Onderzoek van Synaptic Tagging / Capture en Cross-capture met Acute hippocampus Plakjes van Knaagdieren
4 september 2015
Deze video-artikel beschrijft experimentele procedures om langetermijnplasticiteit en de daarmee geassocieerde processen zoals synaptische tagging, capture en cross-tagging in de CA1-piramideneuronen te bestuderen met behulp van acute hippocampus-sneden van knaagdieren.
Het algemene doel van deze procedure is om langdurige plasticiteit en zijn associatieve processen zoals synaptische markering, opname en kruismarkering in de CA een parametale neuronen te bestuderen met behulp van Q hippocampale plakjes uit knaagdieren. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen te dissekeren en snel de hippocampus te isoleren in koude geoxideerde kunstmatige hersenvocht. De tweede stap is het bereiden van acute hippocampale plakjes met behulp van een handmatige weefselsnijder en deze in een interfacekamer te incuberen.
Vervolgens worden twee stimulerende elektroden en twee opname-elektroden in het CA een-gebied geplaatst om veld EPSP- en populatiespike-responsen van twee synaptische inputs op te nemen. De laatste stap is het induceren van een voorbijgaande vorm van plasticiteit in één synaptische input en een aanhoudende vorm van plasticiteit in een andere input binnen een specifiek tijdvenster. Uiteindelijk worden veld EPSP-responsen van beide inputs voor langere tijd opgenomen om synaptische markering, opname en kruisopname mechanismen te onderzoeken.
Synaptische markering en opname vormen een conceptuele basis voor hoe korttermijngeheugen zich binnen een bepaalde tijdsperiode omvormt tot langdurig geheugen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de experimentele stappen moeilijk te leren zijn omdat ze stimulatie en opname van meerdere synaptische inputs vereisen. De procedure wordt gedemonstreerd door Mahesh Shira, machete en maima Sharma, afgestudeerde studenten uit mijn laboratorium.
Om deze procedure te beginnen, bereid A CSF voor en bellen deze met 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide. Vul de bodem van de interfacekamer met gedistilleerd water tot ongeveer 70% van de capaciteit. Schakel vervolgens de temperatuurregelaar in die vooraf ingesteld is op 32 graden Celsius.
Was vervolgens de bovenste kamer gedurende 10 tot 15 minuten door gedistilleerd water met een hoge stroomsnelheid door de instroombuis te laten lopen voordat u overschakelt naar A CSF met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. Plaats vervolgens een net in de bovenste kamer om een rustoppervlak voor de plakjes te bieden. Start carbogen de onderste kamer en dompel de instroombuis in de A CSF die continu carbogen is.
Laat 20 minuten staan om de A CSF te verzadigen met carbogen en deze de bovenste kamer te laten vullen. Monteer in deze stap een scheermes op de weefselsnijder en zorg ervoor dat de snijkant gelijkmatig is uitgelijnd. Test door een klein filterpapier te snijden om er zeker van te zijn dat het mes stevig is bevestigd.
Stel vervolgens de schuifbare vernier micrometer in op de startpositie. Verkrijg nu het hoofd van een geëuthaniseerde rat en maak met een irisschaartjes een snede door de achterkant van de schedel om de hersenstam te verwijderen. Maak vervolgens een kleine insnijding langs de rechterkant van de schedel en een langere insnijding aan de linkerkant.
Verwijder voorzichtig de schedel met een bot UR beginnend vanaf de linkerkant en naar de rechterkant van de schedel. Om de cortex en de dunne laag duura die deze bedekt te onthullen, verwijder voorzichtig de duura met een dunne spatel en verwijder vervolgens de frontale platen met het bot. Ro. Vervolgens verwijdert u de resterende duura, specifiek op de verbinding tussen de cortex en het cerebellum, met het platte uiteinde van een spatel en vermijdt u schade aan de hersenen door de druk naar boven te houden.
Gebruik de spatel om de hersenen voorzichtig in een petrischaal op een aluminium koelblok te scheppen dat gevuld is met koud en koolzuurhoudend A CSF om de hippocampus te isoleren. Gebruik een nr. 11 scalpel om een rechte snede te maken om het cerebellum te verwijderen en een andere snede om een kwart van de voorste portie van de hersenen te verwijderen. Maak vervolgens een ondiepe sagittale snede langs de middenlijn. Begin vanaf de middenlijn.
Verwijder voorzichtig de cortex met de sikkelschapper om de dorsale hippocampus te onthullen. Verwijder vervolgens de laag cortex boven de hippocampus. Maak een kleine snede naar de hippocampale commissure.
Verwijder voorzichtig de hippocampus met de sikkelschapper, beginnend vanaf het dorsale uiteinde met rollende bewegingen. Verwijder vervolgens eventuele cortex en bindweefsel rond de geïsoleerde hippocampus met behulp van het gebogen uiteinde van de sikkelschapper. Om het hippocampale weefsel te snijden, plaats een stuk CSF-geweekt 30 millimeter watmanfilterpapier op het snijstadium van de handmatige snijder.
Breng het hippocampale weefsel over op het filterpapier. Gebruik de platte kant van de sikkelschapper om het filterpapier te verplaatsen om de hippocampus in de juiste oriëntatie ten opzichte van de mes van de snijder te richten, zodat de hippocampus in een hoek van ongeveer 70 graden naar de fia wordt gesneden. Dep vervolgens de overtollige oplossing rond het hippocampale weefsel af.
Snijd met een gevouwen filterpapier de hippocampus, dwars, en gooi weefsel van het uiterste uiteinde van de hippocampus weg waar de snijmorfologie niet duidelijk is. Snijd vervolgens het resterende weefsel in 400 micron dikke plakjes door de verniermicrometer na elke ronde snijden aan te passen. Na elke snede, breng de plakjes voorzichtig over van de mes met een borstel met zachte borstelharen naar een kleine beker gevuld met koud koolzuurhoudend A CSF.
Breng vervolgens de plakjes voorzichtig over op het net in de snijkamer met behulp van een schone plastic pastepipette. Pas voorzichtig de positie van de plakjes aan met een brede punt op een manier die elektrodelocatie en opnamecontrole vergemakkelijkt om ervoor te zorgen dat de plakjes voldoende worden omgeven door een laag A CSF, maar niet volledig ondergedompeld zijn. Dek daarna de kamer af en incubeer de plakjes gedurende twee tot drie uur in synaptische markering en opname experimenten.
Positioneer onder de microscoop de twee stimulerende elektroden in het stratum radi atom van de CA een-regio om de Schaffer collaterale vezels te stimuleren en wanneer de opname-elektrode in het apicale dendritische gebied van ca een halverwege de stimulerende elektroden. Om F-E-P-S-P-responsen op te nemen, plaats nog een opname-elektrode in het stratum parid. DO-laag voor het opnemen van populatiespike.
Wanneer alle elektro
Overzicht
Dit videoartikel beschrijft experimentele procedures om langetermijnplasticiteit en de bijbehorende processen zoals synaptische tagging, capture en cross-tagging in CA1-pyramidale neuronen te bestuderen met behulp van acute hippocampale plakjes van knaagdieren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Elektrofysiologie
- Synaptische Plasticiteit
Achtergrond
- Langetermijnplasticiteit is cruciaal voor geheugenvorming.
- Synaptische tagging en capture zijn mechanismen die geheugenconsolidatie verklaren.
- CA1-pyramidale neuronen spelen een sleutelrol in de hippocampale functie.
- Acute hippocampale plakjes zijn een waardevol model voor het bestuderen van synaptische processen.
Doel van de studie
- Om langetermijnplasticiteit in CA1-neuronen te onderzoeken.
- Om synaptische tagging, capture en cross-tagging mechanismen te verkennen.
- Om een visuele demonstratie van complexe experimentele procedures te geven.
Gebruikte methoden
- Dissectie van knaagdierhersenen om de hippocampus te isoleren.
- Bereiding van acute hippocampale plakjes met behulp van een handmatige weefselsesnijder.
- Plaatsing van stimulerende en opnemende elektroden in het CA1-gebied.
- Inductie van tijdelijke en aanhoudende vormen van plasticiteit voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- Field EPSP-responsen werden opgenomen om synaptische activiteit te beoordelen.
- Mechanismen van synaptische tagging en capture werden aangetoond.
- Succesvolle inductie van plasticiteit in meerdere synaptische inputs werd bereikt.
- Visuele methoden verbeterden het begrip van complexe procedures.
Conclusies
- De studie geeft inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan geheugenvorming.
- Demonstratie van procedures helpt bij het onderwijzen van complexe elektrofysiologische technieken.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van synaptische plasticiteit in de hippocampus.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding synaptic tagging and capture mechanisms provides critical insights into memory consolidation processes, which are relevant for target validation in neurodegenerative disease research. This electrophysiological approach enables mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses by linking synaptic plasticity to functional outcomes in hippocampal circuits. The method supports predictive confidence in early discovery by establishing causal relationships between molecular interventions and long-term potentiation dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to memory formation and synaptic plasticity pathways.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for assessing target engagement through functional readouts of LTP and LTD.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by clarifying the role of plasticity-related proteins in synaptic tagging and capture mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated hippocampal slices for downstream assay standardization and reproducibility testing.
- Operational Value: Enables quantitative measurement of field EPSP and population spike responses as dependent variables for compound screening.
- Scientific Value: Facilitates assay readiness by establishing stable baseline recordings necessary for detecting pharmacological modulation of synaptic plasticity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers translational biomarker alignment by linking electrophysiological outputs to memory persistence models.
- Operational Value: Supports preclinical continuity from discovery through validation of long-term plasticity mechanisms.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by demonstrating transformation of early LTP to late LTP via tagging and capture processes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by providing mechanistic insights into synaptic plasticity that inform target selection and validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating the effects of specific stimulation patterns on synaptic tagging and capture.
- Screening: Delivers assay readiness through stable, long-term field-potential recordings that enable quantitative comparison of synaptic inputs.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (field EPSP slope, population spike) that allow teams to assess plasticity changes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling memory consolidation processes relevant to cognitive disorder therapeutics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological platform for evaluating multiple pharmacological agents on synaptic tagging and capture over extended durations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic insight into memory formation processes.
- Operational Value: Standardization and reproducibility of hippocampal slice preparation and electrode placement for consistent recordings.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing biological risk in CNS target validation through functional synaptic readouts.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to modulate late-phase LTP via tagging and capture mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, electrophysiology, and hippocampal slice preparation.
- Dependent on precision instrumentation including manual tissue slicers, interface chambers, and microelectrode manipulators.
- Necessitates cross-team standardization of stimulation protocols and recording parameters across laboratories.
- Involves adaptation considerations when translating protocols across rodent species or strain backgrounds.
- Limited by the technical complexity of maintaining stable long-term recordings from multiple synaptic inputs over extended durations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:53
Preparation of Artificial Cerebrospinal Fluid (ACSF) and Interface Chamber
2:52
Preparation of Acute Hippocampal Slices
6:36
Recording of CA3-CA1 Synaptic Responses
8:13
Induction Protocols for LTP/LTD
9:25
Results: Schematic Representation of a Transverse Hippocampal Slice and Electrode Location for Field-Potential Recording
10:41
Conclusion
