Bepaling van vetzuuroxidatie en Lipogenese in Mouse primaire hepatocyten

Het algemene doel van deze procedure is om het vetzuurmetabolisme in primaire muizenhepatocyten te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst een muizenlever te perfunderen met digestiemedium, deze te verwijderen en vervolgens de hepatocyten te isoleren. De tweede stap bestaat uit het kweken van de hepatocyten op met collageen gecoate platen.

Vervolgens worden de hepatocyten behandeld met de experimentele interventies die worden getest. De laatste stap is het incuberen van de cellen in aanwezigheid van een radioactief gelabeld substraat. Uiteindelijk wordt vloeibare scintillatie-analyse gebruikt om de effecten van verschillende farmacologische of genetische interventies op vetzuuroxidatie of lipogenese in primaire hepatocyten aan te tonen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van verschillende kernvragen op het gebied van metabolisme en diabetes, waaronder de vraag hoe specifieke farmacologische en genetische interventies de biologie van hepatocyten beïnvloeden. Een visuele demonstratie van deze methode is om twee redenen cruciaal. Ten eerste zijn specifieke perfusiecondities die de gezondheid van hepatocyten beïnvloeden moeilijk te verkrijgen, en ten tweede is de kwantificering van vrijgekomen koolstofdioxide essentieel.

Gas is niet intuïtief. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Tom Akey, een promovendus uit mijn laboratorium. Stel de peristaltische pomp in door één uiteinde van de steriele slang in het voorverwarmde leverperfusiemedium te plaatsen en het andere uiteinde in een afvalcontainer.

Laat de pomp draaien totdat de gehele lengte van de slang is gevuld met medium. Na het opofferen van de betreffende muis wordt de buik van de muis ruim besproten met 70% ethanol. Maak vervolgens met botte scharen een incisie in de middellijn door de dermis over de lengte van de buik en reflecteer deze zijwaarts.

Maak een soortgelijke incisie in het peritoneum om de viscera bloot te leggen. Verschuif de darmen voorzichtig met een stomp instrument. Om de abdominale vasculatuur bloot te leggen, lokaliseer de vena cava inferior in het abdomen en plaats een hechtdraad onder het bloedvat, distaal van de nierader, distaal van de hechting.

Plaats een naald en katheter in de vena cava inferior en voer deze verder door dan de hechting. Terwijl de naald nog op zijn plaats zit, wordt de hechting rond de katheter geknoopt om deze te fixeren, waarna de naald voorzichtig wordt verwijderd. Als dit correct is uitgevoerd, zal het bloed via een pipet door de katheter stromen.

Vul het resterende gedeelte van de katheter met perfusiemedium en zorg ervoor dat er geen lucht aanwezig is. Bevestig vervolgens met grote zorg de slang aan de katheter. Doorboor daarna voorzichtig het diafragma met scherp-geëinde scharen en maak een laterale incisie om de pleuraholte bloot te leggen.

Plaats, terwijl u voorzichtig de galblaas en de pleurale vasculatuur vermijdt, een bulldogklem rond de thoracale vena cava inferior net proximaal van de vena hepatica. Snijd vervolgens de vena portae door en zet de pomp aan op drie tot vier milliliter per minuut. Perfuseer de lever gedurende vijf minuten met leverperfusiemedium, waarbij ongeveer 20 milliliter perfusiemedium wordt gebruikt.

Observe tijdens deze tijd de onmiddellijke kleurverandering van de lever van rood naar een grijsbruine kleur. Indien delen van de lever rood blijven, duidt dit op een gebrekkige perfusie en is de kans op een succesvolle isolatie sterk verminderd. Stop na de vijf minuten durende perfusie de pomp en breng de slang over naar het medium voor leverdigestie.

Start de pomp opnieuw en perfuseer de lever gedurende nog eens 10 tot 15 minuten. Met drie tot vier milliliters per minuut totdat het medium is uitgeput. Stop de pomp aan het einde van de perfusie.

De lever moet een roze kleur hebben en enigszins vergroot lijken. Exiceer op dit punt de lever door middel van zorgvuldige dissectie. Breng deze over naar een weefselkweekschaal van 10 centimeter en verwijder de galblaas.

Voeg vervolgens 10 milliliters platingmedium toe aan de lever en begin de lever voorzichtig te schrapen met een scalpel. Om de hepatocyten te isoleren, wordt de suspensie gefilterd met een 100 micron celzeef en overgebracht naar een 50 milliliter conische buis. Was de plaat met nog eens 10 milliliters platingmedium en verzamel de vloeistof in de 50 milliliter conische buis.

Pelleteer vervolgens de cellen bij vier graden Celsius door vijf minuten te centrifugeren bij 350 Gs, aspireer het medium en resuspendeer de celpellet in 10 milliliters platingmedium. Voeg daarna 10 milliliters 90% colloïdaal silica gecoat met polyvinylperon toe, meng dit voorzichtig en pelleteer de cellen vervolgens opnieuw op dezelfde wijze. Aspireer na centrifugatie de laag dode cellen die bovenop het mengsel drijft.

Was vervolgens de levende celpellets tweemaal met 20 milliliters kweekmedium. Resuspendeer de uiteindelijke celpellet in 10 milliliters kweekmedium en tel de cellen met een hemocytometer. Plaats 90.000 cellen per putje in collageen-gecoate 24-well kweekplaten. Incubeer de platen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende twee uur, 16 tot 20 uur voordat de assay wordt gestart.

Was de cellen twee keer met warme PBS en breng de cellen over naar serumvrij medium voor serumuithongering met 20 nanomoles glucagon. Incubeer de cellen overnacht bij 37 °C en 5% CO2 op de ochtend van de assay.

Bereid het pre-incubatiemedium voor en vervang vervolgens het serumvrije medium. Medium voor het pre-incubatiemedium. Incubeer de cellen in dit mengsel gedurende twee uur bij 37 °C en 5% CO2 tijdens de incubatie.

Droog 0,5 microcuries per putje C 14-palmitaat door het ethanoloplosmiddel onder stikstof te verdampen. Resuspendeer het C 14-palmitaat ongeveer 15 minuten voor het einde van de incubatie in 0,1 N natriumhydroxide bij 12,5 microliter per microcurie. Incubeer het mengsel 10 minuten bij 70 °C. Voeg vervolgens drie volumes voorverwarmd incubatiemedium toe en meng door meerdere keren op te zuigen en uit te pipetteren.

Voeg aan elke well 25 µL van de verdunde C 14 palmitaatmix toe door de plaat voorzichtig te schudden en incubeer gedurende 90 minuten bij 37 °C. Dit is de assayplaat. Verwijder tijdens de incubatie het kapje van een steriele 24-well plaat en plaats in de bodem van elke well een stuk filterpapier van twee centimeter bij twee centimeter. Leg vervolgens een stuk Parafilm van vier inch bij zeven inch over de plaat, waarbij u gebruikmaakt van een groot rechthoekig object, zoals een doosje voor micropipetpunten.

Wrijf over de paraffine op de wells om de paraffine bij de openingen van de wells te perforeren en zo een zegel over de rest van de plaat te creëren. Verwijder vervolgens de geperforeerde cirkels paraffine. Voeg nu, 10 minuten voor het einde van de incubatie, 200 µL van drie normale natriumhydroxide toe aan elke well van de filterpapierplaat, waarbij u erop let dat het filterpapier alle vloeistof absorbeert.

Vries de assayplaat aan het einde van de incubatie snel in met vloeibare stikstof. Voeg vervolgens 100 µL 70% perchloorzuur toe aan elke put van de assayplaat. Dek direct af met een filterpapierplaat en plaats de platen op een orbitale schudmachine.

Schud de platen gedurende twee uur bij kamertemperatuur op een orbitale snelheid van 80 RPM. Meet vervolgens de koolstofdioxdefractie door de vierkante filterpapierstukjes over te brengen naar vier milliliter vloeistofscintillatievloeistof in scintillatiebuisjes en meet het C 14-signaal op een scintillatieteller om het zuuroplosbare materiaal te bepalen. Breng 400 microliters medium over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje, centrifugeer op maximale snelheid gedurende 10 minuten en voeg vervolgens 100 microliters van het resulterende supernatant toe aan 500 microliters van een mengsel van chloroform en methanol in een verhouding van twee op één.

Vortex het mengsel kort en voeg vervolgens 250 µL water toe aan het mengsel en vortex opnieuw. Centrifugeer de monsters vervolgens gedurende 10 minuten bij 1000 g. Breng daarna 200 µL van de bovenfase over naar vier milliliter vloeistof-scintillatievloeistof in een scintillatiebuisje en meet het C 14-signaal na serumuithongering van de cellen. Plaats de cellen vervolgens in lipogenesemedium.

Voeg alle te testen verbindingen van belang toe en incubeer de cellen vervolgens gedurende twee uur bij 37 °C en 5% CO2. Was de cellen twee keer met PBS voordat de cellen worden gelyseerd door 120 µL 0,1 N zoutzuur toe te voegen. Schraap in elke put de wanden om het lysaat vrij te maken en pipetteer vervolgens 100 µL van het lysaat in een microcentrifugebuisje van 1,5 mL.

Voeg vervolgens 500 µL van een mengsel van chloroform en methanol in een twee-op-een verhouding toe aan elke buis. Vortex kort en incubeer daarna gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg na de incubatie 250 µL water toe, vortex en incubeer het monster vervolgens nogmaals vijf minuten bij kamertemperatuur.

Centrifugeer de monsters vervolgens 10 minuten bij 3000 Gs. Draag de onderste fase van de gescheiden vloeistof voorzichtig over naar vier milliliter vloeibare scintillatievloeistof in een scintillatiebuisje en meet de tritiumactiviteit met een scintillatieteller. Deze procedure resulteert doorgaans in de isolatie van 10 tot 30 miljoen hepatocyten per muis. Na een incubatie van een nacht zien gezonde cellen er hexagonaal uit, waarvan velen een kern zullen hebben.

Ongezonde culturen bevatten vaak granulaties of blebs, wat duidt op celdood. Hier worden de resultaten getoond van een assay voor vetzuuroxidatie, waarbij de toevoeging van de cellulaire respiratiepromotor F-C-C-P en oligomycine, een respiratieremmer, werd vergeleken met een vehikelcontrole om de volledige oxidatie te meten. De verhouding tussen koolstofdioxide en zuuroplosbaar materiaal wordt berekend.

Stoffen die de cellulaire ademhaling stimuleren, zoals FCCP, zullen deze ratio verschuiven richting kooldioxide, wat duidt op meer oxidatie via de TCA-cyclus; remmers van de ademhalingsketen zullen de oxidatie in zijn geheel verminderen bij meting. Voor lipo-activiteitsverbindingen zullen stoffen die vetzuuroxidatie verhogen, zoals FCCP, of ATP-synthese verminderen, zoals oligomycine, de lipo-activiteit in gekweekte hepatocyten verlagen in vergelijking met vehicle-controles. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de perfusie volledig en tijdig plaatsvindt na het offeren van het dier.

Bovendien is het tijdens de assay voor vetzuuroxidatie essentieel dat het medium volledig bevriest voor reproduceerbare metingen van kooldioxidegas. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u primaire hepatocyten isoleert, alsof u deze cellen gebruikt om vetzuuroxidatie en lipogenese in vitro te analyseren.