Name: Referentie Bouillon microverdunningsplaten Methode voor dalbavancin In Vitro Gevoeligheid testen van Bacteriën die aNBAO Grow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Leer de broth microverdunningsmethode voor dalbavancin gevoeligheidstesten van Gram-positieve bacteriën. Dit protocol toont unieke voorbereidingsstappen met DMSO en polysorbate 80 voor nauwkeurige MIC-bepaling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Eerder werk met betrekking tot gevoeligheidstests van dalbavancine is waardevol geweest bij de ontwikkeling van gestandaardiseerde methoden en erkentelijkheid voor dit werk wordt gegeven aan JMI Laboratories, Robert Rennie en Beth Goldstein.

Opmerking: Raadpleeg CLSI documenten M7-A10 en M100-S25 en / of ISO / FDIS 20776-1 voor de volledige details van de referentie-bouillon microverdunningsplaten methode voor antimicrobiële gevoeligheid 2, 3, 4 De referentiemethoden zorgen voor opties in een aantal van de. procedures die specifiek zijn voor inoculum voorbereiding en MIC panel productielijn om hetzelfde eindresultaat te bereiken. De methode die hier beschreven heeft betrekking op een antimicrobieel middel, dalbavancin en sommige stappen één van potentieel verschillende manieren de referentiemethode kan vertegenwoordigen. Gepaste veiligheidsmaatregelen (in overeenstemming met bioveiligheid niveau 2) moeten worden benut 10. De MIC paneelformaat gebruikt voor het doel van deze videopublicatie wordt weergegeven in tabel 1. 1. Store dalbavancin Poeder <ol><li> Na ontvangst van diagnostische kwaliteit dalbavancin poeder, bewaar bij -20 ° C in een gedroogde omgeving in een niet ontdooien diepvriezer. Voorafgaand aan gebruik moet het poeder in evenwicht komenbereiken RT voor opening. </li></ol> 2. Bereid MIC Panel verdunningen <ol><li> Bereid een voorraadoplossing niet hoger dan 1600 ug / ml dalbavancin in keurige (zuiver) DMSO in steriele glazen of plastic buizen en gebruik op dezelfde dag van de bereiding of opslag bij -20 tot -60 ° C of lager voor toekomstig gebruik in een niet ontdooien diepvriezer. Rekening houden met de potentie van dalbavancin zoals voorzien op het ontvangen met het poeder documentatie, bij het ​​afwegen van het poeder (zie vergelijking 1 bijvoorbeeld 800 ug / ml voorraad voorbereiding). </li><li> Verdun de verwatering vergelijkbaar met het schema zoals weergegeven in kolom 1 (&quot;Source Concentration&quot;) in tabel 2 met nette DMSO in steriele glazen of plastic buizen. Gebruik een pipet voor het meten van verdunner en andere pipet voor het toevoegen van de eerste dalbavancin bouillon aan de eerste buis. Voor elke volgende dalbavancin voorraad concentratie gebruik maken van een nieuwe pipet. </li><li> Bereid 100X finale MIC panel concentrantsoen verdunningen (tussenliggende concentraties) met nette DMSO. Zoals wordt getoond in de kolommen 2-4 van Tabel 2, samen voldoende hoeveelheden van de bron en DMSO gewenste tussenstand concentratie bereikt (volumes te gebruiken zal afhangen van het aantal MIC panelen worden gemaakt). </li><li> Bereid 0,004% P80: Bereid een verse werkvoorraad oplossing van 2% P80 door het toevoegen van 0,1 ml P80 tot 4,9 ml dH 2 O. Steriliseren door het passeren door een 0,22 micron filter en gebruiksoplossing op dezelfde dag van de bereiding. Bereid 0,004% P80 verdunningsmiddel door een 1: 500 verdunning van 2% P80 (bijvoorbeeld 0,3 ml van 2% P80 tot 149,7 ml CAMHB). </li><li> Verdun de tussenliggende concentraties bereid in Stap 2,2 1: 100 in kation aangepast Mueller Hinton bouillon (CAMHB) aangevuld met 0,004% (v / v) polysorbaat-80 (P-80) P-80 en / of LHB (voor streptokokken) toegevoegd dubbel zo eindconcentratie vanwege toevoeging van inoculum (stap 4,3) zal resulteren in een 1: 2 verdunning. Zie kolommen 6 en 7 in tabel 2 </strong&gt;. </li></ol> 3. Bereid MIC Panelen <ol><li> Doseer 50 pi van elke dalbavancin oplossing bereid in stap 2.3 in geschikte putjes van de MIC-paneel en omvatten media slechts in een goed (groei controle ook). Een multi-channel pipet met steriele tips kunnen worden gebruikt voor deze stap. </li><li> Gebruik panelen direct of zegel met plastic folie, plaats in plastic zakken en onmiddellijk plaats in een niet-ontdooien vriezer bij ≤-20 ° C (bij voorkeur ≤-60 ° C) totdat het nodig is. Indien bevroren panelen worden gebruikt, verwijder afdichtingen en plaats afzonderlijke panelen op de labtafel 15-30 min (tot ver inhoud ontdooid) alvorens tot panel inenting. </li></ol> 4. Inoculeren MIC Panelen Voer Zuiverheid en Setup kiemgetal <ol><li> Selecteer meerdere goed geïsoleerde kolonies van een 18-24 uur agar of andere niet-selectieve agarplaat. Raak de bovenkant van elke kolonie met een steriele lus of doekje en overdracht naar 1-5 ml CAMHB of sAline totdat troebelheid is equivalent aan een 0,5 McFarland standaard. Beoordelen van troebelheid door visuele vergelijking met de 0,5 McFarland of fotometrische inrichting. </li><li> Binnen 15-30 minuten van de voorbereiding, verdunnen het inoculum 1: 100 in CAMHB (100 pi in 10 ml CAMHB). Voor de meeste bacteriën getest op dalbavancin, behalve S. pneumoniae, zal deze verdunning een uiteindelijke goed concentratie van 5 x 10 5 CFU / ml (acceptabel bereik is 2-8 x 10 5 CFU / ml) te verstrekken. Voor S. pneumoniae, bacteriële concentratie op basis van vergelijking van troebelheid van een 0,5 McFarland typisch aanzienlijk minder, dan verdunnen 1:25 inoculum (400 ul in 10 ml CAMHB + 10% + LHB). </li><li> Binnen 15 min na inoculum bereiding overdracht 50 ul van het uiteindelijke inoculum aan elk putje (met uitzondering van de steriliteit controlewell) de MIC panel bereid in stap 3. Een multi-channel pipet met steriele tips kunnen worden gebruikt voor deze stap. </li><li> Voer een zuiverheid chequedoor de overdracht en de verspreiding van een 1-10 ul monster van de positieve groei controle goed met een steriele lus om een niet-selectieve agar (bv trypticasesoja agar met 5% schapen bloed). </li><li> Setup kiemgetal door het verwijderen van 10 ul van de groei controle goed met een enkel kanaal pipet en steriel tip en transfer naar 10 ml zoutoplossing (1: 1000 verdunning). Mengen en overdracht 100 ul met een enkel kanaal pipet en steriel tip om een geschikte, niet-selectieve agar medium (bijv trypticasesoja agar met 5% schapen bloed) en verspreid over het hele agar oppervlak met een steriele lus, herhalen twee keer in verschillende richtingen gelijkmatige verdeling van het inoculum (1:10 verdunning) te verzekeren. </li></ol> 5. Incubate MIC Panelen, kiemgetal en Zuiverheid Platen <ol><li> Verzegelen elke MIC paneel of stapel niet meer dan 4 panelen in een plastic zak, met plastic tape of met een strakke plastic hoes vóór incubatie. Als alternatief, plaats lege MIC paneel op de t-op van de stapel niet meer dan 4 MIC panelen, plaats een vochtige papieren handdoek in een plastic container, plaats MIC panelen in de plastic container en sluiten container veilig met deksel. </li><li> Incubeer MIC panelen in een lucht incubator bij 35 ° C ± 2 ° C gedurende 16-20 uur (stafylokokken en enterokokken) en 20-24 uur (streptokokken) binnen 30 min inoculatie. Incubeer de telling kolonie en zuiverheid platen onder dezelfde omstandigheden behalve Incubate streptokokken in een 5% CO 2 incubator. </li></ol> 6. Lees het MIC en de Kolonie Count platen; Controleer Zuiverheid Plate <ol><li> Lees de MIC de laagste concentratie die volledig remt bacteriegroei in de putjes zoals gedetecteerd door het blote oog. </li><li> Tellen kolonies op de kolonie kiemgetal. Vermenigvuldig elke kolonie verdunningsfactor (1: 10.000) (bijvoorbeeld 50 kolonies gelijk aan 5 x 10 5 CFU / ml). Een aanvaardbare bereik 20-80 kolonies (2-8 x 10 5 CFU / ml) en wordt gebruikt als voorkomendximate richtlijn. </li><li> Controleer zuiverheid plaat. Als alle kolonies zijn vergelijkbaar met de kolonies die in stap 4,1, dan kan het inoculum worden zuiver beschouwd. Als er andere kolonies aanwezig, dan is er potentieel een verontreiniging aanwezig in het MIC paneel en de test moet herhaald worden. </li></ol> 7. Controleer Quality Control resultaten. <ol><li> Zie Tabel 3 voor de verwachte bereik van CLSI kwaliteitscontrole stammen. Alleen rapporteren resultaten van de test isolaten als dalbavancin MIC resultaten voor kwaliteitscontrole organisme (s) zijn binnen het verwachte bereik. </li><li> Als een MIC van ≥0.25 ug / ml wordt verkregen op elke klinische S. aureus isoleren, herhalen de dalbavancin MIC testen en / of naar een referentielaboratorium voor verificatie. </li></ol>

<ol><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Once-weekly+dalbavancin+versus+daily+conventional+therapy+for+skin+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection.</a> The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22M07-A10.+Methods+for+Dilution+Antimicrobial+Tests+for+Bacteria+that+Grow+Aerobically.%3A+Approved+Standard%22">M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard</a>. , Tenth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22M100-S25.+Performance+Standards+for+Antimicrobial+Susceptibility+Testing%3B+Twenty-Fifth+Informational+Supplement%22">M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement</a>. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+laboratory+testing+and+in+vitro+diagnostic+test+systems+--+Susceptibility+testing+of+infectious+agents+and+evaluation+of+performance+of+antimicrobial+susceptibility+test+devices+--+Part+1%3A+Reference+method+for+testing+the+in+vitro+activity+of+antimicrobial+agents+against+rapidly+growing+aerobic+bacteria+involved+in+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22ISO%2FFDIS%22%5BJournal%5D)">Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases.</a> ISO/FDIS. 20776-1, International Organization for Standardization. (2006).</li>
<li>Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surrogate+analysis+of+vancomycin+to+predict+susceptible+categorization+of+dalbavancin%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).</li>
<li>Turnidge, J., Paterson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting+and+revising+antibacterial+susceptibility+breakpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints.</a> Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).</li>
<li>Rennie, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+broth+microdilution+antimicrobial+susceptibility+test+results+for+dalbavancin%2C+a+new+glycopeptide+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent.</a> Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).</li>
<li>Arhin, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polysorbate+80+on+oritavancin+binding+to+plastic+surfaces%3A+implications+for+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+agents+and+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).</li>
<li>Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+reference+broth+microdilution+method+for+testing+telavancin%3A+effect+on+MIC+results+and+correlation+with+other+testing+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+agents+and+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).</li>
<li>Ribbon Panel, B. lue <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Safe+Work+Practices+in+Human+and+Animal+Medical+Diagnostic+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Supplements%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories.</a> MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).</li>
<li>Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+quality+control+evaluations+for+susceptibility+testing+of+Dalbavancin+%28BI397%29%2C+an+investigational+glycopeptide+with+potent+gram-positive+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity.</a> Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).</li>
<li>Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Broth+Microdilution+and+Agar+Dilution+Dalbavancin+and+Vancomycin+MIC+Results+for+42+Aerobic+Gram-positive+Bacteria.+Poster+132%5BTitle%5D)+AND+%22ASM%22%5BJournal%5D)">Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132.</a> ASM. , San Francisco, CA. (2012).</li>
<li>Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+dalbavancin+MIC+values+determined+by+Etest+%28AB+BIODISK%29+and+reference+dilution+methods+using+gram-positive+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).</li>
<li>Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+dalbavancin+against+staphylococci+and+streptococci%2C+assessed+by+BSAC+and+NCCLS+agar+dilution+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+antimicrobial+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).</li>
<li>Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+of+dalbavancin+potency+and+spectrum+in+the+United+States+%282012%29%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+microbiology+and+infectious+disease%22%5BJournal%5D)">Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012).</a> Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).</li>
</ol>

Sandra McCurdy is een werknemer van Durata Therapeutics; Laboratorium Specialists, Inc., de werkgever van Laura Koeth en Jeanna Fisher, werd gecontracteerd door Durata Therapeutics aan het manuscript te bereiden. Publicatie vergoedingen voor dit artikel zijn door het Laboratorium Specialists, Inc. betaald

De volgende methode gegevens worden gepresenteerd voor aanvullende overwegingen bij de voorbereiding van dalbavancin MIC testen. Het ontwerp van de MIC panel zal afhangen van het aantal antimicrobiële middelen te testen (bijv., Dalbavancin alleen of meerdere middelen) en soorten bacteriën te testen. De dalbavancin concentraties dient de interpretatieve breekpunten omvatten alle soorten bacteriën te testen en het gehele reeks verdunningen verwacht ten minste één QC stam. De antimicrobiële verdunningsreeks kan hetzij in rijen of kolommen worden georganiseerd afhankelijk van het aantal antimicrobiële middelen en / of isolaten / plaat en de wijze van inoculatie. Het volume van de dalbavancin poeder en bouillon moet worden berekend om te verzekeren dat optimale hoeveelheden worden geproduceerd en afval is minimaal. Voor het voorbeeld gebruikt in deze publicatie, zijn de volumes op basis van de voorbereiding van twee MIC panelen. Catie aangepast Mueller Hinton bouillon moet worden voorbereid en de autoclaaf volgens de mensfabrikaat instructies en steriliteit van de media geverifieerd. MIC panelen kunnen worden vervaardigd en gebruikt op dezelfde dag van preparaat of zij kunnen worden getest met geschikte voor kwaliteitscontrole en gevalideerde panelen bevroren bewaard voor toekomstig gebruik. Het is belangrijk steriele technieken gedurende de procedure. Er is geen strikte criteria voor de verificatie van inoculum concentratie kolonietellingen. Kolonietellingen kan aanvankelijk worden gecontroleerd voor elke geteste en / of periodiek naar de verdunningsstap die in stap 4,2 valideren species. Het is belangrijk dat de geldigheid van de 0,5 McFarland standaard ook regelmatig wordt gecontroleerd met E. coli ATCC 25922 onder toepassing van een procedure vergelijkbaar met stap 4,5. Als de resultaten niet overeen met 1-2 x 10 8 CFU / ml, een nieuwe 0,5 McFarland standaard moet worden verkregen. Als de kolonietellingen MIC putten buiten het toegestane bereik (2-8 x 10 5 CFU / ml en MIC resultaten van de klinische isolaat (s) variëren van the verwachte normale verdeling (bv. 0,03-0,12 ug / ml voor S. aureus) en / of MIC resultaten voor kwaliteitscontrole isolaat (s) zijn buiten verwachting bereiken, validatie testen is noodzakelijk en wijze modificatie kan worden gerechtvaardigd. Er wordt voorgesteld een gevalideerde 0,5 McFarland standaard wordt gebruikt om het aantal kolonies (s) herhaald en als de resultaten weer buiten de verwachte resultaten dient het inoculum verdunning zoals uitgevoerd in stap 4.2 worden aangepast en de MIC herhaald. Merk op dat een zuiverheid controle nodig is, zelfs als een kolonie telling wordt uitgevoerd omdat het kiemgetal procedure maakt gebruik van een verdunde volume die kunnen lagere concentraties van verontreinigende organismen niet per se op te sporen. Voor een MIC-test is geldig worden beschouwd, moet acceptabel groei plaatsvinden in de groei controle ook. Voor de meeste bacteriën die worden getoetst dalbavancin (bijv., Stafylokokken, streptokokken en enterokokken, de groei zal worden gezien als een knop (typisch&gt; 2 mm) en minder frequently, kan de groei weergegeven als troebelheid in de put. In tegenstelling tot sommige antimicrobiële middelen die kunnen vertonen achterstand effect als de concentratie te verhogen, worden dalbavancin eindpunten meestal goed gedefinieerd. Er zijn verschillende weergave inrichting ter lezing microverdunnings- tests te vergemakkelijken, die kunnen worden gebruikt om dalbavancin bevattende platen gelezen zolang er geen compromis in het vermogen om de groei te onderscheiden in de putjes. De kritische stappen in het protocol zijn aan de delen van de procedure die verband houden met de oplosbaarheid van dalbavancin en toevoeging van P80. Het is belangrijk dat de maximale concentratie van dalbavancin gebruikte niet groter dan 1600 ug / ml, dat DMSO wordt gebruikt als oplosmiddel en die tussenliggende concentraties worden bereid in DMSO alvorens de brij verdunningen zodat de eindconcentratie van DMSO in de MIC panel putten niet groter dan 1%. DMSO is hygroscopisch en dus het gebruik van oudere flessen DMSO was consideration wat dalbavancin oplosbaarheid. Echter, terwijl een kleine BMD studie met kwaliteitscontrole stammen dit blijkt niet een belangrijke variabele te zijn (zie de resultaten sectie), het is een goede gewoonte om nieuwe of onlangs geopende flessen DMSO gebruiken. Het is ook belangrijk dat P80 wordt toegevoegd aan de bouillon in de laatste stap van geneesmiddelverdunning preparaat en is bij een uiteindelijke concentratie van 0,002% in het MIC ook. De BMD procedure hier opgenomen gebruik voorbereiding van de MIC-panelen met behulp van 50 ul / put / goed dus op dalbavancin en P-80-concentraties twee keer de finale concentratie en toevoeging van entstof met 50 ul die laatste volume / put is 100 pl. Deze werkwijze maakt een MIC paneelformaat worden geproduceerd voor het testen van zowel S. aureus en S. pneumoniae omdat gelyseerd paarden bloed kan worden toegevoegd aan het inoculum. Alternatieve methoden voor het bereiden van MIC platen met 100 gl / putje met toevoeging van maximaal 10 gl / putje worden in deCLSI en ISO procedures. De dalbavancin gevoelig breekpunt voor S. aureus is ≤0.12 ug / ml (FDA bijsluiter). Zoals blijkt uit de recente bewaking, de meeste isolaten worden geremd door dalbavancin in gehalten van 0,06 ug / ml 15. Met een vatbare breekpunt nabij de modale MIC kan elke variatie in MIC gevolge van werkwijze verschillen beïnvloeden de vatbaarheid tarieven. Omdat de BMD procedure voor dalbavancin bevat een aantal unieke stappen (in het bijzonder het gebruik van DMSO in de voorbereiding van de voorraad en intermediaire geneesmiddel verdunningen en 0,002% P80 in het MIC goed, is het noodzakelijk dat de methode precies wordt gevolgd. De S. aureus QC organisme (ATCC 29.213) met een zeer duidelijke dalbavancin modale MIC van 0,06 ug / ml, is een goede indicator van de methode variatie en moet regelmatig worden gebruikt om de BMD-methode te valideren. Als MIC resultaten zijn met de verwachte range van 0,03-0,12 ug / ml, maar zijn trending om ofwel de lage of high kant van dit bereik, wordt verdere validatie van de methode gerechtvaardigd. Toevoeging van 0,002% P80 wordt aanbevolen voor alle relevante Gram-positieve organismen (staphylococcci, enterokokken en streptokokken.) Het is echter opmerkelijk dat het is aangetoond dat paardenbloed gelyseerd werkt vergelijkbaar met P-80 ten opzichte van de anti-bindende vermogen en dat de toevoeging van P-80 te CAMHB + LHB geen additioneel effect op dalbavancin streptokokken MIC resultaten. Er is geen disk diffusie werkwijze voor het testen dalbavancin en vanwege de slechte correlatie van BMD en advertentieresultaten, gevoeligheidstests van dalbavancin met de AD methode wordt afgeraden 12, 14. BMD methode worden gebruikt om de toekomstige evaluatie van dalbavancin gevoeligheid en als een gouden standaard voor de commerciële ontwikkeling van antimicrobiële gevoeligheidstests.

Dalbavancin is een semi-synthetisch lipoglycopeptide die door de FDA goedgekeurd in mei 2014 voor de behandeling van acute bacteriële huid en huidstructuur infecties veroorzaakt door Gram-positieve organismen 1. Het primaire doel van detaillering van deze methode in een video-formaat is om duidelijke richtlijnen te verstrekken aan de klinische laboratoria en onderzoekers voor het testen en rapportage van nauwkeurige en reproduceerbare dalbavancin gevoeligheid resultaten. De bepaling van een antimicrobieel middel MIC door commerciële methoden wordt routinematig uitgevoerd in klinische laboratoria voor de beoordeling van de in vitro activiteit van een agent tegen pathogene bacteriën. De hier beschreven methode is de brij microverdunningsplaten werkwijze zoals door CLSI en ISO 2,3,4. Sinds dalbavancin commerciële gevoeligheid methoden zijn momenteel niet beschikbaar (op het moment van deze publicatie) en verspreiding schijf en agar verdunning methoden worden momenteel afgeraden fof dalbavancin verwijzing bouillon verdunning methoden zijn de huidige mogelijkheden 12,14. Aangezien deze referentie methode is niet een commercieel en FDA goedgekeurd in vitro diagnostische methode, klinische laboratoria in de Verenigde Staten die deze procedure voor het testen van de patiënt kunnen gebruiken, moet zich houden aan de wettelijke vereisten voor een laboratorium ontwikkelde toets (LDT). Verwacht wordt dat de dalbavancin gebruik toeneemt, zal laboratoria behoefte om deze verbinding te testen. Vancomycine tests als een surrogaat voor het bepalen van dalbavancin gevoeligheid van S. aureus is gevalideerd 5. Evenwel dalbavancin actief tegen vancomycine tussenproduct S. zijn aureus (VISA) en daarom kunnen clinici dalbavancin MIC resultaten te vragen. Bovendien kunnen MIC resultaten van andere bacteriële soorten worden aangevraagd. De FDA gevoelig breekpunt voor dalbavancin tegen S. aureus is vastgesteld op ≤0.12 ug / ml. FDA toegewezen slechts een susceptible categorie vanwege het gebrek aan gegevens over resistente isolaten. De normale MIC verdeling wild type S. aureus isolaten tussen 0,03-0,12 ug / ml, namelijk modale MIC van 0,06 ug / ml. Een lichte variatie in MIC gevolg methode verschil naast de inherente BMD variatie van ± een verdunning zou kunnen hebben een aanzienlijke invloed op de gevoeligheid tarieven. 6 vergelijkbaar met andere lipoglycopeptide middelen kunnen dalbavancin gevoeligheidstest uitdagend als resultaat oplosbaarheid en de relatief grote omvang van het molecuul en de bindingseigenschappen 7,8,9. De referentie BMD hier beschreven methode omvat twee specifieke stappen die uniek oplosbare middelen en / of lipoglycopeptide middelen zijn: (1) het gebruik van DMSO voor de bereiding van voorraadoplossingen en (2) toevoeging van 0,002% P-80 in de finale MIC panel verdunningen. Het doel van deze video publicatie is om duidelijkheid te verschaffen aan de dalbavancin BMD-methode en specifically richten op deze belangrijke stappen, om nauwkeurige en reproduceerbare MIC resultaten te verzekeren.

```html
<table><tbody><tr><td>Dalbavancin</td><td>Metrics, Inc.</td><td>Greenville, NC</td><td>BI-397</td></tr><tr><td>Vancomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>St. Louis, MO</td><td>C5793</td></tr><tr><td>Cation Adjusted Mueller Hinton Broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>Sparks, MD</td><td>212322</td></tr><tr><td>Lysed horse blood</td><td>Cleveland Scientific</td><td>Bath, OH</td><td></td></tr><tr><td>Dose-it peristaltic pump</td><td>Integra Biosciences</td><td>Hudson, NH</td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel pipet (Viaflo II)</td><td>Integra</td><td>Hudson, NH</td><td>4164</td></tr><tr><td>12 channel pipet (Matrix)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>Single channel pPipets (Ovation 10 &micro;l - 100 &micro;l)</td><td>VistaLab</td><td>Brewster, NY</td><td></td></tr><tr><td>96 well microplate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>Monroe, NC</td><td>650161</td></tr><tr><td>50 ml flat cap conical bottom centrifuge tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>16x125 mm disposable glass tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>12x17 mm snap cap, polystyrene tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>16 ml centrifuge tubes</td><td>BioExpress</td><td>Kaysville, UT</td><td>C-3394-2</td></tr><tr><td>Reagent reservoirs</td><td>Integra Biosciences</td><td>Hudson, NH</td><td>4312</td></tr><tr><td>Disposable sterile lLoops (1 &micro;l &amp; 10 &micro;l)</td><td>Biologix</td><td>Lenexa, KA</td><td>65-0001,65-0010</td></tr><tr><td>Tryptic soy agar + 5% sheep blood</td><td>Becton Dickinson</td><td>Sparks, MD</td><td></td></tr><tr><td>Incubator (ambient)</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator (5% CO2)</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>Handschoenen</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td>52817</td></tr><tr><td>Labjassen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
```

referentie bouillon microverdunningsplaten methode voor dalbavancin<em&gt; in vitro</em&gt; gevoeligheid testen van bacteriën die anbao grow

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobiële gevoeligheidstests (AST) wordt uitgevoerd om de in vitro activiteit van antimicrobiële middelen tegen verschillende bacteriën beoordelen. De AST resultaten die worden uitgedrukt als minimale remmende concentraties (MIC&#39;s) worden gebruikt in onderzoek naar antimicrobiële ontwikkeling en monitoring van resistentieontwikkeling en in de klinische setting voor antimicrobiële therapie begeleiding. Dalbavancin is een semi-synthetisch lipoglycopeptide antimicrobieel middel dat mei 2014 door de Food and Drug Administration (FDA) werd goedgekeurd voor de behandeling van acute bacteriële huid en de huid structuur infecties veroorzaakt door Gram-positieve organismen. Het voordeel van dalbavancin dan huidige anti-stafylokokken therapieën zijn lange halfwaardetijd, die zorgt voor eenmaal per week dosering. Dalbavancin heeft activiteit tegen Staphylococcus aureus (zowel methicilline-gevoelige S. aureus [MSSA] en methicilline-resistente S. aureus [MRSA]), coagulase-negatieve stafylokokken, <em&gt; Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus groep, β-hemolytische streptokokken en vancomycine gevoelig enterokokken. Net als andere recente lipoglycopeptide middelen, optimalisering van CLSI en ISO bouillon gevoeligheid testmethoden omvat het gebruik van dimethylsulfoxide (DMSO) als oplosmiddel bij de voorbereiding voorraadoplossingen en polysorbaat 80 (P80) om hechting van het middel aan plastic verlichten. Vóór de klinische studies en tijdens de initiële ontwikkeling van dalbavancin werden gevoeligheid studies niet uitgevoerd met gebruik van P-80 en MIC resultaten neiging om 2-4 maal hoger en eveneens hogere MIC resultaten werden verkregen met de agar verdunning gevoeligheid methode. Dalbavancin werd voor het eerst opgenomen in CLSI bouillon microverdunningsplaten methodologie tafels in 2005 en gewijzigd in 2006 om het gebruik van DMSO en P-80 te verduidelijken. De brij microdilutie (BMD) die hier wordt getoond is specifiek voor dalbavancin en conform de CLSI en ISO-methoden, stap voor stap detail en focons op de kritische stappen toegevoegd voor de duidelijkheid.

Gestandaardiseerde MIC methoden nodig om resistentie, een belangrijke doelstelling van verscheidene antimicrobiële bewakingsprogramma&#39;s controleren. Dalbavancin MIC resultaten voor isolaten in Europa en de VS geïnd 2011-2013 waren &lt;0,25 g / ml voor 99,9% van S.aureus en 100% van streptokokken (Tabel 4). Om het belang van het gebruik van verse (verzegeld) DMSO, drievoud testen van dalbavancin BMD MICs voor QC stammen S. beoordelen aureus ATCC 29213 en E. faecalis ATCC 29.212 en dubbele tests voor S. pneumoniae ATCC 49619 werd uitgevoerd onder toepassing van (1) DMSO uit verzegelde ampullen, (2) DMSO uit een 1 L fles die was op de vervaldatum en werden vroeger voor 2 jaar en (3) een hoeveelheid van DMSO uit dezelfde 1 L bottle (monster 2) dat liet zitten in een open beker gedurende 72 uur voor gebruik. Dalbavancin MIC resultaten met behulp van panelen met drie DMSO monsters waren vergelijkbaar en winnen de aanvaardbare QC bereik (Tabel 5). Het verlies van dalbavancin activiteit na blootstelling van de voorraadoplossing kunststof en zonder de toevoeging van P-80 is goed gedocumenteerd 7. In 2 aanvullende studies, de toevoeging van P-80 van de basis- en intermediaire voorraadoplossingen (tabel 6) en het gebruik van glas of plastic buizen voor de bereiding van de eerste en tussengelegen voorraadoplossingen (Tabel 7) had geen effect op de dalbavancin MIC resultaten. Er was ook geen effect op dalbavancin MIC resultaten bij polypropeen en polystyreen platen drie fabrikanten gebruikt (Tabel 7). De aanwezigheid van gelyseerd paarden bloed in de bouillon media voor het testen van streptokokken is aangetoond dat een surfactant-achtige activiteit, vergelijkbaar met P-80 7, 8 hebben. De dalbavancin referentiemethode voor streptococcus heeft zowel P-80 en gelyseerd paardenbloed omvatten ,In tegenstelling stafylokokken en enterokokken, dalbavancin MIC resultaten voor streptokokken vergelijkbaar (binnen +/- 1 verdunning) met en zonder de toevoeging van P-80. Zoals eerder voorgesteld en getoond in figuur 1, dalbavancin agar verdunning (AD) MIC typisch 2-8 maal hoger in vergelijking met de huidige BMD referentie 12, 13, 14. Anders BMD, toevoeging van 0,002% P-80 niet invloed dalbavancin AD MIC resultaten 12. <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028eq1.jpg" /> Vergelijking 1: Voorbeeld van dalbavancin Stock Solution Voorbereiding Voorbereiding stappen voor 25 ml van 800 ug / ml dalbavancin oplossing.. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028fig1.jpg" /> Figuur 1. Vergelijking van dalbavancin en Vancomycine BMD naar AD. De resultaten van de studie die dalbava vergelijkingncin en vancomycine BMD en AD MIC resultaten voor bepaalde Gram-positieve bacteriële isolaten. Gemiddelde (A) dalbavancin en (B) Vancomycine Broth microdilutie en Agar Verdunning MIC-resultaten in mg / ml voor 15 Staphylococcus aureus, 8 coagulasepositieve negatieve stafylokokken (CNS), 5 Enterococcus faecalis en 14 streptokokken (groepen A, B en C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53028/53028fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> EEN </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL; 0.06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> B </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> C </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL0.12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> D </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> E </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td&gt; <td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> F </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> G </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 00,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> H </td><td> DAL 0.002 </td><td> DAL 0.004 </td><td> DAL 0.008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> DAL </td><td colspan="2"> Dalbavancin </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td&gt; </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="12"> De concentraties worden vermeld in ug / ml na 50 gl / putje inoculatie </td></tr></tbody></table> Tabel 1. MIC Plate formaat. De 96 well plaat formaat met de locatie van dalbavancin verdunningen en de positieve controle putten als voorbeeld gebruikt in deze video publicatie <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Source Conc. (ug / ml) </td><td> Volume Source (ml) </td><td> Volume DMSO (ml) </td><td> Intermediate Conc. in DMSO (ug / ml) </td><td> Volume Intermediate Conc. (ml) </td><td> Volume CAMHB + 0,004% P80 * (ml) </td><td> 2X Conc. Na 1: 100 verdunning in CAMHB (ug / ml) </td><td> Final Panel Conc. Na inoculatie (ug / ml) </td></tr><tr><td> 800 </td><td> 1.0 </td><td>1.0 </td><td> 400 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 4 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 200 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0.5 </td><td> 1.5 </td><td> 100 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0.5 </td><td> 3.5 </td><td> 50 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 25 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.25 </td><td> 0,125 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.5 </td><td> 1.5 </td><td> 12.5 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,125 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.5 </td><td> 3.5 </td><td> 6.25 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0,5 &lt;/ td&gt; <td> 0.5 </td><td> 3.13 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0.5 </td><td> 1.5 </td><td> 1.5 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0.5 </td><td> 3.5 </td><td> 0.8 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,008 </td><td> 0,004 </td></tr><tr><td> 0.8 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.4 </td><td> 0.02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,004 </td><td> 0,002 </td></tr><tr><td colspan="5"> Deze tabel is gewijzigd van CLSI M100-S25, Tabel 8B 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 2. schema voor het bereiden verdunningen van water onoplosbare Antimicrobial Agents worden gebruikt in Bouillon Verdunningen gevoeligheid testen. De volumes van dalbavancin werkende oplossingen en verdunners voor de voorbereiding van de definitieve MICdalbavancin oplossingen van 0,002-2 mg / ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Kwaliteitscontrole Strain </td><td> Verwacht dalbavancin MIC (ug / ml) </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 0,03-0,12 </td></tr><tr><td> E. faecalis ATCC 29.212 </td><td> 0,03-0,12 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 0,008-0,03 </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Verwachte dalbavancin MIC Resultaten voor Quality Control Stammen 3, 11. CLSI kwaliteitscontrole resultaten voorgesteld stammen te testen, samen met klinische isolaten om een goede methodologie te controleren <img alt="Tabel 4" src="/files/ftp_upload/53028/53028table4.jpg" /> Tabel 4. Verdeling van dalbavancin MIC Resultaten (Aantal bij elke MIC) uit de VS en de Europese 2011-2013 Surveillkomstig Study 15. Dalbavancin MIC resultaten van een gepubliceerde studie van recente klinische isolaten als aanwijzing voor de huidige dalbavancin in vitro activiteit. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup></colgroup><tbody><tr><td rowspan="2"> Isoleren # </td><td colspan="3"> Dalbavancin MIC (ug / ml) </td></tr><tr><td> DMSO 1 </td><td> DMSO 2 </td><td> DMSO 3 </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 0.12 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.12 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29.212 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td rowspan="2"><em&gt; S. pneumoniae ATCC 49.619 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 1 = Ongeopende vlam verzegelde 10 ml ampullen </td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO 2 = vaak geopend 1L fles </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 3 = Veel geopend 1L fles - zat op een bankje in ongedekte beker voor 72 uur </td></tr></tbody></table> Tabel 5. dalbavancin MIC Resultaten (ug / ml) met behulp van DMSO Stock en Intermediate verdunningen Voorbereiding met DMSO van 3 Sources. De resultaten van een studie die dalbavancin MIC effect van het gebruik van verschillende oplosmiddelen DMSO ter voorbereiding van de dalbavancin voorraad en intermediaire verdunningen vergeleken. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Isoleer Aantal </td><td rowspan="2"> Repliceren Aantal </td><td colspan="2"> Dalbavancin MIC (ug / ml) </td></tr><tr><td> DALB w / P80 in DMSO </td><td> DALB w / o P80 in DMSO </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> S. aureus klinische DP80-002SA </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 700.699 </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td>S. pyogenes klinisch: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-004PY </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-005PY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-006PY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-007PY </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-008PY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> S. agalactiae klinische: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-009AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.12 </td></tr><tr><td> DP80-010AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-011AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> DP80-012AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> S. dysgalactiae Clinical DP80-013DY </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae klinisch: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-014SP </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> DP80-015SP </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-016SP </td><td> 1 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> DP80-017SP </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr></tbody></table> Tabel 6. dalbavancin MIC resultaten met behulp van DMSO Stock en Intermediate Verdunningen Voorbereiding met en zonder 0,002% P-80. De resultaten van een studie die dalbavancin MIC effect van het toevoegen van 0,002% P-80 te dalbavancin voorraad en intermediaire verdunningen vergeleken. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="3"> Isoleren </td><td rowspan="3"> Repliceren Aantal </td&gt; <td colspan="4" rowspan="2"> Verwatering Tubes </td><td colspan="4"> Microtiterplaat (Plastic) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Poly-propyleen, Greiner </td><td colspan="3"> Polystyreen </td></tr><tr><td> Glas </td><td> Plastic </td><td> Plastic 1 uur </td><td> Plastic 1uur / Intermediate 1uur </td><td> Greiner </td><td> Corning </td><td> Nunc </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29.212 </td><td&gt; 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td><td> 0.03 </td><td> 0.06 </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td rowspan="2"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td colspan="10"> Glas = Beginvoorraad in glazen fles, die onmiddellijk tussenliggende concentratie te makens in plastic buizen, onmiddellijk wordt gebruikt voor bouillon verdunningen te maken. </td></tr><tr><td colspan="10"> Plastic = Beginvoorraad in plastic centrifugebuis, onmiddellijk wordt gebruikt om intermediaire concentraties te maken in plastic buizen, onmiddellijk wordt gebruikt voor bouillon verdunningen te maken. </td></tr><tr><td colspan="10"> Plastic 1 uur = Beginvoorraad in plastic centrifugebuis, laat zitten op de bank gedurende 1 uur vervolgens gebruikt om intermediaire concentraties te maken in plastic buizen, onmiddellijk wordt gebruikt om de concentratie te maken in bouillon. </td></tr><tr><td colspan="10"> Plastic 1 hr / Intermediate 1 uur = Beginvoorraad in plastic centrifugebuis, laat zitten op de bank gedurende 1 uur vervolgens gebruikt om intermediaire concentraties te maken in plastic buizen, laat zitten op de bank gedurende 1 uur vervolgens gebruikt om de concentratie te maken in bouillon. </td></tr></tbody></table> Tabel 7. dalbavancin MIC resultaten met behulp van Stock verdunningen Voorbereiding in plastic en glazen buizen en MIC Plate Plastic Types. Resultaten ofa dalbavancin MIC studie die effect van het gebruik van plastic of glazen buizen bij het opstellen van de voorraad oplossingen en ook effect van het gebruik van verschillende bronnen en soorten kunststof voor microtiterplaten vergeleken.

Hier presenteren we een protocol voor de bepaling van dalbavancine-gevoeligheid van klinisch relevante grampositieve bacteriën met behulp van een bouillon microdilutie referentiemethode.

Referentie Bouillon microverdunningsplaten Methode voor dalbavancin<em&gt; In Vitro</em&gt; Gevoeligheid testen van Bacteriën die aNBAO Grow

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

Het algemene doel van de volgende procedure is het bepalen van de minimale inhiberende concentratie voor dalbavancine. Om dit te bereiken wordt de methode van bouillonmicroverdunning gebruikt, met de nadruk op de belangrijkste stappen die specifiek zijn voor dalbavancine. De stamoplossing en tussenverdunningen van dalbavancine worden bereid in DMSO en de uiteindelijke verdunningen worden gemaakt in kationen-geadjusteerde Mueller-Hinton-bouillon aangevuld met polysorbaat.De verdunningen worden verdeeld over een 96-well plaat en geïnoculeerd met een gestandaardiseerde bacteriesuspensie. De plaat wordt vervolgens 16 tot 24 uur geïncubeerd en onderzocht om de minimale hoeveelheid dalbavancine te bepalen die nodig is om de bacteriële groei te remmen. Naleving van deze gestandaardiseerde methode garandeert consistente resultaten met zowel klinische isolaten als, zoals hier getoond, kwaliteitscontrole-isolaten. Dalbavancine is een semisynthetisch lipoglycopeptide antimicrobieel middel dat in mei 2014 door de FDA werd goedgekeurd voor de behandeling van acute bacteriële huid- en huidstructuurinfecties veroorzaakt door grampositieve organismen.Deze methode beschrijft de gestandaardiseerde bouillon-microdilutiemethode voor daptomycine, waarbij DMSO wordt gebruikt voor het bereiden van stamoplossingen in polysorbaat 80 om aanhechting van het middel aan plastic te verminderen. Een visuele demonstratie van deze methode is nuttig, aangezien de stappen voor het bereiden van de stamoplossing en de MIC-plaatoplossing afwijken van die van de meeste antimicrobiële middelen. Deze stappen zijn specifiek voor lipoglycopeptide-middelen en moeten nauwgezet worden gevolgd om reproduceerbare en nauwkeurige MIC-resultaten te verkrijgen.De procedure zal worden gedemonstreerd door Gina Fisher, een wetenschappelijk onderzoeker uit mijn laboratorium. Houd er rekening mee dat er passende veiligheidsmaatregelen in overeenstemming met biosafety level two moeten worden genomen bij het uitvoeren van de volgende procedure. Begin met het afwegen van de juiste hoeveelheid dalbavancin om een stamoplossing van 800 µg/mL te bereiden.Voeg de juiste hoeveelheid zuivere DMSO toe aan een steriele glazen of plastic buis, breng vervolgens het poeder over naar de buis en vortex dit. Gebruik daarna de DALBAVANCIN-stamoplossing van 800 µg/mL om 100 x de uiteindelijke MIC-plaatconcentraties voor te bereiden, zoals weergegeven in kolom één tot en met vier. Deze worden aangeduid als de tussenconcentraties.Het totaal voorbereide volume is afhankelijk van het aantal MIC-panels. Verdun vervolgens de tussenconcentraties 1 op 100 in kation-niet-gecorrigeerd Mueller-Hinton-bouillon, ook wel bekend als C-A-M-H-B, aangevuld met 0,004% P 80. De resulterende werkconcentratie van DALBAVANCIN en P 80 is tweemaal de uiteindelijke concentratie.Aangezien de toevoeging van het inoculum zal resulteren in een verdunning van één op twee, breng dan met een multichannelpipet met steriele tips 50 µL van elke verdunning van dalbavancine aan in de juiste putjes van het steriele microverdunningspaneel van 96 putjes. Het MIC-plaatformaat maakt het mogelijk om acht inocula per plaat te testen. Indien de panelen niet onmiddellijk worden gebruikt, seal ze dan met plastic folie, plaats ze vervolgens in plastic zakken en bewaar ze in een vrieskast zonder ontdooifunctie bij ten minste -60 °C tot ze nodig zijn.In deze demonstratie zal één vers bereide plaat worden geïnoculeerd. Om het inoculum voor te bereiden, selecteert u enkele goed geïsoleerde kolonies van een 18 tot 24 uur oude bloedagarplaat of een andere niet-selectieve agarplaat. Hier worden kwaliteitscontrole s aria- en EPHI callous-stammen gebruikt.Raak de bovenkant van elke kolonie aan met een steriel wattenstaafje en breng een deel hiervan over naar een buis met één tot vijf milliliter C-A-M-H-B of zoutoplossing. Blijf dit overbrengen totdat de troebelheid overeenkomt met een 0,5 McFarland-standaard binnen 15 tot 30 minuten na bereiding; verdun het inoculum een op 100 in C-A-M-H-B om een uiteindelijke concentratie van vijf × 10⁵ CFU per milliliter te bereiken. Het acceptabele bereik is twee tot acht × 10⁵ CFU per milliliter.Breng onmiddellijk met een meerkanaalpipet met steriele tips 50 µL van het uiteindelijke inoculum over naar elke betreffende put van de MIC-paneelplaat. Vier rijen worden geïnoculeerd met elk van de twee isolaten, voor een totaal van vier replica's per isolaat. Gebruik vervolgens een pipet om, ter controle van de zuiverheid, 1 tot 10 µL van de oplossing in de positieve groeicontrole over te brengen naar een niet-selectieve agar, zoals tryptische soja-agar met 5% schapenbloed.Gebruik een steriele entlus om de oplossing over het oppervlak van de plaat te verspreiden. Draai de plaat 90 graden en strijk opnieuw om te garanderen dat het inoculum gelijkmatig is verdeeld. Dek de plaat af en zet deze opzij.Ter voorbereiding op een kolonietelling wordt met een enkelkanaalpipet 10 µL van de oplossing in de groeicontrolput overgebracht naar 10 mL zoutoplossingmix, waarna 100 µL met een steriele lus wordt overgebracht naar een geschikt niet-selectief agarmedium, zoals tryptone-soja-agar met 5% schapenbloed; verspreid de oplossing over het gehele agaroppervlak. Herhaal dit proces twee keer in verschillende richtingen om een gelijkmatige distributie van het inoculum te waarborgen. Stap vervolgens maximaal vier MIC-panels op elkaar in een plastic container, waarbij wordt gecontroleerd of het bovenste panel stevig met een deksel is afgesloten.Plaats vervolgens een vochtig papieren handdoekje in de plastic container en sluit deze stevig met het deksel binnen 30 minuten na inoculatie. Incubeer de MIC-panels, de plaat voor het kolonietelling en de plaat voor de zuiverheidscontrole in een incubator met omgevingslucht bij 35 plus of minus twee graden Celsius gedurende 16 tot 20 uur. Lees de volgende dag de minimale remmende concentratie af als de laagste concentratie die bacteriële groei in de wells volledig remt, zoals waarneembaar met het blote oog.Bepaal het aantal kolonies op de plaat voor de kolonieselling. Vermenigvuldig het getelde aantal met de verdunningsfactor. Bijvoorbeeld, 50 kolonies vermenigvuldigd met een verdunningsfactor van 10.000 is gelijk aan vijf keer 10 tot de vijfde CFU per milliliter.Een acceptabel bereik is 20 tot 80 kolonies, wat gelijkstaat aan twee tot acht keer 10⁵ colony forming units per ml. De concentratie van het inoculum is een belangrijke variabele om de gevoeligheidstesten te beheersen en nauwkeurige resultaten te verkrijgen. Controleer tot slot de zuiverheidsplaat.Als alle kolonies vergelijkbaar zijn met de kolonies die als inoculum zijn gebruikt, kan de cultuur als zuiver worden beschouwd. Indien er andere kolonies aanwezig zijn, is er een kans op contaminatie in het MIC-paneel en moet de test worden herhaald. Voor DAL bevans werden de MIC-resultaten vergeleken met die verkregen via de agri-dilutiemethode, zoals hier wordt getoond.Agri-MIC-resultaten voor Dal bevans zijn doorgaans twee tot acht keer hoger dan die van bouillon-microdilutie (MIC-resultaten). Dit staat in contrast met de resultaten voor vancomycine, die vergelijkbaar zijn tussen de bouillon- en agri-methoden.Daarom wordt agar-verdunning niet aanbevolen voor het testen van dalbavancin-bouillon. De resultaten van de micro-verdunnings-MIC voor kwaliteitscontrole moeten binnen de verwachte bereiken liggen, zoals hier getoond. Het kwaliteitscontrole-organisme SS, A TCC 2 9 2 1 3 met een zeer duidelijke modale MIC van 0,06 micrograms per milliliter, is een goede indicator gebleken voor methodevariatie.Als de verkregen resultaten buiten de verwachte bereiken voor de kwaliteitscontroleorganismen vallen of neigen naar de lage of hoge kant van het bereik, is verdere validatie van de methode gerechtvaardigd. Naast het valideren van de methode met behulp van kwaliteitscontroleorganismen voor dalbavancine, kunnen MIC-gegevens van regionale antimicrobiële surveillanceprogramma's een basis bieden voor de te verwachten MIC-resultaten in de klinische laboratoriumomgeving; zoals hier getoond, waren de Dal b Anson MIC-resultaten voor isolaten verzameld in Europa en de VS van 2011 tot 2013 minder dan 0,25 micrograms per milliliter voor 99,9% van de SIU's en 100% van de streptokokken. Op basis van deze surveillancedata is het duidelijk dat dalbavancine MIC-resultaten voor stafylokokken en streptokokken die hoger zijn dan 0,12 micrograms per milliliter zeldzaam zijn.Indien hogere waarden worden waargenomen, dient de test te worden herhaald en/of naar een referentielaboratorium te worden gestuurd voor validatie. De bereiding van de voorraadverdunning in DMSO en de toevoeging van P 80 aan de bouillonverdunning bij een concentratie van 0,002% in de uiteindelijke MIC-well zijn de kritische stappen voor het verkrijgen van nauwkeurige en reproduceerbare dalbavancine MIC-resultaten. Zoals altijd, maar met name op het gebied van de ontwikkeling van bacteriële resistentie, zijn nauwkeurige resultaten van antimicrobiële gevoeligheid cruciaal voor de keuze van de clinicus voor een passende therapie.

a-reference-broth-microdilution-method-for-dalbavancin-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Antimicrobiële gevoeligheid testen van Mycobacterium tuberculosis is een uitdaging, maar essentieel voor de patiëntenzorg. Dit microtiterplaat formaat biedt het testen van 12 antimycobacteriële drugs en zorgt voor minimale remmende concentratie (MIC) waarden, die zal helpen bij een passende behandeling.

Antimicrobiële gevoeligheid testen van Mycobacterium tuberculosis-complex voor de eerste en tweede lijn drugs door de bouillon verdund in een microtiterplaat Format

De huidige diagnostische antimicrobiële gevoeligheid testen is gebaseerd op de groei van plankton isolaten in voedselrijk, aërobe omstandigheden. Hier maken we gebruik van een alternatieve kunstmatige sputum medium om antimicrobiële gevoeligheid van Pseudomonas aeruginosa biofilms te bestuderen onder zowel aërobe en Microaërofiele voorwaarden meer representatief zijn voor de cystic fibrosis long.

Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In Voorwaarden relevanter voor de Cystic Fibrosis Lung

Source: Koeth, L. M., et. al., A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the broth microdilution method for determining the minimum inhibitory concentration (MIC) of a lipoglycopeptide antibiotic against Gram-positive bacteria. It covers bacterial colony isolation, dilution, inoculation of microplate wells with varying antibiotic concentrations, and verification of culture...

A Broth Microdilution Method for Antibiotic Susceptibility Testing of Gram-Positive Bacteria

This video demonstrates a microtiter plate-based method for determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of test antibiotics against bacteria. Upon adding a suspension of the bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa to a microtiter plate containing serial dilutions of a test antibiotic, and an inhibitor of the production of pyomelanin by the bacteria, the optical density of the wells is measured to compute the minimum inhibitory concentration of the antibiotic, and the impact of the...

A Microtiter Plate Method to Assess the Minimum Inhibitory Concentration of an Antibiotic

This video demonstrates an in vitro assay to screen antifungal compounds using a broth microdilution assay. Test compounds are serially diluted in a microtiter plate and incubated with a fungal inoculum. Post-incubation, the plate is examined for wells without visible fungal growth to assess the antifungal potential of the test compounds and their minimum inhibitory concentration (MIC).

An In Vitro Broth Microdilution Assay for the Screening of Antifungal Compounds

De kolen agar rezazurin assay (CARA) is een semi-kwantitatief, medium-doorvoer methode om de activiteit van testmiddelen te beoordelen tegen mycobacteriën die zich vermenigvuldigen, niet vermenigvuldigen of beide. De CARA maakt een snelle evaluatie mogelijk van tijd- en concentratie-afhankelijke activiteit en identificeert parameters om na te streven door kolonievormende eenheid (CFU) assays.

Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

Een eenvoudig en flexibel Bouillon microdilution methode voor het screenen van antischimmel verbindingen en extracten.

Bouillon Microdilution In Vitro Screening: een gemakkelijke en snelle methode om te ontdekken van nieuwe antischimmel Compounds

Antimicrobiële synergie testen wordt gebruikt ter beoordeling van het effect van twee of meer antibiotica in combinatie gebruikt en worden doorgaans uitgevoerd door een van twee methoden: de dambord array of de bepaling van de tijd-doden. Hier presenteren we een geautomatiseerd, inkjet printer-bijgewoonde dambord matrix synergie techniek en een studie van de klassieke tijd-kill synergie.

Antimicrobiële synergie testen door de Inkjet Printer-bijgewoonde geautomatiseerde dambord matrix en de handmatige methode van de tijd-kill

Dit protocol presenteert een snelle antimicrobiële gevoeligheidstest (ASAT) binnen 2,5 uur door eencellige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van het D2O-metabolisme. Deze methode is van toepassing op bacteriën in de urine of volbloedomgeving, die transformerend is voor snelle eencellige fenotypische ASAT in de kliniek.

Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie

Beschrijven we een eenvoudige, snelle en robuuste methode voor de vorming...

Een 96 Goed microtiterplaat-gebaseerde methode voor de controle Formation en schimmelwerende gevoeligheid testen van Candida albicans Biofilms

Leer de broth microverdunningsmethode voor dalbavancin gevoeligheidstesten van Gram-positieve bacteriën. Dit protocol toont unieke voorbereidingsstappen met DMSO en polysorbate 80 voor nauwkeurige MIC-bepaling.

Referentie Bouillon microverdunningsplaten Methode voor dalbavancin

Meer video's verkennen