Name: Microfluïdische Genipin Deposition Techniek voor Extended Cultuur van micropatterned Vascular Gespierd Thin Films (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Leer microfluïdische genipin-depositie voor langdurige cultuur van vasculaire gespierde dunne films met behoud van contractiliteit tot twee weken. Deze methode biedt een betrouwbaar model voor vasculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We erkennen financiële ondersteuning van de American Heart Association Scientist Development Grant, 13SDG14670062 (PWA) en de University of Minnesota Doctoral Dissertation Fellowship (ESH). We erkennen ook de microfabricagebronnen van het Minnesota Nano Center (MNC) en de beeldverwerkingsbronnen van de University Imaging Centers (UIC), beide aan de University of Minnesota. Delen van dit werk werden uitgevoerd in de Karakteriseringsfaciliteit, University of Minnesota, die gedeeltelijke ondersteuning ontvangt van NSF via het MRS-programma.

<ol><li>Humphrey, J. D., Baek, S., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemomechanics+of+cerebral+vasospasm+and+its+resolution%3A+I.+A+new+hypothesis+and+theoretical+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Biochemomechanics of cerebral vasospasm and its resolution: I. A new hypothesis and theoretical framework.</a> Ann. Biomed. Eng. 35, 1485-1497 (2007).</li>
<li>Hald, E. S., Alford, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+phenotype+switching+in+blast+traumatic+brain+injury-induced+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle phenotype switching in blast traumatic brain injury-induced cerebral vasospasm.</a> Transl. Stroke Res. 5, 385-393 (2014).</li>
<li>Olivetti, G., Anversa, P., Melissari, M., Loud, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometry+of+medial+hypertrophy+in+the+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Morphometry of medial hypertrophy in the rat thoracic aorta.</a> Lab. Invest. 42, 559-565 (1980).</li>
<li>, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-241 (2000).</li>
<li>Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biohybrid+thin+films+for+measuring+contractility+in+engineered+cardiovascular+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle.</a> Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).</li>
<li>Rhodin, J. A. G. Architecture of the vessel wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRhodin%2C+JAG+%22Physiol.+Rev%22">Physiol. Rev</a>. ed, B. erne,R. ., , American Physiology Society. (1979).</li>
<li>Balachandran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+strain+induces+dual-mode+endothelial-mesenchymal+transformation+of+the+cardiac+valve%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 19943-19948 (2011).</li>
<li>Grosberg, A., Alford, P. W., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensembles+of+engineered+cardiac+tissues+for+physiological+and+pharmacological+study%3A+heart+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ensembles of engineered cardiac tissues for physiological and pharmacological study: heart on a chip.</a> 11, 4165-4173 (2011).</li>
<li>Alford, P. W., Nesmith, A. P., Seywerd, J. N., Grosberg, A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+contractility+depends+on+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle contractility depends on cell shape.</a> Integr. Biol. (Camb). 3, 1063-1070 (2011).</li>
<li>Win, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+architecture+within+cell-dense+vascular+tissues+influences+functional+contractility%29%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle architecture within cell-dense vascular tissues influences functional contractility).</a> Integr. Biol. (Camb). , (2014).</li>
<li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio%2Fnon-bio+interfaces%3A+a+straightforward+method+for+obtaining+long+term+PDMS%2Fmuscle+cell+biohybrid+constructs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface+B%22%5BJournal%5D)">Bio/non-bio interfaces: a straightforward method for obtaining long term PDMS/muscle cell biohybrid constructs).</a> Colloid Surface B. 105, 144-151 (2013).</li>
<li>Fessel, G., Cadby, J., Wunderli, S., van Weeren, R., Snedeker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-+and+time-dependent+effects+of+genipin+crosslinking+on+cell+viability+and+tissue+mechanics+-+Toward+clinical+application+for+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Dose- and time-dependent effects of genipin crosslinking on cell viability and tissue mechanics - Toward clinical application for tendon repair.</a> Acta Biomater. , (2013).</li>
<li>Lima, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genipin+enhances+the+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage+and+protects+against+inflammatory+degradation+when+used+as+a+medium+supplement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Genipin enhances the mechanical properties of tissue-engineered cartilage and protects against inflammatory degradation when used as a medium supplement.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 692-700 (2009).</li>
<li>Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadhavan%2C+K+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22">J. Biomed. Mater. Res. A</a>. , (2011).</li>
<li>Satyam, A., Subramanian, G. S., Raghunath, M., Pandit, A., Zeugolis, D. I. In vitro evaluation of Ficoll-enriched and genipin-stabilised collagen scaffolds. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSatyam%2C+A+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22">J. Tissue Eng. Regen. Med</a>. , (2012).</li>
<li>Alford, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast-induced+phenotypic+switching+in+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 12705-12710 (2011).</li>
<li>Song, H., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+system+for+controlling+reaction+networks+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A microfluidic system for controlling reaction networks in time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 768-772 (2003).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+vascular+contractility+assay+using+genipin-modified+muscular+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Long-term vascular contractility assay using genipin-modified muscular thin films.</a> Biofabrication. 6, 045005(2014).</li>
<li>Han, M., Wen, J. K., Zheng, B., Cheng, Y., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+deprivation+results+in+redifferentiation+of+human+umbilical+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C50-C58 (2006).</li>
<li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+thin+films+for+building+actuators+and+powering+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Muscular thin films for building actuators and powering devices.</a> Science. 317, 1366-1370 (2007).</li>
<li>Volfson, D., Cookson, S., Hasty, J., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+ordering+of+dense+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Biomechanical ordering of dense cell populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15346-15351 (2008).</li>
<li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+remodeling+in+hypertension%3A+roles+of+apoptosis%2C+inflammation%2C+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis.</a> Hypertension. 38, 581-587 (2001).</li>
<li>Kayembe, K. N., Sasahara, M., Hazama, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+aneurysms+and+variations+in+the+circle+of+Willis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral aneurysms and variations in the circle of Willis.</a> Stroke. 15, 846-850 (1984).</li>
<li>McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromolded+gelatin+hydrogels+for+extended+culture+of+engineered+cardiac+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues.</a> Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).</li>
<li>Weir, B., Grace, M., Hansen, J., Rothberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+vasospasm+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Time course of vasospasm in man.</a> 48, 173-178 (1978).</li>
<li>McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+maladaptive%2C+multiscale+remodeling+of+failing+myocardium+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).</li>
<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).</li>
<li>Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+physiological+biomimicry%3A+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips.</a> Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).</li>
<li>Meer, A. D., van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips%3A+breaking+the+in+vitro+impasse%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse.</a> Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een protocol dat gebaseerd is op eerder ontwikkelde vMTF technologie, waardoor langere experiment keer meer kenmerkend vasculaire chronische ziekteprocessen 1,23,24. Hiervoor micropatroon we genipin, die vooraf is aangetoond dat langdurige functionalisering van PDMS substraten 11 indienen waarbij een microfluidic depositietechniek op gemanipuleerde arteriële lamellen met verbeterde vasculair levensvatbaarheid van weefsel voor gebruik in MTF contractiliteitsstudies verkregen. McC...

Vasculaire ziekten, zoals cerebrale vasospasmen 1,2, 3 hypertensie en atherosclerose 4, langzaam ontwikkelen, zijn gewoonlijk chronisch van aard en omvatten disfunctionele kracht generatie door vasculaire gladde spiercellen (VSMC&#39;s). Wij streven ernaar om deze langzaam vordert vasculaire disfuncties met in vitro methoden met fijnere controle van de experimentele omstandigheden dan in in vivo modellen te bestuderen. We hebben eerder ontwikkelde vasculaire gespierde dunne films (vMTFs) voor het meten van functionele contractiliteit van in vitro gemanipuleerde cardiovasculaire weefsels 5, maar deze methode is beperkt tot een relatief korte termijn studies. Hier presenteren we een substraat modificatie techniek die onze vorige vMTF techniek breidt voor langdurige metingen. Terwijl het endotheel is ook kritisch in algemene vasculaire functie ontworpen arteriële lamellen een bruikbaar model systeem voor het vastleggen van veranderingen in vasculairecontractiliteit tijdens progressie van de ziekte. Een functionele vaatziekte weefselmodel zowel de structuur en functie van de arteriële lamel ingenieur, de basis contractiele apparaat van het vaartuig moet worden recapituleerde een hoge getrouwheid. Arteriële lamellen concentrisch omtrek uitgelijnde vellen contractiele VSMC gescheiden vellen van elastine 6. Microcontact printen van extracellulaire matrix (ECM) eiwitten op polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten is eerder gebruikt als leidraad signalen voor weefselorganisatie nabootsen uitgelijnd cardiovasculair weefsel 5,7-10. Echter, weefsels gevormd via microcontact afdrukken kan integriteit verliezen na 3-4 dagen kweken beperking van hun toepasbaarheid bij chronische studies. Dit protocol voorziet in een oplossing voor dit probleem door het vervangen van de vorige microcontact druktechnieken met een nieuwe microfluïdische depositie techniek. Genchi et al. Gemodificeerde PDMS substraten met genipin en found langdurige levensvatbaarheid van myocytes tot een maand in de cultuur 11. Hier gebruiken we een soortgelijke benadering van cultuur van patroon vasculaire gladde spiercellen te breiden op PDMS. Genipin, natuurlijke hydrolytische afgeleide van de gardenia fruit, een gewenste kandidaat voor modificatie substraat vanwege de relatief lage toxiciteit in vergelijking met soortgelijke verknopingsmiddelen en het toenemende gebruik als een biomateriaal in het gebied van weefselherstel 12,13 en ECM modificatie 14, 15. In dit protocol wordt fibronectine gebruikt als een cel begeleiding cue, net als in voorgaande microcontactprinten methoden; echter genipin afgezet op PDMS substraten voorafgaand aan fibronectine patronen. Dus, zoals cellen afbreken van de matrix patroon, nieuw gesynthetiseerde ECM van aangesloten VSMC kan binden aan het PDMS-genipin beklede substraat. Dit protocol maakt gebruik van een microfluïdische afleverinrichting voor tweefasige genipin en ECM afzetting. Het ontwerp van de microfluïdische apparaat bootst microcontact drukpatronen ontworpen voor arteriële lamellen in eerdere studies 16. Zo verwachten we dat dit protocol om arteriële lamellen bootst dat succes herhalen de zeer uitgelijnd in vivo structuur en de contractiele functie van de arteriële lamellen opleveren. We hebben ook weefsel contractiliteit te evalueren om te bevestigen dat genipin een geschikt substraat modificatie compound voor langdurige in vitro vasculaire ziektemodellen.

<table><tbody><tr><td>Coverslip staining rack</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com/</a></td><td>72239-04</td></tr><tr><td>Microscope cover glass - 25 mm</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com</a></td><td>12-545-102</td></tr><tr><td>Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>#21458</td></tr><tr><td>1-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>360465</td></tr><tr><td>Spincoater</td><td>Specialty Coating Systems, Inc.</td><td><a href="http://www.scscoatings.com/">www.scscoatings.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives (Dow Corning)</td><td><a href="http://www.ellsworth.com/">www.ellsworth.com</a></td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td></tr><tr><td>Fluorescent microbeads</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>17151</td></tr><tr><td>Silicon wafers</td><td>Wafer World, Inc.</td><td><a href="http://www.waferworld.com/">www.waferworld.com</a></td><td>2398</td></tr><tr><td>Photoresist&nbsp;</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Contact mask aligner</td><td>Suss MicroTec</td><td><a href="http://www.suss.com/">www.suss.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Tridecafluro-trichlorosilane</td><td>UCT Specialties, Inc.</td><td><a href="http://www.unitedchem.com/">www.unitedchem.com</a></td><td>T2492</td></tr><tr><td>Surgical biopsy punch</td><td>Integra LifeSciences Corp.</td><td><a href="http://www.miltex.com/">www.miltex.com</a></td><td>33-31AA-P/25</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Cayman Chemical</td><td><a href="http://www.caymanchem.com/">www.caymanchem.com</a></td><td>10010622</td></tr><tr><td>1X phosphate buffered saline</td><td>Mediatech, Inc.</td><td><a href="http://www.cellgro.com/">www.cellgro.com</a></td><td>21-031-CV</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Corning, Inc.</td><td><a href="http://www.corning.com/">www.corning.com</a></td><td>356008</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Life Technologies, Inc.</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">www.lifetechnologies.com</a></td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Umbillical artery smooth muscle cells</td><td>Lonza</td><td><a href="http://www.lonza.com/">www.lonza.com</a></td><td>CC-2579</td></tr><tr><td>Tyrode's solution components</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>various</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td><td>4350020000000000</td></tr><tr><td>Temperature-controlled platform</td><td>Warner Instruments</td><td><a href="http://www.warneronline.com/">www.warneronline.com</a></td><td>641659; 640352; 641922</td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>E7764-50UG</td></tr><tr><td>HA-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>H139-10MG</td></tr></tbody></table>

microfluïdische genipin deposition techniek voor extended cultuur van micropatterned vascular gespierd thin films

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

De chronische aard van de progressie van vasculaire ziekten vereist de ontwikkeling van experimentele technieken die fysiologisch en pathologisch vaatgedrag simuleren op ziekterelevante tijdschalen. Eerder is microcontactprinting gebruikt om functionele arteriële tweedimensionale modellen te fabriceren door het patternen van extracellulaire matrixeiwitten als richtlijnen voor weefselorganisatie. Vasculaire dunne spierfilms gebruikten deze modellen om de functionele contractiliteit te beoordelen. Echter, de gebruikte microcontactprinting-fabricagetechniek bevat doorgaans hydrofobe PDMS-substraten. Terwijl het weefsel de onderliggende extracellulaire matrix vernieuwt, moeten nieuwe eiwitten een conformationele verandering of denaturatie ondergaan om hydrofobe aminozuurresiduen bloot te stellen aan de hydrofobe PDMS-oppervlakken voor hechting, wat resulteert in veranderde bioactiviteit van matrixeiwitten, delaminatie en dood van de weefsels.
Hier presenteren we een microfluïdische depositietechniek voor het patternen van de crosslinkerverbinding genipine. Genipine dient als tussenpersoon tussen gepatternde weefsels en PDMS-substraten, waardoor cellen nieuw gesynthetiseerd extracellulair matrixeiwit op een meer hydrofiele oppervlakte kunnen afzetten en verbonden blijven met de PDMS-substraten. We tonen ook aan dat extracellulaire matrixeiwitten direct op afgezet genipine kunnen worden gepatternd, waardoor de dictie van geëngineerde weefselstructuur mogelijk wordt. Weefsels die met deze techniek zijn gemaakt, vertonen een hoge nauwkeurigheid in zowel structurele uitlijning als contractiele functie van vaatglad spierweefsel in een vaatmusculaire dunne filmmodel. Deze techniek kan worden uitgebreid met behulp van andere celtypen en biedt het kader voor toekomstig onderzoek naar chronische weefsel- en orgaanfuncties.

Het primaire doel van dit werk was om de levensvatbaarheid van micropatterned VSMCs op hydrofobe PDMS substraten uit te breiden. Dit werd bewerkstelligd door het opnemen van een microfluïdische afgiftesysteem patroonmatig genipin en fibronectine aan PDMS (figuur 1) te deponeren. Depositie van ECM eiwitten met behulp van microfluïdische aflevering leverde high fidelity overdracht van het kanaal patroon met blote PDMS tussen de lijnen van genipin en fibronectine (figuur 1D). De gehechte c...

We presenteren een methode voor microfluïdische depositie van genipine en fibronectine met een patroon op PDMS-substraten, waardoor een langere levensvatbaarheid van weefsels met een hoge dichtheid aan vasculaire gladde spiercellen mogelijk wordt. Deze weefselfabricagemethode wordt gecombineerd met eerdere technologie voor dunne vaatwandfilms om de vasculaire contractiliteit te meten gedurende tijdsverlopen die relevant zijn voor ziekten.

Microfluïdische Genipin Deposition Techniek voor Extended Cultuur van micropatterned Vascular Gespierd Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een in vitro model van de contractiele functie van gladde spieren dat kan worden gebruikt om de mechanismen van vasculaire dysfuncties, zoals cerebrale vasospasmen over ziekte-relevante tijdsbestekken, te bestuderen. Dit wordt bereikt met langdurige vasculaire musculaire dunne films door eerst elastomeersubstraten te prepareren door dekglasjes herhaaldelijk te spincoaten met een strook piam gevolgd door PDMS. De tweede stap is het gebruik van een microfluïdisch depositieapparaat om genin en fibronectine sequentieel op het oppervlak aan te brengen.Om begeleidende signalen te bieden voor de zelforganisatie van weefsel op vasculair-musculaire dunne films, is de laatste stap het uitvoeren van een contractiliteitsassay door de vasculair-musculaire dunne films contractie en ontspanning van de contractie te laten induceren terwijl het monster wordt afgebeeld. Uiteindelijk levert deze aanpak weefsels op die de structurele getrouwheid en functionele contractiliteit tot twee weken in cultuur behouden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals met micro-contactdruk geprinte musculaire dunne films, is dat de weefselintegriteit en functionele contractiliteit wekenlang behouden blijven, terwijl weefsels die met eerdere methoden zijn geconstrueerd na drie tot vier dagen beginnen te degraderen.In kweek biedt deze methode een platform voor het bestuderen van kernvragen over vaatziekten, zoals de wijze waarop de functionele mechanica van slagaders verandert tijdens de progressie van een chronische ziekte. Hier bestuderen we de vasculaire mechanica, maar deze methode kan worden toegepast op andere model-organsystemen, zoals organ-on-a-chip-technologieën om hart- of skeletspierfuncties na te bootsen. We kregen het idee voor deze methode toen we langzaam ontwikkelende vasculaire dysfuncties wilden bestuderen en ontdekten dat huidige methoden ofwel niet konden worden gebruikt om de functie van vasculaire gladde spiercellen te kwantificeren, of de integriteit niet gedurende een voldoende lange periode konden behouden.Jin Microfluidische depositie biedt een sjabloon voor cel-zelforganisatie op een manier die vergelijkbaar is met die van microcontactprinten, maar stelt gepatroneerde weefsels ook in staat om hun structuur en integriteit te behouden gedurende tijdsintervallen die geschikt zijn voor het bestuderen van vasculaire remodellering. Begin met het reinigen van een batch glazen dekglasplaatjes met een diameter van 25 millimeter zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol; bedek de randen van de gereinigde dekglasplaatjes door plakband op de zijkanten aan te brengen, waarbij een strook glas in het centrum vrij blijft. Snijd vervolgens de dekglasplaatjes uit de schaal en plaats ze één voor één op een spin-coated chuck.Voeg met een pincet 150 µL van een 10% oplossing van poly N-isopropylacrylamide toe, ook wel poly PAM of Piam genoemd, opgelost in 1-butanol. Zorg ervoor dat het blootgestelde gedeelte van het dekglas volledig wordt bedekt.Zet vervolgens de spin-coater aan en verhoog de snelheid gedurende 10 seconden naar 3000 RPMs. Wacht vijf seconden en verhoog de snelheid vervolgens gedurende 10 seconden naar 6, 000 RPMs. Houd 6, 000 RPMs gedurende één minuut aan en verlaag de snelheid daarna in 10 seconden terug naar 3000 RPMs.Houd dit vijf seconden vast voordat de spincoatingcyclus wordt voltooid. Verwijder, zodra het droog is, voorzichtig de plakband van alle dekglasplaatjes, zodat het volledige dekglasplaatje is vrijgelegd met een dunne laag piam-coating in het midden van het glazen dekglasplaatje. Spincoat vervolgens een laag Degas PDMS op elk dekglasplaatje.Glijd ze in elkaar en harden ze uit in een oven bij 90 °C gedurende ten minste 1,5 uur. Ontwerp een foto-masker voor weefselmicrofluïdische toepassingen en bereid vervolgens een gepatroneerde siliciumwafer voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Ets de wafer na het patroneren met standaardtechnieken en plaats deze met de functionele zijde naar boven in een Petrischaal.Meng vervolgens 100 gram PDMS met een crosslinker-verhouding van 10 op 1; giet de PDMS in de schaal zodat de gepatrooneerde wafer volledig en gelijkmatig wordt bedekt. Plaats de schaal gedurende ongeveer 30 minuten in een vacuümdesiccator totdat alle luchtbellen zijn verwijderd. Uitharden de PDMS vervolgens in de schaal bij 90 °C gedurende ten minste 1,5 uur.Zodra het is uitgehard, snijdt u het overtollige PDMS weg en pelt u het resterende gepatronde PDMS langzaam van de patroonzijde van de wafer. Verwijder het overtollige PDMS rondom de patronen met een scheermesje en vorm de devices in rechthoeken om de verwijdering van het device in latere stappen te vergemakkelijken. Gebruik vervolgens een chirurgische biopsietpons van één millimeter om zowel de inlaat- als uitlaatgaten te maken.Sonicate microfluïdische apparaten in 70% ethanol gedurende ten minste 30 minuten voorafgaand aan elk gebruik. Plaats maximaal 10 dekglasjes met vasculaire spierdunne-film-substraten gedurende acht minuten in een ultraviolette ozonreiniger. Bereid vervolgens een genine-oplossing van vijf milligram per milliliter door één milliliter steriel dubbel gedistilleerd water toe te voegen aan een container van vijf milligram gelyofiliseerde genine.Meng de oplossing met een vortexmixer en zet het flesje minstens 30 minuten bij kamertemperatuur opzij. Plaats de gereinigde microfluïdische apparaten met de functionele zijde naar beneden op elke afdekking. Schuif ze één voor één op hun plaats.Druk de apparaten stevig aan om een goede afdichting op de met PDMS gecoate dekglasjes te garanderen. Plaats snel een druppel 70% ethanol bij de inlaat van elk apparaat voor het primen van het apparaat. Aspireer na vijf tot 10 minuten voorzichtig de overtollige ethanol bij de inlaat en vervang deze onmiddellijk door ongeveer 100 µL PBS.Gebruik een vacuüm om PBS door de uitlaat van de apparaten te trekken om de ethanol weg te spoelen. Stop wanneer er slechts een kleine hoeveelheid PBS bij de inlaat overblijft. Plaats vervolgens 60 µL van de 5 mg/mL genine-oplossing bij elke inlaat en trek de genine-oplossing door de apparaten door een vacuümaspiratietip bij de uitlaat te plaatsen.Stop de zuigwerking wanneer er slechts een kleine hoeveelheid oplossing bij de inlaat overblijft. Plaats vervolgens druppels PBS bij zowel de inlaat als de uitlaat om te voorkomen dat de oplossing uitdroogt. Verplaats tijdens de incubatie de schaal met de apparaten naar een bevochtigde oven of incubator die is ingesteld op 37 °C en incubeer gedurende vier uur.Resuspendeer tijdens de incubatie fibronectine tot een concentratie van 50 micrograms per milliliter in steriel dubbel gedestilleerd water en plaats het gedurende ten minste 30 minuten op ijs na de incubatie met Jin. Trek een minimale hoeveelheid PBS door de inlaat. Voeg vervolgens 100 microliters van een 50 microgram per milliliter fibronectine-oplossing toe.Trek bij elke inlaat de oplossing door de apparaten met behulp van een vacuümaspiratietip. Verplaats bij de uitlaat de onafgedekte schaal met de apparaten naar een oven of incubator die is ingesteld op 37 °C en incubeer gedurende 24 uur. Verwijder na incubatie de apparaten voorzichtig van de dekglasjes door het apparaat langzaam bij een hoek los te pellen terwijl u het dekglasje met de andere hand lichtjes vasthoudt; plaats de dekglasjes vervolgens in steriele platen met zes putjes.Voeg ten minste vijf milliliters penicilline-streptomycine-oplossing toe aan elke put, en plaats de schalen vervolgens in een steriele incubator bij 37 degrees Celsius gedurende ten minste 30 minuten. Zuig na sterilisatie de penicilline-streptomycine-oplossing af en zaai de dekglasjes met gekweekte menselijke navelarterie vasculaire gladde spiercellen bij een concentratie van 80 000 cellen per vierkante centimeter. Incubeer de cellen bij 37 degrees Celsius en 5%carbon dioxide gedurende ten minste 24 uur voorafgaand aan de test.Om met het testen te beginnen, plaatst u een weefselmonster in een schaal van 100 millimeter. Voeg steriele, voorverwarmde tyro-oplossing bij pH 7.4 toe om het monster te bedekken. Maak met een scheermesje verschillende parallelle sneden door de cellaag, loodrecht op de rand van de pijparm.Maak sneden die bredere weefselsecties opleveren van ongeveer twee millimeter dik. Dit zullen de vasculaire musculaire dunne films zijn, afgewisseld met dunne strips die later worden verwijderd. Draai vervolgens het schaaltje 90 graden en maak twee rechte parallelle sneden in het midden van het weefsel, parallel aan de strip piam.Verwijder de dunne strips tussen de vasculaire, musculaire dunne films om te voorkomen dat aangrenzende films contact maken. Plaats de schaal vervolgens op een temperatuurgecontroleerd platform op de tafel van de stereomicroscoop en begin met het vastleggen van time-lapse-beelden, transmissiebeelden en fluorescentiebeelden met de gewenste intervallen gedurende de behandelingsassay. Behandel de vasculaire musculaire dunne films opeenvolgend met 50 nanomolar endothelium, gedurende 20 minuten om contracties op te wekken, gevolgd door 100 micromolar HA 10 77 gedurende 30 minuten om relaxatie op te wekken na afkoeling tot onder de 32 degrees Celsius.De piamater oplost, waardoor de vasculair musculaire dunne films vrijkomen. De meting van de projectielengte kan worden omgezet in een krommingsstraal, die wordt gebruikt om de gemiddelde spanning in de cellaag op de film te berekenen, zoals hier getoond in de opeenvolgende transmissielichtbeelden van een representatieve contractiliteitsassay. Deze beelden kunnen worden omgezet in spanningswaarden, waaruit de basale tonus en de geïnduceerde contractiliteit worden berekend.In deze video wordt een representatieve time-lapse van een volledige contractiliteitsanalyse getoond. Musculaire dunne films bereiken een contractiel evenwicht en trekken vervolgens verder samen na toevoeging van 50 nM endothelium. Eén film ontspant na toevoeging van 100 µM ha 10 77.De lichte daling in basale tonus en weefselcontractiliteit aan het einde van de assay is waarschijnlijk het directe gevolg van het verminderde aantal cellen dat het weefsel samenstelt. Aangezien serumuitgehongerde vasculaire gladde spiercellen niet prolifereren, worden hier fasecontrastbeelden getoond van gladde spiercellen gekweekt op met genine gemodificeerde oppervlakken op verschillende tijdspunten van opoffering, variërend van één dag tot twee weken. Immunohistochemie werd hier gebruikt om de confluentie en cellulaire uitlijning van de weefsels te benadrukken door de F actin-filamenten groen te kleuren na één, vier en zeven dagen serumuithongering.Kwantitatieve beoordeling van de weefselconfluentie over deze tijdsperiode toonde een minimale verslechtering op deze oppervlakken. De uitlijning van de f-actinefilamenten werd gekwantificeerd en het werd bevestigd dat de uitlijning gedurende de twee weken behouden bleef. In kweek kan deze in vitro weefselfabricatietechniek, zodra deze beheerst is, in twee dagen worden uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de microfluïdische depositie een dag vóór de geplande celzaai moet worden gestart en dat een constante fysiologische temperatuur tijdens de experimenten met de vinfilm moet worden gehandhaafd. Na deze procedure kunnen traditionele biochemische methoden, zoals Western blotting en PCR, worden uitgevoerd om veranderingen in eiwit- en genexpressie te bestuderen, zodat het celfenotype kan worden gecorreleerd aan het functionele gedrag. Deze techniek biedt onderzoekers de mogelijkheid om de progressie van langzaam ontwikkelende vasculaire dysfuncties, zoals cerebrale vasospasmen, hypertensie en atherosclerose, en in vitro modellen van de menselijke arteriële wand te onderzoeken.

microfluidic-genipin-deposition-technique-for-extended-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit protocol, tonen we de fabricage van een Microactuator reeks van verticaal verschoven berichten op de technologie gebaseerd is, en hoe deze basistechnologie kunnen worden gewijzigd om high-throughput mechanisch dynamische celkweek te voeren in zowel twee-dimensionale en drie-dimensionale cultuur paradigma's.

Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

Eenvoudige technieken worden beschreven voor de snelle productie van microfabricated neurale cultuur systemen met behulp van een digitale microspiegeltjes voor dynamische masker projectie lithografie op regelmatige celcultuur substraten. Deze cultuur systemen kunnen meer representatief zijn voor natuurlijke biologische architectuur, en de beschreven technieken kan worden aangepast voor tal van toepassingen.

Fabricage van micropatterned Hydrogelen voor Neurale Cultuur Systems met behulp van Dynamic Mask Projectie Fotolithografie

Een methode om cultuur een endotheelcel monolaag het gehele inwendige oppervlak van een 3D microfluïdische apparaat met microvasculaire grootte kanalen (&lt;30 pm) beschreven.

Endothelialized Microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire Interacties in Hematologische ziekten

Een microchannels-on-a-chip platform werd ontwikkeld door de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics. Het endotheel microkanalen platform bootst de driedimensionale (3D) geometrie van in vivo micro-vaatjes, loopt onder gecontroleerde continue perfusie stroom, zorgt voor hoge kwaliteit en real-time beeldvorming en kan worden toegepast voor microvasculaire onderzoek.

Procedure voor de ontwikkeling van multi-diepte Circulaire Cross-sectionele endotheel Microkanalen-on-a-chip

De creatie van functionele microweefsels binnen microfluïdische apparaten vereist de stabilisatie van celfenotypen door traditionele celkweektechnieken aan te passen aan de beperkte ruimtelijke dimensies in microapparaten. Aanpassing van collageen maakt de laag-voor-laag afzetting van ultradunne collageenstructuren mogelijk die primaire cellen, zoals hepatocyten, kunnen stabiliseren als microfluïdische weefselmodellen.

Layer-by-layer Collageen depositie in Microfluïdische Inrichtingen voor Microtissue Stabilization

Dit manuscript bevat een spuitgiet methode om microvaten dat fysiologische eigenschappen van endotheel recapituleren ingenieur. De microfluïdische-based proces creëert patent 3D vasculaire netwerken met tailorable omstandigheden, zoals stroom, cellulaire samenstelling, geometrie, en biochemische hellingen. Het fabricageproces en voorbeelden van mogelijke toepassingen worden beschreven.

Micropatterning en montage van 3D microvaten

Dit protocol beschrijft de implementatie van beeldgestuurde, lasergebaseerde hydrogeldegradatie om vasculair-afgeleide, biomimetische microfluïdische netwerken te fabriceren die zijn ingebed in poly(ethyleenglycol) diacrylaat (PEGDA) hydrogels. Deze biomimetische microfluïdische systemen kunnen nuttig zijn voor weefselengineering toepassingen, generatie van in vitro ziektemodellen en fabricage van geavanceerde "on-a-chip" apparaten.

Beeldgeleide, Laser-gebaseerde Fabrication of Vascular-afgeleide microfluïdische Networks

Wij bieden een veralgemeende protocol gebaseerd op een strategie van de bioprinting microfluidic voor een vezelige vasculaire bed, waar een secundaire celtype verder zou kunnen worden uitgezaaid in de interstitiële ruimte van deze vezelige structuur voor het genereren van gevacuoliseerd weefsels en organoids engineering.

Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

Het protocol wordt beschreven hoe een perfusable vasculaire netwerk in een sferoïde ingenieur. Van de sferoïde omliggende communicatie is bedacht om te induceren angiogenese en de sferoïde verbinden met de microchannels in een microfluidic apparaat. De methode staat de perfusie van het sferoïde, die een langverwachte techniek in driedimensionale culturen is.

Perfusable vasculaire netwerk met een Model van het weefsel in een Microfluidic-apparaat

Hier bieden we een microfluïdische chip en een automatisch gecontroleerd, zeer efficiënt circulatiemicrofluïdisch systeem dat de initiële micromilieu van neovascularisatie samenvat, waardoor endotheelcellen (EC's) tegelijkertijd kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) distributie tegelijkertijd.

Microfluïdisch model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie na te bootsen

Hier presenteren we een protocol om een driedimensionaal vereenvoudigd en ongedifferentieerd huidmodel te genereren met behulp van een microgemachineerd microfluïdisch platform. Een parallelle stromingsbenadering maakt de in situ afzetting van een dermale compartiment mogelijk voor het zaaien van epitheelcellen bovenop, allemaal geregeld door spuitpompen.

Generatie van een vereenvoudigd driedimensionaal huid-op-een-chip-model in een microgemachineerd microfluïdisch platform

Leer microfluïdische genipin-depositie voor langdurige cultuur van vasculaire gespierde dunne films met behoud van contractiliteit tot twee weken. Deze methode biedt een betrouwbaar model voor vasculair onderzoek.

Microfluïdische Genipin Deposition Techniek voor Extended Cultuur van micropatterned Vascular Gespierd Thin Films

Meer video's verkennen