Name: Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Leer de oogirritatietest met het gereconstrueerde humane cornea-achtige epitheliale weefselmodel. Deze methode classificeert stoffen zonder dierproeven en beoordeelt oogveiligheid betrouwbaar in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Dr John Harbell bedanken voor zijn wetenschappelijke ondersteuning en de tijd gewijd aan het EIT-project. De auteurs willen ook graag Beiersdorf AG (Duitsland), IIVS (USA), Mary Kay Inc (USA), Avon Products Inc. (VS), Procter &amp; Gamble / Cosmital (Zwitserland), Laboratoire Pierre Fabre (Frankrijk) te bedanken, Harlan Laboratories (Verenigd Koninkrijk), en LVMH Parfum (Frankrijk) voor deelname aan multi-center International Pre-validatie en validatie studies van de oogirritatietest 15.

<ol><li>National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Request+for+Ocular+Irritancy+Test+Data+From+Human%2C+Rabbit%2C+and+In+Vitro+Studies+Using+Standardized+Testing+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Federal+Register%22%5BJournal%5D)">Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods.</a> Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).</li>
<li>Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ. L396 (49), European Commission. 1-849 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Globally+Harmonized+System+of+Classification+and+Labelling+of+Chemicals+%28GHS%29%22">Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS)</a>. , Fifth revised edition, United Nations. New York and Geneva. (2013).</li>
<li>Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+Study+of+Irritation+and+Toxicity+of+Substances+Applied+Topically+to+the+Skin+and+Mucous+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther+November%22%5BJournal%5D)">Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes.</a> J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).</li>
<li>Adriaens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+analysis+of+the+Draize+test+for+serious+eye+damage%2Feye+irritation%3A+importance+of+understanding+the+in+vivo+endpoints+under+UN+GHS%2FEU+CLP+for+the+development+and+evaluation+of+in+vitro+test+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+tox%22%5BJournal%5D)">Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods.</a> Arch tox. 88, 701-723 (2014).</li>
<li>Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EC%2FHO+international+validation+study+on+alternatives+to+the+Draize+eye+irritation+test%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.</a> Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).</li>
<li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+safety%3A+a+silent+%28in+vitro%29+success+story%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Ocular safety: a silent (in vitro) success story.</a> Altern Lab Anim. 30, Suppl 2. 69-74 (2002).</li>
<li>Wilhelmus, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Draize+Eye+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The Draize Eye Test.</a> Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).</li>
<li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+alternatives+for+ocular+irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+health+persp%22%5BJournal%5D)">In vitro alternatives for ocular irritation.</a> Environ health persp. 106, 485-492 (1998).</li>
<li>McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+ocular+irritation+ranges+of+market-leading+cosmetic+and+personal-care+products+using+an+in+vitro+tissue+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologist%22%5BJournal%5D)">Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent.</a> Toxicologist. 66, 243(2002).</li>
<li>Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+EpiOcular+assay+for+preclinical+qualification+of+formulas+for+human+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologist%22%5BJournal%5D)">Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies.</a> Toxicologist. 96, 249(2007).</li>
<li>Yin, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+ocular+irritation+potential+of+surfactants-based+formulations+at+different+concentrations+using+the+EpiOcular+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologist%22%5BJournal%5D)">Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model.</a> Toxicologist. 108, 378(2009).</li>
<li>Harbell, J., Curren, R. In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarbell%2C+J+%22Handbook+of+Toxicology%22">Handbook of Toxicology</a>. , 2nd Edition, Informa Healthcare. (2001).</li>
<li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+EpiOcular%28TM%29+eye+irritation+test+for+hazard+identification+and+labelling+of+eye+irritating+chemicals+in+response+to+the+requirements+of+the+EU+cosmetics+directive+and+REACH+legislation%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation.</a> Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).</li>
<li>Pfannenbecker, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cosmetics+Europe+Multi-Laboratory+Pre-Validation+of+the+EpiOcular+Reconstituted+Human+Tissue+Test+Method+for+the+Prediction+of+Eye+Irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation.</a> Toxicol in vitro. , (2013).</li>
<li>MatTek Corporation. EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , MatTek Corporation. (2014).</li>
<li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiOcular+Eye+Irritation+Test+%28EIT%29+for+Hazard+Identification+and+Labeling+of+Eye+Irritating+Chemicals%3A+Protocol+Optimization+for+Solid+Materials+and+Extended+Shipment+Times%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times.</a> Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).</li>
<li>Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-house+validation+of+the+EpiOcular%28TM%29+eye+irritation+test+and+its+combination+with+the+bovine+corneal+opacity+and+permeability+test+for+the+assessment+of+ocular+irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation.</a> Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).</li>
<li>Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guideline+for+the+Testing+of+Chemicals%22">OECD Guideline for the Testing of Chemicals</a>. , (2014).</li>
<li>Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model. Toxicol. In Vitro. Blazka, M. E., Harbell, J. 42nd Annual Meeting of the Soc. of Toxicology, Salt Lake City, UT, , (2003).</li>
<li>Kandarova, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+Upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests+%E2%80%94+An+Assessment+of+the+Performance+of+the+Optimised+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test.</a> Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).</li>
</ol>

Publicatie kosten voor dit artikel werden betaald door MatTek Corporation.

We hebben de oogirritatietest (figuur 1), die is ontwikkeld voor de EpiOcular weefsel model gepresenteerd. Het EIT is in staat om oculaire irriterende en bijtende stoffen (GHS-categorieën 1 en 2 gecombineerd) te scheiden van materialen die niet etikettering (GHS Geen categorie) met een hoge mate van gevoeligheid en specificiteit 17. Het EIT vereisen zoals hierin gepresenteerd maakt geen onderscheid tussen GHS Categorie 1 van categorie 2 chemicaliën. Het EIT werd gevalideerd voor de indeling en etikettering van oogirritatie potentieel van een breed scala van chemische stoffen, met inbegrip van cosmetische en farmaceutische ingrediënten. In combinatie met andere in vitro testen, de EIT dienen als een vervanger voor de in vivo konijnen oogirritatie. De EIT gebruikt twee vergelijkbare maar verschillende protocollen voor vloeibare en vaste stoffen, die verschillen in de duur van de blootstelling en na blootstelling incubatieperiode (figuur 1). Het eindpunt gebruikt in de EITis levensvatbaarheid van het weefsel, bepaald met de MTT-bepaling, die eerder gebruikt in relevante menselijke epitheelweefsel modellen 20,21. Om deze test uit te voeren, is geen speciale apparatuur naast standaard celkweek apparatuur nodig. Vanwege de hoge weefsel tot weefsel reproduceerbaarheid, n = 2 weefsels in plaats van het normale aanbevolen n = 3 worden gebruikt. Het vermogen om gebruik n = 2 weefsels is een kritisch aspect van het protocol, aangezien het een ervaren operator twee weefsels tegelijkertijd verwerken, waardoor de variabiliteit van de test die kan optreden minimaliseren vanwege de verschillende behandeling van individuele weefsels 14. Ook, door n = 2 per weefsels testvoorwerp, de irriterende werking van 10 teststoffen van dezelfde fysische toestand (vloeibaar of vast), samen met de positieve en negatieve controles, kunnen worden geëvalueerd met een kit (24 weefsels). Andere belangrijke punten die betrouwbare classificatie van de materialen zorgen zijn specificaties voor de positieve controle substance (levensvatbaarheid van het weefsel ≤50.0%), reproduceerbaarheid tussen dubbele weefsels (verschil &lt;20,0%) en negatieve controle OD (&gt; 0,8 en &lt;2,5). Bij het ​​uitvoeren van de EIT test, is het belangrijk zich te houden aan de gevalideerde protocol en de voorgestelde dosering en schema spoelen (tabellen 3 en 4), omdat afwijking van het protocol of veranderingen in de incubatieperiode kan resulteren in gewijzigde afloop. Evenzo zullen afwijkingen van het 3 uur tijd MTT incubatietijd resulteren in verschillende MTT waarden en kunnen assayresultaat beïnvloeden. Af en toe kan een test chemische optische of andere eigenschappen die kunnen interfereren met de MTT weefsel levensvatbaarheid assay of de oorzaak reductie van MTT te hebben. Bijvoorbeeld, kan een chemische teststof direct verminderen MTT in blauwpaarse reactieproduct, of kan een gekleurde stof die licht absorbeert in hetzelfde bereik als MTT formazan (~ 570 nm) zijn. Echter, deze test stoffen prESENT probleem alleen wanneer op het tijdstip van de MTT-bepaling, een voldoende hoeveelheid van het materiaal nog aanwezig (of geabsorbeerd door) het weefsel. Om deze storing te voorkomen, worden uitgebreid spoelen procedures opgenomen in de EIT-protocol. Als het spoelen niet verwijderen van de TA en de TA interfereert met MTT-reductie, moeten aanvullende controles worden gebruikt om te detecteren en te corrigeren voor het. In het kort, indien rechtstreekse MTT vermindering van de teststof wordt vermoed, 50 gl (of 50 mg vaste stof) van de betrokken chemische stof wordt gedurende 3 uur met werken MTT oplossing bij SCC (NC, 50 ul steriel gedeïoniseerd water, moet draaien gelijktijdig). Als de MTT-oplossing wordt blauw-paars, is de test artikel geacht te hebben verminderd de MTT. In dit geval een functiecontrole behulp gevries- gedood weefsel controles moeten worden uitgevoerd om te beoordelen of het testmateriaal binding aan het weefsel en tot een foutieve verlaging MTT signaal. Als er aanzienlijke reductie van MTT in de TA-blootgestelde gedood weefselcontrole(betrokken op de hoeveelheid in de onbehandelde levende weefsel), de gemiddelde levensvatbaarheid weefsel van het testvoorwerp worden gecorrigeerd door het aftrekken van de gemiddelde levensvatbaarheid van de gedode control. Het EIT ten onrechte aan de kant van de veiligheid, zoals aangetoond door de lage incidentie van vals-negatieve classificaties 14,15,18. Belangrijk is dat geen van de GHS-categorie 1 chemische stoffen, die bijtend voor de ogen en die vertegenwoordigen de meest ernstige oculaire gevaar, werden geclassificeerd als niet-irriterend in deze test 14,15,18,19. Tenslotte, een van de grote voordelen van het RHCE in vitro testmethode is de mogelijkheid testen keurige vloeibare en vaste stoffen (wat niet mogelijk is met tweedimensionale, ondergedompelde celculturen). Het EIT zal een belangrijke bijdrage leveren bij het bepalen van de oogirritatie potentieel van een breed scala van materialen volgens de VN-GHS-indeling en etikettering systeem. De vervanging van dieren o bepalenname op toxiciteit is een doel van het toxicologisch onderzoek voor vele jaren. Het EIT testmethode is een formele valideringsstudie ondersteund door EURL ECVAM voltooid in 2014 en de EpiOcular EIT werd in 2015 in de OESO-richtlijnen als de OESO TG 492 geïmplementeerd.

Consumentenproducten zoals cosmetica, wasmiddelen en schoonmaakmiddelen omvatten een verscheidenheid van chemische stoffen die ernstige schade kan veroorzaken als ze contact met de ogen. Daarom is het testen van deze middelen voor oogirritatie vereist door de VS en de EU regelgevende instanties om de veiligheid van de consument 1 te garanderen. Een beoordeling van de oogirritatie potentieel van mengsels en formuleringen is ook een vereiste voor de naleving van REACH (Registratie, Evaluatie, Autorisatie en beperking van chemische stoffen) wetgeving voor de etikettering van cosmetische ingrediënten in het kader van de EU-cosmetica voor het vervoer van chemische producten, en voor de etikettering van pesticiden en huishoudelijke producten 2. Momenteel, regelgevende instanties nodig oculaire gevaren met behulp van het wereldwijd geharmoniseerd systeem voor de indeling en etikettering van chemische stoffen (GHS) 3. GHS is voornamelijk gebaseerd op de Draize oogirritatie test, de meest gebruikte oogirritatie assay waarin vreemde stoffen en mixtures worden direct ingebracht in de conjunctivale zak van het konijnenoog 4. Volgens GHS-classificatie, GHS-categorie 1 (oculair corrosieve) verwijst naar chemische stoffen die ernstige initiële letsel veroorzaken aan het oog weefsels of ernstige schade aan het oog en de visie die niet volledig reversibel is binnen 21 dagen na blootstelling 3,5 testen. GHS-categorie 2 verwijst naar chemische stoffen die significante veranderingen in het oog dat zijn volledig omkeerbaar binnen 21 dagen van de blootstelling te produceren testen. Chemicaliën test die geen corrosieve of irriterende stoffen worden aangeduid als GHS Geen categorie. Al meer dan 40 jaar, heeft het konijn Draize oogtest is bekritiseerd voor zijn gebrek aan reproduceerbaarheid, overschatting van menselijke reacties, en het gebruik van levende dieren 5-8. Deze zorgen hebben vele voorstellen voor verbetering en vermindering, en vervanging van de in vivo proef 9 aangemoedigd. De behoefte aan gevalideerde niet-dierlijke alternatieven werd verder versterktdoor de goedkeuring van het zevende amendement op de cosmeticarichtlijn, die het gebruik van dieren in de beoordeling van de veiligheid van cosmetische producten (in 2005) verboden en ingrediënten (in 2009) 2. Sinds 1996 is de gereconstrueerde cornea-achtig weefsel model op grote schaal gebruikt door de cosmetische industrie om het irritatie potentieel van grondstoffen, oppervlakteactieve stof gebaseerde formuleringen te evalueren, en samengestelde mengsels die zijn ontworpen voor gebruik in of in de nabijheid van het oog 10-13. Gebruik van het RHCE weefsel model maakt het mogelijk direct actuele toepassing van het testmateriaal op het weefsel oppervlak in zijn oorspronkelijke, onverdunde vorm. Op deze wijze kan niet in water oplosbare preparaten worden getest zonder ze te verdunnen met oplosmiddelen. In antwoord op EURL ECVAM (Europese Unie referentielaboratorium Europees Centrum voor de validatie van alternatieve methoden) verzoek om een ​​breed toepasbaar, eenvoudig, en economische methode van de oogirritatietest (EIT), dat gebruik maakt van een single belichtingstijd en is in staat om oculaire irriterende en bijtende stoffen te scheiden van materialen die niet etikettering nodig hebben ontwikkeld (figuur 1) 14. Op basis van de resultaten van 83 chemicaliën (44 vloeistoffen en 39 vaste stoffen), het EIT bereikte 95,5 / 68,2 / en 81,8% sensitiviteit / specificiteit en nauwkeurigheid (SS &amp; A) voor vloeistoffen, 100,0 / 68,4 / en 84,6% SS &amp; A voor vaste stoffen en 97,6 / 68.3 / en 83,1% voor de totale SS &amp; A. In 2007, een multi-laboratorium pre-validatie studie gesponsord door Cosmetics Europe (voorheen Colipa) onder auspiciën van de EURL ECVAM geëvalueerd de relevantie en betrouwbaarheid van het EIT met het doel om het te brengen formele bevestiging 15. In deze studie werden 298 onafhankelijke studies uitgevoerd in zeven onafhankelijke laboratoria. Studie resultaten toonden 99,7% overeenkomst voorspelling met een lage coëfficiënten van variatie tussen alle deelnemende laboratoria 15. Als gevolg daarvan in 2010 het EIT protocol ging een formele EURL ECVAMvalidatie programma. De validatie studie gebruikte 104 gecodeerd testchemicaliën, met inbegrip van afzonderlijke stoffen en chemische mengsels, die in vivo referentiegegevens (Draize oogirritatie gegevens) beschikbaar waren. Op basis van het succes van dit werk, werd een OESO-ontwerp testrichtsnoer ingediend in 2014. Verwacht wordt dat het EIT aanzienlijk zal bijdragen aan de indeling van oogirritatie potentieel van een breed scala van materialen volgens de VN-GHS-indeling en etikettering systeem.

test op oogirritatie (eit) voor risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane cornea-achtige epithelial (rhce) tissue model

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Om te voldoen aan de zevende wijziging van de cosmeticarichtlijn en de Europese REACH-wetgeving van de EU, worden gevalideerd niet-dierlijke alternatieve methoden voor een betrouwbare en nauwkeurige evaluatie van oculaire toxiciteit bij de mens nodig. Om aan deze behoefte te pakken, hebben we een oogirritatietest (EIT), dat een driedimensionaal gereconstrueerd menselijk hoornvlies-achtige epitheliale (RHCE) weefsel model dat gebaseerd is op de normale menselijke cellen maakt gebruik ontwikkeld. Het EIT is in staat om oculaire irriterende en bijtende stoffen (GHS-categorieën 1 en 2 gecombineerd) en degenen die geen etikettering (GHS Geen Categorie) vereisen scheiden. De test maakt gebruik van twee afzonderlijke protocollen, die is ontworpen voor vloeibare chemicaliën en een tweede, soortgelijk protocol voor vaste testartikelen. Het EIT voorspellingsmodel maakt gebruik van een enkele periode blootstelling (30 min voor vloeistoffen, 6 uur voor vaste stoffen) en een enkele levensvatbaarheid van het weefsel cut-off (60,0% zoals bepaald door de MTT-test). Op basis van de resultaten van 83 chemicaliën (44 vloeistoffen en vaste stoffen 39) EIT bereikte 95,5 / 68,2 / 81,8% en sensItivity / specificiteit en nauwkeurigheid (SS &amp; A) voor vloeistoffen, 100.0 / 68.4 / en 84,6% SS &amp; A voor vaste stoffen, en 97,6 / 68,3 / en 83,1% voor de totale SS &amp; A. Het EIT zal in belangrijke mate bijdragen aan de indeling van de oogirritatie potentieel van een breed scala van vloeibare en vaste stoffen, zonder het gebruik van dieren voor het testen van de regelgeving te voldoen. De EpiOcular EIT methode werd in 2015 geïmplementeerd in de testrichtsnoeren OESO TG 492.

Representatieve EIT resultaten uitgevoerd met 10 testartikelen (TA) en negatieve en positieve controles worden in tabel 6 en figuur 3. De gemiddelde OD = 1,31 voor de NC overeen met 100% levensvatbaarheid van het weefsel, dus de PC (gemiddelde OD = 0,41) hadden relatieve levensvatbaarheid van het weefsel van 31,2%. Wanneer het EIT protocol werd uitgevoerd in 15 geldige onafhankelijke experimenten in 7 laboratoria met behulp van de vloeistof blootstelling protocol en in 8 onafhankelijke geldige experimenten in 4 laboratoria, met behulp van de vaste belichting protocol, de gemiddelde levensvatbaarheid van het weefsel voor de PC met behulp van de vloeistof protocol was 36,4 ± 4,0 % en 32,3 ± 6,4% van de vaste stoffen protocol. In alle gevallen waren de positieve controleresultaten onder de afgesneden waarde van 60,0% 15. Zoals getoond in figuur 3, TA1, TA2, TA4, TA7 en TA8 had weefsel levensvatbaarheid&gt; 60,0% en werden daarom als &quot;NI&quot;. TA3, TA5, TA6, TA9 en TA10 had weefsel levensvatbaarheid X04, 60,0% en werden daarom als &quot;I&quot;. Het verschil van de levensvatbaarheid van het weefsel tussen dubbele weefsels was &lt;20,0% voor alle TA met uitzondering van TA2. Daarom resultaten voor alle de test artikelen, met uitzondering van de TA2, werden beschouwd als &quot;gekwalificeerd&quot;, omdat zij aan alle EIT acceptatiecriteria (paragraaf 10.2). Vanwege de hoge variabiliteit tussen dubbele weefsels voor TA2 in de eerste experiment werd een tweede experiment was nodig om gekwalificeerde EIT resultaten te verkrijgen. Het EIT testmethode zoals hierin beschreven met behulp van het RHCE weefsel model werd gebruikt voor de beoordeling van oogirritatie in verschillende multilaboratory validatie studies, met inbegrip van formele validering door EURL ECVAM / Cosmetica Europa 15,17-19. In alle studies werd het EIT getoond reproduceerbaar te zijn en was in staat om chemische stoffen (zowel stoffen en mengsels) niet vereist indeling en etikettering voor oogirritatie of ernstig oogletsel ac correct te identificerengens UN GHS 15,17-19. Het EIT testmethode voldeden aan de acceptatiecriteria van de Validation Management Group (VMG) voor irritatie van de ogen voor de gevoeligheid, specificiteit en algemene nauwkeurigheid en momenteel wordt het in afwachting van de formele implementatie als een gedeeltelijke vervanging voor in vivo konijnen Draize-test 19. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig1.jpg" /> Figuur 1: Overzicht van het EIT protocol voor vloeibare en vaste testartikelen afkortingen gebruikt: AM, assaymedium;. SCC, standaard kweekomstandigheden; PBS, Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing; RT, kamertemperatuur. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig2.jpg" /> Figuur 2:. De gestandaardiseerde 96-wells plaat configuratie voor de MTT-test weefsel levensvatbaarheid twee 200 pi aliquots zijn transferred aan de juiste putjes van een gelabelde 96-wells plaat. Afkortingen gebruikt: NC, negatieve controle; PC, positieve controle; TA1-TA20, testen artikelen 1-20; Blanco, extractiemiddeloplossing. 96- MTT plaat configuratie wordt gebruikt met Excel-spreadsheet ontworpen om RHCE levensvatbaarheid van het weefsel en EIT resultaten te berekenen. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig3.jpg" /> Figuur 3: EIT resultaten verkregen voor 10-test artikelen, NC en PC controle met behulp van het RHCE weefsel model De grafiek wordt gegenereerd op basis van een Excel-spreadsheet ontworpen om EIT resultaten te presenteren.. Chemicaliën test die de levensvatbaarheid van het weefsel verlaagd ≤ 60,0% ten opzichte van NC worden als irriterend ingedeeld (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 en TA10) en test chemische stoffen die had levensvatbaarheid van het weefsel&gt; 60,0% worden geclassificeerd als niet-Irriterende (&quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7, en TA8). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="7"> Starttijd voor het EIT protocol werk stappen (een dag werk voor één operator) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Elke lijn correspondeert met een paar weefsels </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Volgorde van de stappen: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Vloeistoffen: </td><td> PBS </td><td> TA Belichting </td><td> Post- Soak </td><td> Post- <td> MTT Reactie </td><td> MTT Extractie </td><td> Maatregel </td></tr><tr><td></td><td> 30 min </td><td> 30 min </td><td> 12 min </td><td> 120 min </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> OD </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 10:00 </td><td> 10:12 </td><td> 00:12 </td><td> 15:12 </td><td> na </td></tr><tr><td> PC </td><td> 09:01 </td><td> 09:31 </td><td> 10:01 </td><td> 10:13 </td><td> 00:13 </td><td> 15:13 </td><td> 17:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 10:02 </td><td> 10:14 </td><td> 00:14 </td><td> 15:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 &lt;/ strong&gt; </td><td> 09:03 </td><td> 09:33 </td><td> 10:03 </td><td> 10:15 </td><td> 00:15 </td><td> 15:15 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 10:04 </td><td> 10:16 </td><td> 00:16 </td><td> 15:16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 09:05 </td><td> 09:35 </td><td> 10:05 </td><td> 10:17 </td><td> 00:17 </td><td> 15:17 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 10:06 </td><td> 10:18 </td><td> 00:18 </td><td> 15:18 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:07 </td><td> 09:37 </td><td> 10:07 </td><td> 10:19 </td><td> 00:19 </td><td> 15:19 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 10:08 </td><td> 10:20 </td><td> 00:20 </td><td> 15:20 </td><td></td></tr><tr><td><stro<html> ng&gt; TA-8 </td><td> 09:09 </td><td> 09:39 </td><td> 10:09 </td><td> 10:21 </td><td> 00:21 </td><td> 15:21 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 10:10 </td><td> 10:22 </td><td> 00:22 </td><td> 15:22 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:11 </td><td> 09:41 </td><td> 10:11 </td><td> 10:23 </td><td> 00:23 </td><td> 15:23 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 3:. Sample tijdschema voor het testen van vloeibare testartikelen Protocol stappen inclusief pre-bevochtigen van de weefsels met DPBS, Toepassing van Test Artikelen (TAS), spoelen en Post-weken, Post-incubatieperiode, MTT assay, Winning van MTT, en waardering van MTT OD worden in kolommen. Tijden het duplicaat weefsels zijn georganiseerd in rijen. De gehele test testen 10 TA en controles kunnen worden afgewerkt in een dag. e_content &quot;&gt; <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" height="439" width="582"><tbody><tr><td colspan="6"> Starttijd voor het EIT-protocol stappen (2 dagen werken voor een operator) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Elke lijn correspondeert met een paar weefsels </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dag 1 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Dag 2 (de volgende dag) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Volgorde van de stappen: </td><td> 1 </strong&gt; </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Vaste stoffen: </td><td> PBS </td><td> TA Belichting </td><td> Post- Soak </td><td> Post- Incubaction </td><td> MTT Reactie </td><td> MTT Extractie </td><td> Maatregel </td></tr><tr><td></td><td> 30 min </td><td> 6 uur </td><td> 26 min </td><td> 18 hr </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> OD </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 15:30 </td><td> 15:56 </td><td> 09:56 </td><td> 00:56 </td&gt; <td> na </td></tr><tr><td> PC </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 15:32 </td><td> 15:58 </td><td> 09:58 </td><td> 00:58 </td><td> 15:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 15:34 </td><td> 16:00 </td><td> 10:00 </td><td> 13:00 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 15:36 </td><td> 16:02 </td><td> 10:02 </td><td> 13:02 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 15:38 </td><td> 16:04 </td><td> 10:04 </td><td> 13:04 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 15:40 </td><td> 16:06 </td><td> 10:06 </td><td> 13:06 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:12 </td><td> 09:42 </td><td> 15:42 </td><td> 16:08 </td><td> 10:08 &lt;/ td&gt; <td> 13:08 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:14 </td><td> 09:44 </td><td> 15:44 </td><td> 16:10 </td><td> 10:10 </td><td> 13:10 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:16 </td><td> 09:46 </td><td> 15:46 </td><td> 16:12 </td><td> 10:12 </td><td> 13:12 </td><td></td></tr><tr><td> TA-8 </td><td> 09:18 </td><td> 09:48 </td><td> 15:48 </td><td> 16:14 </td><td> 10:14 </td><td> 13:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:20 </td><td> 09:50 </td><td> 15:50 </td><td> 16:16 </td><td> 10:16 </td><td> 13:16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:22 </td><td> 09:52 </td><td> 15:52 </td><td> 16:18 </td><td> 10:18 </td><td> 13:18 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 4: Voorbeeld tijdschema voor het testen van vaste testartikelen. Protocol stappen inclusief pre-bevochtigen van de weefsels met DPBS, Toepassing van Test artikelen, spoelen en Post-weken, Post-incubatieperiode, MTT assay, Winning van MTT, en waardering van MTT OD worden gepresenteerd in kolommen. Tijden het duplicaat weefsels zijn georganiseerd in rijen. De gehele test testen 10 TA en controles wordt uitgevoerd over een periode van twee dagen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Bedrag </td><td> Reagens </td><td> Opslagcondities </td><td> Bron </td><td> Beschrijving </td><td> Houdbaarheidsdatum </td></tr><tr><td> 1 flacon, 2 ml </td><td> MTT concentraat (MTT-100-CON) </td><td> Beschermd tegen licht (-20ºC) </td><td> MatTek </td><td> Bevroren MTT concentraat </td><td> 2 maanden </td></tr><tr><td> 1 flacon, 8 ml </td><td> MTT verdunner </td><td> 2-8 &amp;# 186; C </td><td> MatTek </td><td> Voor verdunnen MTT concentraat voor gebruik in de MTT assay </td><td> 2 maanden </td></tr><tr><td> 1 fles, 60 ml </td><td> Isopropanol (CAS # 67-63-0) </td><td> RT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Extractiemiddeloplossing </td><td> NA </td></tr></tbody></table> Tabel 5: MTT-100 Assay Kit Components. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Code N ° </td><td> Weefsel </td><td colspan="2"> Ruwe gegevens </td><td colspan="2"> Blanco gecorrigeerde gegevens </td><td rowspan="2"> gemiddelde van OD </td><td rowspan="2"> % Van de levensvatbaarheid </td></tr><tr><td></td><td> n </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td></tr><tr><td> NC </td><td>1 </td><td> 1,316 </td><td> 1.352 </td><td> 1,316 </td><td> 1.352 </td><td> 1,334 </td><td> 101.6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,277 </td><td> 1,309 </td><td> 1,277 </td><td> 1,309 </td><td> 1,293 </td><td> 98.4 </td></tr><tr><td> PC </td><td> 1 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0,388 </td><td> 29.6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,431 </td><td> 32.8 </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1 </td><td> 1,213 </td><td> 1,244 </td><td> 1,213 </td><td> 1,244 </td><td> 1,229 </td><td> 93.5 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 1,355 </td><td> 103.2 </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 1 </td><td> 1.210 </td><td> 1,122 </td><td> 1.210 </td><td> 1,122 </td><td> 1,166 </td><td> 88.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,833 </td><td> 63.4 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 1 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 12.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,138 </td><td> 0,136 </td><td> 0,138 </td><td> 0,136 </td><td> 0,137 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1 </td><td> 1,137 </td><td> 1,160 </td><td> 1,137 </td><td> 1,160 </td><td> 1,149 </td><td> 87.4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.262 </td><td> 1,191 </td><td> 1.262 </td><td> 1,191 </td><td> 1.227 </td><td> 93.4 </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 1 </td><td> 0.610 </td><td> 0,621 </td><td> 0.610 </td><td> 0,621 </td><td> 0,616 </td><td> 46.9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,480 </td><td> 0,484 </td><td> 0,480 </td><td> 0,484 </td><td> 0,482 </td><td> 36.7 </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 1 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,508 </td><td> 38.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,402 </td><td> 30.6 </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1 </td><td> 1,048 </td><td> 1.050 </td><td> 1,048 </td><td> 1.050 </td><td> 1,049 </td><td> 79.9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1,149 </td><td> 1.150 </td><td> 1,149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.150 </td><td> 87.5 </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 1 </td><td> 1,032 </td><td> 1,034 </td><td> 1,032 </td><td> 1,034 </td><td> 1.033 </td><td> 78.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,941 </td><td> 0,935 </td><td> 0,941 </td><td> 0,935 </td><td> 0,938 </td><td> 71.4 </td></tr><tr><td> TA9 </td&gt; <td> 1 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,144 </td><td> 0,149 </td><td> 0,144 </td><td> 0,149 </td><td> 0,147 </td><td> 11.2 </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 1 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 11.4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,254 </td><td> 0,255 </td><td> 0,254 </td><td> 0,255 </td><td> 0,255 </td><td> 19.4 </td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> betekenen </td><td> Dif. </td><td> gemiddelde van </td><td> Dif. </td><td> Dif. / 2 </td><td colspan="2"> Classificatie </td></tr><tr><td></td><td> van OD </td><td> van OD </td><td> levensvatbaarheid [%] </td><td> van de levensvatbaarheid </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NC </td><td> 1,314 </td><td> 0,041 </td><td> 100.0 </td><td> 3.12 </td><td> 1.56 </td><td> NI </td><td> gediplomeerd </td></tr><tr><td> PC </td><td> 0.410 </td><td> 0,043 </td><td> 31.2 </td><td> 3.23 </td><td> 1.62 </td><td> Ik </td><td> gediplomeerd </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1.292 </td><td> 0,127 </td><td> 98.3 </td><td> 9.63 </td><td> 4.81 </td><td> NI </td><td> gediplomeerd </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 0,999 </td><td> 0,333 </td><td> 76.1 </td><td> 25,36 </td><td> 12,68 </td><td> NI </td><td> D&gt; 20 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 0,152 </td><td> 0,030 </td><td> 11.6 </td><td> 2.32 </td><td> 1.16 </td><td> Ik </td><td> gediplomeerd </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1,188 </td><td> 0,078 </td><td> 90.4 </td><td> 5.94 </td><td> 2.97 </td><td> NI </td><td> gediplomeerd </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 0,549 </td><td> 0,134 </td><td> 41.8 </td><td> 10.16 </td><td> 5.08 </td><td> Ik </td><td> gediplomeerd </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 0,455 </td><td> 0,106 </td><td> 34.6 </td><td> 8.07 </td><td> 4.03 </td><td> Ik </td><td> gediplomeerd </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1.100 </td><td> 0,101 </td><td> 83.7 </td><td> 7.65 </td><td> 3.82 </td><td> NI </td><td> gediplomeerd </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 0,986 </td><td> 0.095 </td><td> 75.0 </td><td> 7.23 </td><td> 3.62 </td><td> NI </td><td> gediplomeerd </td></tr><tr><td> TA9 </td><td> 0,085 </td><td> 0,125 </td><td> 6.4 </td><td> 9.48 </td><td> 4.74 </td><td> Ik </td><td> gediplomeerd </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 0,203 </td><td> 0,105 </td><td> 15.4 </td><td> 7.95 </td><td> 3.98 </td><td> Ik </td><td> gediplomeerd </td></tr></tbody></table> Tabel 6:. EIT resultaten verkregen voor 10-test artikelen, NC en PC-besturingen De tafels zijn produced door een Excel-spreadsheet ontworpen om levensvatbaarheid van het weefsel en het EIT resultaten te berekenen. Chemicaliën test die de levensvatbaarheid van het weefsel verlaagd ≤ 60,0% ten opzichte van NC worden als irriterend ingedeeld (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 en TA10) en test chemische stoffen die had levensvatbaarheid van het weefsel&gt; 60,0% worden geclassificeerd als niet-Irriterende (&quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7, en TA8).

We hebben een oogirritatie test die een driedimensionaal gereconstrueerd menselijk hoornvlies-achtige epitheliale (RHCE) weefsel model maakt gebruik ontwikkeld. De test is in staat onderscheid te maken tussen oculaire irriterende en bijtende stoffen (GHS-categorieën 1 en 2 gecombineerd) en degenen die geen etikettering (GHS geen categorie) vereisen.

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Het algemene doel van de oogirritatietest is om stoffen en mengsels te classificeren en te labelen op basis van hun potentieel voor oogirritatie. Deze procedure maakt gebruik van een driedimensionaal gereconstrudeerd hoornvliesachtig weefselmodel. Bij ontvangst wordt de testkit een nacht vooraf geïncubeerd in het assaymedium; de volgende dag worden de weefsels gehydrateerd, gevolgd door de topische applicatie van de positieve en negatieve controles en de betreffende testchemicaliën op de oppervlakken van de weefsels in dubbelvoud.Na een vaste blootstellingsperiode worden de testchemicaliën verwijderd door middel van wassing. De weefsels worden vervolgens nageïncubeerd in vers assaymedium en de toxiciteit van de chemicaliën wordt vervolgens geëvalueerd met een MTT-assay. Uiteindelijk kan het irriterende potentieel van de testartikelen worden beoordeeld door de relatieve levensvatbaarheid van de met het testartikel behandelde weefsels te vergelijken met die van de met de negatieve controle behandelde weefsels.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals versnelde trace-irritatietests, is dat er geen laboratoriumdieren aan te pas komen. Er wordt gebruikgemaakt van een in vitro gedeconstrueerd hoornvliesachtig oculair weefselmodel, dat bestaat uit normale menselijke cellen. Het is toepasbaar op alle soorten stoffen en mengsels en kan onderscheid maken tussen chemicaliën die oogirritatie of ernstige oogbeschadiging veroorzaken en materialen die dat niet doen.Niet-irriterende stoffen die geen classificatie en etikettering vereisen. Het gereconstrueerde menselijke cornea-achtige epitheelweefsel of epi. Ocular wordt geprepareerd in inserts met een poreus membraan waarlangs de voedingsstoffen naar de cellen passeren.Gereconstrueerd weefsel vormt een niet-verhoornd epitheel dat het hoornvliezepepitheel nabootst met progressief gestratificeerde, maar niet verhoornde cellen. Laat de weefsels in de verzendcontainer van 24 putjes na ontvangst van de kit voor menselijk hoornvliez-achtig epitheel op kamertemperatuur komen. Open na 15 minuten de zak met de weefselplaat van 24 putjes onder steriele omstandigheden en controleer alle weefsels op luchtbellen tussen de agrosgel en de inserts. Snijd de tape open.Verwijder de afdekking met een steriel gaasje en inspecteer het weefseloppervlak. Verdeel vervolgens één milliliter kit-assaymedium van 37 °C over de wells van vooraf gelabelde six-well platen. Gebruik daarna steriele pincetten om de inserts met weefsel voorzichtig droog te deppen met steriel gaas om eventuele resterende transportvloeistof te verwijderen en plaats ze in individuele wells van de six-well platen.Vervang na één uur het medium door één milliliter vers assay-medium van 37 °C en incubeer de weefsels gedurende de nacht onder standaard kweekcondities. Pipetteer de volgende dag 20 µL calcium- en magnesiumvrije DPBS op het apicale oppervlak van elk weefsel. Als de DPBS zich niet over de weefsels verspreidt, houd dan de insert voorzichtig vast met een pincet en tik op de plaat om ervoor te zorgen dat de zoutoplossing het gehele weefseloppervlak bevochtigt.Incubeer de platen gedurende 30 minuten. Behandel de weefsels vervolgens met vloeibare testartikelen door 50 µL van de negatieve controle, de positieve controle en de betreffende testartikelen in dubbeltoevoeging aan te brengen volgens het tijdschema. Zorg ervoor dat de behandelingen de gehele weefseloppervlakken bedekken en incubeer de inserts daarna gedurende 30 minuten om de weefsels met vaste testartikelen te behandelen.Breng eerst de inserts over naar een steriel oppervlak. Houd de plaat afgedekt om contaminatie door in de lucht zwevende vaste deeltjes te voorkomen. Breng vervolgens met een genivelleerde lepel topisch 50 milligrams van het testartikel aan op de duplicate weefsels volgens het tijdschema, waarbij u erop let dat de behandeling het gehele weefseloppervlak bedekt.Gebruik alternatief een voorgevulde spuit van één milliliter waarvan de kop is afgesneden om de poeders direct op de cultuur aan te brengen. Druk op de zuiger om het poeder aan te brengen direct nadat de vaste testartikelen zijn toegevoegd, plaats de inserts terug in hun zes-wells-platen en incubeer de weefsels gedurende zes uur om de weefsels te spoelen.Vul na de behandeling, aan het einde van de incubatieperiode van de blootstelling, 3 bekerglazen van 150 milliliter per testartikel met 100 milliliters DPBS. Pak de bovenrand van de inserts vast met gebogen pincetten om ze uit de wells te verwijderen. Pak vervolgens met een pincet twee inserts van dezelfde behandeling bij hun bovenranden vast en giet de behandelingen af op een schoon absorberend materiaal.Dompel vervolgens de inserts in het eerste bekerglas met DPBS en was de weefsels gedurende twee seconden met een cirkelvormige draaiende beweging. Til de inserts daarna op zodat ze grotendeels gevuld zijn met DPBS en schenk de vloeistof terug in het bekerglas. Herhaal het wassen twee keer in het eerste bekerglas.Spoel de inzetten vervolgens op dezelfde manier na de laatste wasbeurt telkens 3 keer uit in het tweede en derde bekerglas met DPBS. Draai elke inzet onder een hoek van ongeveer 45 graden met de open zijde naar beneden en raak met de bovenrand het absorberende materiaal aan om resterend DPBS af te gieten. Dompel de weefsels daarna onmiddellijk onder in vijf milliliter assaymedium op kamertemperatuur.Giet aan het einde van de periode van onderdompeling na het weken het assaymedium af uit een vooraf gelabelde 12-wellplaat en dep de inserts droog op een absorberend materiaal. Breng de inserts vervolgens over naar een nieuwe zes-wellplaat die per well één milliliter warm assaymedium bevat, en plaats de platen in de incubator om de MTT-viabiliteitsassay te starten. Breng de inserts over naar een 24-wellplaat die 0,3 milliliters vers bereide MTT-oplossing bevat.Dep de inserts op het absorberende materiaal vóór overdracht. Verwijder eventuele luchtbellen die onder de inserts opgesloten zitten en plaats de weefsels na drie uur terug in de incubator, waarbij de onderkant van de inserts op het absorberende materiaal rusten. Dompel de inserts vervolgens voor de ondergedompelde extractie van niet-kleurende vloeibare testartikelen onder in een vooraf gelabelde 24-wellplaat die twee milliliters van de juiste extractie-oplossing per well bevat voor een niet-ondergedompelde extractie van vaste of vloeibare kleurstoffen.Overbreng de inserts naar een vooraf gelabelde zes-wellplaat die per well één milliliter extractie-oplossing bevat. Verzegel de platen vervolgens met een heat sealer of parafilm om verdamping te voorkomen en extraheer op een orbitale schudmachine gedurende twee tot drie uur bij kamertemperatuur, met voorzichtig schudden aan het einde van de ondergedompelde extractie. Doorboor de weefsels en giet vervolgens de vloeistof uit elk insert terug in de well; gooi daarna de inserts met de weefsels weg.Meng de extractie-oplossing in elke put en breng twee aliquoten van 200 microliter van elk monster over naar de juiste putten van een vooraf gelabelde 96-wells plaat, zoals geïllustreerd in het schema aan het einde van de extractie zonder onderdompeling. Gooi de inserts en weefsels weg zonder deze door te prikken en voeg één milliliter extractie-oplossing toe aan elke put. Meng de extractie-oplossing in de putten grondig en breng twee aliquoten van 200 microliter van elk monster over naar de juiste putten van een vooraf gelabelde 96-wells plaat, zoals zojuist gedemonstreerd.Lees ten slotte de optische dichtheid van de monsters af in een 96-wells spectrofotometer bij een golflengte van 570 nanometer zonder gebruik van een referentiefilter en voer de resultaten in een spreadsheet in om de respectievelijke weefsellevensvatbaarheid te berekenen. Houd rekening met correcties vanwege interferentie door de teststof zoals aangegeven in het tekstprotocol hier; representatieve resultaten van oogirritatietests uitgevoerd met 10 testartikelen en negatieve en positieve controles worden in dit experiment getoond. Er werd een gemiddelde optische dichtheid van 1,31 waargenomen voor de negatieve controle, wat overeenkomt met een 100% weefsellevensvatbaarheid, met een relatieve weefsellevensvatbaarheid van 31,2% voor de positieve controle. Testartikelen 1, 2, 4, 7 en 8 vertoonden weefsellevensvatbaarheden van meer dan 60%, waardoor deze artikelen als niet-irriterend zijn geclassificeerd; testartikelen 3, 5, 6, 9 en 10.Aan de andere kant vertoonden ze weefselvariabiliteiten van minder dan of gelijk aan 60%, wat resulteerde in hun classificatie als irriterend. Het verschil in weefselviabiliteit tussen dubbele weefsels in dit experiment was minder dan 20% voor alle geteste artikelen, met uitzondering van testartikel twee. Daarom werden de resultaten voor alle testartikelen, behalve testartikel twee, als gekwalificeerd beschouwd, aangezien ze voldoeden aan alle acceptatiecriteria voor de oogirritatietest.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de DICATION-test moet worden uitgevoerd, gebruikmakend van in vitro reconstructief menselijk hoornvliesachtig weefselmodel vier, voor de etikettering van gevarenidentificatie van chemicaliën. Deze procedure is geïmplementeerd in de EOC D-testrichtlijnen als onderdeel van de getrapte teststrategie.

eye-irritation-test-eit-for-hazard-identification-eye-irritating

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In deze video, tonen we de EpiDerm Test op huidirritatie (EpiDerm SIT) ontwikkeld en gevalideerd...

Een In Vitro Test op huidirritatie (SIT) het gebruik van de EpiDerm gereconstrueerde humane epidermale (RHE) Model

Wij bieden een reproduceerbare methode voor het kweken van samenvloeiing monolagen van de menselijke foetus retinale pigment epitheelcellen (hfRPE) cellen die vertonen morfologie, fysiologie, polariteit, en eiwit-en genexpressie-patronen van de volwassen autochtone weefsel. Dit werk is uitgebreid tot een diermodel van verschillende oogziekten.

Experimentele modellen voor Studie van het retinale pigmentepitheel fysiologie en pathofysiologie

Dit rapport beschrijft een methode om chronische experimentele auto-immuun droge ogen in Lewis-ratten te induceren door middel van immunisatie met een emulsie van ratlakakalextract, ovalbumine en complete Freund's adjuvans, gevolgd door de injectie van lacrimale klier extract en ovalbumine in de forniceal subconjunctiva en lacrimale klieren Zes weken later.

Een Chronisch Autoimmuun Droog Oog Rat Model Met Toename In Effector Geheugen T Cellen In Oogappel Weefsel

Hoge-doorvoer kleine remmende RNA screening is een belangrijk instrument die helpen kan sneller het ophelderen van de moleculaire mechanismen van chemische hoornvlies epitheliale letsel. Hierin presenteren wij de ontwikkeling en validatie van blootstelling modellen en methoden mbt de hoge doorvoer screening van waterstoffluoride en chloorpikrine-geïnduceerde hoornvlies epitheliale letsel.

High Throughput SiRNA Screening voor chloorpikrine en waterstoffluoride-geïnduceerde hoornvlies epitheliale cel letsel

Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van een methode om acute of chronische droge oogziekte bij konijnen te veroorzaken door concanavalin A te injecteren in alle delen van het orbitale traankliersysteem. Deze methode, superieur aan de reeds gemelde, genereert een reproduceerbaar, stabiel model van droge ogen geschikt voor de studie van farmacologische middelen.

Een konijn model van waterige-deficiënte droge oogziekte geïnduceerd door Concanavalin Een injectie in de lacrimal klieren: Toepassing op drug werkzaamheid Studies

Het doel van dit protocol is om te evalueren of verschillende kunstmatige traanformuleringen menselijke hoornvliesepitheelcellen kunnen beschermen tegen uitdroging met behulp van een in vitro model. Na blootstelling aan kunstmatige traanformuleringen en uitdroging worden menselijke hoornvliesepitheelcellen beoordeeld op metabole activiteit.

Effect van kunstmatige traanformuleringen op de metabolische activiteit van menselijke cornea-epitheelcellen na blootstelling aan uitdroging

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om driedimensionale gereconstitueerde menselijke epidermis op een reproduceerbare en robuuste manier te cultiveren. Bovendien kenmerkt het de structuur-functierelatie van het epidermale barrièremodel. De biologische reacties van de gereconstitueerde menselijke epidermis op pro-inflammatoire stimuli worden ook gepresenteerd.

Het cultiveren van een driedimensionale gereconstrueerde menselijke epidermis op grote schaal

Dit artikel beschrijft de procedures die worden gebruikt om de toxiciteit van UV-straling en chemische toxines op een primaire en onsterfelijke cellijn te evalueren.

Het bepalen van de toxiciteit van UV-straling en chemicaliën op primaire en onsterfelijke menselijke hoornvliesepitheelcellen

Hier worden diermodellen op basis van muis en konijn ontwikkeld voor mechanisch en chemisch letsel van hoornvliesepitheel om nieuwe therapieën en het onderliggende mechanisme te screenen.

Ex vivo en in vivo diermodellen voor mechanische en chemische verwondingen van cornea-epitheel

Ex vivo orgaancultuur van het hoornvlies van varkens en epitheliale wondgenezing bieden een economisch, ethisch, reproduceerbaar en kwantitatief middel voor het testen van de oculaire toxiciteit van chemicaliën. Ze helpen ook bij het ophelderen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulatie van epithelisatie en weefselherstel, en bij het evalueren van therapieën voor de behandeling van diabetische keratopathie en vertraagde wondgenezing.

Evaluatie van therapeutische en chemische toxiciteit met behulp van orgaangekweekte varkenshoornvliezen en epitheliale wondgenezing

Er wordt een reproduceerbaar protocol gepresenteerd voor de bereiding, verrijking en toepassing van een in situ blauwlicht-crosslinkable gelatine-riboflavine hydrogel voor het herstel van corneale stromale wonden bij konijnen, inclusief procedurele stappen voor chirurgische behandeling, gedeeltelijke tarsorrofie en postoperatieve zorg.

Fabricage en chirurgische toepassing van verrijkte, foto-gekruiste gelatine–riboflavine hydrogels voor herstel van hoornvlieswonden bij konijnen

Leer de oogirritatietest met het gereconstrueerde humane cornea-achtige epitheliale weefselmodel. Deze methode classificeert stoffen zonder dierproeven en beoordeelt oogveiligheid betrouwbaar in vitro.

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model (Video) | JoVE Journal

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

Meer video's verkennen