Observatie van de Ciliaire Beweging van Choroid Plexus epitheelcellen Ex Vivo

Het algemene doel van het volgende experiment is om de beweging van choroïde Plexus epitheliale cellen, Celia ex vivo te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen uit een muizenembryo of -welp te verwijderen om het choroïde plexusweefsel te isoleren. De beweging van de cilia wordt gevisualiseerd door differentiële interferentiecontrast, ofwel DIC-microscopie, en vervolgens wordt een digitaal filmpje van de ciliaire toppen verkregen voor handmatig volgen van de posities van de ciliaire toppen.

Uiteindelijk worden de gereconstitueerde bewegingen van de toppen van de Celia gecategoriseerd en gekwantificeerd op basis van de patronen van hun bewegingen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de celbiologie, zoals Hoe wordt de mortaliteit van Celia tijdens de ontwikkeling geregeld, en hoe verandert het mobiliteitspatroon in de loop van de tijd? De implicatie van deze technieken is uitgebreide pathofysiologische analyse en diagnose.

Syrië geassocieerde ziekten omdat ons fundamentele begrip van kinetisch Syrië nog steeds prikkelt. Begin met het plaatsen van een 70% ethanol gespoelde neonatale muis, met het hoofd in ijskou liebovitz L 15 medium in een steriele 10 centimeter schaal onmiddellijk na onthoofding. Gebruik vervolgens een stel horlogemakertangen om de hoofdhuid van de schedel te verwijderen.

Snijd vervolgens de schedel open door middel van een mediane snede langs de longitudinale sutuur om de hersenen bloot te leggen, gevolgd door het doorsnijden van de hersenzenuwen om het hele orgaan te verzamelen. Breng de geïsoleerde hersenen over in een nieuwe schaal gevuld met vers ijs, koud medium, met de dorsale kant omhoog en plaats de schaal onder een stereomicroscoop. Richt vervolgens het weefsel zodanig dat de reukbollen op drie uur staan en grijpt de hersenen voorzichtig met de horlogemakertangen vast.

Gebruik met de andere hand fijne dissectietangen om de cerebellale poons te snijden die de hersenhelften met de hersenenstam verbinden. Knijp de Dion Cephalon uit om de hemisferen verder te scheiden en plaats de snede met de zijkant omhoog, gevolgd door het trekken aan de lamina afia om de laterale ventrikel choroïde plexus te verwijderen die aan de laterale kant van de hippocampus is bevestigd. Wanneer de choroïde plexus is geïsoleerd, brengt u het weefsel over naar een schaal van 35 millimeter met een glazen bodem die vers medium bevat en plaatst u een gewicht op het weefsel om het binnen 25 tot 60 minuten na de euthanasie voorzichtig op zijn plaats te houden. Begin met het levend beeldvormen van de choroïde plexus epitheliale cel Celia door het aanpassen van de focus van de objectieflens met het oog.

Stel de condensor zo in dat het centrum en de focus overeenkomen met de Kula-verlichting. Plaats vervolgens de juiste optische elementen in de lichtbaan om te voldoen aan de DIC-optiek. Verplaats de DIC-prisma om de contrast van de afbeeldingen aan te passen naar een positie waar de oppervlaktestructuur van het weefsel duidelijk herkend zal worden.

Schakel vervolgens de lichtbaan naar de videocamera en verhoog het lichtvermogen. Met het verwijderen van de neutrale dichtheidsfilters, pas een observatieveld en focus aan, stel de temporele resolutie van de videocamera in op 200 hertz en de belichtingstijd op 0,1 milliseconden voor de gewenste beeldvormingsperiode. Verkrijg vervolgens de beelden nadat de beeldstapel is verkregen, elk enkele frame zal een duidelijk beeld van Celia weergeven om handmatig de slagpatronen van elk cilium te volgen.

Gebruik de muisaanwijzer om de positie van de ciliaire toppen in elk frame te markeren. Gebruik vervolgens de juiste software om de baandata te analyseren en classificeer de banen in een van de twee bewegingsmodi heen en weer of rotatie met het oog. Bereken met behulp van de formule de ciliaire slagfrequentie voor meerdere ciliaire slagcycli.

Aangezien andere Celia op dezelfde cel de beweging van elk cilium kunnen interfereren. Vervolgens, om de angulaire uniformiteit van de ciliaire slagassen binnen een enkele cel te analyseren. Voor de heen en weer trajecten past u de posities van de Celia-tips aan een rechte lijn aan die theta definieert als de hoek die de lijn maakt met de X-as.

Voor de rotatie trajecten past u de posities aan een ellips aan die theta definieert als de hoek die de hoofdas van de ellips maakt met de x-as. Ten slotte, voor een kwantitatieve beschrijving van elk traject, draai de trajecten door theta en definieer hun aspectverhoudingen als de verhoudingen tussen de breedtes van hun verdeling langs de x- en y-as. In deze eerste clip wordt een topview van de choroïde plexus epitheliale cellen met Celia van een twee dagen oude muizenwelp weergegeven door hogesnelheidsvideomicroscopie. Het onregelmatige oppervlak van het choroïde plexusweefsel maakt het zichtbaar zowel in de scherpgestelde als de onscherpe vlakken.

In deze tweede clip wordt een vergroting weergegeven van het omkaderd gebied van de vorige film, waardoor een nadere observatie mogelijk is van de rotatie- en heen en weer bewegingen die door het individuele cilium worden vertoond. Hier worden de trajecten van representatieve ciliaire tip bewegingen gepresenteerd die zijn gerestitueerd uit filmopnames over meerdere cycli, met de tijdsverlopen van de x- en y-coördinaten van de tipposities geplot in de grafieken. Om een faseverschuiving tussen de twee coördinaten in deze grafieken te demonstreren, werden de x- en Y-coördinaten genormaliseerd en over elkaar heen gelegd.

Terwijl motiele CLIA gemakkelijk worden herkend door live beeldvorming, is het niet eenvoudig om de niet-motiele CLIA met deze methode te identificeren. Om deze moeilijkheid te overwinnen, kan scannen elektronenmicroscopie onmisbaar zijn voor het verkrijgen van volledige beelden van de clia ongeacht hun beweeglijkheid. Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om de dissectie snel genoeg uit te voeren zodat de versheid van het monster wordt behouden en de beweeglijkheid van Syrië wordt gehandhaafd.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u weefselmonsters kunt voorbereiden met virale granen