Name: Observatie van de Ciliaire Beweging van Choroid Plexus epitheelcellen Ex Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Leer de analyse van ciliaire beweging in choroid plexus epitheelcellen ex vivo bij muizenembryo's met differentiële interferentiecontrastmicroscopie. Deze methode categoriseert en kwantificeert ciliaire bewegingen voor inzicht in ontwikkelingsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een project voor particuliere universiteiten: bijdrage uit het fonds van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie (MEXT) van Japan (T.I.) en subsidies voor wetenschappelijk onderzoek (C) van MEXT (S.T. en K.N).

De protocollen en het gebruik van proefdieren werden goedgekeurd door de institutionele dierlijke zorg en gebruik van commissies aan de Universiteit van Yamanashi en Waseda University. Dierverzorging werd uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen. 1. CPEC Voorbereiding <ol><li> Bereid de volgende inrichtingen en materialen: een stereomicroscoop, bij voorkeur kunnen overbrengen verlichting van onderen; een paar van horlogemaker pincet (Dumont # 3 en # 4), vlam gesteriliseerd, rechte operationele schaar, vlam gesteriliseerd; twee steriele 10 cm plastic schaaltjes met 20 ml ijskoude Leibovitz L-15-medium; 35 mm glazen bodem gerechten met 2 ml RT Leibovitz L-15-medium; een bekerglas van 100 ml bevattende 70% ethanol; neonatale muis pups. </li><li> Kort dompelen een neonatale muis in 70% ethanol en snel euthanaseren door onthoofding met de operationele schaar. </li><li> Plaats de kop onmiddellijk in ijskoude Leibovitz L-15 medium in steriele 10 cm dish. </li><li> Verwijder het vel van de calvaria met het paar horlogemaker tang, opengesneden de schedel naar de hersenen bloot te leggen, en dan snijd de hersenzenuwen om de hele hersenen te isoleren. </li><li> Breng de hersenen om een ​​nieuwe schotel met ijskoude Leibovitz L-15-medium en observeren onder de stereo-microscoop, om ervoor te zorgen dat de hersenen volledig is ondergedompeld in het medium. </li><li> Stel het dorsale aspect van de hersenen naar boven en oriënteren de hersenen, zodat de olfactorische bollen wonen op de drie uur positie (voor rechtshandige personen). Houd de hersenen voorzichtig met de tang in de linkerhand. </li><li> Met behulp van de fijne dissectie pincet (Dumont # 3 en # 4) in de rechterhand, snijd het corpus callosum en onder de parenchym aansluiten van de hersenhelften, langs de longitudinale spleet van de grote hersenen. </li><li> Duw de hersenhelften weg aan de zijkanten en de dwarse cerebrale spleet bloot te leggen. </li><li> Scheid de hersenhelften door knijpen uit the parenchym tussen de halve bol en thalamus. </li><li> Trek de laterale ventriculaire choroid plexus, dat aan de zijkant van de hippocampus wordt bevestigd door de lamina affixa. </li><li> Breng de geïsoleerde choroid plexus naar de 35 mm glazen onderste schaal met vers Leibovitz L-15 medium, en overtrek gewicht (Materials List) langzaam aan het weefsel op zijn plaats. </li></ol> 2. Live-Imaging van CPEC Cilia <ol><li> Bevestig juiste ultraviolet (UV) en afgeleid (IR) cut filter (s) te blokkeren licht korter dan 400 nm en langer dan 700 nm, en dat neutrale dichtheid (ND) filters (25% en 6%) worden in het lichtpad geplaatst van de geïnverteerde microscoop. </li><li> Pas de scherpstelling van het objectief ruwweg op het oog, en pas vervolgens de condensor, zodat het centrum en de focus te voldoen aan de Köhler verlichting. Plaats een passende differentiële interferentie contrast (DIC) prisma, een DIC element, evenals analyzer polarisator elementen in de liGHT weg om te voldoen aan de DIC optiek. </li><li> Pas het contrast gezien door het prisma positie DIC zodat de structuur van het weefsel oppervlak meest herkenbare. Als alle cilia van de doelcellen beweeglijk kan een duidelijk beeld beweeglijke cilia niet worden verkregen op door hun beweging. </li><li> Verander het lichtpad om de video camera, en verwijder de ND filters om het licht macht te vergroten. </li><li> Gebruik de camera in richtmodus het gezichtsveld en scherp te stellen. Tijdens het scherpstellen, waarin videobeelden worden weergegeven op real-time op het scherm, een duidelijk beeld van beweeglijke cilia is niet beschikbaar. </li><li> Gebruik de camera op 200 Hz met een belichtingstijd van 0,1 msec voor de gewenste periode (seconden tot minuten). Na de overname van het beeld stack, zal enkele frames duidelijke trilharen structuren weer te geven. Als ciliary randen zijn vaag, verhoging van de frame rate of gebruik een kortere belichtingstijd. </li><li> Noteer de beweging van CPEC cilia binnen 25-60 minuten na euthanasie in LeibovitzL-15 medium. </li></ol> 3. Analyse van Ciliaire Motion <ol><li> Handmatig bijhouden slaan patronen van elk cilium op het computerscherm. Mark ciliary tip posities in elk frame met de muisaanwijzer, die worden geassembleerd voor traject informatie van elk cilium. Ofwel analyseren de baan informatie met behulp van dezelfde software of de uitvoer naar andere, meer algemene toepassingen voor verdere analyse. De efficiëntie van deze analysestap wordt beschreven in de discussie. </li><li> Classificeren de trajecten in twee vormen van beweging, heen-en-weer of rotatie, door het oog. </li><li> Bereken de ciliaire kloppende frequentie (CBF) volgens de volgende formule: [CBF = (het aantal frames per seconde) / (gemiddeld aantal frames voor een enkele slag)] 14, dat kan worden verkregen uit een ciliaire tip motion diagram (Figuur 3 ). Herhaal deze berekening voor meerdere cycli ciliaire slaan, omdat andere cilia op dezelfde cel kan interfereren met de beweging van elk cilium, waardoor onregelmatigheden. </li><li> Om de hoek uniformiteit van de ciliaire slaan assen in één cel te analyseren, definiëren het kloppende hoek θ elke bal (figuur 4). Voor back-en-weer trajecten, past de posities van de trilharen tip om een rechte lijn, en definieer θ als de hoek van de lijn maakt met de x-as. Bij roterende trajecten, past de positie van een ellips, en definieert θ de hoek van de lange as van de ellips maakt met de x-as. Details van de fitting worden beschreven in de sectie Representatieve resultaten. </li><li> Voor kwantitatieve beschrijving van elk traject, berekenen algemene aspect ratio AR. In het kort, roteren het traject van - θ en AR definiëren als de verhouding tussen de breedte van de langsheen x - en y -axes (figuur 4B). Details worden in de representatieve resultaten sectie, en de interpretatie, Significantie en de beperking van de parameter worden beschreven in de discussie. </li></ol> 4. Monstervoorbereiding voor SEM Let op: SEM is een belangrijke methode om de status van de cilia op CPECs op een alomvattende manier te evalueren. Specimens voor SEM te bereiden, een standaard procedure eerder gerapporteerd 15 wordt gebruikt met lichte wijzigingen. <ol><li> Voor ontleden het weefsel uit de hersenen, bereidt het fixeermiddel in een 5 ml glazen flacon met polyethyleen dop. Het fixeermiddel bestaat uit 2% paraformaldehyde, 2,5% glutaraldehyde (half Karnovsky&#39;s oplossing 16) in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4. </li><li> Ontleden het weefsel van de hersenen zoals beschreven in stap 1. </li><li> Kort spoel de geïsoleerde weefsel met Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) in een nieuwe schaal en bevestig het weefsel in het fixeermiddel in het glazen flesje gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Gebruik wegwerp overdracht pipetten en omgaan met de exemplaren gently. Na spoelen in HBSS, het weefsel kleverig. <ol><li> Om de monsters te zetten in de fixeeroplossing langzaam verdrijven een kleine hoeveelheid oplossing die het weefsel van de pipet een druppel en aan het fixeermiddel. </li></ol></li><li> Na fixatie, gooi het fixeermiddel en spoel het weefsel met fosfaatbuffer driemaal. </li><li> Dompel het weefsel in een 10% sucrose-oplossing te spoelen de resterende aldehyden. Om volledige verwijdering van aldehyden waarborgen, dompel de monsters in de oplossing gedurende 10 minuten en herhaal vervolgens tweemaal met vers 10% sucrose. Deze stap is belangrijk om goede post-fixatie in opeenvolgende stappen. </li><li> Dompel het weefsel in een oplossing van 1% osmiumtetroxide in fosfaatbuffer gedurende 30 min en vervolgens op ijs te plaatsen voor post-fixatie. Oordelen over de mate van osmification door het monster kleur: wanneer aldehyden volledig worden verwijderd, het monster is zwart. </li><li> Was het achteraf vaste weefselmonsters uitgebreid met dubbele distilled water een paar keer. </li><li> Uitdrogen de monsters door onderdompeling in gegradeerde concentraties ethanol, gewoonlijk 65%, 75%, 85%, 95%, 99% en 100%, gedurende 10 minuten elk. Verkrijgen watervrij ethanol door het plaatsen van moleculaire zeven in 99,5% ethanol uit een nieuw aangeschafte fles. Herhaal dehydratie met watervrij ethanol drie keer. </li><li> Plaats de gedehydrateerde monsters in isoamylacetaat, wisselen reagens voor kritische punt gedroogd, gedurende 10 min. Herhaal deze stap twee keer. Dit reagens snel verdampt en het monster kan droog worden, wat resulteert in vernietiging door oppervlaktespanning. Daarom is niet het monster volledig opdrogen. </li><li> Na de laatste uitwisseling van isoamylacetaat, verwijder het grootste deel van het oplosmiddel, onmiddellijk wikkel de open glazen flacon met aluminiumfolie en plaats de flacon op droog ijs. Met behulp van een naald of fijne tang, maken verschillende gaten in de folie die de monding van de fiool, zodat vloeistof koolstofdioxide gemakkelijk stroomt in de injectieflacon in het kritische punt droger. Ga naar de volgende stapzo snel mogelijk. </li><li> In deze stap, het minimaliseren van de overdracht van isoamylacetaat in de kamer van de droger, maar laat het monster uit te drogen voordat kritisch punt drogen. Bovendien, niet het monster op droogijs onnodig lang aan de vorming van ijs op de flacon voorkomen verlaten. </li><li> Breng de folie verpakte glazen flacon met weefselmonsters in het kritische punt droger die zorgt voor de oppervlaktestructuur van het weefsel blijft intact onder verwijdering van water in het weefsel. Gedetailleerde informatie over de bediening van het kritische punt droger is verkrijgbaar bij instructies van de fabrikant. </li><li> Behandel de monsters voorzichtig met een tandenstoker om mechanische schade te minimaliseren. De verkregen gedroogde weefselmonsters zijn kwetsbaar. Monteer de monsters op metalen stompjes en jas met goud-palladium met behulp van een ion sputter. </li></ol> 5. Observation door SEM <ol><li> Observeren door SEM en beelden opnemen met een digitale camerauitgerust met scanning elektronenmicroscoop. </li><li> Transfer digitale beeldgegevens naar een PC voor analyse. </li></ol>

<ol><li>Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+ciliary+motility+on+choroid+plexus+epithelial+cells+during+the+perinatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period.</a> Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).</li>
<li>Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+cilia+in+developmental+disorders+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The roles of cilia in developmental disorders and disease.</a> Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).</li>
<li>Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+cilia+go+bad%3A+cilia+defects+and+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).</li>
<li>Oh, E. C., Katsanis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+in+vertebrate+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cilia in vertebrate development and disease.</a> Development. 139 (3), 443-448 (2012).</li>
<li>Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+cilia+of+human+airway+epithelia+are+chemosensory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory.</a> Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).</li>
<li>Kiprilov, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+in+culture+possess+primary+cilia+with+hedgehog+signaling+machinery%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery).</a> The Journal of Cell Biology. 180 (5), 897-904 (2008).</li>
<li>Hirokawa, N., Tanaka, Y., Okada, Y., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+flow+and+the+generation+of+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal flow and the generation of left-right asymmetry.</a> Cell. 125 (1), 33-45 (2006).</li>
<li>Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+multiple+primary+cilia+reveals+a+novel+mode+of+ciliary+development+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals.</a> Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).</li>
<li>Takeda, S., Narita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+vertebrate+cilia%2C+towards+a+new+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy.</a> Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).</li>
<li>Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+polyglutamylation+is+essential+for+airway+ciliary+function+through+the+regulation+of+beating+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).</li>
<li>Foster, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+ciliary%2Fflagellar+beating+of+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the ciliary/flagellar beating of Chlamydomonas.</a> Methods in Cell Biology. 91, 173-239 (2009).</li>
<li>Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+digital+imaging+of+ependymal+cilia+in+the+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain.</a> Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).</li>
<li>Okada, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+nodal+cilia+movement+and+measurement+of+nodal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow.</a> Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).</li>
<li>Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beat+pattern+is+associated+with+specific+ultrastructural+defects+in+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetry+and+kinesin+superfamily+protein+KIF3A%3A+new+insights+in+determination+of+laterality+and+mesoderm+induction+by+kif3A-%2F-+mice+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis.</a> The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).</li>
<li>Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolarity+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen. Dit artikel is gericht op de rapportage uitvoerige methodologie om de beweeglijkheid van de trilharen in acht geïsoleerde choroid plexus weefsels. Wetenschappelijke nieuwigheden zijn gemeld in eerdere studies 1,8.

Perspectieven van deze methode Hoewel de hier beschreven techniek biedt geen nadere analyse van cilia dan eerder gepubliceerde methoden, het belang van deze techniek ligt in de eenvoud van het systeem en kosteneffectiviteit, die gemakkelijk kan worden toegepast op het screenen van elk soort ciliaire motiliteit ex vivo. In het bijzonder, TI Workbench biedt een eenvoudige en gebruiksvriendelijke interface die de onderzoekers in staat stelt om te observeren en gemakkelijker te analyser...

Cilia zijn haarachtige uitsteeksels op het oppervlak van de meeste gewervelde cellen, die de aandacht hebben getrokken van medische onderzoekers vanwege een klasse ziekten die ciliopathieën worden genoemd2–4. Ondanks de alomtegenwoordigheid van het orgaan, is er een grote verscheidenheid aan ciliaire functies gerapporteerd, waaronder beweeglijkheid en biosensing. Bijvoorbeeld, beweeglijke cilia op het mucoepitheliale oppervlak transporteren slijm5 en epitheelresten naar de uitgang van tractussen, waardoor ziekte wordt voorkomen door het oppervlak van epitheel te reinigen. Bovendien, tijdens vroege ontwikkelingsperioden en embryonale stadia, reguleren cilia de proliferatie van stamcellen6 en zijn betrokken bij de bepaling van de links-rechts asymmetrie van het gewervelde lichaam7. 
Choroid plexus epitheelcellen (CPEC's) zijn derivaten van neuroepitheliale cellen die het oppervlak van het choroïde plexusweefsel in de hersenen bedekken, die belangrijke rollen spelen bij het handhaven van de homeostase van de intracraniale omgeving door productie van hersenvocht (CSF). Het is eerder aangetoond dat CPEC's meerdere niet-beweeglijke cilia hebben die de productie van CSF reguleren via G-proteïnegekoppelde receptoren die specifiek geconcentreerd zijn op de cilia8. Hoewel deze cilia als rustige niet-beweeglijke cilia werden beschouwd, werd ontdekt dat sommige CPEC-cilia een voorbijgaande beweeglijkheid vertonen tijdens de neonatale periode1. Deze bevinding was belangrijk omdat het aantoonde dat zogenaamde niet-beweeglijke cilia niet noodzakelijkerwijs onbeweeglijk zijn vanaf het begin van de ontwikkeling en mogelijk een voorbijgaande beweeglijkheid tijdens specifieke tijdsvensters kunnen vertonen, mogelijk als reactie op specifieke fysiologische eisen en functies9. Om de beweeglijke aard van CPEC-cilia precies te beschrijven, is het noodzakelijk om een ex vivo observatiesysteem te ontwikkelen dat de analyse van de kinetische profielen die uniek zijn voor CPEC-cilia omvat. 
Met betrekking tot beweeglijkheid, hoewel verschillende technische rapporten observaties van de beweeglijke cilia van het tracheaal epitheel5,10, beweeglijke enkelcellige flagellen11, zogenaamde conventionele beweeglijke cilia12 en nodal cilia13 hebben beschreven, zijn gedetailleerde analytische methoden die toepasbaar zijn op relatief onregelmatige structuren zoals het choroïde plexus tot nu toe niet goed gedocumenteerd. Bovendien is een hoge tijdresolutie vereist om de ciliaire beweging van CPEC's te analyseren, waarbij dure hogesnelheidscamera's onmisbaar zijn. Om deze noodzaak te omzeilen en het monitoren van de ciliaire beweeglijkheid van verschillende celtypen te vereenvoudigen, is een goedkope, hogesnelheidscamera geïntroduceerd en is een gemakkelijk toegankelijke en handige methode ontwikkeld om de beweeglijkheid van beweeglijke cilia op te nemen, met name om de snelheid en het bewegingspatroon van elk cilium te beschrijven1. Bovendien is originele beeldanalysesoftware "TI Workbench" hier gebruikt om gedetailleerde analyse van de beweeglijkheid te vergemakkelijken. Gezamenlijk biedt deze methode een nieuwe beknopte strategie om ciliaire beweging te analyseren samen met correlatieve scanning elektronenmicroscopie (SEM), die kan worden toegepast in een breed scala van ciliumonderzoek.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Vereiste reagentia</td></tr><tr><td colspan="4">voor live celbeeldvorming</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">voor SEM-voorbereiding</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Hank's balanced salt solution</td><td>Life Technologies</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehyde&nbsp;</td><td>Nacalai tesque</td><td>17003-05</td><td></td></tr><tr><td>isoamyl acetate</td><td>Nacalai tesque</td><td>02710-95</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Sieves 4A 1/8&nbsp;</td><td>Wako Chemicals</td><td>130-08655</td><td>voor de bereiding van watervrij ethanol</td></tr><tr><td>fosfaat bufferoplossing (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>fosfaat buffer, 0.1 M</td><td></td><td></td><td>Om 100 ml te maken, meng 19.0 ml van 0.1&nbsp;M NaH2PO4 en 81.0 ml van 0.1&nbsp;M Na2HPO4</td></tr><tr><td>mononatriumfosfaat (dihydraat)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31718-15</td><td></td></tr><tr><td>dinatriumfosfaat (watervrij)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31801-05</td><td></td></tr><tr><td>suclose</td><td>Nacalai tesque</td><td>30406-25</td><td></td></tr><tr><td>osmiumtetraoxide</td><td>Nisshin EM</td><td>300</td><td></td></tr><tr><td>droog ijs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Gereedschap en materialen voor dissectie</td></tr><tr><td colspan="4">voor zowel live beeldvorming als SEM-voorbereiding</td></tr><tr><td>stereomicroscoop</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>platte papieren handdoek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Phi;10 cm plastic schaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 ml beker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rechte operatieschaart</td><td>Sansyo</td><td>S-2B</td><td></td></tr><tr><td>horlogemakerstangen</td><td>Dumont</td><td>No.DU-3 of -4, INOX</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">voor live celbeeldvorming</td></tr><tr><td>glasbodemschaal</td><td>Matsunami Glass</td><td>D110300</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">voor SEM-voorbereiding</td></tr><tr><td>aluminiumfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml glazen vial met polyethyleen dop</td><td>Nichiden Rika-Glass</td><td>PS-5A</td><td></td></tr><tr><td>transferpipet</td><td>Samco Scientific</td><td>SM251-1S</td><td>voor monstersoverdracht</td></tr><tr><td>tandenstoker</td><td></td><td></td><td>voor monstersoverdracht</td></tr><tr><td>ion sputter met goud-palladium</td><td>Hitachi</td><td>E-1030</td><td></td></tr><tr><td>kritische puntdroger</td><td>Hitachi</td><td>HCP-2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Microscopisch apparatuur en materialen</td></tr><tr><td colspan="4">voor live celbeeldvorming</td></tr><tr><td>invertede microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>100 W kwiklamphuisvesting en voeding</td><td>Olympus</td><td>U-ULH en BH2-RFL-T3</td><td></td></tr><tr><td>100 W kwiklamp</td><td>Ushio</td><td>USH103D</td><td></td></tr><tr><td>DIC condensor, n.a. 0.55</td><td>Olympus</td><td>IX-LWUCD</td><td></td></tr><tr><td>elektrische sluiter</td><td>Vincent Associates</td><td>VS35S22M1R3-24 en VMM-D1</td><td>manuele sluiter kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>bandpass filter (400-700&nbsp;nm, &Phi;45&nbsp;mm)</td><td>Koshin Kagaku</td><td>C10-110621-1</td><td></td></tr><tr><td>ND filter (&Phi;45 mm)</td><td>Olympus</td><td>45ND6, 45ND25</td><td>combinatie van 25% en 6% ND filters worden gebruikt</td></tr><tr><td>objectieflens (water immersie) met DIC element</td><td>Olympus</td><td>UApo 40XW/340, n.a., 1.15 met IX-DPAO40</td><td></td></tr><tr><td>hoge snelheidsvideocamera</td><td>Allied Vision Technologies</td><td>GE680</td><td>&#8805;200 Hz frame rate en 1 msec sluitertijd</td></tr><tr><td>beeldverwerving / analyse software</td><td>in-house software</td><td>TI Workbench</td><td>geschikt voor acquisitie met hoge frame rates.</td></tr><tr><td>PC voor camera controle / analyse</td><td>Apple</td><td>Mac Pro</td><td></td></tr><tr><td>vibratie isolatie tafel</td><td>Meiritsu Seiki</td><td>AD0806</td><td></td></tr><tr><td>gewicht voor weefsel</td><td>Warner Instruments</td><td>slice anchor kits</td><td>Het kan worden gemaakt met nylon gaas dat aan een U-vormige samengedrukte &Phi;0.5&nbsp;mm platinadraad is vastgelijmd.</td></tr><tr><td>dekglas (alternatief gewicht voor weefsel)</td><td>Matsunami</td><td>op bestelling</td><td>Een dekglas kan worden gebruikt als weefselgewicht.</td></tr><tr><td colspan="4">voor SEM</td></tr><tr><td>invertede microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>scannende elektronenmicroscoop</td><td>JEOL</td><td>JSM-6510</td><td></td></tr></tbody></table>

observatie van de ciliaire beweging van choroid plexus epitheelcellen<em&gt; ex vivo</em

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

De choroïdale plexus bevindt zich in de ventrikelwand van de hersenen, waarvan de belangrijkste functie wordt geacht de productie van hersenvocht te zijn. Epitheelcellen van de choroïdale plexus (CPEC's) die het oppervlak van het choroïdale plexusweefsel bedekken, herbergen meerdere unieke trilharen, maar de meeste functies van deze trilharen moeten nog worden onderzocht. Om de functie van CPEC-trilhaartjes te ontdekken, met bijzondere aandacht voor hun beweeglijkheid, werd een ex vivo observatiesysteem ontwikkeld om de trilhaarbeweeglijkheid tijdens embryonale, perinatale en postnataal perioden te monitoren. De choroïdale plexus werd uit de hersenventrikel gedissecteerd en onderzocht onder een video-verbeterde contrastmicroscoop, uitgerust met differentieel interferentiecontrast-optica. Onder deze omstandigheden werd een eenvoudige en kwantitatieve methode ontwikkeld om de beweeglijkheidsprofielen van CPEC-trilhaartjes gedurende enkele uren ex vivo te analyseren. Vervolgens werden de morfologische veranderingen van trilharen tijdens de ontwikkeling waargenomen door middel van rasterelektronenmicroscopie om de relatie tussen de morfologische rijpheid van trilharen en beweeglijkheid te verduidelijken. Interessant is dat deze methode veranderingen in het aantal en de lengte van trilharen kon bepalen, die op postnataal dag (P) 2 een piek bereikten, terwijl de slagfrequentie een maximum bereikte op P10, gevolgd door abrupte stopzetting op P14. Deze technieken zullen de verheldering van de functies van trilharen in verschillende weefsels mogelijk maken. Hoewel verwante technieken in een eerder rapport zijn gepubliceerd1, richt de huidige studie zich op gedetailleerde technieken om de beweeglijkheid en morfologie van CPEC-trilhaartjes ex vivo te observeren.

Een overzicht van de werkstroom wordt getoond in figuur 1, inclusief afbeeldingen van de inrichtingen. Live beweging observaties van CPECs Film 1 toont een film van CPECs geïsoleerd uit een perinatale muis en film 2 is een uiteengenomen aanzicht van de beelden in film 1. Opgemerkt wordt dat individuele ciliaire tips zijn minder duidelijk in foto&#39;s vergeleken met die van films. Figuur ...

In dit onderzoek werd een gedetailleerde lichtmicroscopische techniek geoptimaliseerd voor real-time observatie en analyse van de beweging van CPEC cilia ex vivo samen met een elektronenmicroscopische methode voor ultrastructurele analyse.

Observatie van de Ciliaire Beweging van Choroid Plexus epitheelcellen<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de beweging van de cilia van epitheelcellen van de plexus choroidea ex vivo te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen uit een muizenembryo of een pup te verwijderen om het weefsel van de plexus choroidea te isoleren. De ciliaire beweging wordt gevisualiseerd met behulp van differentiële interferentiecontrastmicroscopie, of DIC-microscopie, waarna een digitale film van de ciliaaire uiteinden wordt opgenomen voor het handmatig volgen van de posities van de ciliaaire tips.Uiteindelijk worden de gereconstitueerde bewegingen van de cilia-tips gecategoriseerd en gekwantificeerd op basis van hun bewegingspatronen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de celbiologie, zoals hoe de mortaliteit van cilia tijdens de ontwikkeling wordt gereguleerd en hoe het mobiliteitspatroon in de loop van de tijd verandert. De implicaties van de reikwijdte van deze technieken strekken zich uit tot pathofysiologische analyse en diagnostiek.Ziekten geassocieerd met Syrië, aangezien ons fundamentele begrip van kinetisch Syrië nog steeds beperkt is. Begin met het plaatsen van een met 70% ethanol gespoelde pasgeboren muis, met de kop in ijskoud Liebowitz L 15-medium in een steriele schaal van 10 centimeter, direct na decapitatie. Gebruik vervolgens een horlogemakerspincet om de hoofdhuid van de schedel te verwijderen.Snijd vervolgens de schedel open via een mediane sectie langs de longitudinale naad om de hersenen bloot te leggen, gevolgd door het doorknippen van de hersenzenuwen om het gehele orgaan te oogsten. Verplaats de geïsoleerde hersenen naar een nieuw schaaltje gevuld met vers, ijskoud medium, met de dorsale zijde naar boven, en plaats het schaaltje onder een stereomicroscoop. Orienteer het weefsel vervolgens zodanig dat de bulbi olfactorii op drie uur positie staan en pak de hersenen voorzichtig vast met de horlogemakerspincet.Gebruik met de andere hand fijne dissectiepincetten om de cerebrale verbindingen tussen de cerebrale hemisferen en de cerebrale stam door te snijden. Knijp de Dion Cephalon uit om de hemisferen verder te scheiden en plaats het snijvlak naar boven, waarna de lamina afia wordt teruggetrokken om de choroid plexus van de laterale ventrikels te verwijderen die aan de laterale zijde van de hippocampus is bevestigd. Zodra de choroid plexus is geïsoleerd, wordt het weefsel overgebracht naar een schaaltje met een glazen bodem van 35 millimeter met vers medium, en wordt er een gewichtje op het weefsel geplaatst om het voorzichtig op zijn plaats te houden. Binnen 25 tot 60 minuten na de euthanasie wordt de live-imaging van de epitheelcellen van de choroid plexus gestart door de focus van de objectieflens visueel aan te passen.Stel de condensor zo in dat het centrum en de focus overeenstemmen met de Köhler-verlichting. Plaats vervolgens de juiste optische elementen in de lichtweg om deze aan te passen aan de DIC-optiek. Verplaats het DIC-prisma om het contrast van de beelden aan te passen naar een positie waarin de oppervlaktestructuur van het weefsel duidelijk herkenbaar is.Schakel vervolgens het lichtpad over naar de videocamera en verhoog het lichtvermogen. Pas na het verwijderen van de neutrale dichtheidsfilters het observatieveld en de focus aan, waarbij de temporele resolutie van de videocamera op 200 hertz wordt ingesteld en de belichtingstijd op 0,1 milliseconden voor de gewenste beeldvormingsperiode. Neem vervolgens de beelden op; nadat de beeldenstack is verkregen, zal elk afzonderlijk frame een duidelijk beeld van de cilia tonen om de slagpatronen van elk cilium handmatig te volgen.Gebruik de muisaanwijzer om de positie van de ciliaire uiteinden in elk frame te markeren. Analyseer vervolgens de trajectgegevens met behulp van de passende software en classificeer de trajecten visueel in een van de twee bewegingsmodi: heen en weer of rotationeel. Bereken met behulp van de formule de ciliaire slagfrequentie voor meerdere ciliaire slagcycli.Omdat andere cilia op dezelfde cel de beweging van elk individueel cilium kunnen beïnvloeden, wordt vervolgens de hoekuniformiteit van de slagassen van de cilia binnen een enkele cel geanalyseerd. Voor de heen-en-weertrajecten worden de posities van de cilia-toppen gefit op een rechte lijn, waarbij theta wordt gedefinieerd als de hoek die de lijn maakt met de X-as.Pas voor de rotationele trajecten de posities aan op een ellips, waarbij theta wordt gedefinieerd als de hoek die de hoofdas van de ellips maakt met de x-as. Draai ten slotte, voor een kwantitatieve beschrijving van elk traject, de trajecten met theta en definieer hun aspectratio's als de verhoudingen tussen de breedtes van hun distributie langs de x-as en y-as. In dit eerste fragment wordt een bovenaanzicht getoond van de epitheelcellen van de plexus choroideus met Celia van een muizenpup van twee dagen na de geboorte, in beeld gebracht via high-speed videomicroscopie; het onregelmatige oppervlak van het weefsel van de plexus choroideus maakt dit zichtbaar in zowel de in-focus als out-of-focus vlakken.In dit tweede fragment wordt een vergroot beeld getoond van het omkaderde gebied uit de vorige film, waardoor een nauwkeurigere observatie mogelijk is van de rotatie- en heen-en-weergaande bewegingen van het individuele cilium. Hier worden de trajecten van representatieve bewegingen van de ciliaire tip, gereconstitueerd uit filmopnamen over meerdere cyclen, gepresenteerd, waarbij de tijdsvolgorde van de x- en y-coördinaten van de tipposities in de grafieken is uitgezet. Om een faseverschuiving tussen de twee coördinaten in deze grafieken aan te tonen, werden de x- en y-coördinaten genormaliseerd en over elkaar heen gelegd.Hoewel beweeglijke CLIA's gemakkelijk te herkennen zijn via live-imaging, is het niet eenvoudig om niet-beweeglijke CLIA's met deze methode te identificeren. Om deze moeilijkheid te overwinnen, kan scanning-elektronenmicroscopie onmisbaar zijn voor het verkrijgen van volledige beelden van de clia, ongeacht hun beweeglijkheid. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de dissectie snel genoeg uit te voeren, zodat de versheid van het monster wordt behouden en de beweeglijkheid van Syria wordt gehandhaafd.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u weefselmonsters met viraal sereel klaarmaakt, evenals hoe u de mortaliteit van de CX vivo monitort en kwantificeert.

observation-ciliary-movement-choroid-plexus-epithelial-cells-ex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the development of an ex vivo model of choroidal sprouting to study ocular microvascular angiogenesis. The assay involves culturing mouse eye explants containing the choroid tissue attached to the sclera and retinal pigment epithelium under specific conditions that promote choroidal microvascular sprouting.

Choroid Sprouting Assay to Study Ocular Microvascular Proliferation Ex Vivo

This video demonstrates the procedure of isolating immune cells from mouse choroid plexuses. This procedure is used in neuroimmunology research to understand how immune cells in the choroid plexuses impact brain health and various neurological diseases.

Isolating Immune Cells from Mouse Choroid Plexuses

Source: Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2015). This video demonstrates a live-imaging technique using differential interference contrast (DIC) microscopy to observe the beating of ependymal cilia in sagittal mouse brain sections. Ependymal cilia propel cerebrospinal fluid (CSF), and their activity is recorded in brain sections maintained in a nutrient-rich medium and imaged in a climate-controlled chamber.

Live Imaging of Ependymal Cell Ciliary Activity in a Mouse Brain Section

Source: Van Wonterghem, E., et al. Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the preparation and imaging of choroid plexus tissue from a mouse brain using scanning electron microscopy (SEM). The process includes tissue fixation, dehydration, and coating with a conductive platinum layer to stabilize and prepare the sample for imaging. SEM captures detailed images of epithelial cells with...

Visualization of a Mouse Brain Choroid Plexus Using Scanning Electron Microscopy

Met behulp van hoge-resolutie differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie, is een ex vivo observatie van de afstraffing van beweeglijke ependymale cilia gelegen binnen de hersenen van muizen ventrikels aangetoond live-imaging. De techniek maakt een opname van het unieke ciliaire slaan frequentie en hoek slaan en hun intracellulaire calcium oscillatie stimulatie eigenschappen.

Live-Imaging van de Ependymale Cilia in de laterale ventrikels van de hersenen van muizen

De epitheliale cellen van de choroïdale plexus (CP) vormen de bloed-hersenwaterbarrière (BCSFB). Een in vitro model van de BCSFB gebruikt humane choroïdale plexuspapilloom (HIBCPP) cellen. Dit artikel beschrijft het kweken en basolaterale infectie van HIBCPP cellen met behulp van een cellencultuur filterinzetsysteem.

Een Choroid Plexus Epitheliale-Cell gebaseerde model van het menselijk bloed-cerebrospinale vloeistof Barrier om bacteriële infectie studie uit het basolaterale Side

Het doel van dit protocol is om aan te tonen dat het kweken van retinale pigment epitheliale (RPE) cellen op leeftijd en/of zieke mens Bruch membraan. Deze methode is geschikt om te bestuderen het gedrag van de cel van de RPE op een gecompromitteerde extracellulaire matrix.

Kweken van de epitheliale cellen van de retinale Pigment op een Ex Vivo Model van leeftijd menselijke Bruch membraan

Het doel van dit protocol is het karakteriseren van een nieuw model van glaucoomneurodegeneratie op basis van 360° thermische cauterisatie van de limbale vasculaire plexus, die subacute oculaire hypertensie induceert.

Volledige cirkel Cauterisatie van limbale vasculaire plexus voor chirurgisch geïnduceerd glaucoom bij knaagdieren

Deze studie maakt gebruik van flowcytometrie en twee verschillende gating-strategieën op geïsoleerde perfused muizen hersenen choroïde plexussen; dit protocol identificeert de belangrijkste immuuncelsubsets die deze hersenstructuur bevolken.

Isolatie en karakterisering van de immuuncellen van micro-ontleedde muischoroïde plexussen

De choroïde plexus (CP), een onderbelicht weefsel in de neurowetenschappen, speelt een sleutelrol in de gezondheid en ziekte van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft een microdissectietechniek voor het isoleren van de CP en het gebruik van scanning elektronenmicroscopie om een algemeen beeld te krijgen van de cellulaire structuur.

Microdissectie en Whole Mount Scanning Elektronenmicroscopie Visualisatie van muis choroïde plexus

Leer de analyse van ciliaire beweging in choroid plexus epitheelcellen ex vivo bij muizenembryo's met differentiële interferentiecontrastmicroscopie. Deze methode categoriseert en kwantificeert ciliaire bewegingen voor inzicht in ontwikkelingsbiologie.

Observatie van de Ciliaire Beweging van Choroid Plexus epitheelcellen

Meer video's verkennen