Name: Procedure voor Decellularisatie van Rat Levers in een oscillerende druk perfusie Device (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer decellularisatie van rattenlevers met een oscillerende drukperfusie-apparaat. Deze methode optimaliseert de homogeniteit van decellularisatie via arteriële perfusie onder drukwisselingen voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna Jöhrens en Katharina Struecker dankbaar bedanken voor hun hulp tijdens dit project.

De dieren werden bij de Faciliteit voor Experimentele Geneeskunde (FEM, Charité, Berlijn, Duitsland) gehouden, en alle experimentele protocollen werden beoordeeld en door de Staat Bureau van Volksgezondheid en lokale zaken (LAGeSo, Berlijn, Duitsland goedgekeurd;. Reg No. O 0365 / 11). 1. Lever Oogsten <ol><li> Pre-operatieve voorbereiding <ol><li> Gebruik een kurk bord voor fixatie. Zet een medische laken op het bord. Met behulp van vier naalden, stelt een inhalatie masker op de kurk plaat voor intra-operatieve inhalatie narcose. </li></ol></li><li> Prearrangement van de Portal veneuze canule <ol><li> Sluit een perifere veneuze katheter (20 G) een driewegkraan. De katheter moet schuin worden gesneden met een lengte van ong. 1,5 cm. </li><li> De lucht van het systeem met behulp van een 10 ml injectiespuit gevuld met Ringer-oplossing. Het is heel belangrijk om zorgvuldig ontluchting omdat gasembolie negatief kan beïnvloeden perfusie cellen ontdoen. </li></ol></li><li> Prearrangementvan de arteriële canule <ol><li> Gebruik een vlinder canule en snijd de naald tot een lengte van 5 mm. Monteer een 5 cm buis (ID 0,58 mm; OD 0.96 mm) om de 5 mm naald en zet deze vast met superlijm. Steek een 2 cm lange buis (ID 0,28 mm; OD 0.61 mm) in de grotere buis en zet deze vast met superlijm. </li><li> Slip een andere buis over deze constructie als een steunpunt en zet deze vast met superlijm. De lucht van de arteriële canule met een 5 ml injectiespuit gevuld met Ringer-oplossing. </li></ol></li><li> Anesthesie en analgesie <ol><li> Braken narcose van de rat in de anesthesie inductie kamer met 3,5% isofluraan in zuurstof bij een stroomsnelheid van 1,5 L / min. </li><li> Om veilig analgesie tijdens de werking, injecteer metamizol (100 mg / kg lichaamsgewicht) en lage dosis ketamine / medetomidine (10 mg / 0,1 mg per kg lichaamsgewicht) intraperitoneaal. </li><li> Leveren 1,5% isofluraan in 1 l / min zuurstof via het inademen masker voor latere onderhoud van chirurgische anesthesie. </li></ol></li><li> Preoperatieve Regelingen &lt;ol&gt; <li> Scheer de buik royaal met een elektrische scheren machine. Bevochtig de geschoren incisie op de buik met 70% ethanol voor desinfectie. </li><li> Plaats het dier in rugligging op de geprepareerde plaat, steekt de kop in de inhalatiemasker en bevestig de ledematen met medische tape en pennen. Verwijder overtollige ethanol en vacht met een gaasje kompres. </li></ol></li><li> Anesthesie Assessment <ol><li> Beoordeel de anesthesie diepte door te kijken naar de ademhaling. Als de verdoving lijkt diep genoeg (40-60 ademhalingen / min), controleer dan of analgesie voldoende is door te proberen om de teen knijpen reflex met chirurgische tang om de huid tussen de tenen van beide achterpoten knijpen triggeren. </li></ol></li><li> Abdominale Approach <ol><li> Maak een mediane incisie in de caudale buikwand boven de blaas. Knip tussen die plaats en twee laterale ribben bogen in een V-vormig. Zorg ervoor niet te snijden in het middenrif. Trek de cut buikwand op de borst. </li&gt; <li> Bevestig de zwaardvormig een Overholt klem, trek het craniaal en zet deze vast met een elastiekje. Gebruik natte wattenstaafjes naar de darm te evacueren. Wikkel de darm in een nat gaasverband. Bovendien bestrijken alle abdominale marges met natte verbanden. </li></ol></li><li> Lever Voorbereiding <ol><li> Ontleden de ligamentum falciforme. Gebruik een natte gaasverband aan de mediale en linker leverlobben houden craniaal onder de koepel van het membraan. Expose de hepatoduodenale ligament en de bovenste omental lever kwab. </li><li> Gebruik twee microforceps en veer schaar zorgvuldig ontleden ligament aan dit bovendeel omentale kwab tot het net mobiel. Verplaats de lob met natte wattenstaafjes onder het gaas kompres, die de mediale en liet lobben in de plaats. </li><li> Na mobilisatie van de bovenste omental lever kwab, bewegen de maag naar links. Bevestig de maag met een klem en ontleden de minderjarige omentum met microforceps en het voorjaar schaar. </li><li> Mobiliseer de onderste omental leverkwab tot het mobiele en vervolgens zet de kwab terug in de holte. Gebruik een Backhaus klem aan het duodenum behouden. Beweeg het duodenum naar links te rekken en de hepatoduodenale ligament bloot. Omschrijven de galweg in de uitgerekte hepatoduodenale ligament. </li><li> Prepareer de galwegen van de vet- en pancreasweefsel. Snijd de galwegen 1,5 cm van de galwegen bifurcatie. Ontleden de poortader van de omringende vetweefsel. Expose de gastroduodenale ader. </li><li> Afbinden de gastroduodenale ader twee keer met zijden 6-0 en verdeel de ader tussen de 2 ligaturen. Ontleden de coeliakie romp en de leverslagader van het omringende weefsel totdat alle slagaderlijke Rami worden onthuld. </li><li> Bevrijd de gastroduodenale slagader van het omringende weefsel. Bind de gastroduodenale slagader tweemaal met zijden 6-0, met de banden ver uit elkaar. Ontleden de gastroduodenale slagader tussen de 2 ligaturen. </li><li> Bevrijd de milt slagadervan het omringende weefsel. Bind de milt slagader tweemaal met zijden 6-0, met de banden ver uit elkaar. Ontleden de milt slagader tussen de 2 ligaturen. </li><li> Bevrijd de linker maag slagader van het omringende weefsel. Bind de linker maag slagader tweemaal met zijden 6-0, met de banden ver uit elkaar. Ontleden de slagader tussen de 2 ligaturen. </li><li> Omschrijven de inferieure vena cava tussen de rechter nier en de rechter laterale lever kwab. Ontleden de ader van de retroperitoneale ruimte. Expose de aorta door de coeliakie kofferbak. </li><li> Ontleden de retroperitoneale vetweefsel. Injecteer 1000 IE heparine in 1 ml zoutoplossing in de inferior vena cava. Trek de canule en sluit de incisie met een wattenschijfje. Wacht 1-2 min voor systemisch effect van heparine. </li><li> Omschrijven de aorta met een tang. Ontleden de aorta en exsanguinate de rat. Verder ontleden de inferior vena cava distaal van de nier. </li></ol></li><li> Portal Veneuze Canulatie (Gebruik de opgesteld in paragraaf 1.2 canule) <ol><li> Maak een vis-mond incisie in de distale poortader. Open de incisie met een pincet en canule de poortader. Spoel de lever met 20 ml Ringer oplossing totdat de lever ontkleurt en bevestig de canule met ligaturen (zijde 6-0). </li></ol></li><li> Arteriële Canulatie (Gebruik de opgesteld in paragraaf 1.3 canule) <ol><li> Ontleden de aorta boven de coeliakie kofferbak. Bevrijd de aorta segment van de retroperitoneale ruimte. Snijd de aorta segment lengterichting om een ​​aorta patch te genereren. Steek de zelfgebouwde canule in een statische houder. </li><li> Gebruik 2 tang om de aorta patch glijden over de canule. Afbinden de leverslagader met zijden 6-0 over de canule en bevestig de patch op het landhoofd. </li></ol></li><li> Lever Explantatie <ol><li> Open het membraan, maak een cirkelvormige insnijding en ontleden van de lever van de omringende structuren. </li></ol></li><li> Opslagruimte <ol><li> Stoopnieuw de lever in een steriele 500 ml reservoir gevuld met 350 ml Ringer oplossing tot gebruik. </li></ol></li></ol> 2. Wasmiddel Solutions <ol><li> 10% Triton X-100 voorraadoplossing <ol><li> Vul een fles 1000 ml met 900 ml gedestilleerd water. en voeg 100 ml Triton X-100 (99,9%). Met een roerder om de Triton X-100 te lossen. Vul de fles met aqua dest. tot een totaal volume van 1000 ml wordt bereikt. </li></ol></li><li> 1% Triton X-100 <ol><li> Voeg 100 ml van de voorraadoplossing (10%) om een ​​fles 1000 ml. Voeg 900 ml gedestilleerd water. en tweemaal schud de fles. Filter de 1% Triton X-100 oplossing door een steriel filter. </li></ol></li><li> 10% SDS voorraadoplossing <ol><li> Vul een fles 1000 ml met 900 ml gedestilleerd water. en voeg 66,99 g SDS (99,9%, dichtheid 0,67). Gebruik een roerder om de SDS op te lossen. Vul de fles met aqua dest. tot een totaal volume van 1000 ml wordt bereikt. </li></ol></li><li> 1% SDS <ol><li> Voeg 100 ml van de oplossing (10%) tot een 1.000 ml botTLE. Voeg 900 ml gedestilleerd water. en tweemaal schud de fles. Filter de 1% SDS oplossing door een steriel filter. </li></ol></li></ol> 3. Decellularisatie <ol><li> Set-up van perfusie Device <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" /></li></ol> Figuur 1:. Regeling van de perfusie apparaat voor selectieve arteriële en Portal veneuze perfusie van vier Rat Levers onder Oscillerende Druk Weersomstandigheden (. Gewijzigd van Struecker et al 14) <ol><li> Verbinden de drain een driewegkraan en Heidelberger uitbreiding van het vulniveau reguleren en vullen van de reactor met 500 ml 0,9% NaCl. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" /></li></ol> Figuur 2:. Schema van de perfusie opstelling Verbind de perfusie kamer (1400 cm 3) (1) naar het distale uiteinde (4) van de opvanginrichting (5) via de portale veneuze toegang (2) of via de arteriële acproces (3). De bubble trap (5) moeten worden uitgerust met een obturation (4) aan het distale uiteinde en een opening (6). Sluit de bubble trap (5) om een ​​Heidelberger extensie (7). Koppel de Heidelberger verlenging van de pomp segment (8). Bovendien sluit de pomp segment (8) naar een andere Heidelberger extensie (9). Plaats de laatste Heidelberger verlengstuk (9) in de fles reinigingsmiddel (10). Sluit de respirator (11) aan de perfusie kamer (of de drukverdeler bij meervoudige perfusies). Aan de reactor vloeistoffen drain, sluit de uitstroom naar de fles afval (12). <ol><li> Plaats het segment pomp in de pomp. Start de pomp om de cyclus met PBS te vullen, sluit het distale einde van de zeepbel val en open de ontluchting. Wanneer de onderkant van de bel stevig bedekt met PBS (2-3 cm), sluit de opening en opent het distale uiteinde van de opvanginrichting. </li><li> Lever Installatie <ol><li> Verbinden de driewegkraan van de poortader canule om de bijbehorende toegang reactor. Cluit de arteriële canule om de arteriële. Wees voorzichtig om ervoor te zorgen dat er geen lucht in de systemen. </li></ol></li><li> Toepassing van Oscillerende Druk Weersomstandigheden <ol><li> Gebruik een respirator met een frequentie van 15 slagen per minuut en een amplitude van 26 mbar (min. 4 mbar, max. 30 mbar). Sluit de respirator naar de drukverdeling kamer en sluit de kamer naar de reactor. Start druk applicatie. </li></ol></li><li> Decellularisatie Protocol <ol><li> Voer perfusie stappen met een debiet van 5 ml / min. Start de cellen ontdoen met perfusie van de lever met 1% Triton X-100 gedurende 90 min. Laat afval uitstraling via de uitstroom van de perfusie apparaat om het vloeistofniveau in de perfusie kamer constant en boven de geperfuseerde lever te houden. Na 90 min, verandert het wasmiddel tot 1% SDS. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" /> <img alt="Tabel 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /></li></ol></li></ol> &lt;p&gt; Figuur 3: perfusie protocol voor alle experimentele groepen.

<ol><li>Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+support+strategies%3A+cutting-edge+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Liver support strategies: cutting-edge technologies.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+scaffolds+effectively+support+the+proliferation+and+differentiation+of+mouse+fetal+hepatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6, 134-136 (2010).</li>
<li>Bao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+portal+implantable+functional+tissue-engineered+liver+using+perfusion-decellularized+matrix+and+hepatocytes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats.</a> Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).</li>
<li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+whole-organ+assembly%3A+moving+toward+transplantation+on+demand%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-organ+regenerative+medicine+approach+for+liver+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).</li>
<li>De Kock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+quick+method+for+whole-liver+decellularization%3A+a+novel+in+vitro+three-dimensional+bioengineering+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+toxicology%22%5BJournal%5D)">Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool.</a> Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).</li>
<li>Park, K. M., Woo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+decellularization+for+multi-organ+scaffolds+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+proceedings%22%5BJournal%5D)">Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats.</a> Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).</li>
<li>Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+as+a+practical+scaffold+with+a+vascular+network+template+for+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering.</a> J Biosci Bioeng. , (2012).</li>
<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver Int. 33, 448-458 (2013).</li>
<li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+rat+liver+decellularization+by+arterial+perfusion+under+oscillating+pressure+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2014).</li>
<li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+Liver+Decellularization+Under+Oscillating+Pressure+Conditions%3A+A+Technical+Refinement+to+Improve+the+Homogeneity+of+the+Decellularization+Process%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel de gepresenteerde techniek rattenlever oogsten en ontcelling gemakkelijk reproduceerbaar, zijn er bepaalde kritische stappen te overwegen: Tijdens het prepareren van de lever oogsten, is het belangrijk om ernstig bloeden voorkomen omdat bloedstolling wordt geactiveerd en kunnen leiden tot de vorming van bloedstolsels in de lever. Naar onze mening is het voordelig om de abdominale aorta direct incise vóór canulatie van de poortader om bloed instroom via de leverslagader tijdens perfusi...

Decellularisatie en hercellularisatie kunnen in vitro 1 het genereren van functionele, transplanteren organen mogelijk maken. Door het verwijderen van cellen en antigeen materiaal (bv. DNA, a-Gal epitopen) uit een orgaan, de niet- of minder immunogeen extracellulaire matrix (ECM) worden verkregen. Deze matrix behoudt de driedimensionale microanatomie van een orgaan en kan dienen als het ideale biomatrix voor herbevolking met cellen van een andere, eventueel xenogene oorsprong 2. Aldus zou een gedecellulariseerde rattenlever matrix worden herbevolkt met humane levercellen. Dit gehumaniseerd micro-lever zou kunnen dienen als een ex vivo model voor onderzoek naar ziekten (bv., Aangeboren stofwisselingsziekten, virale ziekten of maligniteiten) of voor preklinische farmaceutische testen 3. Er zijn verschillende protocollen voor rat leverperfusie decellularisatie zijn reeds gepubliceerd 4-13. In alle protocollen, decellularordening werd bereikt door perfusie van basische ionische of niet-ionische detergentia via de canule poortader. Om het beste van onze kennis, waren we de eerste groep om rattenlever decellularisatie rapporteren door selectieve perfusie via de poortader en / of de rat leverslagader 14. Het inschakelen van de selectieve perfusie van verschillende vasculaire systemen in de lever cellen ontdoen betere resultaten stellen en bovendien een belangrijke rol in de cellulaire herbevolking spelen. In de studie hier beschreven, werden levers geperfundeerd in een op maat gemaakt proprietary perfusie apparaat, waardoor perfusie onder oscillerende druk omstandigheden. Deze druk omstandigheden na te bootsen de fysiologische respiratoire-afhankelijke perfusie van de lever: in situ, de lever hangt onder de copula van het middenrif, waarvan de beweging tijdens de ademhaling heeft een directe invloed op de lever perfusie. Inspiration bijzonder leidt tot verlaging van het membraan en knijpen van de lever, optimaliserenhepato-veneuze uitstroom, terwijl vervaldatum leidt tot verhoging van de lever en het verlagen van de intra-abdominale druk om portal-veneuze instroom 15 optimaliseren. Ons doel was om te evalueren of oscillerende druk omstandigheden hebben een invloed op de homogeniteit van de rat leverperfusie decellularisatie door het nabootsen van intra-abdominale voorwaarden ex vivo. De homogeniteit van de decellularisatie werkwijze kan een onderschatte factor perfusie ontcelling zijn. Alle bekende middelen die worden gebruikt voor de lever decellularisatie oorzaak veranderingen aan de ECM. Cellen in slecht doorbloede gebieden blijven binnen de ECM, terwijl andere gebieden zijn al helemaal ontceld. Om de resterende cellen ontbinding moet de perfusie duur of de druk verhoogd, waardoor meer wijzigingen van de goed doorbloede gebieden. Zo moet wasmiddelen voor decellularisatie homogeen worden verdeeld binnen het orgaan.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Zelf gebouwde arteriële canule</td></tr><tr><td>&nbsp;Portex niet-steriele polyetheenbuis</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/100</td><td>0,28 mm ID 0,61 mm OD</td></tr><tr><td>&nbsp;Portex niet-steriele polyetheenbuis</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/200</td><td>0,58 mm ID 0,96 mm OD</td></tr><tr><td>Venodrop Safe butterflykatheter</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3275851</td><td>21 G</td></tr><tr><td colspan="4">portale venecanule</td></tr><tr><td>Perifeer veneuze katheter</td><td>BD</td><td>393224</td><td>BD Venflon Pro 20G</td></tr><tr><td>Driewegstopkraan</td><td>smiths medical</td><td>888-101RE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">chirurgie</td></tr><tr><td>Katoenen stokken</td><td>Hecht-Assistent</td><td>4302</td><td></td></tr><tr><td>Katoenen pads&nbsp;</td><td>Shaoxing Zhengde chirurgisch verband</td><td>13H118-03</td><td></td></tr><tr><td>Gaasverband</td><td>Hubei Haige&nbsp; Medische instrumenten</td><td>14388</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Ringer-oplossing</td><td>Fresenius Kabi</td><td>13 HKP022</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>10 ml spuit</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>10 ml/ Luer Solo</td></tr><tr><td>5 ml spuit</td><td>Braun</td><td>4606061V</td><td>5 ml /Luer Solo</td></tr><tr><td>Hechtdraad (zijde 6/0)</td><td>Resorba</td><td>H1F</td><td>LOT 105001.81</td></tr><tr><td>medisch scherm</td><td>Shaoxing Zhengde chirurgisch verband</td><td>D0613011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">chirurgische instrumenten</td></tr><tr><td>naaldhouder</td><td>Geuder</td><td>17570</td><td></td></tr><tr><td>micro-pincetten</td><td>Inox-Electronic</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>micro-schaar</td><td>Martin</td><td>11-740-11</td><td></td></tr><tr><td>micro-pincetten</td><td>S&amp;T&nbsp;</td><td>112314</td><td></td></tr><tr><td>klem</td><td>Aesculap</td><td>BH111R</td><td></td></tr><tr><td>schaar</td><td>F S T&nbsp;</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>chirurgische pincetten</td><td>Aesculap</td><td>BD 557</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Decellularisatie</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Resmed</td><td>14.24.11.0004</td><td>SmartAIR ST</td></tr><tr><td>Perfusieapparaat</td><td>Charite, laboratorium voor medische techniek</td><td>op maat gemaakt apparaat</td><td>decellularisatieapparaat</td></tr><tr><td>peristaltische pomp ismatec reglo ICC</td><td>IDEX</td><td>ISM4408&nbsp;</td><td>4-kanaals</td></tr><tr><td>heidelberger verlengsnoer 75 cm&nbsp;</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2873</td><td>75 cm</td></tr><tr><td>MS/CA pomp-segment</td><td>IDEX</td><td>IS 3510&nbsp;</td><td>MS/CA/click'n'go/POM-C</td></tr><tr><td>CA 2-stopbuis</td><td>Pharmed</td><td>BPT NSF-51</td><td></td></tr><tr><td>bubbelval&nbsp;</td><td></td><td>op maat gemaakt item</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock slangkoppeling</td><td>Neolab</td><td>Nr. 02-1887</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Detergentia</td></tr><tr><td>SDS-pellets</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>CN30.4&nbsp;</td><td>2,5 kg</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>3051.1&nbsp;</td><td>10 L</td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>DPBS</td></tr><tr><td colspan="4">kleuring</td></tr><tr><td>Eosine 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hematoxylinen</td><td>AppliChem</td><td>A4840</td><td></td></tr><tr><td>Gomori-kleuring</td><td>Morphisto</td><td>11104</td><td></td></tr><tr><td>AlcainBlue-PAS-kleuring</td><td>Morphisto</td><td>11388</td><td></td></tr><tr><td>Direct Red 80&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>365548</td><td></td></tr></tbody></table>

procedure voor decellularisatie van rat levers in een oscillerende druk perfusie device

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularisatie en recellularisatie van parenchymale organen kunnen de generatie van functionele organen in vitro mogelijk maken, en er zijn al verschillende protocollen voor de decellularisatie van rattenlever gepubliceerd. We hadden als doel het decellularisatieproces te verbeteren door de constructie van een eigen perfusieapparaat dat selectieve perfusie via de poortader en/of de leverarterie mogelijk maakt. Verder probeerden we perfusie uit te voeren onder oscillerende omgevingsdrukcondities om de homogeniteit van decellularisatie te verbeteren. De homogeniteit van perfusie decellularisatie is tot nu toe een onderschatte factor. Tijdens decellularisatie kunnen gebieden binnen het orgaan die slecht geperfuseerd zijn nog steeds cellen bevatten, terwijl de extracellulaire matrix (ECM) in goed geperfuseerde gebieden al kan worden beïnvloed door alkalische detergenten. Oscillerende drukveranderingen kunnen de intra-abdominale drukveranderingen nabootsen die tijdens de ademhaling optreden om microperfusie in de lever te optimaliseren. In de hier gepresenteerde studie werden gedecellulariseerde rattenlevermatrices geanalyseerd door histologische kleuring, DNA-gehalteanalyse en corrosiecasting. Perfusie via de leverarterie vertoonde homogenere resultaten dan portaalveneuze perfusie. De toepassing van oscillerende drukcondities verbeterde de effectiviteit van perfusie decellularisatie. Levers geperfuseerd via de leverarterie en onder oscillerende drukcondities vertoonden de beste resultaten. De gepresenteerde technieken voor leveroogst, canulerings- en perfusie met behulp van ons eigen apparaat maken geavanceerde perfusie-opstellingen mogelijk om decellularisatie- en recellularisatie-experimenten in rattenlevers te verbeteren.

De homogeniteit en daarmee de effectiviteit van verschillende ontcelling protocols werden geëvalueerd door macroscopische observatie, histologische analyse en analyse van de resterende DNA inhoud in gedecellulariseerde lever matrices. Bovendien werd corrosie casting uitgevoerd om de intacte microanatomie van levers visualiseren na decellularisatie. Macroscopie Tijdens decellularisatie, levers geworden Lucent, met vermelding van het verwijderen van mobiele content...

De gepresenteerde technieken voor leveroogst, canulerings- en perfusietechnieken met behulp van ons eigen apparaat, maken geavanceerde perfusie-opstellingen mogelijk om de decellularisatie- en recellularisatie-experimenten in rattenlevers te verbeteren.

Procedure voor Decellularisatie van Rat Levers in een oscillerende druk perfusie Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de rol van de perfusiewortel te evalueren bij het optimaliseren van de homogeniteit van decellularisatie door perfusie van de rattenlever. Dit wordt bereikt door eerst de poortaders en leverarteriën van vers geïsoleerde rattenlevers te canuleren. In een tweede stap worden de levers verbonden met een perfusieapparaat voor selectieve perfusie van de poortaders of de leverarteriën.Vervolgens worden oscillerende drukveranderingen toegepast op de perfusiekamer om de intra-abdominale drukveranderingen die optreden tijdens de ademhaling na te bootsen. Door de microperfusie van de lever te optimaliseren, vertonen levers die via de arteria hepatica onder oscillerende drukcondities zijn geperfuseerd uiteindelijk een homogenere en snellere decellularisatie, zoals beoordeeld via macroscopische observatie en histologische en biochemische analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals decellularisatie via portaalveenperfusie, is dat arteriële perfusie onder oscillerende drukcondities leidt tot een homogener decellularisatieresultaat.Deze methode kan echter in een kortere tijd inzicht bieden in vertragingstechnieken. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals experimenten met bodemsolarisatie, extraorale perfusie-opstellingen en organomodellen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de oogst en arteriële canulatie van rode levers gecompliceerd kunnen zijn.Maak vóór het oogsten van de lever een schuine snede aan het uiteinde van een stuk van 1,5 centimeter van een perifere G 20 veneuze katheter. Verbind de katheter met een driewegkraan en gebruik een spuit van 10 milliliter gevuld met ringersoplossing om het systeem te ontluchten. Knip vervolgens de naald van een vlindernaald af tot een lengte van vijf millimeter en gebruik secondelijm om een slangetje van vijf centimeter aan de naald te bevestigen.Plaats een buisje van twee centimeter lang in de grotere buis en fixeer dit buisje eveneens met secondelijm. Schuif een ander buisje over deze constructie en lijm dit op zijn plaats om een abutment te creëren. Gebruik vervolgens een spuit van vijf milliliter gevuld met Ringer-oplossing om de nieuw geconstrueerde arteriële canule te spoelen ter voorbereiding van de lever voor oogst.Begin met het gebruik van een natte gaascompress om de mediale en linker leverkwabben van een geanestheseerde volwassen rat onder de koepel van het diafragma vast te houden. Leg op dit moment ook het hepatoduodenale ligament en de bovenste leverkwab vrij. Gebruik vervolgens twee micro-pincetten en veerscharen om het ligament dat aan de bovenste omentale kwab is bevestigd zorgvuldig te dissekeren totdat de kwab mobiel is.Houd vervolgens de mediale en linker kwabben op hun plaats. Gebruik vochtige wattenstaafjes om de kwab onder de compressie van de GRE en de maag naar links van het dier te verplaatsen. Fixeer de maag met een klem en dissecteer het omentum minus.Dissect vervolgens de onderste of mentale leverkwab totdat deze mobiel is, en verplaats de kwab terug in de holte. Gebruik een Backhouse-klem om het duodenum vast te houden en verschuif het duodenum naar links om het ligament hepatoduodenale bloot te leggen. Omcirculeer de gemeenschappelijke galgang. Dissecteer vervolgens de galgang uit het vet- en pancreasteweefsel door de gang 1,5 centimeter vanaf de bifurcatie van de galgang door te snijden.Dissekeer de vena sal uit het omringende vetweefsel om de vena gastroduodenalis bloot te leggen. Ligeer vervolgens de vena gastroduodenalis tweemaal met 6-0 hechtdraden en klem de ader tussen de twee knopen door. Dissekeer de truncus coeliacus en de arteria hepatica communis uit het omringende weefsel totdat alle arteriële vertakkingen zichtbaar zijn.Nadat alle slagaders zijn gedisseceerd, wordt de vena cava inferior tussen de rechter nier en de rechter zijlob van de lever omcirkeld en wordt de ader uit de retroperitoneale ruimte gedisseceerd. Volg de truncus coeliacus om de aorta bloot te leggen. Disseceer vervolgens het retroperitoneale vetweefsel en omcirkel de aorta boven de truncus coeliacus.Injecteer nu 1000 units heparine in één milliliter saline in de vena cava inferior. Bedek de incisie met een wattenstaafje en wacht één tot twee minuten tot de heparine is ingetreden. Omcirkel vervolgens de aorta met een pincet en dissecteer de aorta en de vena cava inferior distaal van de nier.Om de portaalveenchannule te plaatsen, wordt een visbekincisie gemaakt in de distale portaalader, waarna de incisie met een pincet wordt geopend. Cannuleer vervolgens de portaalader en spoel de lever met 20 milliliters ringersoplossing totdat de lever ontkleurt, waarbij zijden 6-0 ligaturen worden gebruikt om de cannuul te fixeren. Om de arteriële cannuul te plaatsen, wordt de aorta boven de truncus coeliacus gedisseceerd totdat het aortasegment kan worden vrijgemaakt uit de retroperitoneale ruimte.Snijd het aortasegment in de lengte door om een aortapatch te creëren en plaats de zelfgebouwde canule in een statische houder. Gebruik vervolgens twee pincetten om de aortapatch over de canule te schuiven en ligeer de arteria hepatica met een zijden 6-0 hechtdraad over de canule. Fixeer de patch bij de aansluiting om de decellularisatie uit te voeren. Verbind de driewegkraan op de canule van de vena portae met de bijbehorende reactoropening en sluit de arteriële canule aan op de arteriële toegang, waarbij u erop let dat er geen lucht in de systemen terechtkomt.Sluit vervolgens de respirator aan op de drukverdeelkamer en verbind de kamer met de reactor. Start de druktoepassing. Begin daarna met de decellularisatie.Perfuseer de lever met 1% Triton X 100 met een snelheid van vijf milliliter per minuut. Laat het afvalwater via de uitlaat van het perfusieapparaat weglopen om het vloeistofniveau in de perfusiekamer constant en boven de geperfuseerde lever te houden. Vervang na 90 minuten het detergent door 1% SDS. Levers die via de vena portae zijn geperfuseerd, vertonen een homogene verheldering die wijst op decellularisatie, waarbij macroscopisch zichtbare cellen overblijven tijdens en na het proces, terwijl levers die via de arteria hepatica zijn geperfuseerd, een homogener decellularisatieverloop vertonen met minder zichtbare resterende cellen.Wanneer de levers werden geperfundeerd onder oscillerende drukcondities, waren er geen resterende cellen zichtbaar, ongeacht de perfusie. Histologische evaluatie van de gedecellulariseerde levermatrices bevestigt de macroscopische bevindingen inderdaad in levers die via de arteria hepatica werden geperfundeerd.Er worden geen resterende cellen waargenomen, ongeacht of ze onder oscillerende drukcondities waren geperfuseerd of niet. Levers die echter via de vena portae zijn geperfuseerd, vertonen zones met resterende cellen, zelfs als ze onder oscillerende drukcondities zijn geperfuseerd, hoewel deze condities de resterende celmassa in deze levers verminderen; merk op dat de extracellulaire matrices van de levers behouden blijven, ongeacht de decellularisatiecondities. Het DNA-gehalte per drooggewicht van de levermatrix nam in alle experimentele groepen af in vergelijking met native levers. Hoewel de verschillen alleen statistisch significant waren in de groepen die onder oscillerende drukcondities waren geperfuseerd.Daarnaast bevestigde corrosiegieten van de gedecellulariseerde levermatrices dat de microanatomie van de lever behouden bleef tijdens het perfusieproces. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het oogsten, canuleren en perfunderen van rode levers voor een reproduceerbare, homogene decellularisatie. Vergeet niet dat het werken met Triton X 100 en SDS uiterst gevaarlijk kan zijn; bij het uitvoeren van deze procedure moeten daarom voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van handschoenen.

procedure-for-decellularization-rat-livers-an-oscillating-pressure

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Perfusie decellularisatie is een nieuwe techniek om hele lever scaffolds dat het orgel van de extracellulaire matrix samenstelling en microarchitectuur behoudt produceren. Hierin wordt de werkwijze voor het bereiden gehele orgel steigers met behulp van perfusie decellularisatie en de daaropvolgende herstel van de populatie met hepatocyten beschreven. Functionele en transplanteerbare lever enten kan worden gegenereerd met behulp van deze techniek.

Decellularisatie en Recellularization van Whole Levers

Een techniek voor het isoleren van portal fibroblasten van rat lever wordt beschreven. Levers zijn perfusie en...

Isolatie van Rat Portal Fibroblasten door<em&gt; In situ</em&gt; Leverperfusie

Primaire hepatocyten een waardevol hulpmiddel om biochemische, moleculaire en metabolische functies in een fysiologisch relevante experimentele systeem te evalueren. We beschrijven een betrouwbaar protocol voor rat in situ leverperfusie, die consequent levensvatbare hepatocyten genereert tot to1.0 ×...

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Marginale enten, zoals vette levers, enten van oudere donoren, of levers teruggehaald na hartdood (DCD) tolereren conventionele, koude statische opslag alleen slecht. We ontwikkelden een nieuw model van subnormothermic ex vivo lever perfusie voor het behoud, de beoordeling, en de reparatie van marginale lever transplantaties voorafgaand aan de transplantatie.

Techniek van Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Leverperfusie voor de opslag, Assessment, en reparatie van Marginal Lever Enten

Er is een belangrijke donor van lever tekort, en criteria voor lever donoren hebben uitgebreid. Normothermic ex vivo lever perfusie (NEVLP) is ontwikkeld om te evalueren en wijzigen van orgaanfunctie. Deze studie toont een model van de rat van NEVLP en test het vermogen van gepegyleerde-katalase, te verzachten lever behoud letsel.

Een kleine diermodel van Ex Vivo Normothermic lever perfusie

We stellen een nieuwe chirurgische techniek voor een in vivo één lever kwab perfusie model in rat als een voorwaarde voor de verdere studie van in vivo gedeeltelijke lever techniek in de toekomst.

Een nieuwe chirurgische techniek als een fundament voor In Vivo gedeeltelijke lever Engineering in Rat

Dit protocol beschrijft het gebruik van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslangen, temperatuurregeling aangevuld met real-time monitoring en een alarmsysteem voor tweestaps collagenaseperfusieprocedure om de consistentie in de levensvatbaarheid, opbrengst en functionaliteit van geïsoleerde primaire rathepatocyten te verbeteren.

Isolatie van primaire rattenhepatocyten met multiparameterperfusiecontrole

Het protocol beschrijft de chirurgische verkrijging en daaropvolgende decellularisatie van gevasculariseerde varkensflappen door de perfusie van natriumdodecylsulfaatwater door de flapvasculatuur in een aangepaste perfusiebioreactor.

Inkoop en perfusie-decellularisatie van porcine gevasculariseerde flappen in een aangepaste perfusiebioreactor

We beschrijven de chirurgische techniek en het decellularisatieproces voor samengestelde rattenachterpoten. Decellularisatie wordt uitgevoerd met behulp van natriumdodecylsulfaat met een lage concentratie via een ex vivo machineperfusiesysteem.

Verkrijging en decellularisatie van Rat Hindlimbs met behulp van een ex vivo perfusie-gebaseerde bioreactor voor gevasculariseerde composiet allotransplantatie

Een normotherm ex vivo leverperfusie (NEVLP) systeem werd gecreëerd voor muizenlevers. Dit systeem vereist ervaring in microchirurgie, maar zorgt voor reproduceerbare perfusieresultaten. Het vermogen om muizenlevers te gebruiken vergemakkelijkt het onderzoek van moleculaire routes om nieuwe perfusaatadditieven te identificeren en maakt de uitvoering van experimenten gericht op orgaanherstel mogelijk.

Normothermic Ex Vivo Lever Machine Perfusie in Muis

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde tweestaps collagenase-leverperfusietechniek in een rattenmodel en toont het gebruik van geïsoleerde hepatocyten voor in vitro langdurige kweek van 3D-organoïden.

Perfusie van rattenlever en isolatie van primaire hepatocyten: een oude procedure die cruciaal is voor geavanceerde 3D-organoïdencultuur

Leer decellularisatie van rattenlevers met een oscillerende drukperfusie-apparaat. Deze methode optimaliseert de homogeniteit van decellularisatie via arteriële perfusie onder drukwisselingen voor regeneratieve geneeskunde.

Procedure voor Decellularisatie van Rat Levers in een oscillerende druk perfusie Device

Meer video's verkennen