Referentie Bouillon microverdunningsplaten Methode voor dalbavancin In Vitro Gevoeligheid testen van Bacteriën die aNBAO Grow
September 9th, 2015
Hier presenteren we een protocol voor de bepaling van dalbavancine-gevoeligheid van klinisch relevante grampositieve bacteriën met behulp van een bouillon microdilutie referentiemethode.
Het algemene doel van de volgende procedure is om de minimale remmende concentratie voor dalbavancine te bepalen. Gebruik hiervoor de bouillonmicrodilutiemethode met de nadruk op de belangrijkste stappen die uniek zijn voor Dalbavancin. Voorraad en intermediaire verdunning van dalbavancin worden gemaakt in DMSO en de uiteindelijke verdunning wordt gemaakt in kation op aangepaste Mueller Hinton-bouillon, aangevuld met polysorbaat.
De verdunning wordt uitgedeeld in een 96-wellplaat en geïnoculeerd met een gestandaardiseerde suspensie van bacteriën. De plaat wordt vervolgens 16 tot 24 uur geïncubeerd en onderzocht om de minimale hoeveelheid dalbavancin te bepalen die nodig is om bacteriegroei te remmen. Het volgen van deze gestandaardiseerde methode zal consistente resultaten garanderen met zowel klinische isolaten als, zoals hier getoond, kwaliteitscontrole-isolaten Dalbavancin is een semisynthetisch lipoglykopeptide antimicrobiële middel dat in mei 2014 door de FDA werd goedgekeurd voor de behandeling van acute bacteriële huid- en huidstructuurinfecties veroorzaakt door grampositieve organismen.
Deze methode beschrijft de gestandaardiseerde bouillon, microdilutie-gevoeligheidsmethode voor dassin, die het gebruik van DMSO omvat voor het bereiden van voorraadoplossingen in polysorbaat 80 om het vastklampen van het middel aan plastic te verminderen. Visuele demonstratie van deze methode is nuttig. Aangezien de stappen voor de bereiding van voorraad- en MIC-plaatoplossingen niet typisch zijn in vergelijking met de meeste antimicrobiële middelen. Deze stappen zijn uniek voor lipoglykopeptide middelen en zijn belangrijk om te volgen om reproduceerbare en nauwkeurige MIC-resultaten te bereiken.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Gina Fisher, een onderzoekswetenschapper uit mijn laboratorium. Houd er rekening mee dat passende veiligheidsmaatregelen die consistent zijn met bioveiligheidsniveau twee, moeten worden toegepast bij het uitvoeren van de volgende procedure. Begin met het afwegen van de juiste hoeveelheid dalbavancin om een voorraadoplossing van 800 microgram per milliliter te bereiden.
Voeg de juiste hoeveelheid NEAT DMSO toe aan een steriele glazen of plastic buis, breng vervolgens het poeder over naar de buis en vortex het. Vervolgens. Gebruik de 800 microgram per milliliter DALBAVANCIN voorraadoplossing om 100 x eind MIC-plaatconcentraties te bereiden zoals getoond in kolommen één tot vier. Deze worden aangeduid als de intermediaire concentraties.
Het totale bereide volume hangt af van het aantal MIC-panelen. Ten slotte verdun de intermediaire concentraties met een factor een tot 100 in kation niet-aangepaste Mueller Hinten-bouillon, ook bekend als C-A-M-H-B, aangevuld met 0,004%P 80. De resulterende werkconcentratie van DALBAVANCIN en P 80 is twee keer de eindconcentratie.
Aangezien de toevoeging van inoculum resulteert in een verdunning van één op twee, gebruikt u een multikanaals pipette met steriele tips om 50 microliter van elke verdunning van dalbavancin in de juiste putjes van de 96-well steriele microdilutiepanel uit te delen. Het MIC-plaatformaat maakt het mogelijk om acht inocula per plaat te testen. Als de panelen niet onmiddellijk worden gebruikt, breng dan plastic folie aan om ze te verzegelen, plaats ze in plastic zakken en bewaar ze in een niet-ontdooiende vriezer bij minimaal minus 60 graden Celsius totdat ze nodig zijn.
In deze demonstratie zal één vers bereid plaatje worden geïnoculeerd. Om het inoculum voor te bereiden, selecteert u verschillende goed geïsoleerde kolonies van een 18 tot 24 uur bloedauger of andere niet-selectieve augerplaat. Hier worden kwaliteitscontrole s aria en EPHI calloze stammen gebruikt.
Raak de bovenkant van elke kolonie aan met een steriele doek en breng een deel ervan over in een buis met een tot vijf milliliter C-A-M-H-B of zoutoplossing. Blijf overbrengen totdat de troebelheid overeenkomt met een 0,5 McFarland-standaard binnen 15 tot 30 minuten na de bereiding. Verdun het inoculum een op 100 in C-A-M-H-B om een eindconcentratie van vijf maal 10 tot de vijfde CFU per milliliter te bereiken. Het acceptabele bereik is twee tot acht maal 10 tot de vijfde CFU per milliliter.
Gebruik onmiddellijk een multikanaals pipette met steriele tips om 50 microliter van het uiteindelijke inoculum over te brengen naar elk geschikt putje van de MIC-paneelplaat hier. Vier rijen worden geïnoculeerd met elk van de twee isolaten voor een totaal van vier replica's per isolaat. Gebruik vervolgens een pipette om een oplossing van één tot 10 microliter in de positieve groeicontrole over te brengen naar een niet-selectieve agar, zoals try decay's sojaagar met 5%schapenbloed, om een zuiverheidscontrole uit te voeren.
Gebruik een steriele lus om de oplossing over het oppervlak van de plaat te verspreiden. Draai de plaat 90 graden en streek opnieuw om te zorgen dat het inoculum gelijkmatig is verdeeld. Dek de plaat af en zet deze opzij.
Voorbereiding van een kolonietelling, gebruik een enkele kanaalpipette om 10 microliter van de oplossing in de groeicontroleput over te brengen naar 10 milliliter zoute mix en breng vervolgens 100 microliter over naar een geschikt niet-selectief agrimedium, zoals try toay sojaagar met 5%schapenbloed, met behulp van een steriele lus verspreid de oplossing over het gehele agrioppervlak. Herhaal dit proces twee keer in verschillende richtingen om een gelijkmatige verdeling van het inoculum te garanderen. Stapel vervolgens maximaal vier MIC-panelen in een plastic container en zorg ervoor dat het bovenste paneel stevig is afgesloten met een deksel.
Plaats vervolgens een vochtige papieren handdoek in de plastic container en sluit deze binnen 30 minuten na inoculatie veilig met het deksel. Incubeer de MIC-panelen, de kolonietellingplaat en de zuiverheidscontroleplaat in een omgevingsluchtincubator bij 35 plus min twee graden Celsius gedurende 16 tot 20 uur. De volgende dag leest u de minimale remmende concentratie als de laagste concentratie die bacteriegroei in de
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het bepalen van de gevoeligheid van Gram-positieve bacteriën voor dalbavancine met behulp van een bouillon microverdunningsmethode. De focus ligt op belangrijke stappen die uniek zijn voor dalbavancine om nauwkeurige resultaten te garanderen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Farmacologie
- Testen van antimicrobiële gevoeligheid
Achtergrond
- Dalbavancine is een semisynthetisch lipo glycopeptide antimicrobieel middel.
- Goedgekeurd door de FDA in mei 2014 voor de behandeling van acute bacteriële huidinfecties.
- Het bepalen van de minimale remmende concentratie (MIC) is cruciaal voor een effectieve behandeling.
- Gestandaardiseerde methoden zijn noodzakelijk voor reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbaar protocol voor het testen van de gevoeligheid voor dalbavancine vast te stellen.
- Om unieke voorbereidingsstappen voor dalbavancine te benadrukken in vergelijking met andere antimicrobiële middelen.
- Om consistente resultaten te garanderen voor klinische en kwaliteitscontrole isolaten.
Gebruikte methoden
- Bereiding van stamoplossingen van dalbavancine in DMSO.
- Gebruik van kation-aangepaste Mueller Hinton bouillon aangevuld met polysorbaat 80.
- Dispenseren van verdunningen in een 96-wellsplaat en inoculeren met gestandaardiseerde bacteriesuspensies.
- Incubatie en onderzoek naar remming van bacteriële groei.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle bepaling van MIC voor dalbavancine tegen geteste stammen.
- Aangetoond reproduceerbaarheid van resultaten met klinische isolaten.
- Belangrijkheid van het handhaven van juiste inoculumconcentraties voor nauwkeurige gevoeligheidstesten.
- Visuele demonstratie van de methode verbetert het begrip van unieke voorbereidingsstappen.
Conclusies
- De bouillon microverdunningsmethode is effectief voor het beoordelen van de gevoeligheid voor dalbavancine.
- Naleving van het protocol zorgt voor betrouwbare en reproduceerbare resultaten.
- Verdere studies kunnen uitbreiden op de implicaties van dalbavancine gebruik in klinische omgevingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate antimicrobial susceptibility testing is essential for antimicrobial development and resistance monitoring, directly informing go/no-go decisions in early discovery. Dalbavancin’s long half-life and once-weekly dosing profile make it a strategic candidate for Gram-positive infection programs, but reliable MIC determination requires specialized handling due to its lipoglycopeptide properties. This standardized broth microdilution method ensures reproducible, low-variability MIC data, reducing mechanistic ambiguity in target validation and supporting predictive confidence in lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise interrogation of dalbavancin’s inhibitory activity against Gram-positive pathogens, clarifying target engagement and mechanism of action.
- Operational Value: Reduces variability in MIC results by addressing adherence issues through DMSO stock preparation and polysorbate 80 supplementation, improving assay robustness.
- Predictive Value: Generates consistent, low-fold-change MIC data that aligns with surveillance trends, supporting reliable potency ranking in lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative MIC outputs that serve as a standardized benchmark for comparing compound potency across screening campaigns.
- Operational Value: Uses a 96-well format compatible with high-throughput workflows, enabling scalable testing of multiple strains and replicates.
- Reproducibility Value: Incorporates quality control strains with established MIC ranges (e.g., ATCC 29213 at 0.06 µg/mL) to monitor assay drift and ensure run-to-run consistency.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant MIC data for streptococci and staphylococci, aligning with pathogens in acute bacterial skin infection models.
- Operational Value: Supports preclinical efficacy studies by defining exposure thresholds linked to in vivo activity, enabling PK/PD integration.
- Risk Mitigation: Avoids false resistance calls by correcting for agar dilution artifacts, which can overestimate MICs 2- to 8-fold, thus preventing premature deprioritization of promising candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the antimicrobial discovery continuum from early target validation through lead optimization to preclinical profiling, where MIC data informs structure-activity relationships and compound prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of dalbavancin’s mechanism by linking MIC shifts to genetic or phenotypic changes in bacterial strains.
- Screening: Delivers standardized, quantitative susceptibility data that enables reliable comparison of analogs and derivatives in SAR studies.
- Analytics: Generates MIC endpoints that can be statistically analyzed to assess potency, variability, and resistance emergence across strain panels.
- Translational Research: Connects in vitro susceptibility to clinical relevance through surveillance data showing <0.25 µg/mL MICs in >99.9% of staphylococcal and streptococcal isolates.
- Enterprise Reuse: Establishes a reference-compliant SOP that can be shared across discovery, preclinical, and translational teams to ensure data comparability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by minimizing false-positive resistance signals caused by methodological artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized reagent preparation (DMSO stocks, polysorbate 80 broth) and defined inoculum controls (5×10⁵ CFU/mL, 2–8×10⁵ acceptable range).
- Strategic Value: Improves decision-making efficiency by providing reliable MIC cutoffs for go/no-go gates, reducing late-stage attrition due to unexpected resistance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying compounds with consistent sub-0.25 µg/mL activity against key Gram-positive targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antimicrobial susceptibility testing and handling of lipoglycopeptide compounds.
- Necessitates access to DMSO for stock preparation, polysorbate 80, cation-adjusted Mueller Hinton broth, and 96-well microtiter plates.
- Demands strict inoculum standardization using McFarland equivalence and dilution to 5×10⁵ CFU/mL to avoid false susceptibility or resistance results.
- Requires incubation at 35±2°C for 16–20 hours and visual MIC reading as the lowest concentration with no visible growth.
- Dependent on quality control monitoring (e.g., ATCC 29213) to detect reagent degradation, incubator variability, or technician drift that could shift MICs outside expected ranges.
