Procedure voor Decellularisatie van Rat Levers in een oscillerende druk perfusie Device
10 augustus 2015
De gepresenteerde technieken voor leveroogst, canulerings- en perfusietechnieken met behulp van ons eigen apparaat, maken geavanceerde perfusie-opstellingen mogelijk om de decellularisatie- en recellularisatie-experimenten in rattenlevers te verbeteren.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de rol van de perfusiewortel bij het optimaliseren van de homogeniteit van de decellularisatie van rattenlever te evalueren. Dit wordt bereikt door eerst het canuleren van de poortader en de leverarterieën van vers geïsoleerde rattenlevers. Als tweede stap worden de leveren aangesloten op een perfusieapparaat voor selectieve perfusie van de poortader of de leverarterieën.
Vervolgens worden oscillerende drukveranderingen toegepast op de perfusiekamer om de intra-abdominale drukveranderingen na te bootsen die tijdens de ademhaling optreden. Door de microperfusie van de lever te optimaliseren, vertonen leveren die via de leverarterie onder oscillerende drukcondities worden geperfuseerd een meer homogene en snellere decellularisatie, zoals beoordeeld door macroscopisch onderzoek en histologische en biochemische analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals decellularisatie door poortaderperfusie is dat arteriële perfusie onder oscillerende drukcondities leidt tot een meer homogene decellularisatieresultaat.
Hoewel deze methode in kortere tijd inzicht kan geven in decelleratietechnieken, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals res-solarisatie-experimenten, extra-orale perfusie-opstellingen en orgaanmodellen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen, omdat het oogsten en arteriële canuleringen van rode leveren gecompliceerd kunnen zijn.
Maak voor het oogsten van de lever een schuine snede aan het einde van een 1,5 centimeter stuk van een perifere G 20 veneuze katheter. Verbind de katheter met een drieweg-stopkraan en gebruik een 10 milliliter spuit gevuld met ringer-oplossing om het systeem te ontlucht. Snijd vervolgens de naald van een vlindercanule tot een lengte van vijf millimeter en gebruik superlijm om een vijf centimeter buisje aan de naald te bevestigen.
Plaats een twee centimeter lang buisje in het grotere buisje en bevestig dit buisje ook met superlijm. Schuif een ander buisje over deze constructie en lijm het op zijn plaats om een aansluiting te maken. Gebruik vervolgens een vijf milliliter spuit gevuld met ringer-oplossing om de nieuw gebouwde arteriële canule te repareren om de lever klaar te maken voor het oogsten.
Begin door een vochtige verbanddoek te gebruiken om de mediale en linker leverlobben van een verdoofde volwassen rat onder de koepel van het diafragma te houden. Blootstel op dit moment ook het hepatoduodenale ligament en de bovenste leverkwab. Gebruik vervolgens twee microtangen en veerscharen om voorzichtig het ligament te dissecteren dat aan de bovenste omentale kwab is bevestigd totdat de kwab beweegbaar is.
Houd vervolgens de mediale en linker lobben op hun plaats. Gebruik vochtige wattenstaafjes om de kwab onder de GRE's-compress en de maag naar links van het dier te verplaatsen. Bevestig de maag met een klem en dissecter de minor momentum.
Dissecteer vervolgens de lagere of mentale leverkwab totdat deze beweegbaar is en verplaats de kwab terug in zijn holte met behulp van een backhouse-klem om het duodenum vast te houden, verplaats het duodenum naar links om het hepatoduodenale ligament bloot te leggen. Cirkel de galgang om. Dissecteer vervolgens de galgang van het vet- en pancreasweefsel, snijd de gang 1,5 centimeter van de galwegbifurcatie.
Dissecteer de sal-vene uit het omringende vetweefsel, waardoor de gastroduodenale vene zichtbaar wordt. Ligeer vervolgens de gastroduodenale vene twee keer met zes nulnaden en verdeel de vene tussen de twee knopen. Dissecteer de celiacstam en de gemeenschappelijke leverarterie van het omringende weefsel totdat alle arteriële ramia zichtbaar zijn.
Nadat alle slagaders zijn gedisseceerd, beschrijf de inferieure cavale vene tussen de rechter nier en de rechter laterale leverkwab en dissecteer de vene uit de retroperitoneale ruimte. Volg de celiacstam om de aorta te ontsluiten. Dissecteer vervolgens het retroperitoneale vetweefsel en beschrijf de aorta boven de celiacstam.
Injecteer nu 1000 eenheden heparine in een milliliter zoutoplossing in de inferieure vena caver. Bedek de incisie met een katoenen pad en wacht een tot twee minuten tot de heparine zijn werking heeft gedaan. Beschrijf vervolgens de aorta met forceps en dissecteer de aorta en de inferieure vena caver distaal van de nier.
Om de poortveneuze canule te plaatsen, maak een vismondsnede in de distale poortvene en open de incisie met forceps. Canuleer vervolgens de poortvene en spoel de lever met 20 milliliter ringer-oplossing totdat de lever wordt gedehumaniseerd. Gebruik zijde zes nulnaden om de canule op zijn plaats te fixeren. Om de arteriële canule te plaatsen, dissecteer de aorta boven de celiacstam totdat het aortasegment kan worden bevrijd van de retroperitoneale ruimte.
Snij het aortasegment longitudinaal om een aortisch patch te genereren en plaats de zelfgemaakte canule in een statische houder. Gebruik vervolgens twee forceps om de aortapatch over de canule te schuiven en ligeer de leverarterie met een zijde zes nulnaad over de canule. Bevestig het patch op de aansluiting om de decellularisatie uit te voeren. Verbind de drieweg-stopkraan op de poortveneuze canule met de reactortoegang en verbind de arteriële canule met de arteriële toegang, waarbij u ervoor zorgt dat er geen lucht in de systemen komt.
Verbind vervolgens de ventilator met de drukverdeelkamer en verbind de kamer met de reactor. Start de druktoepassing. Begin vervolgens met de decellularisatie.
Voeg de lever toe met 1% tritton X 100 met een snelheid van vijf milliliter per minuut. Laat het afval via de uitlaat van het perfusieapparaat stromen om het vloeistofniveau in de perfusiekamer constant en boven de geperfuseerde lever te houden. Na 90 minuten verandert het detergent in 1%SDS. Leveren die via de poortvene worden geperfundeerd, vertonen een inhomogene opheldering die decellularisatie aangeeft met macroscopisch zichtbare resterende cellen tijdens en na het proces, terwijl leveren die via de leverarterie worden geperfundeerd, een meer homogene decellularisatiecursus vertonen met minder zichtbare resterende cellen.
Als de leveren worden geperfundeerd met de toe
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert technieken voor het oogsten, canuleren en perfunderen van de lever met behulp van een eigen apparaat om experimenten met decellularisatie en recellularisatie in rattenlevers te verbeteren. De studie richt zich op het optimaliseren van de homogeniteit van de leverperfusie tijdens de decellularisatie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Regeneratieve geneeskunde
Achtergrond
- Decellularisatie is cruciaal voor organtransplantatie en tissue engineering.
- Huidige methoden leiden vaak tot ongelijkmatige decellularisatieresultaten.
- Arteriële perfusie kan de resultaten verbeteren in vergelijking met portaalveneuze perfusie.
- Oscillerende drukcondities kunnen fysiologische omstandigheden tijdens perfusie nabootsen.
Doel van de studie
- Om de rol van de perfusiewortel bij de decellularisatie van de lever te evalueren.
- Om de effectiviteit van arteriële perfusie onder oscillerende druk te beoordelen.
- Om de homogeniteit van de decellularisatieresultaten in rattenlevers te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Cannulatie van de poortaders en hepatische arteriën van rattenlevers.
- Aansluiting van levers op een perfusieapparaat voor selectieve perfusie.
- Toepassing van oscillerende drukveranderingen tijdens de perfusie.
- Beoordeling van de decellularisatie via macroscopische observatie en histologische analyse.
Belangrijkste resultaten
- Arteriële perfusie onder oscillerende druk leidt tot een homogenere decellularisatie.
- Snellere decellularisatie werd waargenomen in vergelijking met traditionele methoden.
- Histologische en biochemische analyses bevestigen verbeterde resultaten.
- De techniek vertoont voordelen ten opzichte van bestaande methoden voor portaalveneuze perfusie.
Conclusies
- Het optimaliseren van leverperfusietechnieken kan de decellularisatieprocessen verbeteren.
- Arteriële perfusie met oscillerende druk is een veelbelovende aanpak.
- Verdere studies kunnen deze bevindingen uitbreiden voor klinische toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Topprofessionals
Het verkrijgen van een homogene decellularisatie is cruciaal voor het genereren van betrouwbare scaffolds van de extracellulaire matrix in de regeneratieve geneeskunde en bij preklinische ziektemodellering. Inconsistente perfusie kan leiden tot resterend cellulair materiaal of een ongelijkmatige degradatie van de matrix, waardoor de integriteit en reproduceerbaarheid van de scaffold in gevaar komen. Deze techniek pakt een belangrijk knelpunt in organ engineering aan door de uniformiteit van de perfusie te verbeteren via arteriële cannulatie en fysiologische drukmodulatie, waardoor het voorspellend vertrouwen in de daaropvolgende recellularisatie en functionele beoordeling wordt vergroot.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de architectuur van de extracellulaire matrix mogelijk als basis voor het bestuderen van cel-matrixinteracties in modellen voor fibrose en metabole ziekten.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd gedecellulariseerd levermatrixplatform voor consistente zaaiing van primaire of engineered hepatocyten in assays voor targetvalidatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert reproduceerbare acellulaire scaffolds met behoud van de microvasculaire architectuur, wat betrouwbare perfusiegebaseerde screening van geneesmiddelmetabolisme en toxiciteit ondersteunt.
- Operationele waarde: Vermindert variabiliteit in de kwaliteit van extracellular matrix tussen verschillende batches, waardoor de robuustheid van assays voor de bepaling van de werkzaamheid en veiligheid van verbindingen wordt verbeterd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de ontwikkeling van menselijk relevante levermodellen door recellularisatie met patiëntafgeleide of iPSC-gegenereerde cellen mogelijk te maken voor mechanistische risicoanalyse.
- Operationele waarde: Faciliteert schaalbare productie van gedecellulariseerde organen voor preklinische effectiviteitstests van regeneratieve therapieën.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door een reproduceerbare bron van gedecellulariseerde levermatrix te bieden, die toepassingen voor downstream cellulaire herprogrammering, functionele rijping en ziektemodellering mogelijk maakt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot matrix-gemedieerde signaleringspaden in leverzonering en regeneratieve reacties.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde preparatie van de extracellulaire matrix mogelijk voor perfusie-gebaseerde hepatocyten-assays die fysiologische flow en schuifspanning vereisen.
- Analyses: Maakt kwantitatieve beoordeling van de effectiviteit van de decellularisatie mogelijk via DNA-gehalte, histologische kleuring en vasculaire casting voor lot-vrijgavecriteria.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de kwaliteit van de decellularisatie met het succes van de recellularisatie, wat de continuïteit ondersteunt van ontdekking tot preklinische validatie.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbaar perfusie- en decellularisatieplatform dat aanpasbaar is aan meerdere orgaanmodellen en detergentregimes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert het voorspellende vertrouwen in de kwaliteit van de extracellulaire matrix door de heterogeniteit in decellularisatie-resultaten te verminderen.
- Operationele waarde: Verhoogt de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van scaffoldgeneratie door gestandaardiseerde perfusieparameters en drukcycli.
- Strategische waarde: Vermindert het risico van investeringen in platforms voor organengineering door de succespercentages van recellularisatie en functionele transplantatie te verhogen.
- Impact op portfolio: Maakt een risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten voor regeneratieve geneeskunde mogelijk op basis van metrieken voor scaffoldkwaliteit en reproduceerbaarheid.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microsurgische vasculaire canulatie en het opzetten van een perfusiesysteem.
- Afhankelijkheid van een op maat gemaakt perfusieapparaat met oscillerende druk en de bijbehorende infrastructuur voor vloeistofbeheer.
- Noodzaak van gestandaardiseerde werkprocedures om steriliteit te waarborgen en belvorming tijdens de canulatie te voorkomen.
- Overwegingen voor aanpassing aan verschillende orgaanformaten, vasculaire architecturen en decellularisatie-middelen.
- Praktische beperkingen omvatten de technische complexiteit van arteriële canulatie en het risico op vasculaire schade tijdens de voorbereiding van de vaten.
