Name: TRAP-rc, vertalen Ribosoom Affiniteitszuivering van Rare Cell Populaties van Drosophila Embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Leer TRAP-rc voor het isoleren van mRNA uit zeldzame celpopulaties in Drosophila-embryo's. Deze methode maakt celtype-specifieke translatie-analyse mogelijk zonder celdissociatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Nicolas Allegre, Maud Peyny en Jean-Philippe Da Ponte voor hun uitstekende technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door de Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), de INSERM startbeurs, ANR ID-CELL-SPE beurs, Equipe FRM en de AFM 15845 beurs.

1. Fly Line Generation <ol><li> Genereren twee verschillende constructies. In het eerste construct wordt RpL10A cDNA (ribosomale subunit eiwit L10A) stroomafwaarts van GFP gekloneerd in pUASP-PL-GFP-nter plasmide (gewijzigde versie van 32). Het gebruik van een kiemlijn promotor maakt een polyvalent gebruik van de transgene lijn. LET OP: Haal de tweede construct door het klonen van de regulerende sequentie rijden weefsel-specifieke expressie van de slappe-gen stroomopwaarts van GAL4 (TF) met pPTGAL4 plasmide. </li><li> Injecteren plasmiden afzonderlijk in w 1118 vliegt en steek constructies in de fly genoom door P-element inbrengen (volgens de standaard procedure) 33. </li><li> Selecteer transformanten om te vliegen lijnen herstellen met constructies op twee verschillende chromosomen. De uiteindelijke TRAP lijn wordt gemaakt door deze twee lijnen (genetische kruisjes) te combineren met het oog op een dubbel-transgene stabiele lijn te krijgen. F0: W-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx W-; Cyo / Scu; Slouch Gal4 / TM6B. F1: W-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massaal deze lijn te versterken en het verzamelen van de gewenste-geënsceneerd embryo&#39;s. </li></ol> 2. Embryo Collection <ol><li> Bereid 8 grote cilindrische bevolking kooien met ongeveer 40 g jonge vliegen per kooi (ongeveer 180.000 vliegen / kooi). </li><li> Doorgaan met zogenaamde pre-liederen waarmee vliegt aan de ontwikkeling van embryo&#39;s te verwijderen uit de eileiders. Daarvoor lag de vliegen gedurende 1 uur op twee 11 cm diameter petrischalen die een mengsel van gestolde agar en druivensap en ⅓ bedekken van het oppervlak met verse gistpasta. Na 3 uitwisseling van druivensap platen verzamelen de echte embryo&#39;s over soortgelijke vers gemaakte platen. OPMERKING: incubatie tijd zal variëren afhankelijk van ontwikkelings-tijd-venster bestudeerd. </li><li> Verwijder platen uit kooien en laat ze bij dezelfde temperatuur gedurende de tijd die nodig is om de juiste ontwikkelingsfase verkrijgen (bijvoorbeeld 3 h eileg + 10 h Additional incubatie geeft embryo&#39;s van het podium 10-13 uur na eileg (AEL)). Resuspendeer de plaat inhoud (embryo&#39;s, gist pasta, dode vliegen) met 50 ml water en een borstel. </li><li> Ga door een reeks zeven (700 urn, 355 urn, 112 urn) embryo&#39;s uit dode vliegen en overige delen scheiden en verzamelen embryo op de zeef kleinere diameter vastgehouden, vervolgens kort spoelen in gedeïoniseerd water. Gebruik niet meer dan 18 platen per collectie als het de zeven kunnen verstoppen. </li><li> Dechorionate embryo&#39;s in 4,5% bleekmiddel in gedemineraliseerd water gedurende 2 minuten en goed naspoelen met gedemineraliseerd water gedurende 30-60 sec. Incubeer embryo in PBS 0,01% Tween 20, 100 ug / ml cycloheximide, gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur onder schudden. </li><li> Droge embryo&#39;s op cellulose absorberende lakens en overbrengen naar microcentrifugebuisjes. Weeg de buizen en flash-bevriezen de embryo&#39;s door onderdompeling in vloeibare stikstof. In dit stadium kan de gedroogde embryo&#39;s worden opgeslagen gedurende verscheidene maanden bij -80 ° C. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Voorbereiding van Magnetic Beads Gekoppeld aan GFP Antibody <ol><li> Grondig resuspendeer de Proteïne G magnetische korrels in de oorspronkelijke fles door voorzichtig schudden. </li><li> Overdracht 90 ul van kralen aan een RNase-vrij buis en verzamelen ze op een magneet (30-60 sec). 90 ui bolletjes moet verrichten immunoprecipitatie (IP) met 1 ml lysaat bevattende 60-80 mg / ml eiwitten. Respecteer verhoudingen tot hiel verzadiging te voorkomen. Gebruik meerdere buizen volgens eiwit bedrag. </li><li> Was kralen met 1 x PBS 0,01% Tween 20 (500 ui) en het verzamelen van parels op de magneet bovenstaande vloeistof. Voeg 30 ug GFP antilichaam in 350 ul PBS 0,01% Tween 20 aan de kralen en geïncubeerd onder langzaam over de kop mengen gedurende 30 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verzamel kralen op de magneet (30-60 sec), gooi supernatant en spoel in 500 pl polysoomdisplays extractiebuffer (10 mM Hepes, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 1% Triton, Cycloheximide 100 ug / ml , Protease inhibitor 1 ×, RNase remmer 100 E). </li><li> Verzamel kralen op de magneet en voeg 500 pl blokkerende buffer (BSA 0,1 ug / ul, gist tRNA 0,1 ug / ul, glycogeen 0,1 ug / ul in polysoomdisplays extractiebuffer). </li><li> Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en een keer herhaal deze stap met verse blokkerende buffer. </li><li> Verzamel kralen op de magneet en spoel in 500 ul polysoom extractiebuffer, dan herinneren kralen en direct doorgaan naar de immunozuivering stap (hoofdstuk 6). </li></ol> 4. Lysate Voorbereiding <ol><li> Voordat u begint, het opzetten van het programma op de multi-directionele hoge snelheid kralen molen: 2 × 10 sec bij 5000 toeren per minuut, 15 seconden pauze. Transfer gedroogde embryo&#39;s (1,5 g) tot 15 ml voorgekoeld buisjes op ijs met polysoomdisplays extractiebuffer en onmiddellijk gehomogeniseerd. Homogeniseer in 4 ml extractiebuffer polysoomdisplays 1,5 g embryo. </li><li> Spread gehomogeniseerd embryo&#39;s in twee prechilled 2 ml buizen en maal de embryos door uitvoering van de homogenisator programma. Breng het lysaat in verse voorgekoelde microcentrifugebuizen op ijs en maak een Postnuclear supernatant door centrifugatie bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 2000 g. </li><li> Breng supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis voorgekoelde op ijs, voeg 1/100 monstervolume van 10% Nonidet P-40 aan het supernatant (eindconcentratie = 0,1%) en meng voorzichtig door het buisje. </li><li> Pulse-centrifuge het monster in een minicentrifuge om de vloeistof te verzamelen op de bodem van de buis, voeg 1/9 monstervolume van 300 mM 1,2-Diheptanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DHPC) (eindconcentratie = 30 mM ), meng het voorzichtig door het omkeren van de buis, en incubeer het mengsel op ijs gedurende 5 minuten (mix door meerdere malen om te keren tijdens de incubatie). </li><li> Bereid de post-mitochondriaal supernatant door centrifugatie bij 4 ° C gedurende 10 min bij 20.000 g. Meet proteïneconcentratie door Bradford methode: concentratie lysaat moet tussen 60-80 mg / ml. Take de bovenstaande om een ​​frisse nieuwe voorgekoeld microcentrifugebuisje en onmiddellijk overgaan tot de pre-absorptie stap (hoofdstuk 5). </li></ol> 5. Pre-absorptie <ol><li> Grondig resuspendeer de magnetische korrels door voorzichtig schudden en breng 30 pl van parels in een microcentrifugebuis bij kamertemperatuur (30 ul kralen / 1 ml embryonale lysaat). </li><li> Verzamel kralen op de magneet, pipet uit het supernatant en resuspendeer de kralen in polysoomdisplays extractiebuffer (500 ui). Verzamel kralen op de magneet, voeg embryonale lysaat en incubeer 1 uur bij 4 ° C op een rotator. <ol><li> Verwijder kralen en houden supernatant op ijs voor de immunozuivering stap. Voor immunozuivering houden 100 pl supernatant (input) mondiale RNA-monster te vergelijken met het RNA monster na immunozuivering verzameld door RT-qPCR bijvoorbeeld. </li></ol></li></ol> 6. immunozuivering <ol><li> Voeg 1 ml (overeenkomend met 60-80 mg / ml eiwit) vanpre-geabsorbeerd lysaat aan een RNase-vrije buis met 90 pl van geblokkeerde parels gekoppeld aan GFP antilichaam. Incubeer de monsters bij 4 ° C gedurende 2 uur onder zacht end-over-end mengen in een buis rotator. Als alternatief, het uitvoeren van de incubatie O / N bij 4 ° C. </li><li> Na incubatie verzamelen kralen op de magneet. Gebruik een minicentrifuge verminderde snelheid van de korrels vervolgens resuspenderen ze in 500 pl wasbuffer (Hepes 10 mM, KCl 350 mM, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mM, cycloheximide 100 ug / ml RNase inhibitor 100 U ) en verzamelen ze op de magneet. Herhaal deze stap nog twee keer. </li><li> Verander de kralen aan een nieuwe voorgekoeld RNase vrije buis en was twee keer. Verzamel kralen op een magneet en ga verder met RNA-extractie door toevoeging van 1 ml TRIzol direct naar kralen en de instructies van de fabrikant. </li></ol> 7. RNA Clean-up en Quality Assessment <ol><li> Gebruik een RNeasy Micro Kit volgens de instructies van de fabrikant. Bij oplevering, elutkolome-RNA met een (x) pi RNase-vrij water. Warm gedurende 2 min bij 60 ° C en opslag snel bevroren monsters bij -80 ° C. Controleer RNA kwaliteit met bioanalyzer (volg de instructies van de fabrikant). </li><li> Om de specificiteit van de Traped RNA te testen, uit te voeren reverse transcriptie op 3 ng gezuiverd RNA (input en IP) volgens de instructies van de fabrikant (superscript III). Met het cDNA verkregen qPCR gebruikt genspecifieke primer sets. </li></ol>

<ol><li>Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).</li>
<li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (1038).</li>
<li>Junion, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+view+of+cell+fate+specification%3A+ladybird+acts+at+multiple+levels+during+diversification+of+muscle+and+heart+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors.</a> Genes. 21, 3163-3180 (2007).</li>
<li>Jakobsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+ChIP-on-chip+reveals+Biniou+as+a+universal+regulator+of+the+visceral+muscle+transcriptional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network.</a> Genes. 21, 2448-2460 (2007).</li>
<li>Cunha, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+binding+leads+to+diverse+regulatory+responses%3A+Lmd+is+a+tissue-specific+modulator+of+Mef2+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity.</a> PLoS genetics. 6, e1001014(2010).</li>
<li>Sandmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+transcriptional+network+for+early+mesoderm+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+%26+development%22%5BJournal%5D)">A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster.</a> Genes, & development. 21, 436-449 (2007).</li>
<li>Kvon, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+functional+characterization+of+Drosophila+developmental+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo.</a> Nature. 512, 91-95 (2014).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).</li>
<li>Gallo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REDfly+v3.0%3A+toward+a+comprehensive+database+of+transcriptional+regulatory+elements+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila.</a> Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).</li>
<li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li>
<li>Doyle, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+translational+profiling+approach+for+the+comparative+analysis+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types.</a> Cell. 135, 749-762 (2008).</li>
<li>Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+approaches+to+RNA+profiling+data+for+the+identification+of+genes+enriched+in+specific+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells.</a> Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).</li>
<li>Fomchenko, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+cells+can+become+transformed+and+overtake+PDGF-induced+murine+gliomas+in+vivo+during+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression.</a> PloS one. 6, e20605(2011).</li>
<li>Helmy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+global+alteration+of+translational+regulation+glioma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo.</a> PloS one. 7, e46965(2012).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li>
<li>Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+mouse+line+for+collecting+ribosome-bound+mRNA+using+the+tetracycline+transactivator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+molecular+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82(2014).</li>
<li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li>
<li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+translational+profiling+in+the+Xenopus+laevis+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1%2FStat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).</li>
<li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li>
<li>Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+analysis+of+translating+RNAs+in+developing+flowers+reveals+new+levels+of+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control.</a> Molecular systems biology. 6, 419(2010).</li>
<li>Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+method+for+cell-specific+profiling+of+translated+mRNAs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila.</a> PloS one. 7, e40276(2012).</li>
<li>Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Larval+and+Adult+Drosophila+Astrocytes+Reveals+Stage-Specific+Gene+Expression+Profiles%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles.</a> G3. , (2015).</li>
<li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Res. 22, 766-777 (2012).</li>
<li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).</li>
<li>Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+analysis+of+muscle+founder+cells+implicates+the+chromatin+regulator+Sin3A+in+muscle+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity.</a> Cell reports. 8, 858-870 (2014).</li>
<li>Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+cell+sorting+from+Drosophila+embryos%3A+application+to+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis.</a> Fly. 5, 261-265 (2011).</li>
<li>Busser, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+underlying+the+regulatory+specificity+of+a+Drosophila+homeodomain+protein+that+specifies+myoblast+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity.</a> Development. 139, 1164-1174 (2012).</li>
<li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gal4+in+the+Drosophila+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">Gal4 in the Drosophila female germline.</a> Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).</li>
<li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li>
<li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit document beschrijft een gemodificeerde vertalen Ribosoom Affinity Purification protocol (dubbed &quot;TRAP-rc) gewijd aan de studie van zeldzame celpopulaties in Drosophila embryo. Informatie op de belangrijkste stappen voor een succesvolle isolatie van specifiek RNA in een opbrengst geschikt voor microarray en RNA-seq analyse, dat wil zeggen, 1) hoeveelheid van biologisch materiaal nodig is en geoptimaliseerd wijze van embryo lysis en extractie polysoomdisplays; 2) kralen / antilichaam-to-lysaat verhoudingen voor optimale immunoprecipitatie; 3) stappen waardoor vermindering van achtergrond met inbegrip van wassen buffer samenstelling om zo TRAP-rc experimenten met hoge specificiteit en gevoeligheid te voeren. Dit protocol levert reproduceerbare gegevens waardoor het gemakkelijk toegepast op andere celtypen. Deze techniek maakt het mogelijk om differentiële genexpressie te analyseren op het niveau van actief-vertalen mRNA en aldus de weg vrijmaken voor het begrip van eiwitexpressie in plukje<html> ific celsoort in een bepaald tijdskader. Merk echter op dat eiwit overvloed zal afhangen van de snelheid van de vertaling en afbraakprocessen. Een belangrijke beperking van de TRAP methode is het onvermogen om eiwitgehalte te meten op een nauwkeurige kwantitatieve wijze of post-translationele modificatie detecteren. Verbetering van de kwantificering door het meten van de dichtheid ribosoom aan het mRNA orgaan en daarmee in een celtype-specifieke wijze kan TRAP gecombineerd met ribosoom footprinting een zeer krachtig instrument maken. In een recent artikel 34, werd deze combinatie uitgevoerd in humane embryonale nier-293-cellen. De auteurs rende nuclease footprinting gevolgd door affiniteitszuivering van een induceerbare gebiotinyleerde vorm van RpL10A gebruik streptavidineparels. Dit is een bewijs van het principe dat het mogelijk is ribosoom footprinting voeren in een geheel organisme terwijl gericht op een specifiek celtype, de beperking waarbij de hoeveelheid biologisch materiaal welke hiertoe. &quot;&gt; Performing TRAP experimenten parallel met de wereldwijde transcriptomische analyses zal het mogelijk maken om de verhoudingen tussen de nieuw-getranscribeerd en actively- vertalen RNA. Deze diep informatieve van de mogelijke post-transcriptionele mechanismen die plaatsvinden in specifieke ontwikkelingsstoornissen contexten of specifieke celpopulaties te volgen -door microRNAs bijvoorbeeld. Concluderend TRAP is een zeer efficiënte, specifieke en gevoelige werkwijze voor het identificeren van RNA-gebonden actief vertalen van ribosomen in een cel-specifieke manier. Deze methode kan gebruikt worden in diverse organismen en weefseltypen. De nieuwe TRAP-rc hier beschreven protocol werd geoptimaliseerd voor zeldzame celpopulaties (minder dan 1% van het totaal aantal cellen) en een hoeveelheid eindmateriaal voldoende vervolgens geanalyseerd op hele genoom level. Een mogelijke beperking van deze methode is de eis van een sterke bestuurder gelabelde ribosomen te produceren in voldoende hoeveelheid om compete met endogene niet-gecodeerde degenen in de beoogde celtype. In een recente studie 25, auteurs schatting 10-30% de verhouding van gemerkte versus untagged ribosomen. Om dit probleem te verhogen van UAS-RpL10A-EGFP aantal kopieën moet aanzienlijk deze balans te verbeteren overwinnen. Alternatief, waardoor de beschreven genetische achtergrond een UAS-GAL4 transgen zal de productie van GAL4 eiwit te amplificeren en indirect verhogen expressie van RpL10A-EGFP. Dit moet een betere bezetting van gelabeld ribosomen op mRNA bevorderen. Merk op dat deze reeds efficiënte benadering nog krachtiger door aanpassing complementaire methoden om een ​​kwantitatief aspect brengen of te ontdekken en te ontrafelen moleculaire mechanismen die essentieel zijn voor genexpressie zijn kunnen worden gemaakt.

Begrijpen hoe cellen verwerven specifieke eigenschappen tijdens de ontwikkeling is cruciaal om de complexiteit van organen en hun mogelijke evolutie naar pathologische aandoeningen waarderen. Er is een groot onderzoek druk om het gen regulerende netwerken die cel specificatie en differentiatie ten grondslag liggen door unrevealing wereldwijde genexpressie profielen te ontcijferen, Pol II bindende status, transcriptie-factor bezetting op regulerende sequenties of post-translationele modificaties van histonen. Om genexpressie te beoordelen op mondiaal niveau microarrays en RNA-seq benaderingen worden gebruikt. Microarrays laat mRNA overvloed te detecteren, terwijl RNA-seq is beter afgestemd op het informeren over de verschillende soorten van RNA&#39;s, waaronder codering en niet-coderende RNA&#39;s als microRNAs, lncRNAs of snRNAs. Toch kunnen deze technieken geen onderscheid actief-getranscribeerd, steady-state mRNA, actief-vertalen mRNA en mRNA invoeren van het afbraakproces. Meten steady-stat mRNA niveaus is bekend een slechte schatting van proteoom samenstelling 1-3 is. In tegendeel, het identificeren van een actieve-vertalen mRNA geeft een nauwkeuriger beeld van de eiwitproductie. Echter, transcriptoom studies voornamelijk bij geheel organisme niveau uitgevoerd door het vergelijken van winst of verlies van functie van een bepaalde factor wildtype staat 4-7 of ontleed weefsel, waardoor genexpressieprofielen moeilijk te interpreteren. Recente ontwikkelingen in celgericht gereedschappen, affiniteitszuivering en verbeteringen gevoeligheid laat nu uitvoeren genoom-brede analyses op kleine celpopulaties of zelfs enkele cellen in een levend organisme. In Drosophila, grote verzamelingen transgene lijnen mogelijk specifieke tijdelijke en ruimtelijke targeting van verschillende weefsels en celtypes via de GAL4 / UAS systeem 10/8 waardoor nauwkeuriger kwantificering van de moleculaire mechanismen die nodig is voor celfunctie. 11. Deze methode gebaseerd op sucrosegradiënt centrifugeren maakt de selectie van polysoom fractie en de bepaling van mRNA vertaald genoombrede wanneer geanalyseerd met microarrays of deep sequencing. Polysoom isolatie kan worden gekoppeld met nuclease digestie ribosomale voetafdrukken overeenkomen met RNA fragmenten beschermd door de ribosomen in het vertaalproces 12 identificeren. Ribosomaal footprinting verhoogt de nauwkeurigheid van de kwantificering van RNA translatie en RNA-sequentie-niveau resolutie en ribosoom positionering maakt het mogelijk om te beoordelen van de vertaling te meten. Echter, tot op heden niet is toegepast celspecifieke isoleren van translatomes, voornamelijk als gevolg van de sterke daling van RNA verkregen opbrengst aan het einde van het ribosoom footprinting proces. Gezien het feit dat de grootte selectie van RNA potentiële vals-p kunnen genererenositives van verschillende RNP die ook kan worden beschermd RNA op soortgelijke wijze zijn verdere ontwikkelingen nodig ribosomale footprinting verbeteren en aanpassen aan celspecifieke benaderingen. Een van deze methoden, de zogenaamde vertalen Ribosoom Affinity Purification (TRAP) is in 2008 beschreven door Heiman et al. en toegepast op de translatome isoleren van een subset van neuronen bij muizen. Door epitoop-tagging een ribosomaal eiwit in een celtype-specifieke wijze, kan polysomen selectief worden gezuiverd zonder bewerkelijke stap van cel dissociatie en sorteren. In dit geval is de 60S ribosomaal eiwit L10A aan het oppervlak van het ribosoom werd gelabeld met eGFP 13. Sinds 2008 hebben verschillende studies gebruikte deze methode in verschillende soorten, van muizen 14-19 tot en met X. laevis 20,21, zebravis 22,23 en Arabidopsis thaliana 24. De TRAP werkwijze is ook aangepast aan het Drosophila model en gebruikt om purify celtype-specifieke mRNAs van neuronale cellen en astrocyten 26 25. De veelzijdige binaire GAL4 / UAS werd gebruikt om GFP-gelabelde RpL10A in een weefsel-specifieke wijze tot expressie. Hoofden van volwassen vliegen werden ontleed om polysoom selectie van neuronale cellen (doelwit van pan-neurale Elav-Gal4 driver) en geïsoleerde RNA&#39;s uit te voeren werden gesequenced. Het grote aantal up-gereguleerde genen overeen met die bekende uitgedrukt in het zenuwstelsel, wat aangeeft dat de aanpak goede specificiteit en gevraagd ons aan te passen aan zeldzame celpopulaties (minder dan 1% van de cellen) die in ontwikkeling Drosophila embryo . Binnen het Drosophila model, de embryonale fase is een model van keuze voor het onderzoek van ontwikkelingsprocessen, zoals de moleculaire spelers en morfogenetische mutaties evolutionair geconserveerd zijn. Het enige weefsel-specifieke transcriptomische aanpak tot nu toe uitgevoerd in dit model zijn uitgevoerd met behulp van cellen of nucleaire zorting en zijn alleen in staat om steady-state transcriptome 27-31 bestuderen geweest, het creëren van een behoefte aan methoden gewijd aan weefsel / cel-specifieke translatome profilering in de vlieg embryo. Hier rapporteren we de eerste TRAP-protocol gewijd aan Drosophila embryo&#39;s. Bij deze werkwijze werkzaam in mRNA-translatie in een zeer beperkte cel populatie van ongeveer 100 spiercellen per embryo werd succesvol geïsoleerd met hoge kwaliteit en specificiteit. De binaire GAL4 / UAS-systeem wordt gebruikt om de expressie van GFP-gelabeld RpL10A in subpopulatie van spieren rijden zonder enige toxiciteit, geen zichtbare fenotypen of ontwikkelingsvertraging zoals eerder aangegeven 25. Drosophila embryo bezitten 30 spieren per hemisegment die aanleiding geeft tot de musculatuur van de larve. Door een regulerend gebied ontdekt in de buurt van de slappe identiteit gen 6 van de 30 multi-kernhoudende spieren zijn gericht. In deze assay worden ribosomen geïmmobiliseerd op het mRNA met de translatie elongatieremmer cycloheximide. Cytosolische extracten worden gebruikt voor affiniteitszuivering met GFP antilichaam-beklede magnetische korrels. Kwaliteit van gezuiverde RNA werd gevalideerd met bioanalyzer. Kwantitatieve reverse transcriptie PCR (RT-qPCR) werd gebruikt om de specificiteit en sensitiviteit van mRNA isolatie te bepalen en toonde aan dat onze geoptimaliseerde protocol is zeer efficiënt.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>thermo scientific&nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverde BSA 100X&nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>Gist tRNA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNase In&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Antibody GFP clone N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td><td>75-132&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Lysis homogenisatie&nbsp;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease vrij water&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride (KCl)</td><td>Applied Biosystem&nbsp;</td><td>AM96406</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride (MgCl2)&nbsp;</td><td>Applied Biosystem&nbsp;</td><td>AM95306</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose watten ongebleekt&nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zeven 112, 355, 710 um&nbsp;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&nbsp;</td><td>28948964</td><td></td></tr><tr><td>Filtertips met lage binding&nbsp;</td><td>ClearLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rnase vrije buis 1,5 ml&nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Fischer Bioreagent&nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>Protease remmertabletten, Mini-Complete, EDTA-vrij&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

trap-rc, vertalen ribosoom affiniteitszuivering van rare cell populaties van<em&gt; drosophila</em&gt; embryo

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Het meten van niveaus van mRNA's in het proces van translatie in individuele cellen geeft informatie over de eiwitten die betrokken zijn bij cellulaire functies op een bepaald tijdstip. Het protocol, genaamd Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP), kan dit mRNA-translatieproces op een celtype-specifieke manier vastleggen. Gebaseerd op de affiniteitszuivering van polysomen die een getagde ribosomale subeenheid dragen, kan TRAP worden toegepast op translatoombeschouwingen in individuele cellen, waardoor het mogelijk wordt om celtypen te vergelijken tijdens ontwikkelingsprocessen of om de voortgang van ziekteontwikkeling en de impact van mogelijke therapieën op moleculair niveau te volgen. Hier rapporteren we een geoptimaliseerde versie van het TRAP-protocol, genaamd TRAP-rc (zeldzame cellen), gewijd aan het identificeren van RNA's die betrokken zijn bij translatie uit zeldzame celpopulaties. TRAP-rc werd gevalideerd met behulp van het Gal4/UAS-targetingsysteem in een beperkte populatie spiercellen in Drosophila-embryo's. Dit nieuwe protocol maakt het mogelijk om celtype-specifiek RNA te herstellen in voldoende hoeveelheden voor wereldwijde genexpressieanalyses zoals microarrays of RNA-seq. De robuustheid van het protocol en de grote collecties van Gal4-drivers maken TRAP-rc een zeer veelzijdige aanpak met mogelijke toepassingen in celspecifieke genomische studies.

De Drosophila embryonale somatische spieren systeem bestaat uit 30 spieren per hemisegment, en elke spier heeft een specifieke set van eigenschappen: code van de identiteit van genen, positie, aantal fusie gebeurtenissen, aanhechtingsplaatsen en innervatie. Het identificeren mRNA vertaald in een bepaald spier deelverzameling wordt informatie over de eiwitten die nodig zijn om de specifieke spier kenmerken te vormen. De TRAP-gebaseerde methode, RNA uit een subpopulatie van spieren expressie identiteit gen traag werd gezuiverd (Figuur 1A-B). Een groot probleem van deze aanpak is de kwaliteit en specificiteit van het geïsoleerde RNA. De geoptimaliseerde protocol gemeld hier ingeschakeld systematische terugvordering van hoge kwaliteit RNA beoordeeld met bioanalyzer analyse. Het profiel verkregen shows geen afbraak van RNA (figuur 1C). In andere studies ontwikkeld rond de TRAP methode werden vragen gesteld over de specificiteit van de gegevens. Here i wemprove de methode om achtergrond in verband met niet-specifieke binding van RNA aan de korrels of de buizen en de optimalisering van de wasbuffer onderdrukken. Om het achtergrondniveau en efficiëntie isoleren-slappe expressie brengen beoordelen leidden we RT-qPCR proeven met 3 replicaten van hetzelfde embryonale fase. Fold-verrijkingen van 4 verschillende genen (MEF2, traag, prospero, soxNeuro) werden berekend ten opzichte van input en genormaliseerd tegen de RpL32 gen (figuur 1D). Deze resultaten toonden aan 2,3-voudige verrijking van pan-musculaire gen MEF2 en 5,6-voudige verrijking van de slappe gen. Daarentegen werden de twee genen tot expressie gebracht in het zenuwstelsel uitgeput vergelijking invoeren. Zeer vergelijkbaar voudige verandering waarden werden waargenomen op 3 biologische herhalingen, waaruit blijkt dat het protocol is robuust. Met Slouch-Gal4 chauffeur en beginnen met 1,5 g, rond 1.5x10 ^ 6 embryo&#39;s werden verkregen dat bevat 100 GFP cellen / embryo&#39;s (in totaal 150 x 10 ^ 6 positievecellen). Na het uitvoeren van de TRAP-experiment, de opbrengst is ongeveer 25-45 ng van specifieke RNA afhankelijk van de fase-of-interest. Dit materiaal is genoeg om microarray-analyse of RNA-seq met een amplificatie protocol om een ​​RNA-seq bibliotheek te bouwen draaien. Efficiëntie zal sterk afhangen van de sterkte van de bestuurder gebruikt RpL10A-EGFP tot expressie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Figuur 1. Kwaliteit en specificiteit evaluatie van TRAP geïsoleerd RNA uit Slouch-GAL4&gt; UASRpL10A-EGFP embryo&#39;s. (AB) confocale beelden van een stage 16 embryo-tonen RpL10A EGFP-expressie specifiek in de zes Slouch spiercellen per hemisegment (A). Co-lokalisatie van RpL10A-EGFP met de algemene spier marker Beta3tubulin wordt waargenomen op merge foto (B). (C) Kwaliteitscontrole van Traped RNA ran op bioanalyzer toont perfecte integriteit van rRNA 18S en 28S. (D) RT-qPCR analyse tonen hoge specificiteit van TRAP geïsoleerd mRNA experimenten op 3 biologische herhalingen van fase-16 embryo&#39;s. Voudige verandering wordt berekend ten opzichte van input en genormaliseerd tegen de RpL32 gen. MEF2 transcripten aanwezig in alle spieren geslachten zijn 2,3-voudig verrijkt in vergelijking met ingang terwijl beperkter traag transcripten zijn 5,6-voudig verrijkt. Neurale cellen die Prospero en soxN genen zijn uitgeput 2,2-voudige en 5,5-voudige respectievelijk. Error bars vertegenwoordigt standaarddeviatie (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Het vertalen van Ribosoom Afiniteitszuivering (TRAP) kan de celtype-specifieke translatie van mRNA vastleggen. Hier rapporteren we het eerste TRAP-protocol dat zich richt op de isolatie van mRNA in zeldzame celpopulaties van Drosophila-embryo's.

TRAP-rc, vertalen Ribosoom Affiniteitszuivering van Rare Cell Populaties van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

Het algemene doel van deze procedure is om RNA dat betrokken is bij translatie in drosophila-embryo's te isoleren op een celtypespecifieke manier. Dit wordt bereikt door eerst embryo's te verzamelen van een transgene vliegenlijn, waarbij een GFP-gelabelde ribosomale subunit specifiek wordt tot expressie gebracht in het doelceltype, in dit geval de slouch-spiercellen. De tweede stap is het genereren van een lysaat om een polysoompreparaat te verkrijgen dat een mengsel van gelabelde en niet-gelabelde ribosomen bevat.Vervolgens wordt de eiwitconcentratie in het lysaat geschat en wordt er affiniteitszuivering uitgevoerd met beads gekoppeld aan GFP-antilichamen om ribosomaal RNA-complexen van het celtype van belang vast te leggen. De laatste stap is gewijd aan de extractie en zuivering van totaal RNA. Ten slotte worden respectievelijk kwaliteit- en specificiteitsbeoordelingen uitgevoerd met een bioanalyzer en RT-qPCR.RNA kan vervolgens worden gebruikt voor globale kwantitatieve analyse via RNA-sequencing of microarrays. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methode, zoals VX-sortering, is dat het geen laboratoriumstap van celdissociatie vereist. Het kan aan de bench worden uitgevoerd.Het is snel en maakt directe identificatie van vertaald RNA in een zeer kleine populatie cellen mogelijk, wat een aanzienlijk voordeel is voor het begrip van de acquisitie van celkenmerken. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de myogenese in Josephine-embryo's, kan ze ook worden toegepast op andere weefsels of modelorganismen, zoals planten, zebravis of muizen, en zou ze ook kunnen helpen bij het volgen van de impact van een behandeling op de eiwitsynthese in het geval van een pathologie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Benjamin Berta, een promovendus uit mijn laboratorium. Nadat beide transgene lijnen zijn ontwikkeld volgens de instructies in het geschreven gedeelte van het protocol en zijn gekruist om de trap double cross transgene lijn te creëren, wordt de lijn vermeerderd door eerst acht grote cilindervormige populatiekooien voor te bereiden die ongeveer 40 gram jonge vliegen per kooi bevatten, wat overeenkomt met ongeveer 180.000 vliegen per kooi.Bereid Petri-schalen met een diameter van 11 centimeter voor die een mengsel bevatten van gestolde agar en druivensap, waarbij een derde van het oppervlak is bedekt met vers gemaakte gistpasta, en laat de vliegen gedurende één uur eieren leggen op deze schalen. Herhaal dit proces op twee verdere sets verse druivensapschalen om de vliegen de kans te geven hun eitjes volledig te leggen. De gewenste dubbel transgene embryo's uit de kruising zullen op de vierde schaal worden gelegd.Verwijder de platen met de gewenste embryo's uit de kooien en laat ze bij kamertemperatuur incuberen tot de gewenste ontwikkelingsfase. Hier wordt een incubatietijd van 13 uur gehanteerd. Resuspendeer vervolgens de inhoud van de plaat met ongeveer 50 milliliters water met behulp van een penseel.Scheid de embryo's van de dode vliegen door de vloeistof door drie zeven met diameters van 700, 355 en 112 micron te gieten. Spoel de verzamelde embryo's in de zeef met de kleinste diameter met geïoniseerd water. Behandel de embryo's gedurende twee minuten met 4,5% bleekmiddel in geïoniseerd water en spoel ze vervolgens 30 tot 60 seconden grondig na met geïoniseerd water.Incubeer de embryo's in PBS 0,01%T tussen 20 en 100 microgram per milliliter. Cyclo heide gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur onder agitatie. Nadat de embryo's zijn gedroogd op cellulose-absorptievelen, worden ze overgebracht naar microcentrifugebuisjes, waarna de buisjes gewogen worden en de embryo's worden vriesgedroogd door onderdompeling in vloeibare stikstof.In deze fase kunnen de gedroogde embryo's gedurende meerdere maanden worden bewaard bij -80 °C. Draag 1,5 gram van de gedroogde embryo's over naar vooraf gekoelde 15 ml buisjes die vier milliliter polysoomextractiebuffer bevatten en homogeniseer deze met een steriele serologische pipet van 10 ml.Verdeel vervolgens de gehomogeniseerde embryo's over twee vooraf gekoelde buisjes van twee milliliter en maal de embryo's in een multidirectionele beads-grinder met hoge snelheid. Stel het apparaat zo in dat het twee keer 10 seconden draait bij 5.000 RPM, met een pauze van 15 seconden tussen elke cyclus. Na 10 minuten centrifugeren bij 2000 G wordt het lysaat overgebracht naar een schoon, vooraf gekoeld microcentrifugebuisje op ijs.Voeg 10% non P 40 toe aan het S-supernatans tot een eindconcentratie van 0,1% en meng voorzichtig door de buis te inverteren. Voeg 300 micromolair DHPC toe tot een eindconcentratie van 30 millimolair en meng voorzichtig door de buis te inverteren. Incubeer het mengsel gedurende vijf minuten op ijs, waarbij tijdens de incubatie meerdere keren door inversie wordt gemengd.Na de incubatie in ijs wordt de post-mitochondriale supernatant voorbereid door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 20.000 G bij vier graden Celsius. Na het bepalen van de eiwitconcentratie via de Bradford-methode en het verkrijgen van een eiwitconcentratie tussen 60 en 80 mg/mL, wordt de SNAT overgebracht naar een schone, vooraf gekoelde microcentrifugebuis, waarna direct wordt overgegaan tot de pre-absorptiestap. Resuspendeer de magnetische beads door voorzichtig te schudden en breng vervolgens 30 µL beads per milliliter lysaat over naar een microcentrifugebuis.Verzamel de kraaltjes op de magneet, pipetteer het supernatant weg en resuspendeer de kraaltjes in 500 µL polysome-extractiebuffer. Verzamel vervolgens de kraaltjes op de magneet. Voeg opnieuw embryonaal lysaat toe en incubeer gedurende één uur bij 4 °C op een rotator.Verwijder de kraaltjes en plaats het supernatant op ijs tot de immunopurificatiestap. Bewaar 100 µL van het supernatant als globale RNA-monster voor vergelijking met het monster dat na de immunopurificatie is verzameld. Om het monster te immunopurificeren, voegt u één milliliter vooraf geabsorbeerd lysaat toe aan een RNA-vrije buis met 90 µL geblokkeerde kraaltjes gekoppeld aan een GFP-antilichaam. Incubeer het monster gedurende twee uur of overnight bij 4 °C met zachte end-over-end menging in een buizenrotator na de incubatie.Was de beads door eerst de resterende beads in een minicentrifuge te centrifugeren. Verzamel ze vervolgens met een magneet, resuspendeer ze in 500 µL wasbuffer en incubeer ze terwijl ze worden gemengd. Meng gedurende 10 minuten in de koelruimte en verzamel de beads vervolgens opnieuw met de magneet.Breng de kraaltjes over naar een nieuwe, vooraf behandelde RNase-vrije buis en was deze nog tweemaal. Verzamel vervolgens de kraaltjes op de magneet en ga over tot RNA-extractie door één milliliter TRIOL aan de kraaltjes toe te voegen en de extractie uit te voeren volgens de instructies van de fabrikant. Volg dit op met RNA-zuivering met behulp van een RNEZ micro kit volgens de instructies van de fabrikant.Om de specificiteit van het gevangen RNA te testen, wordt er reverse transcriptie uitgevoerd op drie nanogram immuno-gezuiverd en input RNA volgens standaardprocedures. Gebruik vervolgens het verkregen cDNA voor qPCR met genspecifieke primer-sets. Deze confocale afbeelding van een embryo in stadium 16 toont de expressie van RPL 10 A-E-G-F-P, specifiek in de zes slouch-spiercellen in elk HEMI-segment; er is colokalisatie waargenomen van RPL 10 A-E-G-F-P met de algemene spiermarker bèta drie tubuline.Gevangen RNA is geanalyseerd met een bioanalyzer voor kwaliteitscontrole. Let op de perfecte integriteit van 18S en 28S ribosomaal RNA. Deze figuur toont de resultaten van een RT-qPCR-analyse van drie biologische replica's van embryo's in stadium 16 en demonstreert de hoge specificiteit van trap-geïsoleerd mRNA.De FO-verandering werd berekend ten opzichte van de input en genormaliseerd tegenover de RPL 32-genmethode. Twee transcripten die in alle spierlijnen aanwezig zijn, zijn 2,3 keer verrijkt vergeleken met de input, terwijl meer beperkte slouch-transcripten 5,6 keer verrijkt zijn; neurale cellen die prospero en socks en genen tot expressie brengen, zijn respectievelijk 2,2 keer en 5,5 keer uitgeput na de ontwikkeling. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers, met name in het veld van de ontwikkelingsbiologie, om celidentiteit en de acquisitie van celkenmerken tijdens de differentiatie van doof-embryo's te onderzoeken.

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een belangrijke belemmering voor de biochemische analyses van de ribosomen met ontluikende peptidyl-tRNA's is de aanwezigheid van andere ribosomen zijn in dezelfde monsters, ribosomen niet betrokken bij de vertaling van de specifieke mRNA-sequentie worden geanalyseerd. We ontwikkelden een eenvoudige methode om uitsluitend te zuiveren,, de ribosomen met de ontluikende peptidyl-tRNA van belang.

Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende peptidyl-tRNA&#39;s voor functionele en structurele analyses

Het doel van dit protocol is om een ​​eenvoudige en goedkope aanpak te geven voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g) en het bereiden van eiwit extracten die kunnen worden toegepast in stroomafwaartse proteomische toepassingen, zoals affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS ).

Middelgrote voorbereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo Extracten voor Proteomische Experimenten

We presenteren een aanpak om ribosome-gebonden mRNA van vasculaire endotheliale cellen (ECs) direct in muizenhersenen, Long-en hart weefsels te zuiveren via EC-specifieke genetische code van Enhanced Green fluorescentie proteïne (EGFP) in ribosomen in combinatie met RNA-zuivering .

Het vertalen van ribosome Affiniteits zuivering (TRAP) voor RNA-isolatie van endotheel cellen in vivo

Het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) biedt de mogelijkheid om ontwikkelingsprogramma's te ontleden met minimale verwerking van organen en weefsels. Het protocol levert hoogwaardig RNA op uit cellen die zijn gericht op een groene fluorescerende eiwit (GFP)-gelabelde ribosomalsubunit. Downstream analysetools, zoals qRT-PCR of RNA-seq, onthullen weefsel- en celtypespecifieke expressieprofielen.

Het vertalen van Ribosome Affinity Purification (TRAP) om Arabidopsis thaliana Root Development te onderzoeken op een cell type-specifieke schaal

Hier beschrijven we de immunopreciatie van riosomen en bijbehorend RNA uit geselecteerde populaties volwassen mannelijke muizenkiemcellen met behulp van het RiboTag-systeem. Strategische veredeling en zorgvuldige immunoneerslag resulteren in schone, reproduceerbare resultaten die informeren over het vertalen van de kiemcel en inzicht geven in de mechanismen van gemuteerde fenotypes.

RiboTag immunoprecipitatie in de kiemcellen van de mannelijke muis

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen, targeting-, vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode voor in vivo, directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

Dit protocol is bedoeld om celtypespecifiek te isoleren, ribosomale mRNA's te vertalen met behulp van het NuTRAP-muismodel.

Isoleer celtypespecifieke RNA's uit snap-frozen heterogene weefselmonsters zonder celsortering

Op basis van het assemblagemechanisme van het INAD-eiwitcomplex werd in dit protocol een aangepaste affiniteitszuivering plus concurrentiestrategie ontwikkeld om het endogene Drosophila TRP-kanaal te zuiveren.

Zuivering van endogene Drosophila Transient Receptor Potential Channels

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

Het protocol beschrijft de single nucleotide polymorphisms-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) -methode om ribosomale RNA-transcripten te onderscheiden die zijn afgeleid van de X- of Y-chromosoom ribosomale DNA-locus in Drosophila melanogaster.

Single Nucleotide Polymorfisme-gevoelige FISH-detectie van Locus-specifieke ribosomale RNA-transcriptie in Drosophila melanogaster

Hier geven we details over hoe lysaten bereid kunnen worden en in vitro-vertaling worden uitgevoerd met behulp van Drosophila-embryo's .

Celvrije in vitro mRNA-translatie in Drosophila-lysaten

Leer TRAP-rc voor het isoleren van mRNA uit zeldzame celpopulaties in Drosophila-embryo's. Deze methode maakt celtype-specifieke translatie-analyse mogelijk zonder celdissociatie.

TRAP-rc, vertalen Ribosoom Affiniteitszuivering van Rare Cell Populaties van

Meer video's verkennen