Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

Het algemene doel van de oogirritatietesten is om stoffen en mengsels te classificeren en labelen op basis van hun potentieel voor oogirritatie. Deze procedure maakt gebruik van een driedimensionaal gereconstrueerd hoornvliesachtig weefselmodel. Bij aankomst wordt het testkit 's nachts voorgeïncubeerd in het testmedium. De volgende dag worden de weefsels gehydrateerd, gevolgd door de plaatselijke toepassing van de positieve en negatieve controles en de testchemicaliën van belang op de oppervlakken van de weefsels in duplicaat.

Na een vaste blootstellingsperiode worden de testchemicaliën verwijderd door te wassen. De weefsels worden verder geïncubeerd in vers testmedium en vervolgens wordt de toxiciteit van de chemicaliën geëvalueerd door middel van een MTT-assay. Uiteindelijk kan het irriterende potentieel van de testartikelen worden beoordeeld door de relatieve levensvatbaarheid van de met het testartikel behandelde weefsels te vergelijken met die van de met de negatieve controle behandelde weefsels.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals snelle sporenirritatietesten, is dat er geen laboratoriumdieren bij betrokken zijn. Het maakt gebruik van een in vitro gedeconstrueerd hoornvliesachtig weefselmodel oculaire, dat bestaat uit normale menselijke cellen. Het is toepasbaar op alle soorten stoffen en mengsels en kan onderscheid maken tussen chemicaliën die oculaire irritatie of ernstige oogbeschadiging veroorzaken en materialen.

Niet-irriterende stoffen die geen classificatie en etikettering vereisen. Het gereconstrueerde humane hoornvliesachtige epitheelweefsel of epi. Oculaire is voorbereid in inserts met een poreuze membraan waardoor de voedingsstoffen naar de cellen worden gevoerd.

Gereconstrueerd weefsel vormt een niet-gehoornde epitheel dat het hoornvliesepitheel modelleert met progressief gelaagde maar niet verhoornde cellen. Bij ontvangst van het humane hoornvliesachtige epitheelkit, breng de weefsels in evenwicht in de 24-well verzendcontainer bij kamertemperatuur. Na 15 minuten opent u de zak met de 24-well weefselplaat onder steriele omstandigheden en inspecteert u alle weefsels op luchtbellen tussen het agros-gel en de inserts. Snijd open het plakband.

Verwijder de afdekking met een steriel gaas en inspecteer het weefseloppervlak. Pipetteer vervolgens één milliliter van 37 graden Celsius kit-testmedium in de putjes van vooraf gelabelde zes-welplaten. Gebruik vervolgens steriele pincetten om voorzichtig de weefsels met inserts op steriele gaas te dabbelen om eventuele resterende verzendaros te verwijderen en plaats ze in individuele putjes van de zes-welplaten.

Na één uur vervangt u het medium door één milliliter vers 37 graden Celsius testmedium en incubeert u de weefsels een nacht lang onder standaard kweekcondities. De volgende dag pipetteert u 20 microliter calcium- en magnesiumvrij DPBS op het apicale oppervlak van elk weefsel. Als de DPBS zich niet over de weefsels verspreidt, houdt u voorzichtig de insert vast met pincetten en tikt u op de plaat om ervoor te zorgen dat de zoutoplossing het hele weefseloppervlak bevochtigt.

Incubeer de platen gedurende 30 minuten. Om vervolgens de weefsels te behandelen met vloeibare testartikelen, brengt u 50 microliter van de negatieve controle, de positieve controle en de geschikte testartikelen in duplicaat toe volgens het tijdschema. Zorg ervoor dat de behandelingen de hele weefseloppervlakken bedekken en incubeer vervolgens de inserts gedurende 30 minuten om de weefsels te behandelen met vaste testartikelen.

Draag eerst de inserts over naar een steriele oppervlakte. Houd de plaat bedekt om besmetting met luchtdruppeltjes te voorkomen. Breng vervolgens met een geëgaliseerd lepel topisch 50 milligram van het testartikel aan op de dubbele weefsels volgens het tijdschema, waarbij u ervoor zorgt dat de behandeling het hele weefseloppervlak bedekt.

Alternatief kunt u een voorgevulde 1 milliliter spuit met de kop eraf gebruiken. Om de poeders direct op het kweekmedium te plaatsen. Druk de plunjer in om het poeder direct toe te passen na het aanbrengen van de vaste testartikelen, plaats de inserts terug in hun zes-welplaten en incubeer de weefsels gedurende zes uur om de weefsels te spoelen.

Na de behandeling vult u 3 150 milliliter bekers per testartikel met 100 milliliter DPBS aan het einde van de blootstellingsincuberperiode. Pak de bovenrand van de inserts met gekromde pincetten vast om ze uit de putjes te verwijderen. Neem vervolgens met behulp van pincetten twee inserts uit dezelfde behandeling bij hun bovenranden en giet de behandelingen op een schoon absorberend materiaal.

Dompel vervolgens de inserts in de eerste beker met DPBS en was de weefsels met een ronddraaiende beweging gedurende twee seconden. Til vervolgens de inserts op zodat ze grotendeels gevuld zijn met DPBS en giet de vloeistof terug in de beker. Herhaal de wasbeurt twee keer in de eerste beker.

Spuil vervolgens de inserts in de tweede en derde bekers met DPB S3 keer elke keer op dezelfde manier na de laatste wasbeurt. Draai elke insert naar een hoek van ongeveer 45 graden met de open kant naar beneden en raak de bovenste lip aan met het absorberende materiaal om eventueel resterend DPBS af te tappen. Dompel de weefsels vervolgens onmiddellijk in vijf milliliter kamertemperatuur testmedium.

In een vooraf gelabelde 12-welplaat aan het einde van de post-soaking incubatieperiode, giet u het testmedium af en dabbelt u de inserts op een absorberend materiaal. Breng vervolgens de inserts over naar een nieuwe zes-welplaat met één milliliter warm testmedium per putje en plaats de platen in de incubator om de MTT-levensvatbaarheidstest te starten. Breng de inserts over naar een 24-welplaat met 0,3 milliliter vers bereide MTT-oplossing.

Dabbel de inserts op het absorberende materiaal voordat u ze overbrengt. Laat eventuele luchtbellen los die onder de inserts vastzitten en breng de weefsels na drie uur terug in de incubator. Dabbel de onderkanten van de inserts op het absorberende materiaal. Voor de ondergedompelde