TRAP-rc, vertalen Ribosoom Affiniteitszuivering van Rare Cell Populaties van

Het algemene doel van deze procedure is om RNA dat betrokken is bij translatie in drosophila-embryo's te isoleren op een celtypespecifieke manier. Dit wordt bereikt door eerst embryo's te verzamelen van een transgene vliegenlijn, waarbij een GFP-gelabelde ribosomale subunit specifiek wordt tot expressie gebracht in het doelceltype, in dit geval de slouch-spiercellen. De tweede stap is het genereren van een lysaat om een polysoompreparaat te verkrijgen dat een mengsel van gelabelde en niet-gelabelde ribosomen bevat.

Vervolgens wordt de eiwitconcentratie in het lysaat geschat en wordt er affiniteitszuivering uitgevoerd met beads gekoppeld aan GFP-antilichamen om ribosomaal RNA-complexen van het celtype van belang vast te leggen. De laatste stap is gewijd aan de extractie en zuivering van totaal RNA. Ten slotte worden respectievelijk kwaliteit- en specificiteitsbeoordelingen uitgevoerd met een bioanalyzer en RT-qPCR.

RNA kan vervolgens worden gebruikt voor globale kwantitatieve analyse via RNA-sequencing of microarrays. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methode, zoals VX-sortering, is dat het geen laboratoriumstap van celdissociatie vereist. Het kan aan de bench worden uitgevoerd.

Het is snel en maakt directe identificatie van vertaald RNA in een zeer kleine populatie cellen mogelijk, wat een aanzienlijk voordeel is voor het begrip van de acquisitie van celkenmerken. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de myogenese in Josephine-embryo's, kan ze ook worden toegepast op andere weefsels of modelorganismen, zoals planten, zebravis of muizen, en zou ze ook kunnen helpen bij het volgen van de impact van een behandeling op de eiwitsynthese in het geval van een pathologie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Benjamin Berta, een promovendus uit mijn laboratorium. Nadat beide transgene lijnen zijn ontwikkeld volgens de instructies in het geschreven gedeelte van het protocol en zijn gekruist om de trap double cross transgene lijn te creëren, wordt de lijn vermeerderd door eerst acht grote cilindervormige populatiekooien voor te bereiden die ongeveer 40 gram jonge vliegen per kooi bevatten, wat overeenkomt met ongeveer 180.000 vliegen per kooi.

Bereid Petri-schalen met een diameter van 11 centimeter voor die een mengsel bevatten van gestolde agar en druivensap, waarbij een derde van het oppervlak is bedekt met vers gemaakte gistpasta, en laat de vliegen gedurende één uur eieren leggen op deze schalen. Herhaal dit proces op twee verdere sets verse druivensapschalen om de vliegen de kans te geven hun eitjes volledig te leggen. De gewenste dubbel transgene embryo's uit de kruising zullen op de vierde schaal worden gelegd.

Verwijder de platen met de gewenste embryo's uit de kooien en laat ze bij kamertemperatuur incuberen tot de gewenste ontwikkelingsfase. Hier wordt een incubatietijd van 13 uur gehanteerd. Resuspendeer vervolgens de inhoud van de plaat met ongeveer 50 milliliters water met behulp van een penseel.

Scheid de embryo's van de dode vliegen door de vloeistof door drie zeven met diameters van 700, 355 en 112 micron te gieten. Spoel de verzamelde embryo's in de zeef met de kleinste diameter met geïoniseerd water. Behandel de embryo's gedurende twee minuten met 4,5% bleekmiddel in geïoniseerd water en spoel ze vervolgens 30 tot 60 seconden grondig na met geïoniseerd water.

Incubeer de embryo's in PBS 0,01%T tussen 20 en 100 microgram per milliliter. Cyclo heide gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur onder agitatie. Nadat de embryo's zijn gedroogd op cellulose-absorptievelen, worden ze overgebracht naar microcentrifugebuisjes, waarna de buisjes gewogen worden en de embryo's worden vriesgedroogd door onderdompeling in vloeibare stikstof.

In deze fase kunnen de gedroogde embryo's gedurende meerdere maanden worden bewaard bij -80 °C. Draag 1,5 gram van de gedroogde embryo's over naar vooraf gekoelde 15 ml buisjes die vier milliliter polysoomextractiebuffer bevatten en homogeniseer deze met een steriele serologische pipet van 10 ml.

Verdeel vervolgens de gehomogeniseerde embryo's over twee vooraf gekoelde buisjes van twee milliliter en maal de embryo's in een multidirectionele beads-grinder met hoge snelheid. Stel het apparaat zo in dat het twee keer 10 seconden draait bij 5.000 RPM, met een pauze van 15 seconden tussen elke cyclus. Na 10 minuten centrifugeren bij 2000 G wordt het lysaat overgebracht naar een schoon, vooraf gekoeld microcentrifugebuisje op ijs.

Voeg 10% non P 40 toe aan het S-supernatans tot een eindconcentratie van 0,1% en meng voorzichtig door de buis te inverteren. Voeg 300 micromolair DHPC toe tot een eindconcentratie van 30 millimolair en meng voorzichtig door de buis te inverteren. Incubeer het mengsel gedurende vijf minuten op ijs, waarbij tijdens de incubatie meerdere keren door inversie wordt gemengd.

Na de incubatie in ijs wordt de post-mitochondriale supernatant voorbereid door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 20.000 G bij vier graden Celsius. Na het bepalen van de eiwitconcentratie via de Bradford-methode en het verkrijgen van een eiwitconcentratie tussen 60 en 80 mg/mL, wordt de SNAT overgebracht naar een schone, vooraf gekoelde microcentrifugebuis, waarna direct wordt overgegaan tot de pre-absorptiestap. Resuspendeer de magnetische beads door voorzichtig te schudden en breng vervolgens 30 µL beads per milliliter lysaat over naar een microcentrifugebuis.

Verzamel de kraaltjes op de magneet, pipetteer het supernatant weg en resuspendeer de kraaltjes in 500 µL polysome-extractiebuffer. Verzamel vervolgens de kraaltjes op de magneet. Voeg opnieuw embryonaal lysaat toe en incubeer gedurende één uur bij 4 °C op een rotator.

Verwijder de kraaltjes en plaats het supernatant op ijs tot de immunopurificatiestap. Bewaar 100 µL van het supernatant als globale RNA-monster voor vergelijking met het monster dat na de immunopurificatie is verzameld. Om het monster te immunopurificeren, voegt u één milliliter vooraf geabsorbeerd lysaat toe aan een RNA-vrije buis met 90 µL geblokkeerde kraaltjes gekoppeld aan een GFP-antilichaam. Incubeer het monster gedurende twee uur of overnight bij 4 °C met zachte end-over-end menging in een buizenrotator na de incubatie.

Was de beads door eerst de resterende beads in een minicentrifuge te centrifugeren. Verzamel ze vervolgens met een magneet, resuspendeer ze in 500 µL wasbuffer en incubeer ze terwijl ze worden gemengd. Meng gedurende 10 minuten in de koelruimte en verzamel de beads vervolgens opnieuw met de magneet.

Breng de kraaltjes over naar een nieuwe, vooraf behandelde RNase-vrije buis en was deze nog tweemaal. Verzamel vervolgens de kraaltjes op de magneet en ga over tot RNA-extractie door één milliliter TRIOL aan de kraaltjes toe te voegen en de extractie uit te voeren volgens de instructies van de fabrikant. Volg dit op met RNA-zuivering met behulp van een RNEZ micro kit volgens de instructies van de fabrikant.

Om de specificiteit van het gevangen RNA te testen, wordt er reverse transcriptie uitgevoerd op drie nanogram immuno-gezuiverd en input RNA volgens standaardprocedures. Gebruik vervolgens het verkregen cDNA voor qPCR met genspecifieke primer-sets. Deze confocale afbeelding van een embryo in stadium 16 toont de expressie van RPL 10 A-E-G-F-P, specifiek in de zes slouch-spiercellen in elk HEMI-segment; er is colokalisatie waargenomen van RPL 10 A-E-G-F-P met de algemene spiermarker bèta drie tubuline.

Gevangen RNA is geanalyseerd met een bioanalyzer voor kwaliteitscontrole. Let op de perfecte integriteit van 18S en 28S ribosomaal RNA. Deze figuur toont de resultaten van een RT-qPCR-analyse van drie biologische replica's van embryo's in stadium 16 en demonstreert de hoge specificiteit van trap-geïsoleerd mRNA.

De FO-verandering werd berekend ten opzichte van de input en genormaliseerd tegenover de RPL 32-genmethode. Twee transcripten die in alle spierlijnen aanwezig zijn, zijn 2,3 keer verrijkt vergeleken met de input, terwijl meer beperkte slouch-transcripten 5,6 keer verrijkt zijn; neurale cellen die prospero en socks en genen tot expressie brengen, zijn respectievelijk 2,2 keer en 5,5 keer uitgeput na de ontwikkeling. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers, met name in het veld van de ontwikkelingsbiologie, om celidentiteit en de acquisitie van celkenmerken tijdens de differentiatie van doof-embryo's te onderzoeken.