Aanpassing van de elektrospinproces te bieden drie unieke omgevingen voor een Tri-layered

Het algemene doel van deze procedure is het elektrospinnen van een driedimensionale fasische steiger, waardoor de co-cultuur van volledig gedifferentieerde volwassen menselijke cellen mogelijk wordt om de natuurlijke extracellulaire matrix te repliceren die deze cellen in C two tegenkomen. Dit wordt bereikt door eerst een willekeurig uitgelijnde microfiber-steiger te elektrospinnen. De tweede stap is het vormen van een bifasische steiger door een willekeurig uitgelijnde nanofiberlaag direct op de microfiber-steiger te elektrospinnen.

Vervolgens wordt een apart uitgelijnd nanofiber-steunstructuur via electrospinning vervaardigd. De laatste stap is om elke steunstructuur te zaaien met het respectievelijke celtype en de steunstructuren als één enkel construct samen te kweken in een perfusie-bioreactorsysteem. Uiteindelijk kunnen multicellular interacties worden geanalyseerd door het meten van mediatorafgifte en immunokleuring.

Het construct. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals 2D getransformeerde membranen, is dat elektrische steigers een 3D vezelige omgeving bieden die kan worden aangepast om een fysiologisch relevante morfologie te verkrijgen. Het is een poreuzere structuur die de cocultuur van meerdere celtypen mogelijk maakt.

Deze methode biedt een stabiel platform door gebruik te maken van gecohorteerde, zieke of gezonde menselijke cellen als in vitro model. Dit zal helpen de afhankelijkheid van diermodellen te verminderen, aangezien deze beperkt zijn in hun relevantie voor menselijke ziekten, en het aantal dieren dat in experimenten wordt gebruikt verlagen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in ziekten zoals astma en COPD, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals voor de studie van inflammatoire darmziekten of voor de ontwikkeling van een huidmodel voor chemische tests.

Bereid eerst drie verschillende oplossingen van 10 milliliter PET door 8%, 10% en 30% PET op te lossen in één-op-één mengsels van chloormethaan en trichloorazijnzuur. Roer de oplossingen een nacht lang bij kamertemperatuur zodat het PET de volgende dag volledig is opgelost. Overbreng de PET-oplossingen naar spuiten en bevestig een naald van gauge 23 aan de spuit met het 8%-mengsel en naalden van gauge 18 aan de andere twee spuiten met de 10% en 30% PET-oplossingen.

Bereid het microvezelsteigerstel voor. Laad eerst de spuit met de 30%PET-oplossing in de spuitpomp met de naaldpunt naar beneden. Positioneer de manul op 15 centimeter van de naaldtip en zorg ervoor dat de naald op het midden van de trommel is gericht.

Bevestig de positieve voedingslijn aan de naaldpunt met een metalen krokodillenklem en aard de manl door de aardingslijn met de bananenstecker te verbinden. Zet de motor aan en stel de snelheid van de manl in op 60 RPMs. Schakel de spuitenpomp in om een stroomsnelheid van 2,0 milliliters per uur te verkrijgen.

Tijdens het maken van de microvezelsteunstructuren laat u de pomp draaien totdat de oplossing uit de naaldpunt wordt geperst, om het systeem te primen door alle lucht in de naald te verwijderen. Stop vervolgens de pomp op de spuitenpomp.

Stel het totale volume van de te verdrijven oplossing in op twee milliliter en start de pomp. Breng vervolgens een potentiaal van 14 kilovolt aan tussen de naald en de mandrel electro spin gedurende één uur, totdat twee milliliter van de 30%PET-oplossing is ge-electrosponnen. Schakel het spanningspotentiaal uit terwijl het microvezelsteiger nog op de mandrel bevindt. Verwijder de krokodillenklem en vervang de spuit met de 30%PET-oplossing door de spuit met de 8%PET-oplossing.

Sluit vervolgens de krokodillenklem opnieuw aan op de naald van 23 gauge. Wijzig de stroomsnelheid van de spuitpomp naar 0,5 milliliters per uur en ontlucht de naald door de spuitpomp te laten lopen totdat de oplossing uit de punt stroomt. Terwijl de mandrel blijft draaien met 60 RPMs, wordt een potentiaal van 14 kilovolt aangelegd tussen de naaldpunt en de mandrel, en wordt het totale volume dat door de spuitpomp moet worden geëxtrudeerd ingesteld op twee milliliters.

Voer het elektrospinnen vier uur lang uit totdat twee milliliter van de 8%PET-oplossing is gesponnen. Schakel na voltooiing van het elektrospinnen de voeding en de motor van het draaiende mandrel uit. Snijd het bifasische scaffold met een mes langs de breedte van het mandrel om een 2D-sheet van het scaffold te verkrijgen met de afmetingen van het oppervlak van het mandrel.

Om uitgelijnde PET-scaffolds te bereiden, plaatst u de spuit met de 10%PET-oplossing in de spuitpomp met de naaldpunt naar beneden. Sluit vervolgens de krokodillenklem aan op de naald. Stel de stroomsnelheid in op 0,5 milliliters per uur en spoel de naald voor met PET-oplossing.

Zet vervolgens de motor aan en stel de draaisnelheid van het mandrel in op 2000 RPMs. Schakel daarna de spuitpomp in. Stel de spanningsvoeding in op 14 kilovolt en schakel de voeding in om vier uur lang te electrospinnen totdat twee milliliter van de oplossing is ge-electrospun.

Wanneer het elektrospinnen is voltooid, schakelt u de voeding en de motor uit. Snijd het steigerwerk met een mesje langs de breedte van het mandrel om een uitgelijnde 2D-vel steigerwerk te verkrijgen. Bewaar de elektrogesponnen steigers in aluminiumfolie om de elektrostatische lading te verminderen.

Gebruik een biopsiepen met een diameter van 0,8 millimeter om schijfjes bifasische of uitgelijnde scaffolds uit de SPU-vellen te ponsen. Plak vervolgens het bifasische scaffoldschijfje met niet-toxische aquariumlijm op een pakking. Plaats de pakkingen en scaffolds in een 12-well weefselkweekplaat.

Steriliseer de pakkingen en scaffolds met ultraviolet I-straling gedurende 30 minuten aan elke zijde van de scaffolds. Week ze vervolgens de volgende dag gedurende de nacht in een 20% antibioticum-antimycoticumoplossing bij vier graden Celsius. Was de scaffolds 3 keer met PP S en bewaar de scaffolds in PBS bij vier graden Celsius tot het moment van gebruik.

Breng de bifasische scaffolds over van de PBS naar een nieuwe 12-wells plaat en warm deze gedurende één uur bij 37 degrees Celsius op in DMEM-medium aangevuld met 10%FCS. Verwijder het aangevulde DMEM-medium en plaats de microvezelfase van de scaffolds; zaai 15 000 MRC five fibroblastcellen in 30 microliters aangevuld DMEM-medium op elke scaffold om de fibroblasten te helpen in de scaffold te penetreren. Plaats de plaat op een orbitale schudder en agiteer de scaffolds gedurende twee uur bij 100 RPMs.

Voeg vervolgens twee milliliters DMEM-gesupplementeerd medium toe aan elk scaffold en incubeer de scaffolds gedurende de nacht bij 37 °C met 5% CO₂. Verwijder de volgende dag het medium uit de wells en draai de scaffolds om, zodat de nanofase van de scaffolds apicaal is gericht. Zaai vervolgens 30.000 Calu-3 epitheelcellen in 30 microliters DMEM/F12-medium gesupplementeerd met 10% FCS op de nanofase van het scaffold.

Incubeer het steigerwerk gedurende twee uur bij 37 °C en 5% koolstofdioxide voordat de steigerwerken worden ondergedompeld in een 70:30 mengsel van DMEM/F-12 en DMEM-gesupplementeerd medium en de statische incubatie voor nog eens 12 uur wordt voortgezet om de gladde spiercellen van de luchtwegen te kweken. Transfer eerst de uitgelijnde steigerwerken van de PBS naar een nieuwe 12-well plaat en verwarm deze samen met het DMEM-gesupplementeerd medium gedurende één uur bij 37 °C. Verwijder het DMEM-gesupplementeerd medium en voeg 25.000 gladde spiercellen van de luchtwegen in 30 µL DMEM-gesupplementeerd medium toe aan elk steigerwerk en incubeer deze gedurende twee uur bij 37 °C en 5% koolstofdioxide.

Zodra ze zijn gehecht, worden de scaffolds ondergedompeld in DMEM-gesupplementeerd medium. Plaats ze terug in de incubator en laat ze een nacht staan voordat de tri-cultuur in de bioreactor wordt opgezet. Plaats de volgende dag de bifasische gezaaide scaffold in de kamer van de bioreactor, met de epitheliale fase naar boven gericht in de kamer.

Plaats vervolgens het uitgelijnde scaffold onder het bifasische scaffold, zodat het zich naast de microvezelfase van het bifasische scaffold bevindt. Vergrendel de twee kamers van de bioreactor met elkaar. Stel vervolgens twee perfusie-stroomcircuits op in een incubator, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, en pomp na één week medium door de twee circuits met een snelheid van ongeveer 0.1 milliliters per minuut met behulp van een peristaltische pomp.

Verwijder het medium uit de apicale kamer en de kweek. De epitheelcellen worden aan het lucht-vloeistofgrensvlak gekweekt voor nog een week voordat de analyse plaatsvindt. Na twee weken in de bioreactor werd het hier getoonde tri-culture steigerwerk gefixeerd en in coupes gesneden om de celkernen te tonen die over alle drie de lagen van het construct verdeeld waren; de celkernen werden gekleurd met DPI en verschijnen blauw, terwijl het materiaal van het steigerwerk grijs verschijnt. Hier zijn scanning elektronenmicroscoopbeelden van de elektrogesponnen nanofiber-, microfiber- en uitgelijnde steigerwerken die respectievelijk werden geprepareerd voor het zaaien van epitheelcellen, fibroblasten en gladde spiercellen.

Alle drie de celtypen vertoonden een toename in levensvatbaarheid wanneer ze gedurende een periode van twee weken op hun individuele scaffolds werden gekweekt. Ze bleven elk ook celtype-specifieke eiwitten tot expressie brengen na de kweekperiode van twee weken. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om onderzoek te doen naar de natuurlijke extracellulaire matrix die u probeert na te bootsen met de elektrogesponnen vezels.

Cellen vertonen verschillend gedrag wanneer ze zich hechten aan verschillende 3D-topografieën. Zo vormen epitheelcellen alleen een functionele barrière wanneer ze worden gekweekt op nanovezels. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u een meerlaags co-cultuursysteem kunt opbouwen, dat kan worden gebruikt voor de studie van intercellulaire interacties binnen een dynamische kweekomgeving.

Vergeet niet dat het belangrijk is om uw elektrospinningsparameters, zoals de stroomsnelheid en het voltage, af te stemmen op het polymeer- en oplosmiddelsysteem dat u van plan bent te gebruiken bij het uitvoeren van deze procedure. Dit is cruciaal voor het genereren van de gewenste vezels. Denk er daarnaast aan om het elektrospinnen uit te voeren in een geventileerde zuurkast of kast, zodat oplosmiddelen correct kunnen worden afgevoerd.