Name: Selectieve Uitputting van Microglia van Cerebellaire Korrel celkweken behulp L-leucine Methyl Ester (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Leer microglia selectief uitputten uit cerebellaire korrelcelkweken met L-leucine methyl ester. Deze methode helpt onderzoekers neuronale functie te bestuderen zonder microgliale invloed.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door een Aims2Cure, UK en een UCL Impact Award Ph.D. beurs aan JMP en een MRC Capacity Building Ph.D. beurs in dementie aan JMP.

Alle experimenten die hierin zijn beschreven werden uitgevoerd volgens het Verenigd Koninkrijk Animals (Scientific Procedures) Act van 1986. 1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur Media en gerechten <ol><li> Bereid twee roestvrijstalen laboratorium ontleden schaar en twee roestvrijstalen laboratorium tang. Autoclaaf alle instrumenten en plaats in een cultuur kap O / N onder ultraviolet licht (UV) licht voor sterilisatie. </li><li> Voeg 500 ml minimaal essentieel medium (MEM) kweekmedium (10% foetaal runderserum [FBS], 20 mM KCI, 25 mM NaHCO 3, 30 mM D-glucose, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 gg / ml streptomycine en 6 ug / ml ampicilline) en filter steriliseren. Bewaar bij 4 ° C voor maanden. </li><li> Bereid 24 putjes met 14 mm, nummer 1 dikte coverslips. Autoclaaf de dekglaasjes en vacht bij 100 mg / l poly-d-lysine (PDL), zoals eerder beschreven 3. UV-licht steriliseren O / N. </li></ol> 2. Voorbereiding van de CGC Cultuur Solutions <ol><li> Bereid &#39;oplossing A (100 ml) in geautoclaveerde, UV licht behandelde, steriele dH 2 O bevattende 250 mg glucose, 300 mg runderserumalbumine [BSA], 955 mg fosfaat gebufferde zoutoplossing [PBS] (Ca2 + en Mg + vrij) en 1 ml van 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O. </li><li> Bereid &#39;oplossing B (10 ml) dat 1 ml 5 mg / ml trypsine verdund in 9 ml van oplossing A </li><li> Bereid &quot;oplossing C&quot; (10 ml) dat 1000 eenheden DNase, 0,5 mg sojaboontrypsineremmer, 100 gl 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O, verdund tot 10 ml met oplossing A </li><li> Bereid &#39;oplossing D&#39; (20 ml) die 3,2 ml oplossing C, verdund tot 20 ml met oplossing A </li><li> Bereid BSA / Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS) oplossing die EBSS, 25 mM NaHCO 3, 3 mM MgSO 4 · 7H 2 O, en4% BSA, pH 7,4, zoals eerder beschreven 3. </li><li> Bereid LME door toevoeging pure LME in 5 ml MEM kweekmedium tot een eindconcentratie van 150 mM LME geven, de oplossing op pH 7,4 terug met een benchtop pH meter en filter gesteriliseerd met een 28 mm polyethersulfon (PES) 0,2 urn spuit filter. </li></ol> 3. Het kweken van de CBC&#39;s <ol><li> Verzamel cerebella 4-7 dagen oude pups rat zoals eerder beschreven 3. Direct plaatsen in petrischaal met 5 ml oplossing A op het ijs. </li><li> Giet het overtollige oplossing uit cerebella en plaats weefsel in de petrischaal deksel. </li><li> Hak fijn weefsel met een goed gevlamd scheermesje in ten minste drie verschillende richtingen. </li><li> Voeg gehakt weefsel aan oplossing B (spoel petrischaal met een oplossing beperkte weefsel zorgen verlies) en overbrengen in een waterbad bij 37 ° C gedurende 5 min. Schud zachtjes om de paar minuten. </li><li> Voeg oplossing D (20 ml) aan de buis trypsine, schudden en cent neutraliserenrifuge bij 65 xg gedurende 5 min. </li><li> Giet supernatant. </li><li> Resuspendeer in 4 ml oplossing C. Triturate goed (ongeveer 10 maal elk) met drie gevlamde glas pipetten van afnemende diameter totdat de suspensie zo homogeen mogelijk. </li><li> Langzaam en voorzichtig enkele druppels van dit homogenaat bovenop de BSA / EBSS. Als het begint te dalen door de BSA / EBSS, tritureer meer en / of voeg een beetje oplossing C. Het homogenaat wordt in een laag bovenop de BSA / EBSS zitten. Niet schudden. Spin bij 100 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer pellet (soft) in 1 ml MEM medium. </li><li> Tellen cellen met een hemocytometer en plaat bij 800.000 cellen / dekglaasje in 500 pl MEM medium. Plaats in een incubator bij 37 ° C met 6% CO2. </li><li> Verander het medium de volgende dag (24-36 uur na de prep). Voeg een oplossing MEM medium dat 10 uM van de celcyclus inhibitor arabinofuranosyl cytidine (AraC). <ol><li> Perdekglaasje, behouden 250 ui van het oude medium in een frisse 24 wells plaat, zuigen de rest, voeg 250 ul van normale MEM medium en zuig dit om de cellen te wassen, voeg dan de 250 ul van het oude medium terug naar de cellen en vul met 250 pl AraC-bevattend medium. Opmerking: Cellen kunnen worden gebruikt vanaf 6 dagen in vitro (DIV). </li></ol></li></ol> 4. Selectief Depleting de Microglia (Uitgevoerd op 6 DIV) <ol><li> Toevoegen pure LME aan 5 ml van een afzonderlijke portie van MEM medium tot een eindconcentratie van 150 mM LME geven. </li><li> Breng de oplossing op pH 7,4 en filter gesteriliseerd met een 28 mm polyethersulfon (PES) 0,2 urn spuitfilter. </li><li> Verdun oplossing tot een concentratie van 50 mM (2 x LME) in MEM medium en in een waterbad bij 37 ° C gedurende 10 min met normale MEM medium voor controlekweken. </li><li> Verwijder de helft (250 ui) MEM medium van CGC kweken en bewaar bij 37 ° C. </li><li> Behandel cellenmet MEM medium dat 2 x LME (250 ui), verdunde 1: 1 geven een goed concentratie van 25 mM, of voorverwarmd MEM medium zonder LME (250 ul) van controlekweken. </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 6% CO2 gedurende 1 uur. </li><li> Was cellen tweemaal in vers voorverwarmd MEM medium LME-bevattende media verwijderd en vervang de vastgehouden kweekmedium en een gelijk volume verse voorverwarmde MEM medium tot de overeenkomstige putjes. </li><li> Terug kweken in de broedstoof (bevochtigd met 6% CO2 bij 37 ° C) en laat het rusten gedurende 24 uur voor verdere behandeling. </li></ol>

<ol><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+remarkable%2C+yet+not+extraordinary%2C+human+brain+as+a+scaled-up+primate+brain+and+its+associated+cost%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost.</a> PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).</li>
<li>Evans, G. J., &Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+neurotransmitter+release+by+dihydropyridine-sensitive+calcium+channels+involves+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neuro%22%5BJournal%5D)">Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation.</a> Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).</li>
<li>Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways+mobilized+in+microglia+and+neurones+as+a+consequence+of+chromogranin+A-induced+microglial+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation.</a> J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).</li>
<li>Contestabile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+granule+cells+as+a+model+to+study+mechanisms+of+neuronal+apoptosis+or+survival+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro.</a> Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).</li>
<li>Kramer, D., Minichiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+of+primary+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell culture of primary cerebellar granule cells.</a> Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).</li>
<li>Facci, L., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+rat+cerebellar+granule+neurons+and+application+to+identify+neuroprotective+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents.</a> Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).</li>
<li>Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+of+the+accessory+cell+necessary+for+mitogen-stimulated+T+and+B+cell+responses+in+human+peripheral+blood%3A+delineation+by+its+sensitivity+to+the+lysosomotropic+agent%2C+L-leucine+methyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester.</a> J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).</li>
<li>Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+glia+release+factors+with+opposing+actions+upon+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival.</a> J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).</li>
<li>Guillemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtention+and+characterization+of+primary+astrocyte+and+microglial+cultures+from+adult+monkey+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains.</a> J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).</li>
<li>Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+expression+in+cultures+enriched+for+mature+oligodendrocytes+is+due+to+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia.</a> J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).</li>
<li>Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+p53+activation+is+detrimental+to+neuronal+sysnapses+during+activaton-induced+inflammation%3A+implications+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration.</a> Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).</li>
<li>Frade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+induces+release+of+glutathione+from+cultured+rats+astrocytes+%E2%80%93+a+possible+neuroprotective+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism.</a> J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).</li>
<li>Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+improved+procedure+for+the+removal+of+microglia+from+confluent+monolayers+of+primary+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).</li>
<li>Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+release+activators+of+neuronal+proliferation+mediated+by+activation+of+mitogen-activated+protein+kinase%2C+phosphatidylinositol-3-kinase%2FAkt+and+delta-Notch+signalling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades.</a> J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).</li>
<li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures%3A+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).</li>
<li>Kumamaru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+clodronate+selectively+eliminates+microglia+from+primary+astrocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures.</a> J Neuroinflamm. 9, 116(2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De belangrijkste stappen voor de succesvolle selectieve eliminatie van microglia van CGC verzekeren en / of gemengde kweken zijn: 1) het handhaven van een steriele en gezonde CGC cultuur; 2) filter steriliseren van de LME-bevattend medium en terug de oplossing op pH 7,4; 3) het bijhouden van de ingehouden CGC media en LME-bevattende media bij 37 ° C naar heat shock te voorkomen; en 4) snel werken om de tijd cellen buiten de incubator gehouden verminderen. We gebruikten 25 mM LME...

Het menselijk brein bestaat uit een geschatte 85 miljard neuronen en een verdere 85 miljard niet-neuronale cellen, waaronder glia 1. Vandaar de Griekse etymologie van &#39;glia &quot;vertaald Engels zo - voor het grootste deel van de afgelopen 100 jaar neuroscientists zijn vooral gericht op de neuronale celpopulatie, geloven gliacellen weinig meer dan passieve steuncellen die structurele ondersteuning voor neuronen &#39;lijm&#39;. Onlangs is het echter steeds duidelijker dat neuronale-gliale interacties veel fundamentele fundamentele aspecten van neurobiologie, neurofysiologie en het ontstaan ​​en de progressie van vele neurodegeneratieve ziekten kunnen zijn. Cerebellaire granule cellen (CBC), de meest voorkomende homogene neuronale populatie in het menselijk brein, domineren het cerebellum en make-up meer dan 90% van de cellulaire bestanddelen. Bijgevolg zijn deze cellen zijn uitgebreid gebruikt in vitro modelsysteem voor thij bestuderen van neuronale ontwikkeling, functie en pathologie 2-6. Echter, CGC culturen bevatten nog steeds microglia en andere glia in aantoonbaar significante proporties. Hierdoor kan CGC data vermoedelijk weergave van de directe neuronale reacties op andere cel behandelingen daadwerkelijk optreden - gedeeltelijk of geheel - van de indirecte secundaire respons van naburige glia in de kweek. Om dit te bepalen, we selectief afgesplitst microgliale van CGC neuronale kweken met behulp van L-leucine methylester (LME). LME is een lysomotropic middel oorspronkelijk gebruikt om selectief te vernietigen macrofagen 7, en is sindsdien gebruikt om ook selectief afbrekende microglia van neurale, astrocyten, en gemengde gliale culturen 8,9,10. LME wordt geïnternaliseerd door macrofagen en microglia, waarbij veroorzaakt lysosomale ontwrichting en daaropvolgende apoptose 13,14. Macrofagen en microglia zijn karakteristiek rijk aan lysosomen, waardoor ze particula zijnrly kwetsbaar bij blootstelling aan LME behandeling. Dit protocol biedt een krachtige, maar eenvoudige en gemakkelijke manier om de bijdrage van microglia in experimenten met behulp van CGC en andere neuronale / gliale cultuur systemen vast te stellen.

<table><tbody><tr><td>Forceps&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td>Het gebogen uiteinde vergemakkelijkt het verwijderen van de kleine hersenen&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro-dissectie schaar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146</td><td>Rechte, scherpe punt vergemakkelijkt P4-7 dissectie van knaagdieren&nbsp;</td></tr><tr><td>L-leucine methyl ester hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7517-19-3</td><td></td></tr><tr><td>EBSS oplossing&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7510-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27964-99-4</td><td>Bestrijk dekglasjes 1 dag voor gebruik&nbsp;</td></tr><tr><td>Rund serum albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Sojaboon trypsine-remmer&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6414</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-ED1 antilichaam&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab31630</td><td></td></tr></tbody></table>

selectieve uitputting van microglia van cerebellaire korrel celkweken behulp l-leucine methyl ester

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, de residente immunocompetente cellen van het CZS, spelen veelzijdige rollen in het moduleren en controleren van neuronale functie, evenals het mediëren van aangeboren immuniteit. Primaire knaagdier celkweekmodellen hebben ons begrip van neuronale-glia-interacties enorm bevorderd, maar pas recentelijk zijn methoden om microglia specifiek uit gemengde culturen te elimineren, gebruikt. Een van deze technieken – hier beschreven – is het gebruik van L-leucine methyl ester, een lysotroop middel dat wordt geïnternaliseerd door macrofagen en microglia, waarbij het lysosomale disruptie en daaropvolgende apoptose veroorzaakt13,14. Experimenten met L-leucine methyl ester hebben de kracht om de bijdrage van microglia aan de omringende cellulaire omgeving onder diverse kweekcondities te identificeren. Met behulp van een in ons laboratorium geoptimaliseerd protocol, beschrijven we hoe microglia uit P5 knaagdier cerebellaire granulecelcultuur kan worden geëlimineerd. Deze benadering maakt het mogelijk om de relatieve impact van microglia op experimentele gegevens te beoordelen, evenals om te bepalen of microglia een neuroprotectieve of neurotoxische rol spelen in kweekmodellen van neurologische aandoeningen, zoals beroerte, Alzheimer’s of Parkinson’s ziekte.

Het vermogen van deze techniek om selectief microglia van CGC en / of gemengde kweken elimineren berust op de daaropvolgende vermogen van de onderzoeker nauwkeurig te identificeren en differentiëren microglia van de omringende cellen. Dit kan worden bereikt door een microgliale-specifieke cel maker, zoals isolectin-B4, zie figuur 1. Zoals in figuur 2, werden geen waarneembare veranderingen in astrocyten en neuronale dichtheid en morfologie met betrekking op elke belangrijke behandelings...

Microglia kunnen neuronen en andere gliacellen in cultuur beïnvloeden door verschillende niet-celautonome mechanismen. Hier presenteren we een protocol om selectief microglia uit primaire neuronale culturen te depelen. Deze methode heeft het potentieel om de rol van microgliale-neuronale interacties te verduidelijken, met implicaties voor neurodegeneratieve aandoeningen waarbij neuro-inflammatie een karakteristieke eigenschap is.

Selectieve Uitputting van Microglia van Cerebellaire Korrel celkweken behulp L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Het algemene doel van deze procedure is om microgliaalcellen selectief te elimineren uit sella-granulcelculturen. Dit wordt bereikt door eerst een populatie cgcs te kweken en deze te bewaren in een incubator bij 37 °C met 6% CO2. De tweede stap is het maken van een LME-oplossing in MEM-medium om een uiteindelijke concentratie van 150 millimolair LME te verkrijgen.De volgende helft van het MEM-medium uit de CGC-culturen wordt verwijderd en bewaard in de incubator, waarna de CGC-culturen worden vervangen door een gelijk volume LME dat MEM-medium bevat en gedurende één uur in de incubator worden geplaatst bij 37 °C met 6% koolstofdioxide. De laatste stap is om de CGC-culturen tweemaal te wassen met vers, voorverwarmd MEM-medium.Vervang het behouden kweekmedium door een gelijk volume vers medium en plaats de cellen vervolgens gedurende 24 uur terug in de incubator voordat verdere behandelingen worden uitgevoerd. Tot slot worden immunochemie en fluorescentiemicroscopie gebruikt om de specifieke uitputting van microgliacellen uit cerebellaire korrelcelculturen aan te tonen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de neurobiologie, zoals welke effecten microglia hebben op neuronen onder verschillende omstandigheden, en welke betekenis deze effecten hebben voor ons begrip van neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben, omdat het werken met primaire culturen nauwkeurigheid en snelheid vereist. Begin deze procedure door de cerebella van vier tot zeven dagen oude rattenpups te verzamelen. Plaats ze onmiddellijk in een Petrischaal met vijf milliliters oplossing A op ijs.Verwijder vervolgens de overtollige oplossing van de cerebella en plaats het weefsel in het deksel van de Petrischaal. Hak het weefsel daarna fijn met een scheermesje in ten minste drie verschillende richtingen. Voeg vervolgens het fijngehakte weefsel toe aan oplossing B. Plaats het vijf minuten in een waterbad op 37 °C en schud het elke paar minuten voorzichtig.Voeg vervolgens 20 milliliter oplossing D toe aan de buis om de trypsine te neutraliseren en centrifugeer 5 minuten bij 60 5G. Schenk daarna de supernatant af en resuspendeer in vier milliliter oplossing CT. Pipetteer het monster 10 keer met elk van de drie gevlamde glaspipetten van afnemende diameter tot de suspensie zo homogeen mogelijk is.Voeg vervolgens langzaam en voorzichtig een paar druppels van dit homogenaat toe bovenop de B-S-A-E-B-S-S; als het door de B-S-A-E-B-S-S begint te zinken, moet u meer titreren en iets meer oplossing C toevoegen. Het homogenaat moet als een laag bovenop de B-S-A-E-B-S-S blijven liggen. Centrifugeer dit 5 minuten bij 100 G en schud niet. Verwijder daarna het supernatant en resuspendeer het pellet.Tel de cellen in één milliliter MEM-medium met een hemocytometer en zaai ze uit op 800 000 cellen per dekglas. Voeg daarna 500 µL MEM-medium toe en plaats het geheel in een incubator bij 37 °C met 6% CO2. Maak vervolgens een MEM-mediumoplossing met 10 µM van de celcyclusremmer RC. Behoud voor elk dekglas 250 µL van het oude medium in een nieuwe 24-wellplaat en aspireer de rest.Voeg 250 µL normaal MEM-medium toe om de cellen te wassen. Voeg vervolgens 250 µL oud medium terug toe aan de cellen en vul aan met 250 µL medium dat RSE bevat. Voeg bij deze procedure puur LME toe aan vijf milliliter MEM-medium om een eindconcentratie van 150 mM LME te verkrijgen.Breng de oplossing terug naar pH 7.4 met behulp van een zuuroplossing. Filtreer deze vervolgens steriel met een 28 millimeter PES spuitfilter van 0,2 micrometer. Verdun daarna de LME-oplossing tot een concentratie van 50 millimolair in MEM-medium.Plaats het vervolgens gedurende 10 minuten in een waterbad op 37 °C, samen met normaal MEM-medium voor de controleculturen. Verwijder na 10 minuten 250 µL van het MEM-medium uit elke CGC-cultuur. Bewaar het medium vervolgens bij 37 °C.Behandel de cellen vervolgens met MEM-medium dat twee keer zoveel LME bevat, of met voorverwarmd MEM-medium zonder LME. Voor controleculturen worden de cellen gedurende één uur geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 6% koolstofdioxide. Was de cellen daarna twee keer met vers, voorverwarmd MEM-medium om het LME-bevattende medium te verwijderen. Vervang vervolgens het resterende cultuurmedium door een gelijke hoeveelheid vers, voorverwarmd MEM-medium.Incubeer tenslotte de culturen gedurende 24 uur bij 37 °C in 6% bevochtigde koolstofdioxide voordat verdere behandelingen worden uitgevoerd. Deze figuur toont representatieve beelden van de experimenten die zijn uitgevoerd op CGC-culturen na behandeling met 25 tot 75 millimolaire LME gedurende één uur, gevolgd door het uitwassen. Immunochemie werd uitgevoerd met DPI voor kwantificering van het totale aantal cellen en de cellen met een apoptotische morfologie, en met ISO lectine B4 voor identificatie en kwantificering van microglia. Deze grafiek toont de kwantificering van cellen met een apoptotische morfologie; hier zijn de representatieve beelden te zien van de experimenten die zijn uitgevoerd op CGC-culturen na behandeling met 25 millimolaire LME gedurende één uur.Immunochemie werd uitgevoerd met DAPI, anti beta three tubulin voor de identificatie van veranderingen in de neuronale dichtheid en anti GFAP voor de identificatie van veranderingen in de astrocytaire dichtheid en morfologie. De afbeeldingen van de negatieve controle representeren CGC-culturen waarin de primaire antilichamen waren weggelaten. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer twee uur worden uitgevoerd indien deze correct wordt uitgevoerd.

selective-depletion-microglia-from-cerebellar-granule-cell-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

The video demonstrates a technique for isolating microglia from the cortex of an adult mouse brain. First, the cortex undergoes segmentation and homogenization to remove neurons and other glial cells, preserving microglia. Following that, the cell suspension is exposed to anti-myelin magnetic microbeads and a magnetic field, effectively separating microglia and myeloid cells from myelin debris and cells containing myelin.

Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain

This video demonstrates the technique for isolating and culturing primary mouse cerebellar granule neurons. Cells are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells and produce a pure culture of cerebellar granule neurons.

Isolation and Culture of Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

This video demonstrates a technique for the selective removal of microglia from a primary rat neuronal culture. Cerebellar granule neurons are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells. Additionally, they are treated with lysosome-targeting agents to deplete microglia from the culture.

Selectively Removing Microglia from a Rat Cerebellar Granule Neuron Culture

This video demonstrates a protocol for extracting microglial cells from demyelinating lesions in mouse brains using magnetic cell sorting. The protocol involves dissecting the lesioned brain tissue containing microglial cells, treating the tissue with specific enzymes to obtain a single-cell suspension, and utilizing microglial receptor-specific magnetic beads to isolate the microglial cells.

Isolating Microglia from Mouse Brain Demyelinating Lesions Using Magnetic Activated Cell Sorting

This video outlines the generation of a neuronal injury model using reactive oxygen species (ROS) in mouse primary cerebellar granule neurons. It details the process of inducing oxidative stress by adding high concentrations of hydrogen peroxide. ROS exposure causes DNA strand breaks and genomic instability. Additionally, the oxidation of cellular proteins impairs their functions, while lipid peroxidation compromises membrane integrity. This cascade leads to cytochrome c release and caspase...

Modeling Reactive Oxygen Species-Induced Neuronal Death in Mouse Cerebellar Granule Neurons

Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen

Dit protocol beschrijft hoe om neuronale levensvatbaarheid nauwkeurig te meten met behulp van Fluorescein Diacetate (FDA) en Propidium Iodide (PI) dubbele kleuring in gekweekte cerebellar granule neuronen, een primaire neuronale cultuur die gebruikt wordt als een in vitro model in neurowetenschappen en neurofarmacologie onderzoek.

Beoordeling van neuronale levensvatbaarheid met behulp van Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Dubbele Verf In Cerebellaire Granule Neuron Cultuur

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om te isoleren en primaire muisknop cerebrale submodule neuronen (CGNs) van 6-7 dag oud pups, efficiënte transductie van CGNs voor verlies en winst van functie studies, kweken en modellering NMDA-geïnduceerde neuronale excitotoxicity, lage-kalium-veroorzaakte celdood, DNA-schade en oxidatieve stress met behulp van de zelfde cultuur-model.

Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.

Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

Hier presenteren we een protocol om primaire microglia te isoleren en te zuiveren in diermodellen van demyeliniserende ziekten, met behulp van kolomvormige magnetisch geactiveerde celsortering.

Isolatie van primaire microglia van muizen door magnetisch geactiveerde celsortering in diermodellen van demyelinisatie

Leer microglia selectief uitputten uit cerebellaire korrelcelkweken met L-leucine methyl ester. Deze methode helpt onderzoekers neuronale functie te bestuderen zonder microgliale invloed.

Selectieve Uitputting van Microglia van Cerebellaire Korrel celkweken behulp L-leucine Methyl Ester

Meer video's verkennen