Aanpassing van de elektrospinproces te bieden drie unieke omgevingen voor een Tri-layered In Vitro Model van de Airway Muur
31 juli 2015
Vooruitgang in biomateriaaltechnologieën maakt de ontwikkeling van driedimensionale constructen met meerdere celtypen mogelijk. We hebben electrospinning protocollen ontwikkeld om drie individuele scaffolds te produceren om de belangrijkste structurele cellen van de luchtweg te kweken en zo een 3D in vitro model van de wand van de bronchiolen in de luchtweg te bieden.
Het algemene doel van deze procedure is om een driedimensionaal fase-scaffold elektrospinnen, waardoor het mogelijk is om volwaardig gedifferentieerde volwassen menselijke cellen co-cultuur te laten in een omgeving die de natuurlijke extracellulaire matrix nabootst die deze cellen in C twee tegenkomen. Dit wordt bereikt door eerst een willekeurig uitgelijnde microvezel-scaffold elektro te spinnen. De tweede stap is om een bifasisch scaffold te vormen door een willekeurig uitgelijnde nanovezel-laag rechtstreeks op de microvezel-scaffold te elektrospinnen.
Vervolgens wordt een afzonderlijke uitgelijnde nanovezel-scaffold elektrogesponnen. De laatste stap is om elk scaffold te zaaien met hun respectieve celtype en om de scaffolds co-cultuur te laten in een profused bioreactor systeem als een enkele constructie. Uiteindelijk kunnen multicellulaire interacties worden geanalyseerd door het meten van mediator-afgifte en immunokleuring.
De constructie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals 2D getransformeerde membranen, is dat elektrische scaffolds een 3D vezelige omgeving bieden die kan worden aangepast om een fysiologisch relevante morfologie te bieden. Het is een meer poreuze structuur en maakt de kerncultuur van meerdere celtypen mogelijk.
Deze methode biedt een stabiel platform dat gebruikmaakt van gecohorteerde, zieke of gezonde menselijke cellen als in vitro-model. Dit zal helpen om onze afhankelijkheid van diermodellen te verminderen, die een beperking hebben in hun relevantie voor menselijke ziekten, en het aantal dieren dat voor experimenten wordt gebruikt, te verminderen. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in ziekten zoals astma en COPD, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals voor de studie van inflammatoire darmziekten, of voor de ontwikkeling van een huidmodel voor chemische testen.
Om te beginnen, bereid drie verschillende 10 milliliter oplossingen van PET voor door 8%, 10% en 30% PET op te lossen in een-op-een mengsels van chloormethaan en trifluorazijnzuur. Roer de oplossingen een nacht lang op kamertemperatuur om de PET de volgende dag op te lossen. Breng de PET-oplossingen over in spuiten en bevestig een 23 gauge naald aan de spuit met het 8% mengsel en 18 gauge naalden aan de andere twee spuiten met de 10% en 30% PET oplossingen.
Bereid de microvezel-scaffold voor. Laad eerst de spuit met de 30% PET oplossing in de spuitpomp met de naaldpunt aan de onderkant. Plaats de mandrel 15 centimeter van de naaldpunt en zorg ervoor dat de naald op het midden van de trommel is gericht.
Bevestig de positieve elektrische toevoerleiding aan de naaldpunt met behulp van een metalen krokodilclip en aard de mandrel door de aardlijn aan te sluiten op de bananenstop. Schakel de motor in en stel de mandrelsnelheid in op 60 RPM. Schakel de spuitpomp in om een stroomsnelheid van 2,0 milliliter per uur te bereiken.
Tijdens het maken van de microvezel-scaffolds. Laat de pomp draaien totdat de oplossing uit de naaldpunt wordt uitgestoten om het systeem te primen door lucht uit de naald te verwijderen. Stop vervolgens de pomp op de spuitpomp.
Stel het totale volume oplossing dat moet worden uitgestoten in op twee milliliter en start de pomp. Breng vervolgens een potentiaal van 14 kilovolt aan tussen de naald en de mandrel en elektrospin gedurende één uur totdat twee milliliter van de 30% PET oplossing is geëlektrosponnen met de microvezel-scaffold nog steeds op de mandrel. Schakel de spanning uit. Verwijder de krokodilclip en vervang de spuit met de 30% PET oplossing door de spuit met de 8% PET oplossing.
Verbind vervolgens de krokodilclip opnieuw met de 23 gauge naald. Verander de stroomsnelheid van de spuitpomp naar 0,5 milliliter per uur en prime de naald door de spuitpomp te laten lopen totdat de oplossing uit de punt stroomt. Terwijl de mandrel blijft draaien met 60 RPM, breng de potentiaal van 14 kilovolt aan tussen de naaldpunt en de mandrel en stel het totale volume dat door de spuitpomp moet worden uitgestoten in op twee milliliter.
Elektrospin gedurende vier uur totdat twee milliliter van de 8% PET oplossing is geëlektrosponnen. Wanneer het elektrospinnen voltooid is, schakel de stroomvoorziening en de motor die de mandrel draait uit. Snijd de bifasische scaffold met een mes langs de breedte van de mandrel om een 2D-vel van scaffold met de grootte van het mandreloppervlak te produceren.
Om gealigneerde PET-scaffolds voor te bereiden, laad de spuit met 10% PET oplossing in de spuitpomp met de naaldpunt aan de onderkant. Verbind vervolgens de krokodilclip met de naald. Stel de stroomsnelheid in op 0,5 milliliter per uur en prime de naald met PET oplossing.
Schakel vervolgens de motor in en stel de mandrelsnelheid in op 2000 RPM. Schakel vervolgens de spuitpomp in. Stel de spanningsvoorziening in op 14 kilovolt en schakel de stroomvoorziening in om gedurende vier uur te elektrospinnen totdat twee milliliter oplossing is geëlektrosponnen.
Wanneer het elektrospinnen is voltooid, schakel de stroomvoorziening en de motor uit. Snijd de scaffold met een mes langs de breedte van de mandrel om een gealigneerd 2D-vel van scaffold te produceren. Bewaar de geëlektrosponnen scaffolds in aluminiumfolie om elektrostatische lading te verminderen.
Gebruik een biopsiepen met een diameter van 0,8 millimeter om schijven van bifasische of gealigneerde scaffolds uit de SPU-vellen te ponsen. Lijm vervolgens de schijf van de bifasische scaffold aan een afdichting met niet-toxische aquariumlijm. Plaats de afdichtingen en scaffolds in een 12-putjes weefselkweekplaat.
Steriliseer de afdichtingen en scaffolds met ultraviolette I-straling gedurende 30 minuten aan elke kant van de scaffolds. Week vervolgens overnacht in een 20% antibiotische antimycotische oplossing bij vier graden Celsius. Was de scaffolds met PP S3 keer en bewaar de scaffolds in PBS bij vier graden Celsius totdat ze worden gebruikt.
Breng de bifasische scaffolds over van de PBS
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het creëren van driedimensionale constructies met meerdere celtypen met behulp van elektrospintechnieken. De ontwikkelde scafolds hebben tot doel de luchtwegbronchiolewand na te bootsen, waardoor de co-cultuur van gedifferentieerde menselijke cellen wordt vergemakkelijkt.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biomaterialen
- Weefselengineering
- Celcultuur
Achtergrond
- Vooruitgang in biomateriaaltechnologieën heeft de ontwikkeling van complexe weefselmodellen mogelijk gemaakt.
- Bestaande methoden zijn vaak gebaseerd op 2D-culturen, die de in vivo-omgeving niet nauwkeurig weerspiegelen.
- 3D-scaffolds kunnen cellulaire interacties verbeteren en de extracellulaire matrix nabootsen.
- Deze studie richt zich op luchtwegstructurele cellen en hun interacties in een gecontroleerde omgeving.
Doel van het onderzoek
- Om een 3D in vitro-model van de luchtwegbronchiolewand te ontwikkelen.
- Om de co-cultuur van meerdere celtypen te vergemakkelijken voor betere ziektemodellering.
- Om de afhankelijkheid van diermodellen in onderzoek te verminderen.
Gebruikte methoden
- Elektrospinning van microvezel- en nanovezelscaffolds.
- Co-cultuur van gedifferentieerde volwassen menselijke cellen.
- Gebruik van een geperfundeerd bioreactorsysteem voor verbeterde nutriëntbezorging.
- Meting van cellulaire interacties door middel van mediatorvrijlating en immunokleuring.
Belangrijkste resultaten
- De elektrogesponnen scaffolds ondersteunden met succes de groei van meerdere celtypen.
- 3D-constructen vertoonden verbeterde cellulaire interacties in vergelijking met traditionele 2D-culturen.
- Mogelijke toepassingen omvatten het bestuderen van ziekten zoals astma en COPD.
- De methode biedt een stabiel platform voor in vitro-experimenten.
Conclusies
- Deze elektrospintechniek biedt een veelbelovende aanpak voor het creëren van fysiologisch relevante weefselmodellen.
- Het kan de onderzoek naar respiratoire ziekten en daarbuiten aanzienlijk bevorderen.
- Toekomstige studies kunnen extra toepassingen in andere orgaansystemen verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Tri-layered electrospun scaffolds enable physiologically relevant in vitro airway models, supporting predictive confidence in respiratory disease research. This platform advances early-stage target validation and mechanistic de-risking by replicating native extracellular matrix environments for multiple human cell types. The approach reduces reliance on animal models and enhances translational continuity for pharmaceutical R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of intercellular cross-talk in a tissue-relevant 3D context.
- Supports functional target validation by maintaining differentiated cell phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking through controlled microenvironmental parameters.
- Improves predictive confidence for airway disease targets and pathways.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible 3D scaffolds for multi-cell-type co-culture assays.
- Delivers quantitative outputs via mediator release and immunostaining readouts.
- Enables reliable evaluation of compound effects in disease-relevant systems.
- Supports scalability and platform reuse for diverse screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with human airway tissue architecture for translational biomarker studies.
- Reduces translational risk by modeling disease mechanisms in physiologically relevant constructs.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions for respiratory and inflammatory disease programs.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation in human-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This tri-layered scaffold system integrates from early discovery through preclinical research, supporting target validation, screening, and translational studies in respiratory disease pipelines.
- Discovery Biology: Replicates airway wall microenvironments for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible 3D scaffolds for quantitative multi-cell-type analysis.
- Analytics: Enables measurement of mediator release and protein expression for comparative studies.
- Translational Research: Provides disease-relevant models for biomarker alignment and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for diverse tissue modeling applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in airway disease research.
- Operational Value: Standardizes 3D scaffold production and co-culture workflows for reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by reducing animal model dependence.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of respiratory and inflammatory disease assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrospinning, cell culture, and bioreactor operation.
- Needs access to instrumentation for scaffold fabrication and perfused bioreactor systems.
- Demands cross-team standardization of scaffold parameters and cell seeding protocols.
- Adaptation to other tissue models requires tailoring scaffold properties to native ECM characteristics.
- Solvent handling and parameter optimization are critical for reproducible scaffold generation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Electrospinning Biphasic and Aligned Polyethylene Terephthalate Scaffolds
5:34
Sterilization of Scaffolds
6:24
Seeding of Fibroblasts and Epithelial Cells onto Biphasic Scaffolds and Airway Smooth Muscle onto Aligned Scaffolds
8:36
Tri-culture Using a Bioreactor System
9:29
Results: Tri-Culture Cells Continue to Produce Cell Type Specific Proteins
10:20
Conclusion
