Kupffer Cell Isolatie Nanoparticle toxiciteit testen

Het algemene doel van het volgende experiment is om muis-Kupffer-cellen in grote aantallen te isoleren en te zuiveren om de toxiciteit van nanodeeltjes te bestuderen. Dit wordt bereikt door muizenlevers te perfunderen met een H-B-S-S-E-G-T-A-oplossing en een collageenoplossing om het leverweefsel voorzichtig te verteren. Vervolgens worden de levercellen gezuiverd via dichtheidscentrifugatie en selectieve adhesie om een cultuur van gezuiverde Kupffer-cellen te verkrijgen.

Vervolgens wordt een flowcytometrie-analyse uitgevoerd om de zuiverheid en de zure F-eigenschappen van de cupfor-cellen te bevestigen. De resultaten tonen aan dat de toxiciteit van gefunctionaliseerde koolstofnanobuisjes kan worden gemeten in cupfor-cellen. Op basis van de gemodificeerde L-D-H-S-A wordt bevestigd dat dit model kan worden toegepast voor toxiciteitstesten van nanodeeltjes.

De methode die we u vandaag willen tonen, kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de nanotoxicologie, zoals het beoordelen van de toxiciteit van onlangs ontwikkelde drugcarriers. Dit is van groot belang, aangezien de meeste gebruikte geïmmortaliseerde cellijnen eigenschappen vertonen die significant verschillen van de weefsels waaruit ze zijn afgeleid. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal. Wanneer de methode succesvol wordt uitgevoerd, resulteert dit in een hoge opbrengst en zuiverheid van ke-cellen, die vervolgens kunnen worden gebruikt als model om een reeks nanodeeltjes op toxiciteit te screenen.

Nadat alle reagentia die vermeld staan in de tabel met materialen en reagentia bij het bijbehorende tekstprotocol vers zijn bereid, worden de E-G-T-A-H-B-S-S-oplossing en de collagenase-oplossing 30 minuten lang op 40 °C voorverwarmd; gebruik 70% ethanol om de flexibele pompslangen te spoelen. Giet vervolgens 40 mL E-G-T-A-H-B-S-S-oplossing in een centrifugebuis die in het waterbad is geplaatst en gebruik de voorverwarmde E-G-T-A-H-B-S-S om de flexibele pompslangen te spoelen. Na het euthanaseren van een CD1-muis, conform het tekstprotocol, worden de buikharen afgeschoren en wordt het buikoppervlak gedesinfecteerd met 70% ethanol.

Bevestig de anesthesie door in de teen te knijpen. Snijd door de buikholte en leg de vena portae en de vena cava inferior vrij door de darmen naar de linkerzijde van de buik te verschuiven. Start de pomp op een snelheid van 1 tot 3 ml/min met E-G-T-A-H-B-S-S-oplossing en canuleer de vena portae met een 23 gauge vlinder naald; klem het gecanuleerde gedeelte van de vena portae af en zet vervolgens de sine-pincet vast op het oppervlak van de geopende buik van de muis.

De lever moet binnen de eerste 30 seconden van de perfusie bleek worden; maak vervolgens snel een incisie in het onderste gedeelte van de vena cava inferior om te voorkomen dat er een overmatige druk in de lever wordt opgebouwd, en verhoog de stroomsnelheid geleidelijk naar 7 ml per minuut gedurende de eerste minuut van de perfusie. Wanneer er minder dan 5 ml EGTA-HBSS-oplossing over is in de centrifugebuis, voegt u 40 tot 50 ml collageen-A-oplossing toe en verhoogt u de stroomsnelheid vervolgens geleidelijk naar 10 ml per minuut gedurende 30 seconden.

Laat de lever opzwellen door met een pincet periodiek druk uit te oefenen op de vena cava inferior in intervallen van 10 tot 32 seconden. Dit verbetert de celdissociatie en verkort de perfusietijd met collagenase. Wanneer er minder dan 10 milliliters collagenase-oplossing in de centrifugebuis overblijft, voegt u nog 40 tot 50 milliliters voorverwarmde collagenase-oplossing toe aan de buis.

Zodra er 70 tot 80 milliliter is geperfuseerd, wordt met een pincet lichte druk op het oppervlak uitgeoefend. Een indrukkingsmerk geeft aan dat de levercellen gedissocieerd zijn. Verwijder de lever als één geheel uit de buikholte en plaats deze in een centrifugebuis met 20 tot 30 milliliter celisolatiemedium.

Houd levercellen tot drie uur op ijs en voeg tot drie levers samen voor zuivering om voldoende cellen te verkrijgen. Plaats één geperfuseerde lever in een Petrischaal met 15 milliliter medium voor celisolatie en gebruik een schaar of pincet. Scheur het glanzende kapsel open en laat alle levercellen in het medium vrijkomen.

Filtreer de oplossing door een cellenzeef van 100 micrometer in een centrifugebuis. Centrifugeer vervolgens de cel-suspensie bij 50 g bij vier graden Celsius gedurende twee minuten. Parenchymale cellen bevinden zich in het pellet en niet-parenchymale cellen bevinden zich in het supernatant.

Verzamel het supernatant in een schone centrifugebuis en centrifugeer gedurende twee minuten bij 50 gs. Herhaal dit voor een totaal van vier overdrachten en centrifugeerstappen. Vervolg met de volgende centrifugeerstap.

Centrifugeer de supernatant bij 1.350 g gedurende 15 minuten. Om de niet-parenchymale cellen te pelletteren, wordt de supernatant weggegooid en de pellet geresuspendeerd in 10 milliliter medium voor Kupffer-celisolatie. Voeg de oplossing met niet-parenchymale cellen toe aan de discontinuë 25-50% isotone gradiënt die eerder volgens het tekstprotocol is bereid en centrifugeer bij 850 g gedurende 15 minuten zonder versnelling of remming. Aspireer met een serologische pipette van 10 milliliter ongeveer 12 milliliter van de verrijkte Kupffer-celfractie, die troebel verschijnt binnen de 25% SIP-fractie nabij de interface tussen 25% en 50% SIP.

Breng de cellen over naar een centrifugebuis met 35 tot 40 milliliters medium voor celisolatie en meng voorzichtig; centrifugeer vervolgens bij 1.350 ×g en vier graden Celsius om de cellen te pelletteren. Verwijder het supernatant en gebruik vijf tot 10 milliliters voorverwarmd medium om de cellen te resuspenderen. Tel de cellen met een hemocytometer en gebruik trypaanblauw-kleuring om de viabiliteit te meten. Plaats de gezuiverde niet-parenchymale cellen in 24-wells platen bij een dichtheid van 5 × 10⁵ cellen per well.

Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2. Verwijder vervolgens voorzichtig het medium. Gebruik voorverwarmde HBSS om de cellen te wassen en vervang dit door 500 µL per well vers voorverwarmd celkweekmedium.

Breng de cellen gedurende ten minste vier uur terug naar 37 °C om de cellen te laten hechten voordat de behandeling met nanodeeltjes plaatsvindt. Nadat de zuiverheid en fagocytische activiteit van de C4-cellen zijn gekarakteriseerd en de incubatie met gefunctionaliseerde koolstofnanobuisjes of fcts is uitgevoerd zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt het supernatant weggegooid en wordt er 200 µL lysisbuffer per putje toegevoegd. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 tot 60 minuten, pipetteer krachtig en verzamel de gelyseerde C4-cellen in microcentrifugebuisjes.

Centrifugeer vervolgens bij 20,000 GS gedurende 10 minuten om de fcn ts die door de cellen zijn opgenomen samen met het celdebris neer te slaan. Verzamel het supernatant in microcentrifugebuisjes en bewaar dit bij -20 °C. Alternatief kan 50 µL worden overgebracht naar een 96-well plaat, waarna een gelijk volume substraatmengseloplossing uit de lactate dehydrogenase kit wordt toegevoegd.

Voeg triplicaten toe van blanco wells met 50 microliters lysisbuffer en 50 microliters substraatmix-oplossing. Dek vervolgens de plaat af en incubeer deze 15 minuten bij kamertemperatuur voordat u 50 microliters stopoplossing toevoegt. Lees tot slot de absorbentie af bij 490 nanometers in een microplate reader en gebruik de volgende formule om het percentage celviabiliteit te berekenen.

Deze figuur illustreert dat het aantal gezuiverde niet-parenchymale cellen varieert tussen 8 en 14 × 10⁶ cellen per muis en trian. Blauwe kleuring toonde een celviabiliteit van ongeveer 95% aan. Adherente cellen namen binnen 30 minuten incubatie een ronde vorm aan en na vier uur spreidden de cellen zich uit en begonnen er clusters te vormen, zoals hier te zien is.

Cellen werden gekleurd met F4/80-antilichamen om de zuiverheid van de cellen aan te tonen, welke via flowcytometrie op boven de 95% werd vastgesteld. Bovendien wees flowcytometrische analyse na 12 uur kweek uit dat 85% van de cellen fagocytische activiteit vertoonde, gebaseerd op hun vermogen om fluorescerende beads van 1 µm op te nemen. Dit aantal daalde echter na 72 uur kweek, waarbij slechts 40% van de cellen fagocytisch was, zoals hier wordt getoond.

Cellen die gedurende 24 en 72 uur waren geïncubeerd met gefunctionaliseerde koolstofnanobuisjes vertoonden vergelijkbare morfologieën in vergelijking met naïeve cellen. In tegenstelling hiermee vertoonden cellen die waren geïncubeerd met 10% DMSO, gebruikt als positieve controle, een necrotische morfologie; na analyse met de gemodificeerde LDH-assay vertoonden cellen die gedurende 24 en 72 uur waren behandeld met 10% DMSO een hoge toxiciteit in vergelijking hiermee. fcts veroorzaakten slechts een geringe maar significante afname van de celviabiliteit wanneer de cellen gedurende 72 uur werden blootgesteld aan 50 µg/mL. Met deze methode kunnen andere celgebaseerde SC en alle typen nanodeeltjes worden getest met behulp van geïsoleerde ke-cellen.

Dit maakt het mogelijk om betrouwbare gegevens te verzamelen terwijl het gebruik van dieren wordt geminimaliseerd. We hopen dat deze techniek de weg kan vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van nanotechnologische psychologie om de veiligheid te screenen van de vele veelbelovende nanodragers die in toenemende mate worden ontwikkeld.