Kupffer Cell Isolatie Nanoparticle toxiciteit testen
18 augustus 2015
Levermacrofagen, Kupffer-cellen genoemd, zijn verantwoordelijk voor het opvangen van circulerende nanodeeltjes. We beschrijven hier een methode, met hoge celzuiverheid en opbrengst, voor het isoleren van Kupffer-cellen. De gemodificeerde LDH-test wordt hier gebruikt om de toxiciteit veroorzaakt door koolstofnanoboortjes in Kupffer-cellen te meten.
Het algemene doel van het volgende experiment is om muiscup voor cellen in groot aantal te isoleren en zuiveren om nanodeeltjestoxiciteit te bestuderen. Dit wordt bereikt door muizenlevers te perfunderen met een H-B-S-S-E-G-T-A-oplossing en een collageen, een oplossing om het leverweefsel voorzichtig te verteren. Vervolgens worden levercellen gezuiverd door middel van dichtheid, centrifugatie en selectieve aanhechting om een kweek van gezuiverde cup voor cellen te verkrijgen.
Vervolgens wordt flowcytometrieanalyse uitgevoerd om de zuiverheid en F zure eigenschappen van cup voor cellen te bevestigen. Er worden resultaten verkregen die aantonen dat de toxiciteit van gefunctionaliseerde koolstofnanobuizen kan worden gemeten in cup voor cellen. Gebaseerd op de gemodificeerde L-D-H-S-A wordt ondersteund dat dit model kan worden toegepast op nanodeeltjestoxiciteitstesten.
De methode die we u vandaag willen laten zien, kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van nanotoxicologie, zoals het beoordelen van de toxiciteit van recent ontwikkelde geneesmiddelendragers. Dit is belangrijk omdat de meeste gebruikte geïmmortaliseerde cellijnen significant verschillende eigenschappen vertonen van de weefsels waaruit ze zijn afgeleid. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal. Als de methode succesvol wordt uitgevoerd, zal dit resulteren in het verkrijgen van een hoge opbrengst en zuiverheid van ke-cellen, die vervolgens kunnen worden gebruikt als een model om een reeks nanodeeltjes te screenen op toxiciteit.
Nadat alle reagentia in de tabel met materialen en reagentia die bij de bijbehorende tekstprotocol worden gevonden, vers klaargemaakt zijn, verwarmt u de E-G-T-A-H-B-S-S-oplossing en de collageenase-oplossing gedurende 30 minuten op 40 graden Celsius, gebruik 70%ethanol om de flexibele slang van de pomp te spoelen. Giet vervolgens 40 milliliter E-G-T-A-H-B-S-S-oplossing in een centrifugebuis die in het waterbad is ondergedompeld en gebruik de voorverwarmde E-G-T-A-H-B-S-S om de flexibele slang van de pomp te spoelen. Nadat een CD een muis is geëuthanaseerd volgens het tekstprotocol, scheer de buikharen en desinfecteer het buikoppervlak met 70%ethanol.
Bevestig de anesthesie door het knijpen in de tenen. Snijd door de buikholte en leg de poortader en inferieure holle ader bloot door de darm lateraal naar links van de buik te verplaatsen. Start de pomp met een snelheid van één tot drie milliliter per minuut met E-G-T-A-H-B-S-S-oplossing en met een 23 gauge vlindernaald kanuleer de poortader, klem de kanuleerde sectie van de poortader en draai vervolgens de sinustang op het oppervlak van de geopende muizenbuik.
De lever zou binnen de eerste 30 seconden van de perfusie bleek moeten worden, snijd snel het onderste deel van de inferieure holle ader in om overmatige druk op te bouwen in de lever en verhoog de stroomsnelheid geleidelijk tot zeven milliliter per minuut gedurende de eerste minuut van de perfusie. Wanneer er minder dan vijf milliliter E-G-T-A-H-B-S-S-oplossing in de centrifugebuis overblijft. Voeg 40 tot 50 milliliter collageen toe, een oplossing, verhoog vervolgens de stroomsnelheid geleidelijk tot 10 milliliter per minuut over 30 seconden.
Laat de lever opzwellen door met pincetten periodiek druk op de inferieure holle ader uit te oefenen gedurende intervallen van 10 tot 32 seconden. Dit zal de celafscheiding verbeteren en de perfusietijd met collageenase verkorten. Wanneer er minder dan 10 milliliter collageenase-oplossing in de centrifugebuis overblijft, voegt u nog eens 40 tot 50 milliliter voorverwarmde collageenase-oplossing toe aan de buis.
Zodra er 70 tot 80 milliliter is geperfundeerd, gebruikt u een pincet om lichte druk uit te oefenen op het oppervlak. Een indrukking geeft aan dat de levercellen zijn gedissocieerd. Verwijder de lever uit de buikholte als één stuk en plaats deze in een centrifugebuis met 20 tot 30 milliliter cup voor celisolatiemedium.
Houd de levercellen maximaal drie uur op ijs en verzamel maximaal drie levers voor zuivering om cup voor cellen te zuiveren. Plaats één geperfundeerde lever in een petrischaal met 15 milliliter cup voor celisolatiemedium met schaar of pincetten. Breek de glimmende capsule en laat alle levercellen in het medium vrij.
Filter de oplossing door een 100 micrometer celzeef in een centrifugebuis. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie bij 50 GS bij vier graden Celsius gedurende twee minuten. Parenchymcellen zullen zich in het pellet bevinden en niet-parenchymcellen zullen zich in het supernatant bevinden.
Verzamel het supernatant in een schone centrifugebuis en centrifugeer gedurende twee minuten bij 50 gs. Herhaal dit voor een totaal van vier overdrachten en centrifugeertijden. Centrifugeer vervolgens.
Het supernatant bij 1.350 GS gedurende 15 minuten. Om de niet-parenchymcellen te pelleten, gooit u het supernatant weg en hersuspendeert u het pellet in 10 milliliter cup voor celisolatiemedium, voegt u de niet-parenchymcellen oplossing toe aan de discontinu 25 50%isotone gradiënt die eerder is bereid volgens het tekstprotocol en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 850 GS zonder versnelling of breuk. Gebruik een 10 milliliter serologische pipet om ongeveer 12 milliliter van de verrijkte cup voor celfractie die troebel lijkt binnen de 25%SIP fractie dicht bij de 25 50%SIP-interface te aspireren.
Breng de cellen over in een centrifugebuis met 35 tot 40 milliliter cup voor celisolatiemedium en meng voorzichtig, centrifugeer bij 1.350 GS en vier graden Celsius om de cellen te pelleten, gooit u het supernatant weg en gebruikt u vijf tot tien milliliter voorverwarmd medium om de cellen te hersuspenderen met een hemo cytometer. Tel de cellen en gebruik trianblauwkleuring om de levensvatbaarheidsplaat te meten. De gezuiverde niet-parenchymcellen in 24 welplates met een dichtheid van vijf keer 10 tot de vijfde cellen per putje.
Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 grade
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het isoleren en zuiveren van Kupffer-cellen van muizen om de toxiciteit van nanodeeltjes te onderzoeken. Een methode met leverperfusie en dichtheidscentrifugering wordt gebruikt om een hoge celzuiverheid en opbrengst te bereiken.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Toxicologie
Achtergrond
- Kupffer-cellen zijn levermacrofagen die circulerende nanodeeltjes opvangen.
- Het begrijpen van de toxiciteit van nanodeeltjes is cruciaal voor biomedische toepassingen.
- Technieken voor het isoleren van cellen met hoge zuiverheid zijn essentieel voor nauwkeurige toxiciteitstesten.
- De gemodificeerde LDH-assay is een betrouwbare methode voor het beoordelen van celtoxiciteit.
Doel van het onderzoek
- Om Kupffer-cellen te isoleren en zuiveren uit muizenlevers.
- Om de toxiciteit van koolstofnanobuisjes in deze cellen te bestuderen.
- Om het gebruik van Kupffer-cellen in nanodeeltjestoxiciteitstesten te valideren.
Gebruikte methoden
- Perfusie van muizenlevers met een H-B-S-S-E-G-T-A-oplossing.
- Collagenase-oplossing gebruikt voor zachte leverweefselvertering.
- Dichtheidscentrifugering voor celzuivering.
- Flowcytometrie-analyse om celzuiverheid en -functionaliteit te bevestigen.
Belangrijkste resultaten
- Hoge-zuiverheids Kupffer-cellencultures werden succesvol verkregen.
- Koolstofnanobuisjestoxiciteit was meetbaar in Kupffer-cellen.
- De gemodificeerde LDH-assay beoordeelde effectief de celtoxiciteit.
- Dit model ondersteunt verdere nanodeeltjestoxiciteitstesten.
Conclusies
- De isolatiemethode biedt een betrouwbare benadering voor het bestuderen van Kupffer-cellen.
- Functionele koolstofnanobuisjes kunnen op toxiciteit worden getest in dit model.
- De bevindingen dragen bij aan het begrijpen van nanodeeltjesinteracties in de lever.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolating primary Kupffer cells addresses a key limitation in nanotoxicology where immortalized cell lines yield discrepant results, improving predictive confidence in nanoparticle safety assessment. This method supports target validation by providing a physiologically relevant model of liver macrophage function, critical for de-risking nanoparticle-based drug carriers. High-yield, high-purity isolation enables reproducible screening of nanomaterials, aligning with early discovery goals for translational biomarker alignment and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modeling nanoparticle-Kupffer cell interactions in a disease-relevant system.
- Operational Value: Provides a purified primary cell source (>95% purity) for consistent target engagement and pathway clarification studies.
- Predictive Value: Supports lead identification by measuring functional outcomes like phagocytic activity and viability after nanoparticle exposure.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers a standardized biological system for quantitative LDH-based toxicity readouts, enabling reliable compound evaluation.
- Operational Value: Uses accessible equipment (centrifuge, perfusion pump) to ensure scalability and cross-lab reproducibility.
- Assay Readiness: Generates sufficient cell yield (up to 14×10⁶ cells/mouse) for multi-well plate screening of nanoparticle libraries.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical workflows by using primary cells that reflect human liver macrophage biology more closely than immortalized lines.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through consistent toxicity measurement (e.g., LDH release) across nanoparticle doses and exposure times.
- Translational Continuity: Enables biomarker-aligned screening where Kupffer cell activation or dysfunction predicts in vivo nanoparticle clearance and safety.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing a reproducible assay for nanoparticle toxicity screening before preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on nanoparticle uptake and macrophage activation via flow cytometry confirmation of F4/80+ phagocytic cells.
- Screening: Enables assay standardization through density gradient purification and selective adhesion steps that yield homogeneous Kupffer cell populations.
- Analytics: Generates quantitative viability data via modified LDH assay, allowing dose-response modeling and cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling RES-mediated nanoparticle capture, a key determinant of biodistribution and clearance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable to diverse nanomaterials (e.g., functionalized CNTs, drug carriers) across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by using primary cells that maintain native phagocytic and cytokine signaling functions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized perfusion, digestion, and purification steps yielding >95% pure Kupffer cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early predictive confidence in nanoparticle biocompatibility, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of nanocarriers based on liver macrophage toxicity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent surgery, perfusion techniques, and primary cell handling.
- Dependent on centrifugation equipment, cell strainers, and flow cytometry for validation.
- Necessitates standardization across teams for collagenase digestion times and gradient preparation to ensure consistency.
- Adaptation considerations include adjusting mouse weight (35-45 g) to optimize yield and cannulation success.
- Practical limitations include cell viability decline in culture (phagocytic activity drops from 85% to 40% over 72 hours), requiring timely assay execution.
