Referentie Bouillon microverdunningsplaten Methode voor dalbavancin In Vitro Gevoeligheid testen van Bacteriën die aNBAO Grow
9 september 2015
Hier presenteren we een protocol voor de bepaling van dalbavancine-gevoeligheid van klinisch relevante grampositieve bacteriën met behulp van een bouillon microdilutie referentiemethode.
Het algemene doel van de volgende procedure is om de minimale remmende concentratie voor dalbavancine te bepalen. Gebruik hiervoor de bouillonmicrodilutiemethode met de nadruk op de belangrijkste stappen die uniek zijn voor Dalbavancin. Voorraad en intermediaire verdunning van dalbavancin worden gemaakt in DMSO en de uiteindelijke verdunning wordt gemaakt in kation op aangepaste Mueller Hinton-bouillon, aangevuld met polysorbaat.
De verdunning wordt uitgedeeld in een 96-wellplaat en geïnoculeerd met een gestandaardiseerde suspensie van bacteriën. De plaat wordt vervolgens 16 tot 24 uur geïncubeerd en onderzocht om de minimale hoeveelheid dalbavancin te bepalen die nodig is om bacteriegroei te remmen. Het volgen van deze gestandaardiseerde methode zal consistente resultaten garanderen met zowel klinische isolaten als, zoals hier getoond, kwaliteitscontrole-isolaten Dalbavancin is een semisynthetisch lipoglykopeptide antimicrobiële middel dat in mei 2014 door de FDA werd goedgekeurd voor de behandeling van acute bacteriële huid- en huidstructuurinfecties veroorzaakt door grampositieve organismen.
Deze methode beschrijft de gestandaardiseerde bouillon, microdilutie-gevoeligheidsmethode voor dassin, die het gebruik van DMSO omvat voor het bereiden van voorraadoplossingen in polysorbaat 80 om het vastklampen van het middel aan plastic te verminderen. Visuele demonstratie van deze methode is nuttig. Aangezien de stappen voor de bereiding van voorraad- en MIC-plaatoplossingen niet typisch zijn in vergelijking met de meeste antimicrobiële middelen. Deze stappen zijn uniek voor lipoglykopeptide middelen en zijn belangrijk om te volgen om reproduceerbare en nauwkeurige MIC-resultaten te bereiken.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Gina Fisher, een onderzoekswetenschapper uit mijn laboratorium. Houd er rekening mee dat passende veiligheidsmaatregelen die consistent zijn met bioveiligheidsniveau twee, moeten worden toegepast bij het uitvoeren van de volgende procedure. Begin met het afwegen van de juiste hoeveelheid dalbavancin om een voorraadoplossing van 800 microgram per milliliter te bereiden.
Voeg de juiste hoeveelheid NEAT DMSO toe aan een steriele glazen of plastic buis, breng vervolgens het poeder over naar de buis en vortex het. Vervolgens. Gebruik de 800 microgram per milliliter DALBAVANCIN voorraadoplossing om 100 x eind MIC-plaatconcentraties te bereiden zoals getoond in kolommen één tot vier. Deze worden aangeduid als de intermediaire concentraties.
Het totale bereide volume hangt af van het aantal MIC-panelen. Ten slotte verdun de intermediaire concentraties met een factor een tot 100 in kation niet-aangepaste Mueller Hinten-bouillon, ook bekend als C-A-M-H-B, aangevuld met 0,004%P 80. De resulterende werkconcentratie van DALBAVANCIN en P 80 is twee keer de eindconcentratie.
Aangezien de toevoeging van inoculum resulteert in een verdunning van één op twee, gebruikt u een multikanaals pipette met steriele tips om 50 microliter van elke verdunning van dalbavancin in de juiste putjes van de 96-well steriele microdilutiepanel uit te delen. Het MIC-plaatformaat maakt het mogelijk om acht inocula per plaat te testen. Als de panelen niet onmiddellijk worden gebruikt, breng dan plastic folie aan om ze te verzegelen, plaats ze in plastic zakken en bewaar ze in een niet-ontdooiende vriezer bij minimaal minus 60 graden Celsius totdat ze nodig zijn.
In deze demonstratie zal één vers bereid plaatje worden geïnoculeerd. Om het inoculum voor te bereiden, selecteert u verschillende goed geïsoleerde kolonies van een 18 tot 24 uur bloedauger of andere niet-selectieve augerplaat. Hier worden kwaliteitscontrole s aria en EPHI calloze stammen gebruikt.
Raak de bovenkant van elke kolonie aan met een steriele doek en breng een deel ervan over in een buis met een tot vijf milliliter C-A-M-H-B of zoutoplossing. Blijf overbrengen totdat de troebelheid overeenkomt met een 0,5 McFarland-standaard binnen 15 tot 30 minuten na de bereiding. Verdun het inoculum een op 100 in C-A-M-H-B om een eindconcentratie van vijf maal 10 tot de vijfde CFU per milliliter te bereiken. Het acceptabele bereik is twee tot acht maal 10 tot de vijfde CFU per milliliter.
Gebruik onmiddellijk een multikanaals pipette met steriele tips om 50 microliter van het uiteindelijke inoculum over te brengen naar elk geschikt putje van de MIC-paneelplaat hier. Vier rijen worden geïnoculeerd met elk van de twee isolaten voor een totaal van vier replica's per isolaat. Gebruik vervolgens een pipette om een oplossing van één tot 10 microliter in de positieve groeicontrole over te brengen naar een niet-selectieve agar, zoals try decay's sojaagar met 5%schapenbloed, om een zuiverheidscontrole uit te voeren.
Gebruik een steriele lus om de oplossing over het oppervlak van de plaat te verspreiden. Draai de plaat 90 graden en streek opnieuw om te zorgen dat het inoculum gelijkmatig is verdeeld. Dek de plaat af en zet deze opzij.
Voorbereiding van een kolonietelling, gebruik een enkele kanaalpipette om 10 microliter van de oplossing in de groeicontroleput over te brengen naar 10 milliliter zoute mix en breng vervolgens 100 microliter over naar een geschikt niet-selectief agrimedium, zoals try toay sojaagar met 5%schapenbloed, met behulp van een steriele lus verspreid de oplossing over het gehele agrioppervlak. Herhaal dit proces twee keer in verschillende richtingen om een gelijkmatige verdeling van het inoculum te garanderen. Stapel vervolgens maximaal vier MIC-panelen in een plastic container en zorg ervoor dat het bovenste paneel stevig is afgesloten met een deksel.
Plaats vervolgens een vochtige papieren handdoek in de plastic container en sluit deze binnen 30 minuten na inoculatie veilig met het deksel. Incubeer de MIC-panelen, de kolonietellingplaat en de zuiverheidscontroleplaat in een omgevingsluchtincubator bij 35 plus min twee graden Celsius gedurende 16 tot 20 uur. De volgende dag leest u de minimale remmende concentratie als de laagste concentratie die bacteriegroei in de
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het bepalen van de gevoeligheid van Gram-positieve bacteriën voor dalbavancine met behulp van een bouillonmicrodilutiemethode. De nadruk ligt op cruciale stappen die specifiek zijn voor dalbavancine om nauwkeurige resultaten te garanderen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Microbiologie
- Farmacologie
- Antimicrobiële gevoeligheidstests
Achtergrond
- Dalbavancine is een semisynthetisch lipoglycopeptide antimicrobieel middel.
- In mei 2014 door de FDA goedgekeurd voor de behandeling van acute bacteriële huidinfecties.
- Het bepalen van de minimale inhiberende concentratie (MIC) is essentieel voor een effectieve behandeling.
- Gestandaardiseerde methoden zijn noodzakelijk voor reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol vast te stellen voor het testen van de gevoeligheid voor dalbavancine.
- Om de unieke bereidingsstappen voor dalbavancine te benadrukken in vergelijking met andere antimicrobiële middelen.
- Om consistente resultaten te garanderen bij klinische en kwaliteitscontrole-isolaten.
Gebruikte methoden
- Bereiding van stockoplossingen van dalbavancine in DMSO.
- Gebruik van kation-geadjusteerd Mueller Hinton-bouillon aangevuld met polysorbaat 80.
- Verdelen van verdunningen in een 96-wellplaat en inoculeren met gestandaardiseerde bacteriële suspensies.
- Incubatie en onderzoek naar remming van bacteriële groei.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle bepaling van de MIC voor dalbavancine tegen de geteste stammen.
- Aantoonbare reproduceerbaarheid van resultaten met klinische isolaten.
- Belang van het handhaven van juiste inoculumconcentraties voor nauwkeurige gevoeligheidstests.
- Visuele demonstratie van de methode bevordert het begrip van de unieke voorbereidingsstappen.
Conclusies
- De methode van bouillonmicrodilutie is effectief voor het beoordelen van de gevoeligheid voor dalbavancine.
- Naleving van het protocol garandeert betrouwbare en reproduceerbare resultaten.
- Verdere studies kunnen dieper ingaan op de implicaties van het gebruik van dalbavancine in klinische settings.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Nauwkeurige bepaling van de antimicrobiële gevoeligheid is essentieel voor de ontwikkeling van antimicrobiële middelen en resistentiemonitoring, en is direct bepalend voor go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase. De lange halfwaardetijd en het wekelijkse doseringsschema van dalbavancine maken het een strategische kandidaat voor programma's tegen Gram-positieve infecties, maar een betrouwbare bepaling van de MIC vereist gespecialiseerde behandeling vanwege de lipoglycopeptide eigenschappen. Deze gestandaardiseerde bouillonmicroverdunningsmethode zorgt voor reproduceerbare MIC-gegevens met een lage variabiliteit, waardoor mechanische ambiguïteit bij targetvalidatie wordt verminderd en het voorspellend vertrouwen bij lead-optimalisatie wordt ondersteund.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt nauwkeurige analyse van de remmende activiteit van dalbavancine tegen Gram-positieve pathogenen mogelijk, waardoor doelwitinteractie en het werkingsmechanisme worden verduidelijkt.
- Operationele waarde: Vermindert variabiliteit in MIC-resultaten door adhesieproblemen aan te pakken via de bereiding van DMSO-voorraadoplossingen en supplementatie met polysorbaat 80, wat de robuustheid van de assay verbetert.
- Voorspellende waarde: Genereert consistente MIC-gegevens met een lage fold-change die in lijn zijn met surveillancetrends, wat een betrouwbare rangschikking van de potentie bij lead-identificatie ondersteunt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve MIC-resultaten die dienen als een gestandaardiseerde benchmark voor het vergelijken van de potentie van verbindingen over verschillende screeningscampagnes.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van een 96-wells formaat dat compatibel is met high-throughput workflows, wat schaalbare tests van meerdere stammen en replica's mogelijk maakt.
- Reproduceerbaarheidswaarde: Bevat kwaliteitscontrole-stammen met vastgestelde MIC-bereiken (bijv. ATCC 29213 bij 0.06 µg/mL) om assay-drift te monitoren en consistentie tussen runs te waarborgen.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Levert ziekterelelevante MIC-gegevens voor streptokokken en stafylokokken, in overeenstemming met pathogenen in acute bacteriële huidinfectiemodellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt preklinische effectiviteitsstudies door blootstellingsdrempels te definiëren die gekoppeld zijn aan in vivo activiteit, waardoor PK/PD-integratie mogelijk wordt.
- Risicobeperking: Voorkomt onterechte conclusies over resistentie door te corrigeren voor artefacten bij agar-dilutie, die MIC's met een factor 2 tot 8 kunnen overschatten, waardoor voortijdige deprioritisering van veelbelovende kandidaten wordt voorkomen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het continuüm van antimicrobiële ontdekking, van vroege targetvalidatie via lead-optimalisatie tot preklinische profilering, waarbij MIC-gegevens bijdragen aan de structuur-activiteitsrelaties en de prioritering van verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van het mechanisme van dalbavancine door verschuivingen in de MIC te koppelen aan genetische of fenotypische veranderingen in bacteriële stammen.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve gevoeligheidsgegevens die een betrouwbare vergelijking van analogen en derivaten in SAR-studies mogelijk maken.
- Analytics: Genereert MIC-eindpunten die statistisch geanalyseerd kunnen worden om potentie, variabiliteit en het ontstaan van resistentie over verschillende stammenpanelen te beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro gevoeligheid met klinische relevantie via surveillancedata die <0,25 µg/mL MIC's laten zien in >99,9% van de staphylococcen- en streptococcen-isolaten.
- Bedrijfbrede herutilisatie: Stelt een referentie-conforme SOP vast die gedeeld kan worden tussen discovery-, preklinische en translationele teams om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door vals-positieve resistentiesignalen, veroorzaakt door methodologische artefacten, te minimaliseren.
- Operationele waarde: Verbeterde reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde bereiding van reagentia (DMSO-stocks, polysorbaat 80-bouillon) en gedefinieerde inoculumcontroles (5×10⁵ CFU/mL, acceptabel bereik 2–8×10⁵).
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van de besluitvorming door betrouwbare MIC-afkapwaarden te bieden voor go/no-go-beslissingen, waardoor uitval in een laat stadium door onverwachte resistentie wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk door verbindingen te identificeren met een consistente activiteit onder 0,25 µg/mL tegen belangrijke Gram-positieve targets.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in antimicrobiële gevoeligheidstesten en het omgaan met lipoglycopeptideverbindingen.
- Vereist toegang tot DMSO voor de bereiding van voorraadoplossingen, polysorbaat 80, kation-gecorrigeerde Mueller Hinton-bouillon en microtiterplaten met 96 putjes.
- Vereist strikte standaardisatie van het inoculum met behulp van McFarland-equivalentie en verdunning tot 5×10⁵ CFU/mL om foutieve gevoeligheids- of resistentieresultaten te voorkomen.
- Vereist incubatie bij 35±2°C gedurende 16–20 uur en een visuele MIC-aflezing als de laagste concentratie zonder zichtbare groei.
- Afhankelijk van kwaliteitscontroles (bijv. ATCC 29213) om degradatie van reagentia, variabiliteit van de incubator of drift van de technicus te detecteren die de MIC's buiten de verwachte bereiken zou kunnen verschuiven.
