </li><li> Centrifugeer de plaat gedurende 15 min bij 300 xg bij 37 ° C om de infectie te synchroniseren. Breng de plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol></li><li> Killing extracellulaire Salmonella met Gentamicine. <ol><li> Op 1 uur na infectie, verwijder plaat uit incubator en voeg 0,1 ml van macrofagen medium met 0,1 mg / ml Gentamicineextracellulaire bacteriën te doden. Toevoegen gentamicine aan alle putjes, zelfs uninfected controls, zodat alle cellen op dezelfde wijze behandeld worden. Breng de plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol></li><li> Het wassen van de cellen. <ol><li> Op 2 uur na infectie, verwijder plaat uit incubator en wassen putjes 2x met 1 ml normaal DMEM (voorverwarmd tot 37 ° C) en vervangen door macrofagen medium (voorverwarmd tot 37 ° C) bevattende 10 ug / ml &#160; Gentamycine groei van overblijvende extracellulaire bacteriën te voorkomen. Breng de plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol></li><li> Voorbereiden van vers buffers met detergenten en antilichamen. <ol><li> Vlak voor het gewenste tijdstip van analyse bereiden verse voorraadoplossing van digitonine bij 1 mg / ml in KHM buffer (110 mM kaliumacetaat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,3). Filter de voorraad en verdun in KHM bufferen tot een werkende concentratievan 50 ug / ml digitonine. Bovendien wordt een oplossing van 0,1% saponine in KHM Buffer, anti- Salmonella antilichaam gekoppeld aan FITC (CSA-1-FITC) en 1/500, anti-calnexine op 1/100 of anti-PDI op 1/100 in KHM Buffer aangevuld met 3% BSA. </li></ol></li><li> Cel permeabilisatie. <ol><li> Verwijder de plaat uit incubator en was putjes 3x met 0,5 ml buffer KHM (voorverwarmd tot 37 ° C). Verwijder KHM buffer en voeg 0,25 ml plain KHM putjes A4 en B1 / C1, KHM Buffer met digitonine putjes A1 - A3 en B2 / C2 of KHM Buffer met saponine putjes A5 en B3 / C3 (volgens tabel 1). Incubeer gedurende precies 1 min bij kamertemperatuur en onmiddellijk alle putjes 3x met 0,5 ml buffer KHM (voorverwarmd tot 37 ° C). </li></ol></li><li> Primair antilichaam kleuring. <ol><li> Verwijder de KHM buffer en voeg het primaire antilichaam oplossing (Goat anti Salmonella FITC, 250 ul / putje, 0,1 gg / ml) aan de geschikte putjes (Figuur 1 </strong&gt;, tabel 1). Incubeer de plaat gedurende 15 minuten in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> Was de cellen 1x met 1 ml PBS. </li></ol></li><li> Geïnfecteerde cellen (wells A1 - A5): FACS-analyse <ol><li> Was de cellen 3x met PBS en voeg 0,5 ml ijskoude PBS bevattende 0,1% Triton. Transfer naar een 5 ml FACS buis met mobiele zeefdop te breken celaggregaten. Houd monsters op ijs. </li><li> Analyseer de monsters van een FACS. De volledig gepermeabiliseerde controles, stelt de poort voor de totale bacteriën op basis van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing (FSC / SSC) eerste, en de mCherry signaal (610 nm ± 20 nm filter). </li><li> Vervolgens analyseert het FITC-signaal in de totale bacteriële populatie De volledig permeabel en niet permeabel controles om de poorten van cytosolische bacteriën (FITC +, mCherry +) en vacuolaire bacteriën (FITC, mCherry +) (figuur 3) in te stellen. </li><li> Met set poorten, analyse van deze monsters en bepaalt het percentage cytosolische vs.vacuole bacteriën gebruiken FlowJo software volgens het protocol van de fabrikant. </li></ol></li><li> Geïnfecteerde permeabilisatie controles (putten B1 - B3, C1 - C3): microscopie <ol><li> Bevestiging <ol><li> Verwijder PBS en voeg 250 pl 4% PFA in PBS. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Was de putjes 2x met 1 ml PBS en voeg 250 ul van 0,1 M glycine in PBS gedurende 10 min naar het fixeermiddel blussen. Was de putjes 2x met 1 ml PBS. </li></ol></li><li> Secundair antilichaam kleuring. <ol><li> Stain permeabilisatie regelaars voor 1 uur bij KT met geschikte secundaire antilichamen gekoppeld met fluoroforen in PBS gesupplementeerd met 0,1% saponine en 3% BSA volledig permeabilize cellen. </li><li> Wassen dekglaasjes 3x met 1 ml PBS en monteer de dekglaasjes analyse montage medium met DAPI (1,5 ug / ml). </li></ol></li><li> Microscopie analyse. <ol><li> Analyseer de dekglaasjes met de controles op een 40x of 63x vergroting met behulp van een confocale fluocerend microscoop. Als de permeabilisatie heeft gewerkt, mag er geen kleuring van niet- gepermeabiliseerde cellen, calnexin kleuring voor zowel digitonin- en saponine-gepermeabiliseerde cellen en PDI kleuring alleen saponine-gepermeabiliseerde cellen (figuur 4) zijn. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Digitonine Assay met Unlabeled Salmonella (Microscopie-gebaseerde analyse) <ol><li> Voorbereiding bacteriën O / N culturen. <ol><li> Inoculeer ongelabeld wildtype Salmonella SL1344 (streptomycineresistente) 1 dag vóór de infectie in 3 ml LB medium aangevuld met streptomycine (90 gg / ml) in een schudder bij 37 ° CO / N. </li><li> Plating cellen voor infectie. <ol><li> Seed BMDMs in een 24 wells plaat met steriele dekglaasjes bij een dichtheid van 1,25 x 10 5 cellen / putje in 1 ml macrofaag medium (DMEM gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum (FCS, aangevuld-de, 56 ° C,30 min), 1% HEPES, 1% L-niet-essentiële aminozuren (NEAA), 1% L-glutamine en 10% L929 supernatant). Seed putjes volgens tabel 1 overeenkomt met het individuele omstandigheden. </li><li> Incubeer de cellen O / N in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol></li><li> Voorbereiding van de bacteriën op infectie. <ol><li> De volgende dag, het gehalte van Salmonella in de O / N kweek door verdunning van de kweek 1:10 in PBS en het meten van de OD 600 tegen een enkel PBS controle. Hierdoor wordt de OD 600 wordt gemeten in het lineaire bereik van de spectrofotometer. </li><li> Bepaal de concentratie van Salmonella per milliliter. Een OD 600 van 1 komt overeen met 1 x 10 9 bacteriën. </li><li> Verdun de bacteriën in macrofagen medium tot een concentratie van Salmonella 1,25 x 10 6 cellen / ml bereiken. </li></ol></li><li> Infectie van cellen met Salmonella. <ol&gt; <li> Verwijder medium uit alle putjes. Voeg 1 ml van plain macrofagen medium om niet-geïnfecteerde controle wells (B1 - B3, C1 - C3). Voeg 1 ml van Salmonella suspensie aan putjes A1 - A5 een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 bacteriën per cel bereikt. </li><li> Centrifugeer de plaat gedurende 15 min bij 300 xg bij 37 ° C om de infectie te synchroniseren. Breng de plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol></li><li> Killing extracellulaire Salmonella met Gentamycin. <ol><li> Op 1 uur na infectie verwijderd plaat uit incubator en voeg 0,1 ml van macrofaag medium dat 1 mg / ml gentamycine extracellulaire bacteriën te doden alle putjes. Breng de plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol></li><li> Het wassen van de cellen. <ol><li> Op 2 uur na infectie verwijderd plaat uit incubator en was 3 x elke well met 1 ml vers medium bevattende macrofagen 10 ug / ml Gentamycine voorkomengroei van overblijvende extracellulaire bacteriën. Breng de plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. </li></ol></li><li> Voorbereiden van vers buffers met detergenten en antilichamen. <ol><li> Vlak voor het gewenste tijdstip van analyse bereiden verse voorraadoplossing van digitonine bij 1 mg / ml in KHM buffer (110 mM kaliumacetaat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,3). Filter de voorraad en verdun in KHM Buffer om een ​​werkende concentratie van 50 ug / ml van digitonine. </li><li> Bovendien wordt een oplossing van 0,1% saponine in KHM Buffer, anti- Salmonella FITC (CSA-1, 0,1 ug / ml), anti-calnexine op 1/100 of anti-PDI op 1/100 in KHM buffer gesupplementeerd met 3% BSA (zie materialen tabel voor antilichaamconcentratie). </li></ol></li><li> Cel permeabilisatie. <ol><li> Verwijder de plaat uit incubator en was putjes 3x met 0,5 ml buffer KHM (voorverwarmd tot 37 ° C). Verwijder KHM Buffer en voeg 0,25 ml vlakte KHM Bufferputjes A4 en B1 / C1, KHM Buffer met digitonine putjes A1 - A3 en B2 / C2 of KHM Buffer met saponine putjes A5 en B3 / C3 (volgens tabel 1). Incubeer gedurende precies 1 min bij kamertemperatuur en onmiddellijk alle putjes 3x met 0,5 ml buffer KHM (voorverwarmd tot 37 ° C). </li></ol></li><li> Primair antilichaam kleuring. <ol><li> Verwijder de KHM buffer en voeg het primaire antilichaam oplossing (Goat anti Salmonella CSA1-FITC, 250 ul / putje, 0,1 gg / ml) aan de geschikte putjes (Figuur 2, Tabel 1). Incubeer de plaat gedurende 15 minuten in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. Was 3 x met 1 ml PBS. </li></ol></li><li> Fixatie. <ol><li> Verwijder PBS en voeg 250 pl 4% PFA in PBS. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Was de putjes 2x met 1 ml PBS en voeg 250 ul van 0,1 M Glycine in PBS gedurende 10 min naar het fixeermiddel blussen. Was de putjes 2x met 1 ml PBS. </li></ol></li><li> TotaalSalmonella kleuring van geïnfecteerde monsters. <ol><li> Wassen dekglaasjes 3x met PBS met 0,1% Saponine / 3% BSA en incubeer de monsters met een anti-CSA1 antilichaam (geit anti-CSA1, 0,1 gg / ml, muis anti-LPS werkt ook, 0,1 gg / ml) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in PBS met 0,1% Saponine / 3% BSA. </li><li> Was 3x in PBS met 0,1% Saponine / 3% BSA. Incubeer uw monsters met een secundair anti-geit-antilichaam gekoppeld aan fluorofoor keuze in PBS met 0,1% Saponine / 3% BSA gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Wassen dekglaasjes 3x met 1 ml PBS en monteer de dekglaasjes analyse montage medium met DAPI (1,5 ug / ml). </li></ol></li><li> Microscopie analyse. <ol><li> Verwerven van gegevens met een confocale microscoop door het tellen cytosolische Salmonella (anti- Salmonella FITC positief) en de totale Salmonella (dubbel positief) (Figuur 5). Permeabilisatie controles moeten tonen: geen kleuring voor niet-gepermeabiliseerde cellen, calnexin sbevattende voor digitonine gepermeabiliseerde cellen en PDI kleuring voor saponine gepermeabiliseerde cellen (figuur 4). Wells A4 en A5 zal dienen als interne controles voor de Salmonella vlekken. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Kumar, Y., Valdivia, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leading+a+sheltered+life%3A+intracellular+pathogens+and+maintenance+of+vacuolar+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments.</a> Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).</li>
<li>Chong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+phagosomal+stage+of+Francisella+tularensis+determines+optimal+phagosomal+escape+and+Francisella+pathogenicity+island+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression.</a> Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).</li>
<li>Mellouk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+subverts+the+host+recycling+compartment+to+rupture+its+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole.</a> Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).</li>
<li>Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-mediated+reentry+of+Francisella+tularensis+into+the+endocytic+compartment+after+cytoplasmic+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).</li>
<li>Broz, P., Monack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+described+pattern+recognition+receptors+team+up+against+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens.</a> Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).</li>
<li>Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+LPS+activates+caspase-11%3A+implications+in+TLR4-independent+endotoxic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock.</a> Science. 341, 1250-1253 (2013).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+of+intracellular+Shigella+from+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Escape of intracellular Shigella from autophagy.</a> Science. 307, 727-731 (2005).</li>
<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonellae+interplay+with+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li>
<li>Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li>
<li>Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bimodal+lifestyle+of+intracellular+Salmonella+in+epithelial+cells%3A+replication+in+the+cytosol+obscures+defects+in+vacuolar+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication.</a> PLoS One. 7, e38732(2012).</li>
<li>Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+Toxoplasma+gondii+parasitophorous+vacuole+by+IFNgamma-inducible+immunity-related+GTPases+%28IRG+proteins%29+triggers+necrotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death.</a> PLoS Pathog. 5, e1000288(2009).</li>
<li>Meunier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+activation+requires+lysis+of+pathogen-containing+vacuoles+by+IFN-induced+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases.</a> Nature. 509, 366-370 (2014).</li>
<li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+interferon-gamma-inducible+p65+GTPases+plays+a+critical+role+in+host+defense+against+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii.</a> Immunity. 37, 302-313 (2012).</li>
<li>Degrandi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+guanylate+binding+protein+2+%28mGBP2%29+controls+Toxoplasma+gondii+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).</li>
<li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+of+the+inflammasome+by+caspase-1+adaptors+ASC+and+Ipaf%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf.</a> Nature. 430, 213-218 (2004).</li>
<li>Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+cytosolic+Salmonella+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells.</a> PLoS One. 9, e84681(2014).</li>
<li>Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+flow+cytometry+to+determine+differential+redistribution+of+cytochrome+c+and+Smac%2FDIABLO+from+mitochondria+during+cell+death+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling.</a> PLoS One. 7, e42298(2012).</li>
<li>Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+orientation+of+the+human+papillomavirus+type+16+E5+oncoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein.</a> J Virol. 84, 1696-1703 (2010).</li>
<li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+measurements+of+vacuolar+rupture+caused+by+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens.</a> J Vis Exp. , e50116(2013).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Differential permeabilisatie is een eenvoudige en robuuste methode te analyseren en kwantificeren van de subcellulaire verdeling van de bacteriële ziekteverwekkers tussen vacuole compartimenten en het cytosol. Dezelfde test is met succes gebruikt bij bacteriën zoals Francisella novicida 2,4 en Shigella flexneri 12. Aangezien vele intracellulaire pathogenen wijzigen of de ontvangende structuren endomembrane wijzigen, de robuustheid van de digitonine permeabilisatie zal moeten worde...

Intracellulaire bacteriële pathogenen repliceren rechtstreeks in de gastheercel cytosol of in gespecialiseerde vacuolaire compartimenten 1. Tijdens de beginfase van de infectie meest pathogenen te geïnternaliseerd hetzij fagocytose door gespecialiseerde cellen (bijvoorbeeld macrofagen) of actief bevorderen hun opname in niet-fagocytaire cellen. In fagocytische cellen, de fagosoom normaal gen met lysosomen een degradatieve compartiment, waarbij de gefagocyteerde deeltjes gedigereerd vormen. Gespecialiseerde cytosolische bacteriën, zoals Francisella novicida of Shigella flexneri, ontsnappen phagosomal afbraak door het induceren van de breuk van de phagosome en vervolgens ontsnappen in de cytosol 2,3. Dit vereist-virulentie geassocieerd mechanisme zoals de Francisella Pathogeniteit Island (FPI), of de Shigella flexneri T3SS, die effector eiwitten die de vacuole breuk 2-4 bevorderen injecteert. De gastheercel cytosol functieseen aantal geconserveerde patroonherkenning receptoren die normaal gesproken de aanwezigheid van ziekteverwekkers herkennen en veroorzaken aangeboren immuunsysteem signalering 5. Bovendien xenophagy, een antimicrobieel vorm van autophagy kan bacteriën die de cytosol voeren degraderen. Cytosolische bacteriën zijn doorgaans goed aangepast aan het bot of te omzeilen deze reacties met behulp van verschillende strategieën. Bijvoorbeeld, Francisella wijzigt haar LPS gastheer erkenning te vermijden en Shigella voorkomt autofagie recruitment met uitgescheiden effector eiwitten 6,7. Een andere strategie om lysosomale degradatie ontsnappen is in dienst van het model vacuole pathogeen Salmonella enterica serovar Typhimurium, daarna aangeduid als Salmonella typhimurium. Salmonella maakt gebruik van een T3SS aan effectoren dat de eerste phagosome verbouwen in zijn intracellulaire niche te injecteren, de Salmonella bevattende vacuole (SCV) 8,9. Continue manipulatie van gastheer paden ismoet deze vacuole door het aantrekken lipiden en andere voedingsstoffen naar de vacuole te handhaven. Inderdaad, een Sifa mutant van Salmonella nalaat vacuolaire stabiliteit, en komt in de cytosol gastheercellen binnen enkele uren na infectie, wat resulteert in activering van innate immune paden en autophagy recruitment 8. Vacuolaire ontsnappen van Salmonella varieert afhankelijk van het celtype dat studies en verschillende rapporten hebben aangetoond dat epitheelcellen zelfs WT Salmonella kunnen de SCV en hyperreplicate ontsnappen in de cytosol 10. Recente rapporten tonen aan dat aangeboren immuunsysteem detectie vacuolen pathogenen ook afhankelijk van het vermogen van de gastheer herkennen en destabiliseren pathogeen bevattende vacuolen (PCVs) 11-14. Aangezien de host of de bacteriën kunnen genotype verdeling van intracellulaire bacteriën tussen de vacuole en cytosolische compartiment beïnvloeden, is het noodzakelijk om het aantal vacuolen vs. kwantificerencytosolische bacteriën. Aangezien in de meeste experimentele opstellingen gastheercellen worden geïnfecteerd met meer dan één bacterie, vervolgens kunnen verschillende bacteriën herbergen in verschillende subcellulaire compartimenten, is een techniek vereist die kwantificering mogelijk maakt op het niveau van afzonderlijke bacteriën. Differential permeabilisatie (ook bekend als bescherming phagosomal test) biedt deze resolutie 2,4,10,12. De assay is gebaseerd op selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan gastheercel met het detergens digitonine, die vacuolaire membranen wordt afgebroken en maakt daardoor selectieve kleuring van cytosolisch bacteriën antilichamen. Hier hebben we twee protocollen voor het kwantificeren van cytosolische en vacuolaire Salmonella typhimurium middels differentiële permeabilisatie. Het principe van deze werkwijze wordt beschreven in Figuur 1: beenmerg afgeleide macrofagen (BMDMs) worden geïnfecteerd met stationaire fase mCherry-expressie Salmonella. Stationaire fase Salmonella nodig to worden gebruikt omdat ze downregulate de uitdrukking van de SPI-1 T3SS, waarvan de activiteit anders zouden worden erkend door de NLRC4 inflammasoom en veroorzaken een snelle celdood (pyroptosis) van de BMDMs 15. Na de infectie werden de cellen worden gewassen en behandeld met 50 ug / ml digitonine gedurende 1 minuut. Cellen worden onmiddellijk opnieuw gewassen en geïncubeerd met anti-Salmonella-antilichamen gekoppeld met FITC bacteriën markeren met toegang tot het cytosol. Na een additionele wasstap cellen worden gelyseerd en het percentage mCherry + (vacuole) en FITC + / + mCherry (cytosol) bacteriën wordt bepaald door FACS. We rapporteren ook een aanpassing van deze werkwijze die kan worden gebruikt als er geen fluorescerend eiwit tot expressie stammen zijn (figuur 2). Extra stappen zijn ingevoerd na de FITC labeling waarbij cellen gefixeerd en volledig gepermeabiliseerd. Daarna alle bacteriën worden gekleurd met anti-Salmonella antistoffen en bijbehorende secundaire antilichamen. Deteel gebeurt dan door middel van microscopisch plaats van FACS-analyse.

<table><tbody><tr><td>Digitonine</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td>50 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>PFA</td><td>mpbio</td><td>219998380</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumacetaat</td><td>Sigma</td><td>791733</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>anti-Salmonella CSA-1-FITC</td><td>KPL</td><td>01-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>anti-Salmonella CSA-1</td><td>KPL</td><td>02-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>anti-Calnexine</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-860D</td><td>1/100</td></tr><tr><td>anti-PDI</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-890</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield montagemedium</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Anti konijn antilichaam-488</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11070</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Life Technologies</td><td>15710-49</td><td>100 &mu;g/ml en 10 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Amimed</td><td>5-13K00-H</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 Confocal microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>beeldvorming gedaan bij 63X</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BD technologies</td><td></td><td>detectie mCherry 610 nm</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BD technologies</td><td></td><td>detectie FITC 530 nm</td></tr></tbody></table>

kwantificering van cytosolische vs. vacuole<em&gt; salmonella</em&gt; in het primair macrofagen door differential permeabilisatie

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellulaire bacteriële pathogenen kunnen repliceren in het cytosol of in gespecialiseerde pathogeen bevattende vacuolen (PCVs). Om de cytosol te bereiken, bacteriën zoals Shigella flexneri en Francisella novicida nodig om de breuk van de phagosome induceren. Daarentegen Salmonella typhimurium repliceert in een vacuolaire compartiment zogenaamde Salmonella bevattende vacuole (SCV). Maar bepaalde mutanten van Salmonella niet aan SCV integriteit te behouden en zijn dus vrij in het cytosol. Het percentage cytosolische vs. vacuole bacteriën op het niveau van afzonderlijke bacteriën kan worden gemeten door differentiële permeabilisatie, ook bekend als phagosome bescherming assay. De aanpak maakt gebruik van het onroerend goed van wasmiddel digitonine selectief cholesterol te binden. Aangezien de plasmamembraan bevat meer cholesterol dan andere cellulaire membranen kunnen digitonine worden gebruikt om selectief permeabiliseren het plasmamembraan terwijl intracellulaire membranenintact. Kortom, na infectie met het pathogeen expressie brengen van een fluorescente merker eiwit (bijv mCherry oa), wordt het plasmamembraan gastheercellen permeabel gemaakt met een korte incubatie in digitonine bevattende buffer. De cellen worden vervolgens gewassen en geïncubeerd met primair antilichaam (gekoppeld aan een fluorofoor keuze) gericht tegen de bacterie naar keuze (bijvoorbeeld anti- Salmonella FITC) en opnieuw gewassen. Als alleen bacteriën worden gebruikt, kan een extra stap worden uitgevoerd, waarbij alle membranen permeabel en bacteriën gekleurd met een corresponderende antilichaam. Na de kleuring, kan het percentage in vacuolen en cytosolische bacteriën worden gekwantificeerd door FACS of microscopie door telling met één of twee positieve gebeurtenissen. Hier hebben we experimentele details voor het gebruik van deze techniek met de bacterie Salmonella typhimurium. Het voordeel van deze test is dat, in tegenstelling tot andere assay biedt een kwantificering van het niveau van afzonderlijke bacte-ria, en indien geanalyseerd met behulp van microscopie levert het exacte aantal cytosolische en vacuolaire bacteriën in een bepaalde cel.

Figuur 1 en Figuur 2 tonen de schema&#39;s van de digitonine assay in protocol 1 en protocol 2 ter illustratie van de kritische stappen in het protocol en de verkregen resultaten worden beschreven. Figuur 3 toont typische FACS resultaten. Positieve en negatieve controles worden gebruikt om de poorten die voor mCherry + / FITC bacteriën (Salmonella vacuole) en mCherry + / + FITC bacteriën (Salmonella cytosol). Op basis van deze poorten het percentage cytosolische en vacuola...

We beschrijven de kwantificering van cytosolische en vacuolaire Salmonella typhimurium in uit beenmerg afgeleide macrofagen met behulp van differentiële digitonine permeabilisatie.

Kwantificering van cytosolische vs. vacuole<em&gt; Salmonella</em&gt; In het Primair macrofagen door Differential Permeabilisatie

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het bepalen van het percentage cytosolische en vacuolaire Salmonella Typhi in geïnfecteerde macrofagen afgeleid van beenmerg. Dit wordt bereikt door macrofagen te infecteren met M-Cherry-expresserende Salmonella Typhi. In een tweede stap worden de cellen behandeld met het detergent Triton, dat het plasmamembraan permeabiliseert, maar niet de vacuolaire membranen.Vervolgens worden de cellen gekleurd met een anti-salmonella-antilichaam gekoppeld aan het fluorofoor Zi. Om cytosolische Salmonella Typhimurium te labelen, tonen de resultaten het percentage cytosolische bacteriën ten opzichte van het totaal aantal bacteriën op basis van fluorescentie-geactiveerde cel sortering of FACS. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van pathogeeninteractie, zoals of een intracellulair pathogeen zich repliceert in een vacuole of in het cytosol. Inoculeer de bacteriële stam één dag voor de infectie in 3 mL Luria-Bertani-medium aangevuld met streptomycine en ampicilline in een schudmachine bij 37 °C gedurende de nacht om rekening te houden met de individuele condities. Voeg dekglasjes toe aan de wells van een 24-w

quantification-cytosolic-vs-vacuolar-salmonella-primary-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In dit artikel beschrijven we een methode gebruik te maken van multi-spectraal imaging flowcytometrie om de internalisering van polyanhydride nanodeeltjes of bacteriën door RAW 264.7 cellen te kwantificeren.

Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

This video demonstrates an assay to quantify the intracellular growth of parasites in bone marrow-derived macrophages (BMMs). The macrophage cells are infected with the motile and non-motile invasive stages of Leishmania, metacyclic promastigotes and amastigotes, respectively. The parasites invade the macrophages, getting internalized into a parasitophorous vacuole and multiplying inside. The intracellular parasite growth is quantified using a microscope upon fluorescently staining the...

An In Vitro Assay to Quantify the Intracellular Growth of Parasite in Macrophages

This video demonstrates an assay to quantify cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium inside bone marrow-derived macrophages using differential permeabilization. The macrophages are infected with a fluorescent protein-expressing Salmonella, which is internalized inside a specialized vacuolar structure called Salmonella-containing vacuole or SCV. A subset of bacteria escape the SCV and enter the cytosol. The cholesterol-rich plasma membrane of macrophages is permeabilized using digitonin,...

An Assay to Quantify Cytosolic and Vacuolar Salmonella in Infected Primary Macrophages

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Een high-throughput assay in vitro fenotype Salmonella of andere bacteriële vereniging, invasie en replicatie in fagocytische cellen met hoge doorvoer capaciteit ontwikkeld. De methode werd gebruikt om Salmonella-gen knock-out mutantstammen evalueren op hun betrokkenheid in gastheer-pathogeen interacties.

High-throughput Assay om Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, en replicatie in macrofagen

Dit artikel beschrijft methoden voor de synthese en TL-etikettering van nanodeeltjes (NP). De NP's werden toegepast in pulse-chase experimenten om de endo-lysosomale systeem van eukaryotische cellen te labelen. Manipulatie van de endo-lysosomale systeem door de activiteiten van de intracellulaire pathogeen Salmonella enterica werden gevolgd door live cell imaging en gekwantificeerd.

Toepassing van TL Nanodeeltjes naar herinrichting van de Endo-lysosomale systeem Bestudeer door intracellulaire bacteriën

We beschrijven hier een eenvoudige en snelle methode voor de isolatie van Salmonella typhimurium-phagosomes van macrofagen bevattende coating van de bacteriën met biotine en daar.

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Alle pathogene Leishmania soorten zich bevinden en repliceren in macrofagen van hun gewervelde gastheren. Hier presenteren we een protocol om te infecteren lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen in cultuur met Leishmania, gevolgd door precieze kwantificering van intracellulaire groei kinetiek. Deze methode is handig voor het bestuderen van de afzonderlijke factoren beïnvloeden host-pathogen interactions en Leishmania virulentie.

Kwantificering van intracellulaire groei binnen macrofagen is een snel en betrouwbare methode voor de beoordeling van de virulentie van Leishmania parasieten

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van muis peritoneale macrofaag fagocytose met behulp van verbeterde groene fluorescentie eiwit-uiting van Escherichia coli.

Met behulp van verbeterde eiwit-uiting van groene fluorescentie Escherichia Coli te beoordelen muis peritoneale Macrophage fagocytose

Salmonella dringt binnen en repliceert zich in intestinale epitheelcellen, zowel in Salmonella-specifieke vacuolen als vrij in het cytosol (hyperreplicatie). Een high-throughput fluorescentiemicroscopie-gebaseerd protocol wordt hier beschreven om de intracellulaire fenotypen van Salmonella te kwantificeren door middel van twee complementaire beeldanalyses via ImageJ, waarbij een eencellige resolutie en scoring wordt bereikt.

Geautomatiseerde analyse van intracellulaire fenotypen van Salmonella met behulp van ImageJ

Leer hoe je cytosolische en vacuolaire Salmonella typhimurium kwantificeert in beenmergmacrofagen met differentiële digitoninepermeabilisatie. Deze methode onderscheidt bacteriële lokalisatie met FACS-analyse.

Kwantificering van cytosolische vs. vacuole

Meer video's verkennen