Knaagdieren Brain Micro-injectie om te studeren Molecular substraten van gemotiveerd gedrag
16 september 2015
Knaagdieren zijn een geschikt model om de moleculaire substraten van gedrag en complexe psychiatrische stoornissen te onderzoeken. Hersenmicro-injectie bij wakkere knaagdieren kan worden gebruikt om ziekte-substraten te verduidelijken. Een efficiënte en aanpasbare hersenmicro-injectiemethode evenals de uitvoering van een operante paradigma dat motivatie kwantificeert wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van deze procedure is om nauwkeurig een canule en micro-injectoren te vervaardigen, evenals om micro-injectie correct uit te voeren. Dit wordt bereikt door eerst een canule te maken van een geschikte lengte. De tweede stap is om micro-injectoren te snijden en te assembleren.
Bereid vervolgens micro-injectoren, slangen en een pomp voor micro-injectie voor. De laatste stap is om micro-injectie te voltooien en een diffusieperiode te laten passeren. Uiteindelijk wordt micro-injectie gebruikt om reagentia nauwkeurig in het gewenste hersengebied te injecteren. Demonstratie van goede omgang.
Tijdens micro-injectie zal Ryan Poland, een student in mijn laboratorium, aanwezig zijn. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat er bijzondere zorg moet worden genomen en alle stappen grote aandacht vereisen om een correcte canuleplaatsing en micro-injectielocatie te garanderen. Om de canule eerst voor te bereiden, tekent u met een fijnpuntige pen een referentielijn van 15 millimeter op het tape.
Gebruik het vervolgens als een gids voor het markeren van de 15 millimeter secties sequentieel op de slang met een scherpe permanente marker. Vervolgens gaat u de canuleslang inkepen door deze aan te raken met de langzaam draaiende afsnijschijf van de rotatietool. Op de gemarkeerde punten draait u de canule 180 graden en inkept u de andere kant van de slang.
Snijd de slang niet helemaal door, omdat dit kan leiden tot occlusie. Buig vervolgens de slang scherp om deze in secties van 15 millimeter te breken. Houd vervolgens elk uiteinde van de canule loodrecht op de afsnijschijf tussen de duim en wijsvinger.
Roteer de canuleslang terwijl u het uiteinde aanraakt aan het oppervlak van de afsnijschijf om een stomp uiteinde te genereren. Boor vervolgens beide uiteinden van de canule met een 26 gauge afgeschuinde naald om ervoor te zorgen dat alle oneffenheden zijn verwijderd en dat de canule niet geblokkeerd is. Om de obturator voor te bereiden, klemmen u een canule op ongeveer de halve lengte met een rechte hemostaten met middelzwaar gewicht, leg de vergrendelde hemostaten op de werkbank zodat de canule loodrecht op de werkbank staat.
Voer vervolgens een uiteinde van de atordraad in de canule totdat deze het bankje bereikt. Buig de draad door met de vingers te knijpen totdat een hoek van 30 graden is bereikt terwijl het contact tussen de obturator en het bankje wordt gehandhaafd. Verwijder vervolgens de draad uit de canule en snijd het overtollige gedeelte af op 2,5 millimeter van de bocht met kleine diagonale scharnieren.
Houd in deze procedure een uiteinde van de micro-injector slang loodrecht vast met een vergrendelde rechte hemostaat. Draai een hemostaat terwijl u spanning op de slang houdt en wikkel deze ten minste één keer strak om de hemostaat. Meet vervolgens 32 millimeter vanaf het andere losse uiteinde van de micro-injector slang en grijpt dit punt loodrecht met een tweede hemostaat.
Buig de slang heen en weer terwijl u de spanning vasthoudt totdat deze breekt. Inspecteer vervolgens de micro-injector slang om ervoor te zorgen dat beide uiteinden recht zijn en dat de binnendiameter niet geblokkeerd is. Trek een referentielijn van vijf millimeter op de meetlint en markeer vijf millimeter secties van canuleslang sequentieel met een permanente marker.
Raak vervolgens de canuleslang op gemarkeerde punten aan de langzaam draaiende afsnijschijf om de slang te inkepen. Buig vervolgens de micro-injector kraagslang scherp om deze in vijf millimeter secties te breken. Schuif een kraag op elke micro-injectorbuis op ongeveer twee centimeter van het uiteinde.
Breng een kleine hoeveelheid superlijm aan op de micro-injectorbuis op vijf millimeter van een uiteinde. Schuif vervolgens de kraag over de superlijmparel zodat deze één millimeter van het uiteinde van de micro-injectiebuis is. Bedek vervolgens beide uiteinden van de kraag met lijm.
Bevestig vervolgens een 26 gauge naald aan de een milliliter spuit gevuld met steriel water. Schuif het acht centimeter stuk micro-injector plastic slang op de naald, zorg ervoor dat de buis niet wordt doorboord, en schuif het andere uiteinde van de plastic slang over het kraaggedeelte van de opgedroogde micro-injector. Duw de watergevulde spuitpomp om te controleren op patent C. In deze stap buigt u de voltooide micro-injector op 15 millimeter van het uiteinde tegenover de kraag met 95 graden.
Snijd vervolgens de plastic slang op 70 centimeter en schuif deze over de micro-injectorkraag. Om de pomp voor micro-injectie voor te bereiden, stelt u de diameter van de gewenste infusiesnelheid van de micro-injectienaald en het doelinjectievolume op de buis in. Stel vervolgens de pompmodus in op volume zodat een precieze hoeveelheid automatisch wordt afgeleverd.
Stel vervolgens de terugslag van de pomp in om de spuit te laten vullen tot de injectievolume plus een extra 0,2 microliter. Plaats nu de punt van de gaststrakke spuit in het steriele water dat in een kleine weiboot zit en laat de plunjer voorzichtig fladderen om de interne draad gelijkmatig te smeren. Trek de plunjer naar de terugslag op de pomp om de micro-injectienaald met water te vullen.
Schuif vervolgens. De PE 20 slang die is aangesloten op de micro-injector op een 26 gauge naald die is bevestigd aan een een milliliter steriele watergevulde spuit. Spuit sterieel water door de micro-injector en inspecteer het spuitpatroon en de afstand.
Plaats vervolgens een gesteriliseerde micro-injector op een steriele werkruimte. Schuif de slang van de naald, snijd de slang onder het gebied dat is beschadigd door de naald terwijl u deze rechtop houdt om te voorkomen dat water eruit druppelt. Duw vervolgens de micro-injector spuitplunjer iets naar voren om een druppel op het uiteinde van de naald te maken en schuif de watergevulde PE 20 slang op de naald.
Duwt vervolgens de plunjer volledig naar voren om voorbereid te zijn voor monsterbelasting en om ervoor te zorgen dat er geen spoor ethanol in de micro-injector achterblijft. Controleer de instelling op lekken door de waterdruppel die wordt gevormd op de punt van de micro-injector een paar keer met
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor hersenmicro-injectie bij wakkere knaagdieren, gericht op het onderzoeken van de moleculaire substraten van gedrag en psychiatrische stoornissen. De procedure beschrijft in detail de vervaardiging van canules en micro-injectoren, waarbij de nadruk ligt op precisie en zorg tijdens het micro-injectieproces.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Psychiatrische stoornissen
- Gedragsanalyse
Achtergrond
- Knaagdieren dienen als effectieve modellen voor het bestuderen van complex gedrag.
- Microinjectietechnieken kunnen ziekte mechanismen verduidelijken.
- Nauwkeurige toediening van reagentia is cruciaal voor het succes van het experiment.
- Aandacht voor detail is essentieel bij het microinjectieproces.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode voor hersenmicroinjectie te ontwikkelen.
- Om motivatie te kwantificeren via operante paradigma's.
- Om het begrip van psychiatrische stoornissen te verbeteren door middel van moleculair onderzoek.
Gebruikte methoden
- Vervaardiging van canuleleidingen op specifieke lengtes.
- Precisieassemblage van micro-injectoren.
- Voorbereiding van micro-injectoren, slangjes en pompen voor injectie.
- Uitvoering van de micro-injectie met een focus op nauwkeurigheid en diffusie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vervaardiging van canules en micro-injectoren.
- Gedemonstreerde juiste micro-injectietechnieken.
- Vastgestelde protocollen voor het waarborgen van de nauwkeurigheid van de reagensafgifte.
- Belichting van de uitdagingen waar beginners tijdens het proces tegenaan lopen.
Conclusies
- De methode biedt een kader voor het bestuderen van de hersenfuncties bij knaagdieren.
- Aandacht voor detail is cruciaal voor een succesvolle microinjectie.
- Deze aanpak kan het onderzoek in de gedragsneurowetenschappen verder bevorderen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Precieze hersenmicro-injectie maakt mechanistische analyse mogelijk van moleculaire substraten die ten grondslag liggen aan gemotiveerd gedrag, een kritiek omslagpunt bij de validatie van targets voor neuropsychiatrische therapeutica. Deze techniek ondersteunt het beperken van risico's bij therapeutische hypothesen door gecontroleerde perturbatie van specifieke neurale circuits in ziekterelateerde systemen mogelijk te maken, waardoor het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen wordt verbeterd. De integratie hiervan met kwantitatieve gedragstests, zoals progressieve ratio-screening, faciliteert translationele continuïteit van target-engagement naar functionele output, wat bijdraagt aan portfoliobeslissingen in CNS-drugdiscovery.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door specifieke neurale systemen selectief te modificeren, te versterken of stil te leggen om de moleculaire substraten van motivatie te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt een aanpasbare, kosteneffectieve methode voor de productie van chirurgische instrumenten, wat schaalbare implementatie in diverse ontdekkingsprojecten ondersteunt.
- Voorspellende waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van het doelwit door nauwkeurige regionale toediening, waardoor mechanistische ambiguïteit in gedragsfenotypes wordt verminderd.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream evaluatie van farmacologische manipulaties van gemotiveerd gedrag.
- Kwantitatieve output: Maakt meting van de effectiviteit van de bekrachtiger mogelijk via progressive ratio-schema's, wat dosis-responstgegevens genereert die gevoelig zijn voor farmacologische interventies.
- Reproduceerbaarheid: Gestandaardiseerde microinjectietechnieken verbeteren de consistentie tussen studies, wat betrouwbare screeningscampagnes van verbindingen ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Knaagdiermodellen bieden een sterke translationele validiteit vanwege behouden neurale circuits die stimulus-actie-uitkomsten verwerken, wat extrapolatie naar menselijke motivatiepaden ondersteunt.
- Preklinische continuïteit: Verbindt moleculaire interventies in gedefinieerde hersenregio's met meetbare veranderingen in zelfadministratiegedrag, waardoor beslissingen over risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk worden.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt het onderzoek naar moleculaire targets die correleren met gedragsmatige uitkomsten, wat de ontwikkeling van translationele biomarkers faciliteert.
Integratie van pipeline en workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van doelwitvalidatie via lead-identificatie tot preklinische evaluatie, in het bijzonder voor CNS-indicaties waarbij gemotiveerd gedrag een cruciale fenotypische read-out is.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door nauwkeurige toediening van reagentia aan kernen zoals de nucleus accumbens core mogelijk te maken.
- Screening: Faciliteert de gereedheid van assays voor het evalueren van compound-effecten op motivatie met behulp van operante conditioneringsparadigma's met progressieve ratio-schema's.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (bijv. breakpoints, responsnelheden) die vergelijking van versterkende effectiviteit tussen condities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt moleculaire manipulatie in astrocyten of neuronen met veranderingen in ethanol-zelftoediening, wat de preklinische validiteit van targets ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Aanpasbare fabricage van canules en injectoren maakt platformhergebruik mogelijk voor meerdere targets, hersengebieden en gedragsassays.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in doelwitvalidatie door vermindering van off-target effecten en verbeterde anatomische precisie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van microinjectieprocedures over laboratoria en projecten heen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go beslissingen via mechanische risicovermindering, waardoor het risico op falen in een late fase bij de ontwikkeling van geneesmiddelen voor het centraal zenuwstelsel wordt verlaagd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van doelwitten mogelijk op basis van functionele validatie in motivatie-relevante circuits.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stereotaxische chirurgie, neuroanatomie en gedragsconditionering om een nauwkeurige plaatsing van de canule en valide motivationele resultaten te garanderen.
- Afhankelijk van precisie-instrumentarium, waaronder rotatiegereedschappen, hemostaten, spuitpompen en steriele slangetjes, voor een consistente fabricage van de micro-injector.
- Vereist standaardisatie tussen de chirurgische, gedragsmatige en farmacologische teams om de procedurele getrouwheid en dataintegriteit te waarborgen.
- Overwegingen bij aanpassing omvatten soortspecifieke anatomie, coördinaten van het doelgebied en compatibiliteit met diverse reagentia (virussen, geneesmiddelen, oligonucleotiden).
- Praktische beperkingen omvatten de technische vaardigheid die nodig is om weefselbeschadiging, occlusie of verkeerde plaatsing te voorkomen, wat de interpretatie van het gedrag zou kunnen beïnvloeden.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:13
Preparation of Cannula and Obturator
3:13
Preparation of Microinjector
5:32
Performing Microinjection
8:50
Results: Reduced Rat Motivation to Self-administer Ethanol by Overexpressing DREADDs in Nucleus Accumbens Core Astrocytes
9:35
Conclusion
