Name: Kupffer Cell Isolatie Nanoparticle toxiciteit testen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Leer de isolatie van muizen Kupffer-cellen via leverperfusie en densiteitscentrifugatie voor nanodeeltjestoxiciteitstesten. Deze methode biedt hoge opbrengst en zuiverheid voor betrouwbaar onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het EU FP7-ITN Marie-Curie Netwerkprogramma RADDEL. MB en KAJ willen Joe Varguese en Rui Serra Maia graag bedanken voor hun hulp en suggesties tijdens de optimalisatie van de Kupffer celisolatie.

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, voorschriften en regelgevende instanties. Het protocol gedemonstreerd werd uitgevoerd onder de leiding en de goedkeuring van de Britse Home office regelgeving 1. Perfusie and Cell Collection (figuur 1) <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" /> Figuur 1:. Leverperfusie Na verdoving van de muis, het spijsverteringskanaal lateraal naar links van de buik om de poortader (PV) toegankelijk te maken. De PV canule een trage stroomsnelheid (1-3 ml / min) van EGTA / HBSS oplossing en de onderste veina cava (IVC) onmiddellijk gescheurd om overtollige druk in de lever te voorkomen. In de eerste minuut van perfusie, wordt het debiet geleidelijk verhoogd tot 7 ml / min. De collagenase wordt vervolgens geperfuseerd bij 10 ml / min totdat de volledige digestie wordt verkregen. <ol><li> Prepaopnieuw vers alle reagentia in het materiaal tabel beschreven. </li><li> Warm de EGTA (ethyleenglycol Tetra-azijnzuur) / HBSS (Hank&#39;s Balanced Salt Solution) oplossing (50 ml per muis) en collagenase-oplossing (100 ml per muis) gedurende 30 minuten bij 40 ° C. </li><li> Eerst spoelen met 70% ethanol de pomp flexibele slang. Giet 40 ml van EGTA / HBSS oplossing in een centrifugebuis ondergedompeld in het waterbad en spoel de pomp flexibele buis met voorverwarmde EGTA / HBSS oplossing. </li><li> Voer terminal verdoving met een barbituraat om op betrouwbare wijze te produceren bewusteloosheid voor respiratoire depressie en de dood. Injecteer fenobarbital bij 1 mg / kg, ip een vrouwelijke of mannelijke CD1-muizen (35-45 g). Bevestig de narcose door teen knijpen. </li><li> Scheren buik haren en steriliseer de buik oppervlak met 70% ethanol-oplossing. </li><li> Knip de buikholte en de poortader en inferior vena cava bloot door het bewegen van de darm lateraal links van de buik. </li><li> Stert de pomp met een snelheid van 1-3 ml / min met EGTA / HBSS oplossing canule en de poortader met een 23 g vlindernaald (wings gesneden). Klem het deel van de poortader gecanuleerde met de 23-G naald en vervolgens draai de serrefine tang aan het oppervlak van de geopende muis buik. De lever moet snel bleek binnen de eerste 30 seconden van EGTA / HBSS oplossing perfusie. </li><li> Snel insnijden het onderste gedeelte van de inferior vena cava overdruk gebouw in de lever voorkomen, en vervolgens krachtiger debiet geleidelijk 7 ml / min, in de eerste minuut van perfusie. Het dier sterft als gevolg van bloeden secundair aan caval venapunctie Vena. </li><li> Bij minder dan 5 ml van EGTA / HBSS oplossing is overgebleven in de centrifugebuis, vul het met Collagenase Solution (40-50 ml). Verhoog het debiet geleidelijk 10 ml / min gedurende 30 sec. </li><li> Maak de lever deining door druk op de onderste vena cava, met een pincet voor 5-10 sec intervallen. This kan periodiek worden uitgevoerd (5-10 keer tijdens de spijsvertering). Deze stap zal de lever cel dissociatie te verbeteren en vermindering van de perfusie tijd met collagenase. </li><li> Bij minder dan 10 ml collagenase oplossing achterblijft in de centrifugebuis, giet 40-50 ml voorverwarmde Collagenase oplossing in de centrifugebuis. </li><li> Na 10-15 min perfusie en ongeveer 70-80 ml collagenase oplossing geperfuseerd met een klein druk op het oppervlak van de lever met een pincet. Een afdruk van de druk geeft aan dat de lever cellen worden gescheiden. </li><li> Haal de lever uit de buikholte als een stuk en plaats het in een centrifuge buisje met 20-30 ml Kupffercellen Isolation Medium. Blijf levercellen op ijs of bij 4 ° C gedurende 3 uur maximum ter voorkoming van hinder levensvatbaarheid levercel. </li><li> Herhaal de perfusie over verscheidene dieren indien nodig, terwijl de geperfuseerde lever op ijs. Pool 1-3 levers voor zuivering en ga verder met fase 3. </li></ol> 2. Bereiding van de dichtheidsgradiënt te centrifugeren (figuur 2) <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" /> Figuur 2:. Voorbereiding van de dichtheidsgradiënt Alle procedures worden uitgevoerd onder steriele toestand worden uitgevoerd. De SIP wordt bereid door 15,3 ml van gecoate silica deeltje oplossing 1,7 ml 10 x PBS. Een 5 ml SIP worden gemengd met 15 ml PBS tot 20 ml 25% SIP oplossing. 10 ml van SIP worden gemengd met 10 ml PBS tot 20 ml 50% SIP oplossing. Een centrifugebuis bevattende 50% SIP-oplossing (20 ml) wordt gekanteld en 25% SIP-oplossing (20 ml) wordt langzaam toegevoegd met behulp van een serologische pipet 25 ml. <ol><li> Ga verder met de volgende stappen (hoofdstuk 2., 3. en 5.) onder steriele conditie en houden cellen op ijs of bij 4 ° C. Bereid de SIP (oplossing isotoon beklede silicadeeltjes) door mengen van 15,3 ml van gecoate silica deeltje oplossing met 1,7 ml 10 x PBS. </li&gt; <li> Aan 20 ml van 25% SIP oplossing te maken, meng 5 ml van SIP met 15 ml PBS. Aan 20 ml van 50% SIP oplossing te maken, meng 10 ml van SIP met 10 ml PBS. </li><li> Vul een centrifugebuis van 20 ml van de 50% oplossing SIP. Kantel de centrifugebuis een hoek dicht bij 90 ° en voeg langzaam 25% de SIP-oplossing (20 ml) aan de zijwand van de buis met behulp van een 25 ml serologische pipet, zonder het oppervlak van de 50% SIP laag raken. Bij het toevoegen van de 25% SIP oplossing geleidelijk verminderen van de hoek van de buis. Houd de dichtheidsgradiënt op ijs tot gebruik. </li></ol> 3. Kupffer Cell Purification (figuur 3) <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" /> Figuur 3:. Zuivering van Kupffer cellen door dichtheidsgradiënt centrifugeren en celadhesie Alle procedures worden uitgevoerd onder steriele toestand worden uitgevoerd. (A) na breuk van de Glisson de capsule worden levercellen gefiltreerd door een 100 micrometer zeef. De suspensie wordt bij 50 x g gecentrifugeerd om hepatocyten (pellets) gooi en het verzamelen van de niet-parenchymcel fractie (supernatant). Deze stap wordt 3 maal herhaald. Non-parenchymale cellen worden toegevoegd op een discontinue gradiënt isotone en gecentrifugeerd bij 800 x g gedurende 15 min. Kupffer cellen vanuit het 25% SIP kussen worden verder gezuiverd door celadhesie selectie. (B) Cellen worden uitgeplaat in 24-well plaat en geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 30 min. Niet-hechtende cellen worden eenmaal gewassen met 500 pi HBSS. Kupffercellen tonen hun hechtende morfologie 4 uur na plateren, wanneer f -CNTs kunnen worden toegevoegd aan de cellen. De schaal bar vertegenwoordigt 25 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol><li> Zet een doorbloed lever in een petrischaal met 15 ml Kupffer Cell Isolation Medium. Scheuren van de Glisson&#39;s capsule (membraan van de lever) met een schaar en laat alle levercellen in de Kupffer-cel isolatiemedium. Filtreer de oplossing hoewel een 100 urn zeef cel te halen in een centrifugebuis. Herhaal de perfusie procedure aanvullende levers geperfuseerd en bundelen de cellen in dezelfde centrifugebuis (15 ml van een muis, tot 45 ml van drie muizen). </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 50 x g gedurende 2 min bij 4 ° C. Parenchymale cellen (hepatocyten) zal in de pellet en niet-parenchymale cellen (inclusief Kupffercellen) zal in het supernatant. </li><li> Verzamel de bovenstaande vloeistof in een schone centrifugebuis en centrifugeer bij 50 xg gedurende 2 minuten elk. Herhaal deze stap drie keer. </li><li> Centrifugeer bij 1350 xg gedurende 15 min aan niet-parenchymale cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml van Kupffer Cell isolatiemedium. </li><li> Voeg de niet-parenchymcellen-oplossing isotoon de discontinue gradiënt 25/50%, zoals beschreven in 2.3. Centrifuge bij 850 xg gedurende 15 min zonder versnelling of breken. </li><li> Lokaliseer de Kupffer verrijkte celfractie troebele verschijning in de 25% fractie SIP nabij de 25/50% SIP interface (Figuur 3). Met behulp van een 10 ml serologische pipet, zuig ongeveer 12 ml van de verrijkte Kupffer celfractie. Transfer cellen in een centrifugebuis die 35-40 ml Kupffer Cell isolatiemedium. Meng voorzichtig en centrifugeer bij 1350 xg gedurende 15 min bij 4 ° C om de cellen te pelleteren. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in 5-10 ml voorverwarmde Kupffer celkweekmedium. Tellen cellen (hemocytometer) en meet de levensvatbaarheid met trypanblauw vlekken. </li><li> Plate het gezuiverde niet-parenchymale cellen in 24-wells platen met een dichtheid van 5 x 10 5 cellen / putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 (figuur 3). Na 30 min, verwijder voorzichtig het medium, wassen met voorverwarmd Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) keer dan vervangenmet 500 pl vers en voorverwarmde Kupffer Cell Culture Medium (per putje). </li><li> Laat Kupffer cellen ten minste 4 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 vóór de behandeling met nanodeeltjes, zodat zij hun hechtende morfologie verwerven. </li></ol> 4. Karakterisering <ol><li> Kupffercellen Zuiverheid <ol><li> Bereid verse PBS / BSA-oplossing gebruikt om Kupffer levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Was de cellen eenmaal met 500 ui PBS / BSA oplossing. Verwijder de PBS / BSA-oplossing en los Kupffer cellen in 500 ul van verse PBS / BSA-oplossing met zachte schrapen. Wanneer cellen worden uitgeplaat in 24-puts platen inkorten uiteinden van schraapbladen met een schaar de onthechting gemakkelijker gaan maken. Overdracht cellen in flowcytometrie tubes. </li><li> Tellen Kupffer cellen met een hemocytometer en centrifuge 1 x 10 5 cellen bij 1350 x g. Resuspendeer Kupffer cellen in 30 ui F4 / 80 antilichaam (puur). Goed mengen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Houd de ongekleurde cellen (niet geïncubeerd met het antilichaam) op ijs. </li><li> Voeg 2 ml PBS / BSA oplossing in gekleurde cellen, centrifuge op 1350 g gedurende 5 minuten en gooi de resulterende supernatant. Resuspendeer gekleurde cellen in 200 ul PBS / BSA. </li><li> Voor flowcytometrieanalyse, poort 10000 unstained Kupffer cellen op basis van hun grootte (voorwaartse verstrooiing) en de granulariteit (zijwaartse verstrooiing). Analyseer fluorescentie van gated cellen in FL-1 kanaal. </li><li> Herhaal deze procedure Gekleurde Kupffer cellen behoud van dezelfde instellingen voor de flowcytometrie analyse van ongekleurde Kupffer cellen. Selecteren en kwantificeren van de fluorescentie van gekleurde cellen om de zuiverheid van Kupffer cellen te beoordelen. </li></ol></li><li> Kupffer Cell fagocytoseactiviteit <ol><li> Vervang medium met 0,5% (v / v) fluorescerende beads in Kupffer celkweekmedium en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> Om niet-geïnternaliseerde kralen, centrifuge Kupffercellen op 1350 xg, di verwijderenscard het supernatant en resuspendeer cellen in 500 ul PBS / BSA oplossing. Herhaal deze stap nog 2 keer. </li><li> Schraap Kupffer cellen in 500 ul PBS / BSA oplossing en overdracht cellen in een flow-cytometrie buis. </li><li> Centrifuge Kupffercellen op 1350 xg, gooi het supernatant en resuspendeer cellen in 200 ul PBS / BSA Solution. </li><li> Voor flowcytometrieanalyse, poort 10000 unstained Kupffer cellen op basis van hun grootte (voorwaartse verstrooiing) en de granulariteit (zijwaartse verstrooiing). Analyseer fluorescentie van gated cellen in FL-2-kanaal. </li></ol></li></ol> 5. Incubatie van Chemisch gefunctionaliseerde koolstof nanobuisjes (f -CNTs) <ol><li> Bereid een dispersie van f -CNTs (1 mg / ml) in water door sonicatie gedurende 15 min vóór gebruik. F -CNTs bereid in-house 22. </li><li> Bereid 2x geconcentreerd f- CNTs dispersie in Kupffer celkweekmedium. Sonificeer f- CNTs verspreid in medium voor2 min voordat u doorgaat met stap 5.3). </li><li> Voor elke goed, vervang 250 ul van oude media met 250 pi van 2x f -CNTs dispersie. Onbehandelde putten (250 ui geconditioneerd medium + 250 ul vers Kupffer Cell Culture Medium) en putjes behandeld met 10% DMSO worden als negatieve en positieve controles, respectievelijk. </li><li> Incubeer Kupffer cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 of 72 uur. </li></ol> 6. toxiciteit Evaluatie van f -CNTs in Kupffer cellen door de Modified lactaatdehydrogenase (LDH) Assay <ol><li> Verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 200 ul (per putje van 24-putjes plaat) lysisbuffer en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten 1 uur. </li><li> Na het uitvoeren van krachtig pipetteren, verzamel gelyseerde Kupffer cellen in microcentrifuge buizen en centrifugeer bij 40.000 xg gedurende 10 min f -CNTs die door cellen en celafval werden pelleteren. </li><li> Verzamel de bovenstaande vloeistoffen (ƒ-CNT gratis) inmicrocentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C of ga verder met stap 6.5). </li><li> Transfer 50 pi in een 96-well plaat en een gelijk volume van het substraatmengsel oplossing (LDH kit) aan elk putje. Bedek de plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten voor het toevoegen van 50 pi van de stopoplossing (LDH kit). Drievoud blanco putjes die 50 pl lysisbuffer, 50 ui substraatmengsel-oplossing en 50 gl stopoplossing toevoegen. </li><li> Lees de absorptie bij 490 nm in een microplaat reader en gebruik de volgende formule om de (%) cellevensvatbaarheid te berekenen. </li></ol><img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" />

<ol><li>Hoffmann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+novel+kidney+biomarkers+in+preclinical+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies.</a> Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).</li>
<li>Nel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterial+Toxicity+Testing+in+the+21st+Century%3A+Use+of+a+Predictive+Toxicological+Approach+and+High-Throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening.</a> Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).</li>
<li>Bregoli, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+antimony+trioxide+nanoparticles+on+human+hematopoietic+progenitor+cells+and+comparison+to+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines.</a> Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).</li>
<li>Yamasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Aberrations+and+Cellular+Heterogeneity+in+SV40-Immortalized+Human+Corneal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology%2C+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells.</a> Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).</li>
<li>Motoyoshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megalin+contributes+to+the+early+injury+of+proximal+tubule+cells+during+nonselective+proteinuria%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria.</a> Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).</li>
<li>Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+barrier+characteristics+and+expression+of+cell+adhesion+molecules+in+proximal+tubule-derived+cell+lines+commonly+used+for+in+vitro+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies.</a> Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).</li>
<li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+non-equivalence+of+murine+%28monocyte-%29+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).</li>
<li>Kermanizadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Kupffer+cells+in+the+hepatic+response+to+silver+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles.</a> Nanotoxicology. , (2013).</li>
<li>Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Primary+Liver+Macrophages+for+Studying+Quantum+Dot+Interactions+with+Biological+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems.</a> Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).</li>
<li>Wan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M2+Kupffer+Cells+Promote+M1+Kupffer+Cell+Apoptosis%3A+A+Protective+Mechanism+Against+Alcoholic+and+Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease.</a> Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).</li>
<li>Matsuoka, M., Tsukamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+hepatic+lipocyte+collagen+production+by+Kupffer+cell-derived+transforming+growth+factor+%CE%B2%3A+Implication+for+a+pathogenetic+role+in+alcoholic+liver+fibrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis.</a> Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).</li>
<li>Polakos, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kupffer+Cell-Dependent+Hepatitis+Occurs+during+Influenza+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection.</a> The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).</li>
<li>Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+enzymes+released+by+liver+macrophages+may+promote+hepatic+injury+in+a+rat+model+of+hepatic+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage.</a> Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).</li>
<li>Knittel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+parenchymal+and+non-parenchymal+cells+of+rat+liver%3A+regulation+by+TNF-%CE%B1+and+TGF-%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1.</a> Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).</li>
<li>Branster, M. V., Morton, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Intact+Liver+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of Intact Liver Cells.</a> Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).</li>
<li>Smedsrød, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li>
<li>Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+endothelial+cells+of+adult+rat+liver+as+resolved+by+sedimentation+velocity+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry.</a> J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).</li>
<li>Miller, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+cells+from+livers+of+carcinogen-treated+rats+by+free-flow+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis.</a> Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).</li>
<li>Firme, C. P., Bandaru, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+issues+in+the+application+of+carbon+nanotubes+to+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems.</a> Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).</li>
<li>Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+assessment+of+carbon+nanotube+interaction+with+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+correcting+for+carbon+nanotube+interferences+with+a+commercial+LDH+cytotoxicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay.</a> Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).</li>
<li>Wang, J. T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetically+Decorated+Multiwalled+Carbon+Nanotubes+as+Dual+MRI+and+SPECT+Contrast+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents.</a> Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).</li>
<li>Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+isolate+and+culture+mouse+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells.</a> Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).</li>
<li>Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+liver+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Isolation of liver Kupffer cells.</a> Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14(2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De volgende stappen zijn cruciaal voor hoge opbrengst en hoge levensvatbaarheid van Kupffercellen bereiken. Aseptische omstandigheden moeten worden gebruikt om de kans op bacteriële en fungale contaminatie. Alle instrumenten moeten worden gesteriliseerd voor gebruik. Reagentia moeten vers worden bereid voor het uitvoeren van de isolatie procedure. De keuze van de collagenase IV, met een lage tryptisch activiteit, is cruciaal. Verschillende partijen van dezelfde leverancier verschillende enzy...

Het gebied van nanotoxicologie onderzoek richt zich op het biologisch effect van nanodeeltjes te karakteriseren. Toxicologische studies op basis van in vivo onderzoek blijven de meest accurate methoden. Echter, is het gebruik beperkt door de kosten, arbeid en tijd eisen 1. Als alternatief zijn in vitro assays werden gebruikt vanwege hun eenvoud en de mogelijkheid van het ontwikkelen high-throughput in vitro testplatformen 2 - zodat uitbreiding van het aantal geteste omstandigheden. De meeste nanotoxicological studies worden uitgevoerd met behulp van in vitro testen met onsterfelijk gemaakte cellijnen. Er zijn echter zorgen over de extrapolatie van deze experimentele bevindingen in vivo toxicologische effecten 3. Inderdaad kan de eigenschappen van geïmmortaliseerde cellijnen significant van weefsels ze zijn ontleend, bijvoorbeeld genetische transformatie 4, verslechtering van de belangrijkste morfologische kenmerken te5, het verlies van cellulaire polariteit 6 en functionele veranderingen, zoals de regulering van ontstekingsmediatoren 7. Kupffer cellen zijn de meest voorkomende macrofaag populatie in het lichaam en die direct in contact met bloed door langs de wand van de lever sinusoïden. Als onderdeel van het reticulo-endotheliale systeem (RES), die macrofagen verantwoordelijk voor het opvangen van circulerende nanodeeltjes en vormen derhalve een zeer geschikt model de toxiciteit van nanodeeltjes te bestuderen. In vivo 8 en in vitro studies 9 van inflammatoire responsen geassocieerd met Kupffer cellen blootgesteld aan nanodeeltjes elders gepubliceerd. Kupffer cellen zijn ook betrokken bij de pathogenese van leverziekten zoals alcoholische leverziekte 10, leverfibrose 11 of virale hepatitis 12. Er werd gemeld dat geïsoleerde Kupffer cellen nuttig inzicht om cellulaire mechanismen inv beschrijvenolved in de lever verstoring 13,14. Verscheidene werkwijzen zijn beschreven voor het isoleren en zuiveren Kupffer cellen. Celisolatie kan ontstaan ​​door mechanische of enzymatische dissociatie 15. Collagenase spijsvertering toont het voordeel van het behoud van de functionele integriteit van Kupffer cellen, terwijl leidt tot hoge Kupffer celopbrengst 16. Vele experimentele benaderingen, variërend in complexiteit en kosten, zijn gebruikt om Kupffercellen scheiden van andere levercel populaties. Zo kunnen Kupffer cellen zuiverheid worden bereikt door immunoaffiniteit 17, stroom 18 elektroforese, selectieve adhesie 16 of centrifugale technieken 16 die cellen te selecteren op basis van hun grootte en dichtheid. Een combinatie van deze methoden kunnen worden gekozen om de zuiverheid van de bevolking 16 verhogen. Er is geen consensus over de ideale methode voor Kupffer cel isolatie, want het is meestal afhankelijk van de toepassing en de beschikbare uitrustingt. In het geval van toxiciteit nanodeeltjes testen, de eenvoud en hoge opbrengst van de techniek in verband met functionele behoud van Kupffer cellen bleken het meest geschikt voor deze toepassing zijn. De Kupffer cellen isolatiemethode hier gerapporteerd is gebaseerd op een 2-staps werkwijze perfusie gevolgd door zuivering op dichtheidsgradiënt. De methode werd aangepast van het originele protocol ontwikkeld door Smedsrød et al. 16 ontworpen voor rattenlever celisolatie. De meeste studies gerapporteerd en beschreven de isolatie van Kupffer cellen uit levers rat. Hierin beschrijven we een werkwijze voor Kupffercellen isoleren uit muizenlever, met een hoge opbrengst en zuiverheid. Het gebruik van muizen reduceert het experiment kosten en maakt de behandeling van verscheidene lever grote hoeveelheden Kupffercellen toxiciteit nanodeeltjes testen te verkrijgen. In het volgende protocol werden Kupffer cellen geïncubeerd met gefunctionaliseerde koolstof nanobuisjes (f </em&gt; -CNTs). De unieke fysisch-chemische eigenschappen van CNTs - zoals bij hoge lengte tot diameter groot oppervlak hebben CNTs interessante kandidaten die als vectoren voor therapie en diagnose doeleinden. Echter, zijn bezorgdheid geuit over de toxiciteit van CNT 19, en de ontwikkeling van nieuwe in vitro testen is gericht op het vergroten van het inzicht in de CNT biologisch effect. Toxiciteit in Kupffer-cel is geassocieerd met een gebrek aan structurele integriteit van de celmembraan. Dit wordt gemeten door het verlies van de cytoplasmatische enzym LDH uit de cel in de supernatant. Het principe van deze methode is daarom om vrijgekomen LDH te verwijderen en meten wat overblijft in de cellen 20. Dit gebeurt in plaats van het meten van de vrijgekomen LDH in de supernatant omdat de aanwezigheid van CNTs in het supernatant interfereert met de test 21. Wij stellen voor het gebruik van deze eenvoudige en kosteneffectieve Kupffer celisolatie method hoge aantal functionele Kupffer cellen te isoleren. Hierdoor kan de screening van toxiciteit van verschillende nanodeeltjes, in een relevante primaire macrofaag model.

<table><tbody><tr><td>Euthatal (pentobarbital natrium)</td><td>Merial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1 muizen</td><td>Charles River&nbsp;&nbsp;</td><td>-</td><td>Het gewicht van de muis moet variëren van 35 tot 45 g. We adviseren het gebruik van mannelijke CD1-muizen omdat hun gewicht snel toeneemt (bv. een mannelijke CD1-muis van 7 weken oud overschrijdt 35 g in gewicht). Het wordt ook aangeraden om vooraf contact op te nemen met de dierenleverancier om de levering van oudere dieren te regelen. Als alternatief kunnen dieren binnenshuis zijn om het gewenste gewicht te bereiken.&nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS (Ca2+ en Mg2+ vrij, met bicarbonaat)&nbsp;&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;&nbsp;</td><td>14175-053</td><td>HBSS moet&nbsp; Ca2+ vrij zijn.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ethyleenglycoltetraazijnzuur (EGTA) tetranatriumzout&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;&nbsp;</td><td>E8145&nbsp;&nbsp;</td><td>EDTA kan ook worden gebruikt, maar EGTA heeft het voordeel dat het Ca2+ selectief aan zich bindt.&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;&nbsp;</td><td>15630-056&nbsp;</td><td>100 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Collageenase type IV&nbsp;</td><td>Worthington&nbsp;</td><td>CSL-4&nbsp;</td><td>Het wordt geadviseerd om verschillende batches van collageenase te testen of op zijn minst de leverancier te vermelden dat het product geschikt moet zijn voor isolatie van levercellen&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;Low glucose DMEM&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;&nbsp;</td><td>D5523&nbsp;</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI (met natriumpyruvaat en Glutamax)&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;&nbsp;</td><td>12633-012&nbsp;</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Penicilline/Steptomycine&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;&nbsp;</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum&nbsp;</td><td>First-Link&nbsp;&nbsp;</td><td>60-00-850&nbsp;</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypanblauwoplossing&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T8154&nbsp;</td><td>100 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Gekoelde silicadeeltje-oplossing (Percoll)</td><td>GE Healtcare&nbsp;&nbsp;</td><td>17-0891-02&nbsp;</td><td>Percoll&reg; is zeer stabiel en kan meerdere jaren worden bewaard&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Fosfaatbufferoplossing met zoutoplossing&nbsp;&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;&nbsp;</td><td>10010-023</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>10x Fosfaatbufferoplossing met zoutoplossing&nbsp;&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;&nbsp;</td><td>70011-036</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide&nbsp;</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>D/4120/PB08&nbsp;</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>LDH-kit (CytoTox 96)&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>G1781&nbsp;</td><td>Beschermd tegen licht bewaren&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM zonder fenolrode kleurstof</td><td>Life Technologies&nbsp;&nbsp;</td><td>31053-028&nbsp;</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>F4/80-antilichaam (Alexa 488)</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA497A488</td><td>Niet verdunnen, gebruikt in zuivere vorm voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>Fluorescente kralen</td><td>Sigma</td><td>L2778</td><td>Latexkralen, amine-gemodificeerd polystyreen, fluorescerend rood. 1 ml</td></tr><tr><td>Naam van het materiaal</td><td>Bedrijf&nbsp;</td><td>Catalogusnummer&nbsp;</td><td>Opmerkingen/Beschrijving&nbsp;</td></tr><tr><td>Butterfly-bloedafnameset (23 G/305 mm lange buis)&nbsp;&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td>367288</td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilters (0,22 &mu;m Blue Rim)&nbsp;</td><td>Minisart&nbsp;</td><td>16534-K&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen (50 ml blauwe dop)&nbsp;</td><td>BD Biosciences, Falcon&nbsp;</td><td>35 2070&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal (90 x 15 mm)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;&nbsp;</td><td>BSN 101VR20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;m celzeef&nbsp;&nbsp;</td><td>BD&nbsp;&nbsp;</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltiekpomp&nbsp;</td><td>Watson Marlow&nbsp;</td><td>SciQ 300&nbsp;&nbsp;</td><td>Spoel de buis voor en na elk gebruik met steriel PBS en 70% ethanol.</td></tr><tr><td>24-welplaten</td><td>Corning&nbsp;&nbsp;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>96-welplaten&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;&nbsp;</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Omega</td><td></td></tr><tr><td>Serrefine-tang</td><td>Hammacher GmbH&nbsp;</td><td>Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051</td><td>De serrefine-tang maakt het mogelijk om het vat dat is gekannuleerd met de 23 G-naald te klemmen zonder dat de tang tijdens de perfusieprocedure vastgehouden hoeft te worden. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&nbsp;</td></tr><tr><td>Flowcytometriebuizen</td><td>BD Biosciences, Falcon&nbsp;</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen (1,5 ml)</td><td>Elkay</td><td>&nbsp; 000-MICR-150</td><td></td></tr><tr><td>Celkrabber</td><td>BD Biosciences, Falcon</td><td>353086</td><td>Snijd de uiteinden van de messen af met een paar schaar om cellen in 24-welplaten te schrapen.</td></tr><tr><td>Naam van het reagens</td><td>Bedrijf&nbsp;</td><td>Catalogusnummer&nbsp;</td><td>Opmerkingen/Beschrijving&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;EGTA (Ethyleenglycoltetraazijnzuur)/HBSS (Hank's gebalanceerde zout-oplossing) oplossing&nbsp;</td><td></td><td></td><td>HBSS bevattend 0,5 mM EGTA en 25 mM HEPES. Breng de pH naar 7,4

kupffer cell isolatie nanoparticle toxiciteit testen

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

De grote meerderheid van in vitro studies hebben nanotoxicological geïmmortaliseerde cellijnen gebruikt voor hun bruikbaarheid. Echter, de resultaten van nanodeeltjes toxiciteit in geïmmortaliseerde cellijnen of primaire cellen toonden verschillen, benadrukt de noodzaak om het gebruik van primaire cellen verlengen in vitro assays. Dit protocol beschrijft de isolatie van muizenlever macrofagen, genaamd Kupffer cellen en hun toepassing toxiciteit nanodeeltjes bestuderen. Kupffer cellen zijn de meest voorkomende macrofaag bevolking in het lichaam en vormt een deel van het reticulo-endotheliale systeem (RES), die verantwoordelijk is voor de vangst van circulerende nanodeeltjes. De Kupffer cellen isolatiemethode hier gerapporteerd is gebaseerd op een 2-staps werkwijze perfusie gevolgd door zuivering op dichtheidsgradiënt. De werkwijze, gebaseerd op collagenase digestie en dichtheid centrifugatie wordt aangepast van het originele protocol ontwikkeld door Smedsrød et al. ontworpen voor rat levercellen isolation en levert hoge opbrengst (tot 14 x 10 6 cellen per muis) en een hoge zuiverheid (&gt; 95%) van Kupffer cellen. Deze isolatie methode vereist geen geavanceerde of dure apparatuur en vormt daarom een ​​ideale compromis tussen complexiteit en cel opbrengst. Het gebruik van zwaardere muizen (35-45 g) verbetert de opbrengst van de isolatiemethode en maakt daarnaast opmerkelijk de procedure van poortader canule. De toxiciteit van gefunctionaliseerde koolstofnanobuisjes f -CNTs gemeten in dit model de gemodificeerde LDH assay. Deze methode beoordeelt cellevensvatbaarheid door meting van het gebrek aan structurele integriteit van Kupffer celmembraan na incubatie met F -CNTs. Toxiciteit veroorzaakt door f -CNTs kunnen consequent worden gemeten met behulp van deze test, benadrukken dat geïsoleerde Kupffer cellen zijn nuttig voor de toxiciteit van nanodeeltjes testen. Het algemene begrip van nanotoxicologie kunnen profiteren van dergelijke modellen, waardoor de nanodeeltjes selectie voor klinische vertaling efficiënt.

Het aantal niet-gezuiverde parenchymcellen consistent was en varieerde tussen 8 en 14 x 10 6 cellen per muis (17 isolaties werden uitgevoerd). Elke muis contrast was voldoende om 16 tot 28 wells plaat. Cel levensvatbaarheid door trypan blauw kleuring toonden cellevensvatbaarheid ~ 95%. Kupffer cellen vertoonden een ronde vorm in 30 min incubatie bij 37 ° C, in verband met hun onvolledige hechtende morfologie (figuur 4A). Bij 4 uur incuberen en vervolgens werden de cellen uitgespreid en celclu...

Levermacrofagen, Kupffer-cellen genoemd, zijn verantwoordelijk voor het opvangen van circulerende nanodeeltjes. We beschrijven hier een methode, met hoge celzuiverheid en opbrengst, voor het isoleren van Kupffer-cellen. De gemodificeerde LDH-test wordt hier gebruikt om de toxiciteit veroorzaakt door koolstofnanoboortjes in Kupffer-cellen te meten.

Kupffer Cell Isolatie Nanoparticle toxiciteit testen

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om muis-Kupffer-cellen in grote aantallen te isoleren en te zuiveren om de toxiciteit van nanodeeltjes te bestuderen. Dit wordt bereikt door muizenlevers te perfunderen met een H-B-S-S-E-G-T-A-oplossing en een collageenoplossing om het leverweefsel voorzichtig te verteren. Vervolgens worden de levercellen gezuiverd via dichtheidscentrifugatie en selectieve adhesie om een cultuur van gezuiverde Kupffer-cellen te verkrijgen.Vervolgens wordt een flowcytometrie-analyse uitgevoerd om de zuiverheid en de zure F-eigenschappen van de cupfor-cellen te bevestigen. De resultaten tonen aan dat de toxiciteit van gefunctionaliseerde koolstofnanobuisjes kan worden gemeten in cupfor-cellen. Op basis van de gemodificeerde L-D-H-S-A wordt bevestigd dat dit model kan worden toegepast voor toxiciteitstesten van nanodeeltjes.De methode die we u vandaag willen tonen, kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de nanotoxicologie, zoals het beoordelen van de toxiciteit van onlangs ontwikkelde drugcarriers. Dit is van groot belang, aangezien de meeste gebruikte geïmmortaliseerde cellijnen eigenschappen vertonen die significant verschillen van de weefsels waaruit ze zijn afgeleid. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal. Wanneer de methode succesvol wordt uitgevoerd, resulteert dit in een hoge opbrengst en zuiverheid van ke-cellen, die vervolgens kunnen worden gebruikt als model om een reeks nanodeeltjes op toxiciteit te screenen.Nadat alle reagentia die vermeld staan in de tabel met materialen en reagentia bij het bijbehorende tekstprotocol vers zijn bereid, worden de E-G-T-A-H-B-S-S-oplossing en de collagenase-oplossing 30 minuten lang op 40 °C voorverwarmd; gebruik 70% ethanol om de flexibele pompslangen te spoelen. Giet vervolgens 40 mL E-G-T-A-H-B-S-S-oplossing in een centrifugebuis die in het waterbad is geplaatst en gebruik de voorverwarmde E-G-T-A-H-B-S-S om de flexibele pompslangen te spoelen. Na het euthanaseren van een CD1-muis, conform het tekstprotocol, worden de buikharen afgeschoren en wordt het buikoppervlak gedesinfecteerd met 70% ethanol.Bevestig de anesthesie door in de teen te knijpen. Snijd door de buikholte en leg de vena portae en de vena cava inferior vrij door de darmen naar de linkerzijde van de buik te verschuiven. Start de pomp op een snelheid van 1 tot 3 ml/min met E-G-T-A-H-B-S-S-oplossing en canuleer de vena portae met een 23 gauge vlinder naald; klem het gecanuleerde gedeelte van de vena portae af en zet vervolgens de sine-pincet vast op het oppervlak van de geopende buik van de muis.De lever moet binnen de eerste 30 seconden van de perfusie bleek worden; maak vervolgens snel een incisie in het onderste gedeelte van de vena cava inferior om te voorkomen dat er een overmatige druk in de lever wordt opgebouwd, en verhoog de stroomsnelheid geleidelijk naar 7 ml per minuut gedurende de eerste minuut van de perfusie. Wanneer er minder dan 5 ml EGTA-HBSS-oplossing over is in de centrifugebuis, voegt u 40 tot 50 ml collageen-A-oplossing toe en verhoogt u de stroomsnelheid vervolgens geleidelijk naar 10 ml per minuut gedurende 30 seconden.Laat de lever opzwellen door met een pincet periodiek druk uit te oefenen op de vena cava inferior in intervallen van 10 tot 32 seconden. Dit verbetert de celdissociatie en verkort de perfusietijd met collagenase. Wanneer er minder dan 10 milliliters collagenase-oplossing in de centrifugebuis overblijft, voegt u nog 40 tot 50 milliliters voorverwarmde collagenase-oplossing toe aan de buis.Zodra er 70 tot 80 milliliter is geperfuseerd, wordt met een pincet lichte druk op het oppervlak uitgeoefend. Een indrukkingsmerk geeft aan dat de levercellen gedissocieerd zijn. Verwijder de lever als één geheel uit de buikholte en plaats deze in een centrifugebuis met 20 tot 30 milliliter celisolatiemedium.Houd levercellen tot drie uur op ijs en voeg tot drie levers samen voor zuivering om voldoende cellen te verkrijgen. Plaats één geperfuseerde lever in een Petrischaal met 15 milliliter medium voor celisolatie en gebruik een schaar of pincet. Scheur het glanzende kapsel open en laat alle levercellen in het medium vrijkomen.Filtreer de oplossing door een cellenzeef van 100 micrometer in een centrifugebuis. Centrifugeer vervolgens de cel-suspensie bij 50 g bij vier graden Celsius gedurende twee minuten. Parenchymale cellen bevinden zich in het pellet en niet-parenchymale cellen bevinden zich in het supernatant.Verzamel het supernatant in een schone centrifugebuis en centrifugeer gedurende twee minuten bij 50 gs. Herhaal dit voor een totaal van vier overdrachten en centrifugeerstappen. Vervolg met de volgende centrifugeerstap.Centrifugeer de supernatant bij 1.350 g gedurende 15 minuten. Om de niet-parenchymale cellen te pelletteren, wordt de supernatant weggegooid en de pellet geresuspendeerd in 10 milliliter medium voor Kupffer-celisolatie. Voeg de oplossing met niet-parenchymale cellen toe aan de discontinuë 25-50% isotone gradiënt die eerder volgens het tekstprotocol is bereid en centrifugeer bij 850 g gedurende 15 minuten zonder versnelling of remming. Aspireer met een serologische pipette van 10 milliliter ongeveer 12 milliliter van de verrijkte Kupffer-celfractie, die troebel verschijnt binnen de 25% SIP-fractie nabij de interface tussen 25% en 50% SIP.Breng de cellen over naar een centrifugebuis met 35 tot 40 milliliters medium voor celisolatie en meng voorzichtig; centrifugeer vervolgens bij 1.350 ×g en vier graden Celsius om de cellen te pelletteren. Verwijder het supernatant en gebruik vijf tot 10 milliliters voorverwarmd medium om de cellen te resuspenderen. Tel de cellen met een hemocytometer en gebruik trypaanblauw-kleuring om de viabiliteit te meten. Plaats de gezuiverde niet-parenchymale cellen in 24-wells platen bij een dichtheid van 5 × 10⁵ cellen per well.Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2. Verwijder vervolgens voorzichtig het medium. Gebruik voorverwarmde HBSS om de cellen te wassen en vervang dit door 500 µL per well vers voorverwarmd celkweekmedium.Breng de cellen gedurende ten minste vier uur terug naar 37 °C om de cellen te laten hechten voordat de behandeling met nanodeeltjes plaatsvindt. Nadat de zuiverheid en fagocytische activiteit van de C4-cellen zijn gekarakteriseerd en de incubatie met gefunctionaliseerde koolstofnanobuisjes of fcts is uitgevoerd zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt het supernatant weggegooid en wordt er 200 µL lysisbuffer per putje toegevoegd. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 tot 60 minuten, pipetteer krachtig en verzamel de gelyseerde C4-cellen in microcentrifugebuisjes.Centrifugeer vervolgens bij 20,000 GS gedurende 10 minuten om de fcn ts die door de cellen zijn opgenomen samen met het celdebris neer te slaan. Verzamel het supernatant in microcentrifugebuisjes en bewaar dit bij -20 °C. Alternatief kan 50 µL worden overgebracht naar een 96-well plaat, waarna een gelijk volume substraatmengseloplossing uit de lactate dehydrogenase kit wordt toegevoegd.Voeg triplicaten toe van blanco wells met 50 microliters lysisbuffer en 50 microliters substraatmix-oplossing. Dek vervolgens de plaat af en incubeer deze 15 minuten bij kamertemperatuur voordat u 50 microliters stopoplossing toevoegt. Lees tot slot de absorbentie af bij 490 nanometers in een microplate reader en gebruik de volgende formule om het percentage celviabiliteit te berekenen.Deze figuur illustreert dat het aantal gezuiverde niet-parenchymale cellen varieert tussen 8 en 14 × 10⁶ cellen per muis en trian. Blauwe kleuring toonde een celviabiliteit van ongeveer 95% aan. Adherente cellen namen binnen 30 minuten incubatie een ronde vorm aan en na vier uur spreidden de cellen zich uit en begonnen er clusters te vormen, zoals hier te zien is.Cellen werden gekleurd met F4/80-antilichamen om de zuiverheid van de cellen aan te tonen, welke via flowcytometrie op boven de 95% werd vastgesteld. Bovendien wees flowcytometrische analyse na 12 uur kweek uit dat 85% van de cellen fagocytische activiteit vertoonde, gebaseerd op hun vermogen om fluorescerende beads van 1 µm op te nemen. Dit aantal daalde echter na 72 uur kweek, waarbij slechts 40% van de cellen fagocytisch was, zoals hier wordt getoond.Cellen die gedurende 24 en 72 uur waren geïncubeerd met gefunctionaliseerde koolstofnanobuisjes vertoonden vergelijkbare morfologieën in vergelijking met naïeve cellen. In tegenstelling hiermee vertoonden cellen die waren geïncubeerd met 10% DMSO, gebruikt als positieve controle, een necrotische morfologie; na analyse met de gemodificeerde LDH-assay vertoonden cellen die gedurende 24 en 72 uur waren behandeld met 10% DMSO een hoge toxiciteit in vergelijking hiermee. fcts veroorzaakten slechts een geringe maar significante afname van de celviabiliteit wanneer de cellen gedurende 72 uur werden blootgesteld aan 50 µg/mL. Met deze methode kunnen andere celgebaseerde SC en alle typen nanodeeltjes worden getest met behulp van geïsoleerde ke-cellen.Dit maakt het mogelijk om betrouwbare gegevens te verzamelen terwijl het gebruik van dieren wordt geminimaliseerd. We hopen dat deze techniek de weg kan vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van nanotechnologische psychologie om de veiligheid te screenen van de vele veelbelovende nanodragers die in toenemende mate worden ontwikkeld.

kupffer-cell-isolation-for-nanoparticle-toxicity-testing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een nieuwe methode om macrofagen te verkrijgen van de primaire cultuur van de levercellen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van de proliferatie van macrofagen in de cultuur, gevolgd door het schudden van de cultuur kolven en zuivering door middel van selectieve gehechtheid aan plastic schaaltjes. Deze techniek biedt een efficiënte lever macrofagen, zonder ingewikkelde apparatuur en vaardigheden.

Een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen Isolaat van Mixed primaire culturen van Adult levercellen

Hierin beschrijven we protocollen voor het oogsten van muizen-alveolaire macrofagen, die aangeboren immuunsysteem cellen woonachtig zijn in de longen, en de behandeling van hun activering in reactie op de co-cultuur met polyanhydride nanodeeltjes.

Oogsten Murine alveolaire macrofagen en evalueren van cellulaire activatie geïnduceerd door polyanhydride Nanodeeltjes

In this video, we demonstrate the isolation of Kupffer cells or liver macrophages from the mouse liver. The liver is perfused with a digestion solution followed by density gradient separation. The isolated adherent Kupffer cells can be used for further analysis.

Isolation and Culture of Mouse Kupffer Cells

This video demonstrates the isolation of lymphocytes, including natural killer cells or NK cells, from human liver tissue for selective expansion. Enzymatic and mechanical digestion, followed by density gradient separation, promotes lymphocyte isolation, including NK cells. The collected lymphocytes can be further used for the selective expansion of NK cells.

Natural Killer Cell Isolation from Liver Tissue for Selective Expansion

Analyse van nanodeeltjes interactie met gedefinieerde subpopulaties van immune cellen door flowcytometrie.

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Productie afvalwater (PBW) werd behandeld met cuprisch oxide nanodeeltjes (CuO-NP's) en cellulaire toxiciteit werd beoordeeld in gekweekte menselijke cellen. Het doel van dit protocol was om het native milieumonster te integreren in een celkweekformaat waarbij de veranderingen in toxiciteit als gevolg van CuO-NP behandeling werden beoordeeld.

Verwijdering van Trace Elements van Cupric Oxide Nanodeeltjes van Uranium<em&gt; In Situ</em&gt; Herstel Bleed Water en het effect op levensvatbaarheid van de cellen

Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

Microglia (immuuncellen van de hersenen), worden gebruikt als een surrogaat biosensor om te bepalen hoe nanodeeltjes neurotoxiciteit beïnvloeden. We beschrijven een reeks experimenten die zijn ontworpen om de microgliale respons op nanodeeltjes te meten en de blootstelling van hypothalamusneuronen aan supernatant van geactiveerde microglia om neurotoxiciteit te bepalen.

Microglia als een surrogaat Biosensor om te bepalen nanodeeltjes Neurotoxiciteit

Deze procedure werd vastgesteld om te worden gebruikt voor de ontwikkeling van geavanceerde 3D-leverculturen in vitro, die een meer fysiologisch relevante beoordeling kunnen bieden van de genotoxische gevaren die gepaard gaan met blootstelling aan nanomaterialen gedurende zowel acute als langdurige, herhaalde dosisschema's.

Geavanceerde 3D-levermodellen voor in vitro genotoxiciteitstests na langdurige blootstelling aan nanomaterialen

Dit artikel heeft tot doel een protocol te bieden voor de isolatie en kweek van primaire kanker-geassocieerde fibroblasten uit een syngenetisch muizenmodel van triple-negatieve borstkanker en hun toepassing voor de preklinische studie van nieuwe nanodeeltjes die zijn ontworpen om zich te richten op de tumormicro-omgeving.

Isolatie van primaire kanker-geassocieerde fibroblasten uit een syngenetisch muizenmodel van borstkanker voor de studie van gerichte nanodeeltjes

Hier presenteren we een niet-genetische methode om menselijke autologe leversferoïden te genereren met behulp van mononucleaire cellen geïsoleerd uit steady-state perifeer bloed.

Humane leversferoïden uit perifeer bloed voor leverziektestudies

Leer de isolatie van muizen Kupffer-cellen via leverperfusie en densiteitscentrifugatie voor nanodeeltjestoxiciteitstesten. Deze methode biedt hoge opbrengst en zuiverheid voor betrouwbaar onderzoek.

Kupffer Cell Isolatie Nanoparticle toxiciteit testen

Meer video's verkennen