Name: T-cellen Capture Bacteriën door Transinfection van dendritische cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Leer hoe CD4+ T-cellen bacteriën vastleggen via transinfectie van geïnfecteerde dendritische cellen in een muismodel. Deze methode kwantificeert bacteriële opname en toont aan dat T-cellen effectiever doden dan professionele fagocyten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC van het Spaanse Ministerie van Wetenschap en Innovatie en PIES201020I046 van Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).

Opmerking: Experimentele procedures werden goedgekeurd door het Comité voor onderzoek Ethiek van de Universidad Autònoma de Madrid en uitgevoerd onder toezicht van de Universidad Autònoma de Madrid Hoofd van dierenwelzijn en gezondheid in overeenstemming met de Spaanse en Europese richtlijnen. Muizen werden gekweekt in specifieke pathogeenvrije (SPF) huisvesting en ze werden gedood door opgeleid en gekwalificeerd personeel met behulp van kooldioxide (CO 2) inademing methode. 1. Mouse Bone Marrow-afgeleide DCs Differentiatie en de Infection Opmerking: Figuur 1 vat deze eerste stap. Alle procedures moeten in de kap van dit punt worden uitgevoerd, met alleen steriele media, instrumenten, pipetpunten en cultuur gerechten. <ol><li> Muis Bone Marrow-afgeleide DCs Differentiatie <ol><li> Ontleden dij- en dijbenen van een C57 / BL6 muizen en 22 over in een kunststof schaal met 10 ml RPMI medium. </li&gt; <li> Snijd elke epifyse af, met een steriele schaar en beenmerg, die een karakteristieke fel rode kleur heeft bloot. </li><li> Infundeer de binnenkant van het bot met 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (PBS / BSA / EDTA buffer) met een steriele spuit op een steriele Petri schotel. </li><li> Verzamel de celsuspensie en centrifugeer in een buis bij 600 xg in een gekoelde centrifuge (4 ° C). </li><li> Resuspendeer de cellen in 1 ml ammonium-chloride-Kalium (ACK) lyserende buffer (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3 en 0,1 mM EDTA) en incubeer gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te elimineren. </li><li> Voeg 10 ml van RPMI 1640-medium met 10% foetaal runderserum (FBS) en filtreer door een cel zeef (70 um) om botfragmenten en celklonten verwijderen voordat centrifugeren bij dezelfde snelheid (600 xg) omdat klonten werden verwijderd door filtreren. </li><li> Tel de cellen van eend passen tot 5 x 10 5 cellen / ml met RPMI 10% FBS (bevattende 50 uM B-mercaptoethanol, 1 mM natrium pyruvaat) en voeg 20 ng / ml recombinant murine granulocyt macrofaag-kolonievormende stimulerende factor (rm-GM-CSF) als eindconcentratie. </li><li> Voeg deze suspensie aan een steriele, microbiologische kwaliteit, 15 cm Petrischaal en cultuur in een CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Om de drie dagen, het afsluiten zowel niet-hechtende cellen en losgemaakte cellen met 5 mM EDTA in PBS en resuspendeer in 5 x 10 5 cellen / ml celdichtheid, vers medium bevattende 20 ng / ml rm-GM-CSF. </li></ol></li><li> Rijping van DCs en Antigen laden <ol><li> Op dag 9, resuspendeer de cellen bij 5 x 10 5 cellen / ml dichtheid in medium bevattende 20 ng / ml rm-GM-CSF. Voeg dan 20 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) naar hoog MHC-II expressie mogelijk maken op cellen en incubeer in een niet-weefselkweek behandelde steriele 15 cm Petrischaal van 24 uur. </li><li> Na ééndag van de LPS-stimulatie, vlekken sommige DC cellen met antilichamen tegen muis CD11c, MHCII en Gr-1 DC differentiatie te controleren door flowcytometrie. Een voorbeeld van flowcytometrie analyse van DCs wordt getoond in figuur 3A en 3B. <ol><li> Incubeer DCs (5 x 10 5 cellen / monster) met een anti-muizen-CD16 / CD32 monoklonaal antilichaam bij 2,5 ug / ml eindconcentratie in 50 ul PBS / BSA / EDTA-buffer per monster. Daarna voeg 50 ul van de antilichamen tegen MHCII (IA / IE), CD11c en Gr-1 geconjugeerd met verschillende fluorochromen bij 1: 100, 1: 200 en 1: 500 in PBS / BSA / EDTA buffer respectievelijk. </li><li> Tenslotte wassen DCs met PBS / BSA / EDTA-buffer en geanalyseerd door flowcytometrie volgens het protocol van de fabrikant. Opmerking: Als de cellen zijn goed gedifferentieerde cellen zijn klaar voor antigeen laden. </li></ol></li><li> Wassen DCs RPMI met 10% FBS (zonder antibiotica) en incubeer ze met 10 ug / ml OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) op een kunststof buis 1 ml RMPI 10% FBS medium per 5 x 10 6 DCs gedurende minimaal 1 uur bij 37 * C. Als een negatieve controle, laat DC zonder incubatie met OVAp. </li></ol></li><li> Infectie van DCs <ol><li> Infect DCs bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 bacteriën (10 bacteriën per DC) gedurende 1 uur in een CO2-incubator (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Wash DC cellen 3x in PBS en 1 x in RMPI 10% FBS en centrifugeer bij 450 xg om zo extracellulair bacterieën. Tenslotte hersuspenderen cellen in RMPI 10% FBS medium (zonder antibiotica) en 20 x 10 6 cellen / ml. </li></ol></li></ol> 2. Isolatie van CD4 + T lymfocyten van OTII transgene muizen Opmerking: Figuur 1 geeft een overzicht van deze tweede stap. Lymfeklieren worden gebruikt in plaats van milt CD4 + T-cellen te isoleren, omdat het aandeel van CD4 + lymfocyten in lymfeklierens (~ 50%) groter is dan in de milt (~ 25%) en dat de zuivering zou effectiever zijn. <ol><li> Maak Single-cell Opschorting van de lymfeklieren <ol><li> Verwijder lies, oksel, brachiale, cervicale en mesenterische lymfklieren 23 van OTII transgene muizen en overbrengen in een plastic schaal met 10 ml RPMI 10% FBS medium. </li><li> Grind lymfeklieren onder een steriele kap met twee frosted microscoopglaasjes. Plaats lymfeklieren op een matte kant van een microscoopglaasje, en wrijf met een matte kant van de tweede schuif totdat organen grond zijn geweest. </li><li> Was enkele celsuspensie in PBS / BSA / EDTA buffer. </li><li> Filter de cellen hoewel een cel zeef (70 um) om bindweefsel te verwijderen en wassen met PBS / BSA / EDTA buffer. </li><li> Resuspendeer de cellen in 1 ml ACK lysisbuffer en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te elimineren. </li></ol></li><li> Isolatie van CD4 + T cellen <ol><li> Was opnieuw als in stap 2.1.3 en tellencellen te resuspenderen in 100 x 10 6 cellen / ml in PBS / BSA / EDTA buffer. Voeg gebiotinyleerde antilichamen tegen CD8, IgM, B220, CD19, MHC klasse II (I-Ab), CD 11 b, CD 11 c en DX5 op 1: 250 gedurende 30 min op ijs latere negatieve selectie van CD4 + T-cellen. </li><li> Was de cellen in PBS / BSA / EDTA-buffer en incubeer de cellen (100 x 10 6 cellen / ml) met streptavidine microkorrels met een concentratie aanbevolen protocol van de fabrikant gedurende 15 min op ijs. </li><li> Was de cellen in PBS / BSA / EDTA-buffer en filteren hoewel een cel zeef (30 um) voor CD4 + T cel isolatie. </li><li> Isoleer CD4 + T-cellen door negatieve selectie met een magnetische celscheiding machine volgens protocol van de fabrikant. </li><li> Tel de cellen en breng de 4 x 10 6 cellen / ml met RPMI 10% FBS medium (zonder antibiotica). </li><li> Vast te stellen en te houden op het ijs geïsoleerd CD4 + T-cellen (3 x 10 5 cellen) om de zuiverheid van stroom te controlerencytometer beschreven 24. Een voorbeeld van CD4 + T-cellen zuivering wordt getoond in figuur 3C. </li></ol></li></ol> 3. T-cel Transinfection Metingen door Gentamicin Protection Assay Opmerking: Figuur 2 geeft een overzicht van deze derde stap van het protocol. <ol><li> T-cel Transinfection <ol><li> Incubeer geïsoleerde CD4 + T-cellen met geïnfecteerde DC cellen (1: 1) (de DCs werden gedurende 1 uur en gewassen te elimineren vrije bacteriën) gedurende 30 min immuun synapsvorming toe in een CO2 incubator (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Voeg 0,5 ml van geïsoleerde CD4 + T-cellen (2 x 10 6 cellen) en 0,1 ml van geïnfecteerde DC (2 x 10 6 cellen) op een 24-well kweekplaat. Als negatieve controle infecteren direct 0,5 ml van CD4 + T-cellen bij een MOI van 10 bacteriën gedurende 30 min. </li><li> Omvat extra controles scheiden geïnfecteerde DC van T cellen met behulpeen polycarbonaat transwell barrière (met 3 micrometer poriegrootte), belemmeren DC-T fysiek contact. Voeg 0,1 ml van DCs in de transwell en 0,5 ml van CD4 + T-cellen in het onderste compartiment van het putje (24-putjes plaat). </li><li> Tenslotte voorzien RMPI medium totdat er 0,6 ml in elk putje gelijke volumes maken in alle monsters. </li><li> Na 30 min immune synapsvorming, voeg 100 ug / ml gentamicine en incubeer gedurende 1 uur voor het verzamelen van cellen in een CO2 incubator (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol></li><li> Opnieuw isolatie van CD4 + T cellen <ol><li> Verzamelen van niet-hechtende cellen en resuspendeer ze in PBS / BSA / EDTA buffer. De meeste van DCs blijven aan de plastic cultuur plaat bevestigd. Vortexbuizen zachtjes naar cel desaggregatie garanderen. Blijf 500 ul cel supernatant als controle blijkt dat gentamicine goed heeft gewerkt. </li><li> Opnieuw isoleren CD4 + T-cellen uit monsters die DC en T-cellen bevatten samen als in stap 2,2, Hoewel de meeste van de DCs op de plaat moeten bevestigd. Houd de monsters op ijs. Rekening houden met enige experimenten met minder dan 2% verontreiniging. Een voorbeeld van CD4 + T-cellen na zuivering transinfection is getoond in figuur 3D. </li></ol></li><li> Lyse T-cellen en Seed ze op Bacteriën Medium-agar platen. <ol><li> Was CD4 + T-cellen tweemaal met PBS. </li><li> Tel de cellen en resuspendeer ze op 2 x 10 6 cellen / ml in PBS. </li><li> Voeg 500 ul van 0,1% Triton X-100 in 500 pl T-cellen te lyseren op 1 x 10 6 cellen / ml, loslaten van de intracellulaire bacteriën uit de T-cellen. </li><li> Maak 3 seriële verdunningen van gelyseerde cellen en zaad 50 ul van elke verdunning op bacteriën medium agarplaten. Verdeel platen in 4 porties en het zaad van de verschillende verdunningen van gelyseerde cellen in elk deel. Representatieve resultaten worden weergegeven in figuur 4. <ol><li> Als controle, ook de plaatopgeslagen celsupernatant van de conjugaten op agar, dat gentamicine zorgen heeft goed gewerkt. Plaat ook geïnfecteerde DC&#39;s als een extra controle. Indien treedt vanaf DCs verontreinigingen (&lt;2%), aftrekken van de kolonievormende eenheden (CFU) gevonden lage DC verontreiniging. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Kwantificering van T-cel Transinfection door flowcytometrie Opmerking: Figuur 2 geeft een overzicht van deze stap. <ol><li> T Cell Transinfection <ol><li> Infect BMDCs zoals in stap 1,3, maar gebruik GFP tot expressie brengende bacteriën in dit geval. </li><li> Vlek CD4 + T-cellen (geïsoleerd uit lymfeknopen in stap 2,2) met een cel tracker chloormethyl aminocoumarin (CMAC) gedurende 30 min bij 37 ° C volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Was gelabelde CD4 + T-cellen tweemaal met RMPI 10% FBS (zonder antibiotica). </li><li> Incubeer geïnfecteerde DC (na 1 uur incuberen met bacteriën) met gelabelde CD4 +T-cellen gedurende 30 min immuun synapsvorming toestaan ​​bij 37 * C onder alle controles waarin in stap 3.1.1. </li></ol></li><li> Kleuring van geïnfecteerde CD4 + T cellen <ol><li> Na 30 min DC-T immune synapsvorming, verzamel cellen en wassen in PBS / BSA / EDTA. </li><li> Na twee wassingen met PBS / BSA / EDTA-buffer, afzonderlijke geaggregeerde cellen door voorzichtig vortexen de buizen. </li><li> Bevestig de monsters in 0,2 ml / buis met PBS dat 3% PFA gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Was ze vervolgens in PBS. </li><li> Incubeer met anti-muizen-CD16 / CD32 monoklonaal antilichaam (2,5 ug / ml) in 50 ul / monster PBS / BSA / EDTA gedurende 15 min op ijs met Fc receptoren van dendritische cellen te blokkeren. </li><li> Voeg een konijn anti-bacterie-antilichaam (10 ug / ml eindconcentratie) in 50 ul / monster PBS / BSA / EDTA gedurende 30 min op ijs extracellulaire bacteriën kleuren. </li><li> Was de cellen met PBS / BSA / EDTA en incuberen met een antilichaam tegen CD 11 c muis geconjugeerd met fycoerytrine (PE) en SEcondary antilichaam tegen konijn, geconjugeerd met andere fluorochroom zoals Alexa-Fluor 647 in 1: 200 in 100 ul / monster PBS / BSA / EDTA gedurende 30 min op ijs. </li><li> Was de cellen en monsters geanalyseerd door flow cytometrie. Niet vergeten een monster transinfected T-cellen met niet-fluorescerende bacteriën als negatieve controle en monsters gelabeld met één van elk fluorochroom gebruikt in het experiment om de monsters te compenseren en pas de flowcytometrie instellingen 25 omvatten. Representatieve analyse wordt getoond in figuur 5. Opmerking: Als de bacteriën geen GFP tot expressie, intracellulaire en extracellulaire bacteriën, label extracellulaire bacteriën te onderscheiden, repareren en doorlaatbaar monsters met Triton X-100 bij 0,5% in PBS gedurende 5 min. Daarna vlek totale bacteriën (intracellulaire + extracellulair) met een verschillend fluorochroom. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+microorganisms+and+activation+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of microorganisms and activation of the immune response.</a> Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).</li>
<li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+biology+of+the+cell%22">Molecular biology of the cell</a>. , Garland Science. New York. (1989).</li>
<li>Pancer, Z., Cooper, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The evolution of adaptive immunity.</a> Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).</li>
<li>Rhoades, R. A., Bell, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRhoades%2C+RA+%22Medical+Phisiology%22">Medical Phisiology</a>. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).</li>
<li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Invasion%3A+The+Paradigms+of+Enteroinvasive+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens.</a> Science. 304 (5668), 242-248 (2004).</li>
<li>Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+and+recognition+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation and recognition in bacterial infections.</a> Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Adhesion+and+Entry+into+Host+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells.</a> Cell. 124 (4), 715-727 (2006).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).</li>
<li>Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+clathrin+drives+actin+accumulation+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse.</a> Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).</li>
<li>Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+bone+marrow-derived+dendritic+cells+and+macrophages+to+productive+infection+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes.</a> Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).</li>
<li>Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN%2C+a+dendritic+cell-specific+HIV-1-binding+protein+that+enhances+trans-infection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells.</a> Cell. 100 (5), 587-597 (2000).</li>
<li>Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+mature+dendritic+cells%3A+Trojan+exosomes+riding+the+Trojan+horse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse.</a> PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740(2010).</li>
<li>Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+communication%3A+diverse+structures+for+exchange+of+genetic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information.</a> Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).</li>
<li>McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+serve+as+a+reservoir+for+Listeria+monocytogenes+growth+during+infection+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice.</a> Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).</li>
<li>Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+impairs+T+lymphocyte+dynamics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).</li>
<li>Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+kill+bacteria+captured+by+transinfection+from+dendritic+cells+and+confer+protection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice.</a> Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).</li>
<li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).</li>
<li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bone+marrow+derived+murine+dendritic+cells+for+use+in+2-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).</li>
<li>Inaba, K., Inaba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-isolation+of+Salmonella-infected+cells+with+defined+bacterial+load+from+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).</li>
<li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).</li>
<li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+X+%22Current+protocols+in+immunology%22">Current protocols in immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1(2008).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+th17+differentiation+of+na%C3%AFve+CD4+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765(2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li>
<li>Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+operation+of+a+flow+cytometric+immunophenotyping+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+diagnostic+pathology%22%5BJournal%5D)">Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory.</a> Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).</li>
<li>Itano, A. A., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+to+naive+CD4+T+cells+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node.</a> Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

T-cellen of T-lymfocyten een soort leukocyten die een centrale rol in celgemedieerde immuniteit speelt en behoren tot de adaptieve immuunrespons 26. T-cellen zijn ongevoelig voor besmetting in vitro maar sommige rapporten geven aan dat ze kunnen worden geïnfecteerd in vivo 14,15. Het intieme contact van APC en T-cellen tijdens immunologische synaps dienen als platforms voor de uitwisseling van biologisch materiaal 13, zoals sommige virussen zoals HIV 11. Rece...

Wanneer een ziekteverwekker infecteert de gastheer, is er meestal een activering van het aangeboren en adaptieve immuunreacties, noodzakelijk voor bacteriële verwijdering. Aangeboren immuniteit is de eerste verdedigingslinie die de meeste infecties voorkomt. Aangeboren immuniteit te onderscheiden op een nauwkeurige manier elementen die zijn geconserveerd onder brede groepen van micro-organismen (pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen, PAMPs) 1. De mechanismen van aangeboren immuniteit omvatten fysische barrières zoals huid, chemische barrières (antimicrobiële peptiden, lysozyme) en de aangeboren leukocyten, waarbij de fagocyten (macrofagen, neutrofielen en dendritische cellen), mestcellen, eosinofielen, basofielen en natuurlijke killer cellen omvatten 2. Deze cellen herkennen en pathogenen te elimineren, hetzij door een aanval op hen door contact of via fagocytose, die pathogeen engulfing en doden omvat. Dit systeem staat niet toe levenslange verdediging, in tegenstelling tot adaptieve immuniteit, die immunologisch geheugen tegen p verlenenathogens. Het adaptieve immuunsysteem is de tweede verdedigingslinie en is in staat te herkennen en te reageren op specifieke antigenen van verschillende microbiële en niet-microbiële stoffen 3. De hoofdcomponenten van het adaptieve immuunsysteem zijn lymfocyten, die B- en T-cellen omvatten. B-cellen zijn betrokken bij de humorale respons, antilichamen uitscheiden tegen pathogenen of exogene eiwitten. Echter, T cellen zijn de celgemedieerde immuniteit, het moduleren van de immuunrespons met cytokinen afscheiding of doden pathogeen geïnfecteerde cellen 4. Antigeen presenterende cellen (APC&#39;s) zoals dendritische cellen of macrofagen, bestanddelen van het aangeboren immuunsysteem, kan fagocytose pathogenen en verwerken bacteriële componenten in antigenen, die op het celoppervlak worden door de Major Histocompatibility Complex (MHC) 5-7 herkennen. Nadat APC ziekteverwekkers hebben phagocytized, zijn ze meestal migreren naar de drainerende lymfeklieren, waar ze interageren met Tcellen. T-lymfocyten kunnen specifieke peptide-MHC-complexen herkennen aan hun T-cel receptoren. De immune synaps (IS) optreedt in het grensvlak tussen een antigeen beladen APC en een lymfocyt tijdens antigeenpresentatie 8,9. Sommige bacteriën kunnen fagocytose overleven en systematisch te verspreiden binnen de APC&#39;s. In deze visie, geïnfecteerde APC&#39;s dienen als bacteriële reservoirs of &quot;Trojaanse paarden&quot;, dat bacteriële spread 10 vergemakkelijken. Het intieme contact tussen APC&#39;s en de lymfocyten die plaatsvinden tijdens IS vorming ook functioneren als een platform voor de uitwisseling van een deel van membranen, genetisch materiaal en exosomes en kunnen gekaapt bepaalde virussen om T-cellen te infecteren; Dit proces heet transinfection 11-13. Sommige pathogene bacteriën (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica en Shigella flexneri) kunnen T-lymfocyten dringen in vivo en hun gedrag 14-16 passen. We hebbenrecent beschreven dat T-lymfocyten kunnen ook bacteriën door transinfection van eerder geïnfecteerde dendritische cellen (DCs) tijdens antigeenpresentatie 16 vangen. T-cel bacteriële capture door transinfection buitengewoon effectiever (1,000-4,000x) dan directe infecties. T-cellen capture pathogeen en niet-pathogene bacteriën aangeeft dan transinfection is een proces gedreven door T-cellen. Opvallend transinfected T (Tit) cellen snel doodde de gevangen bacteriën en deed dat efficiënter dan professionele fagocyten 16. Deze resultaten, die een dogma van de immunologie breken, blijkt dat de cellen van adaptieve immuniteit functies die zogenaamd exclusief de aangeboren immuniteit waren kunnen uitvoeren. Bovendien toonden wij aan dat tit cellen scheiden grote hoeveelheden pro-inflammatoire cytokines en tegen bacteriële infecties in vivo. Hier presenteren we de verschillende protocollen die worden gebruikt om de bacteriële transinfection proces bestudereneen muismodel. Dit model is gebaseerd op het gebruik van CD4 + T-cellen uit transgene muizen OTII, die een TCR specifiek voor peptide 323-339 van OVA (OVAp) in het kader van I-Ab 17 die specifieke interactie met bacteriën geïnfecteerde bot aangebracht marrow- afgeleide DCs (BMDCs) 18,19 geladen met OVAp, de vorming van een stabiele immuunsysteem synapsen. T-cel transinfection kunnen worden gevisualiseerd en gevolgd met behulp van fluorescentie microscopie. Bovendien kan flowcytometrie worden gebruikt voor het detecteren van geïnfecteerde cellen door gebruik te maken van de fluorescentie geëmitteerd door bacteriën tot expressie groen fluorescerend eiwit (GFP) 16,20. Bovendien kunnen T-cel transinfection worden gekwantificeerd door een gevoeliger benadering de gentamicine survival test die meting van een groot aantal events mogelijk maakt. Gentamicin is een antibioticum dat eukaryote cellen niet kunnen binnendringen. Daarom is het gebruik van dit antibioticum maakt differentiatie van intracellulaire bacteriën die het antibioticum toevoeging fr overleefdOM extracellulaire degenen die werden gedood 21.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>r-GMCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>SIGMA</td><td>L2630-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3023901</td><td></td></tr><tr><td>2-ME</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>OVAp OTII (323&ndash;339)</td><td>GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 70uM</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;30 uM Syringe Filcons Sterile</td><td>BD</td><td>340598</td><td></td></tr><tr><td>AutoMacs Classic</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-088-887</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Normon</td><td>624601.6</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Costar</td><td>3415</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Pronadisa</td><td>1231</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Pronadisa</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>IgM Biot</td><td>ImmunoStep</td><td>Clone RMM-1</td><td></td></tr><tr><td>B220 Biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td></td></tr><tr><td>CD19 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553784</td><td></td></tr><tr><td>MHC-II Biot (I-A/I-E)</td><td>BD Biosciences</td><td>553622</td><td></td></tr><tr><td>CD11b biot</td><td>Immunostep</td><td>11BB-01mg</td><td></td></tr><tr><td>CD11c biot</td><td>Immunostep</td><td>11CB3-01mg</td><td></td></tr><tr><td>DX5 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553856</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32</td><td>ImmunoStep</td><td>M16PU-05MG</td><td></td></tr><tr><td>anti Salmonella</td><td>ABD Serotec</td><td>8209-4006</td><td></td></tr><tr><td>CD11cPE</td><td>BD Biosciences</td><td>553802</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0041-U100</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>553129</td><td></td></tr><tr><td>MHC-II (I-A/I-E) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553623</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td></td></tr><tr><td>CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin)</td><td>Life technologies</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

t-cellen capture bacteriën door transinfection van dendritische cellen

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recent hebben we, in tegenstelling tot wat beschreven is, aangetoond dat CD4+ T-cellen, het paradigma van adaptieve immuuncellen, bacteriën van geïnfecteerde dendritische cellen (DC's) vastleggen door een proces dat transinfectie wordt genoemd. Hier beschrijven we de analyse van het transinfectieproces, dat plaatsvindt tijdens het proces van antigeenpresentatie. Dit proces werd onthuld door het gebruik van CD4+ T-cellen van transgene OTII-muizen, die een T-celreceptor (TCR) dragen die specifiek is voor een peptide van ovoalbumine (OVAp), en die daarom stabiele immuuncomplexen kunnen vormen met geïnfecteerde dendritische cellen geladen met dit specifieke OVAp. De dynamiek van groen fluorescent eiwit (GFP)-expresserende bacteriën tijdens DC-T-celoverdracht kan worden gemonitord door live-celbeeldvorming en de kwantificering van bacteriële transinfectie kan worden uitgevoerd door middel van flowcytometrie. Bovendien kan transinfectie worden gekwantificeerd door een gevoeligere methode gebaseerd op het gebruik van gentamicine, een niet-permeabele aminoglycoside antibioticum dat extracellulaire bacteriën doodt, maar niet intracellulaire. Deze klassieke methode is eerder gebruikt in de microbiologie om de efficiëntie van bacteriële infecties te bestuderen. Wij leggen hierbij het protocol van het volledige proces uit, van de isolatie van de primaire cellen tot de kwantificering van transinfectie.

Hierin beschreven we hoe muizen T-cel bacteriële transinfection uitvoeren van geïnfecteerde beenmerg afgeleide-DC&#39;s en hoe bacteriële transinfection meten via twee verschillende benaderingen: flowcytometrie en gentamicine survival test Figuur 1 geeft een overzicht van de procedure om de cellen te verkrijgen.. DCs gegenereerd door incubatie van beenmergcellen met GM-CSF gedurende 9 dagen. Vervolgens worden DCs gerijpt met LPS te verhogen MHCII op zijn membraan te lade...

Hier een protocol wordt bacteriële capture meten door CD4 + T-cellen die tijdens antigeenpresentatie via transinfection van pre-geïnfecteerde dendritische cellen (DC). We zien hoe de noodzakelijke stappen uit te voeren: het isoleren van primaire cellen, infectie van DC, DC / T-cel conjugaat vorming, en meting van bacteriële T celtransfectie.

T-cellen Capture Bacteriën door Transinfection van dendritische cellen

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van bacteriële transinfectie van CD4+ T-cellen, met behulp van een muiscelmodel. In vivo zijn sommige pathogene bacteriën, zoals Listeria monocytogenes en Salmonella enteritidis, in staat om T-lymfocyten te infecteren en hun gedrag te modificeren. In vitro zijn T-cellen echter niet eenvoudig te infecteren.Op basis van deze observatie hebben we onderzocht of T-cellen bacteriën kunnen opvangen uit geïnfecteerde dendritische cellen tijdens antigeenpresentatie, zoals gebeurt bij virale infecties. We ontdekten dat T-cellen bacteriën opvangen en vervolgens doden. In feite stelden we vast dat T-cellen dit efficiënter doen dan professionele fagocyten.Deze resultaten spreken een centraal dogma van de immunologie tegen en tonen aan dat cellen van de adaptieve immuniteit functies kunnen uitvoeren die vermeend exclusief zijn voor de aangeboren immuniteit. Vandaag presenteren we het protocol dat is gebruikt om het proces van bacteriële transinfectie in een muismodel te bestuderen. Esteban Veiga en ik zullen deze procedure demonstreren samen met Guillermo Ramirez-Santiago, Raquelle Garcia-Ferreras, twee promovendi, en Monica Torres-Torres

t-cells-capture-bacteria-by-transinfection-from-dendritic-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We presenteren een protocol om antigeen-specifieke muis T-cellen te produceren met behulp van retrovirale...

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

We presenteren onze geoptimaliseerde high-throughput nucleofection protocol als een efficiënte manier transfecteren primaire menselijke monocyt-afgeleide dendritische cellen met een plasmide DNA of siRNA, zonder dat cel rijping. We verder bewijs leveren voor een succesvolle siRNA zwijgen van gerichte gen RIG-I zowel op mRNA-en eiwitniveau.

Geoptimaliseerd protocol voor Efficiënte Transfectie van dendritische cellen zonder Cell Rijping

De compartimentering van eiwitten, hetzij binnen het plasma membraan of in de intracellulaire locaties is een regulerend mechanisme die sterk kunnen beïnvloeden signalering resultaten, vandaar dat te begrijpen signalering is het van belang het bestuderen van de ruimtelijke en temporele gedrag van de betrokken eiwitten. We beschrijven hier een TIRF microscopie gebaseerde systeem om signaaltransductie in T-cellen te bestuderen, maar is breed toepasbaar.

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

Source: Cruz-Adalia, A., et al. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates bacterial transinfection through antigen-specific T cell–dendritic cell interactions. Bacteria-infected dendritic cells presenting ovalbumin peptide are incubated with T cells, either directly or separated by a membrane. Direct contact allows immunological synapse formation, enabling bacterial transfer, while the membrane prevents interaction. Gentamicin...

In Vitro Bacterial Transinfection of T Cells via Immunological Synapse Formation

This video demonstrates an in vitro technique to stimulate lymphocytes via non-typeable Haemophilus influenzae (NTHi) and to assess the immune response. Incubating isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) with NTHi causes the bacterial cells to stimulate T lymphocytes, leading to cytokine production. Upon inhibiting the secretion of cytokines, immunofluorescence staining is performed to detect the accumulated intracellular cytokines in stimulated T lymphocytes.

An In Vitro Technique to Stimulate Lymphocytes via Pathogenic Bacteria

Hier maken we gebruik van retrovirale transductie en concatemere transfectie van een cellijn die de componenten van een lentivirale vector (LV) in de afwezigheid van tetracycline kan uitdrukken. Dit LV GFP codeert en gepseudotypeerd met een glycoproteïne, SVGmu, dat specifiek is voor een receptor op dendritische cellen.

Een tetracycline-gereguleerde Cell Line Produceert hoge titer lentivirale vectoren die specifiek zijn gericht op dendritische cellen

Unlike celvrij HIV-1 deeltjes geïnfecteerd CD4 + T-cellen effectief waargenomen door plasmacytoïde dendritische cellen (pDCs). Dit manuscript beschrijft een werkwijze waarbij perifere mononucleaire cellen (PBMC's) of geïsoleerde pDCs mede gekweekt met HIV-1 geïnfecteerde T-cellen aangeboren sensing evalueren pDCs zoals bepaald door afgifte van type I IFN.

Het beoordelen van de Aangeboren Sensing van HIV-1 geïnfecteerde CD4<sup&gt; +</sup&gt; T cellen door plasmacytoïde dendritische cellen gebruiken een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultuur systeem.

Hier demonstreren we hoe monocyten worden geïsoleerd door magnetische kralenscheiding van mononucleaire cellen uit het perifere bloed na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van humaan geanticoaguleerd bloed. Na incubatie gedurende 5 dagen, worden menselijke monocyten gedifferentieerd in onrijpe dendritische cellen en zijn ze klaar voor experimentele procedures in een niet-klinische omgeving.

Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed

In dit protocol wordt een darmmicrobiota-antigeenspecifiek T-cel adoptief transfer colitismodel beschreven. CD4+ T-cellen worden geïsoleerd uit CBir1 TCR transgene muizen. Deze zijn specifiek voor een immunodominant darmmicrobiota-antigeen CBir1 flagellin, dat wordt overgedragen in ontvangende Rag1-/- muizen, wat leidt tot darmontsteking.

Inductie van darmontsteking door adoptieve overdracht van CBir1 TCR transgene CD4 + T-cellen naar immunodeficiënte muizen

Hier beschrijven we in vitro kweekomstandigheden, isolatie en verhoogde aanmaak van extracellulaire blaasjes (EV's) van Echinococcus granulosus. De kleine EV's werden gekenmerkt door dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie. De opname door beenmerg-afgeleide dendritische cellen en hun fenotypische modulatie werden bestudeerd met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Isolatie en dendritische celopname van kleine extracellulaire blaasjes van Echinococcus granulosus

Leer hoe CD4+ T-cellen bacteriën vastleggen via transinfectie van geïnfecteerde dendritische cellen in een muismodel. Deze methode kwantificeert bacteriële opname en toont aan dat T-cellen effectiever doden dan professionele fagocyten.

T-cellen Capture Bacteriën door Transinfection van dendritische cellen

Meer video's verkennen