Name: Limbale Aanpak-Subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in Muizen retinaal pigment epitheel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Leer een subretinale injectietechniek voor gentherapie in muizenretina met virale vectoren. Deze methode levert doelgenen effectief af aan het retinale pigmentepitheel en ondersteunt onderzoek naar oogaandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de Seoul National University Research Grant (800-20140542), de Pioneer Research Program van NRF / MEST (2012-0009544), en de Bio-Signal Analysis Technology Innovation Program van NRF / MEST (2009-0090895), en de verlening van NRF / MEST (2015M3A9E6028949).

Alle experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Vereniging voor Onderzoek in Vision en Oogheelkunde Verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Geluid Onderzoek en de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Seoul National University Institutional Animal Care en gebruik Comite en Seoul National University Hospital Bioveiligheid Comité. 1. Voorbereiding Injection Kit en virale vectoren <ol><li> Bereid de microliter spuit uitgerust met een 33 G stompe naald gesteriliseerd met ethyleenoxide gas. Verdun de virale vectoren in PBS voor de adequate titer in de micro tube (dwz 1 x 10 6 TU / ul). Spoel de spuit enkele malen met virale vectoren om elke dode ruimte te verwijderen in de spuit. </li></ol> 2. Subretinal Injectie van virale vectoren <ol><li> Verdoven volwassen muizen (dwz, 6-8 weken oud) een intraperitoneale injectie van het mengsel van tiletamine en zolazepam (1: 1, 2,25 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine hydrochloride (0,7 mg / kg lichaamsgewicht) of een andere geschikte anesthesie regime. </li><li> Verwijden leerlingen met een oog druppel fenylefrine 0,5% en tropicamide 0,5%. </li><li> Bereid de microliter spuit door belading met 1,5-2 ul virale vectoren. </li><li> Open het ooglid en steken het oog op de evenaar voor gemakkelijke injectie bloot en focus op onder de operatiemicroscoop. Handhaaf het uitstekende ooghoogte tot de voltooiing van de injectie, of verplaatsing van de naald kan optreden tijdens de injectie. Om de oogbol stevig vast te houden, plaats de vingers buiten de orbitale rand. </li><li> Breng een druppel oftalmische viscoelastische oplossing van het hoornvlies. </li><li> Plaats een rond dekglaasje op de top van het hoornvlies tot het netvlies te visualiseren. </li><li> Doorboren klein gaatje aan lichte de limbus met een steriele 30 G 02/01 naald voor de verdere subretinale injectie. Maak het gat inferieure for het rechteroog en superieur voor het linkeroog voor het gemak. OPMERKING: Als het gat is gemaakt op tijdelijke of nasale, is het moeilijk om te worden gedekt door het ooglid na de injectie. Initiële punctie moet iets worden achter de limbus de limbale vaten die langs de limbus en gemakkelijk herkenbaar voorkomen. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het raken van de lens met een naald tijdens het maken van de eerste lekke band. Steek het hele afschuining van de naald om de lens punctie te voorkomen. </li><li> Plaats de 33 G stompe naald van microliter spuit door de pre-lekke gat en de aanpak van de naald in de subretinale ruimte tot het moment waarop een milde weerstand wordt gevoeld. LET OP: Voor de subretinale injectie, de beste aanpak hoek van de naald is ongeveer 45 graden tegen iris vliegtuig, en de stompe naald moet naar achteren worden geschoven in de richting van pupil- omgeving. Gestippelde vierkant aangegeven de voorgestelde naald pad over het glasachtig holte van de subretinale spuitgietenn in figuur 1. OPMERKING: Er zullen geen weerstand voelde toen piercing (of passeren) de retinale lagen zoals ze zijn erg zacht. Aldus, de eerste gevoel van lichte weerstand geeft aan dat de naald reeds aangeraakt RPE laag en het inbrengen van de naald moet worden gestopt. Wees voorzichtig om geen sclerale weefsel dringen met hoge druk, omdat de naald in de potentiële subretinale ruimte moet worden geplaatst. Als de naald prikt de sclerale weefsel door overmatige kracht, gaat het in de oculaire orbitale ruimtes zonder weerstand. (Deze stap is essentieel) </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53030/53030fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematisch diagram van de Subretinal Injection. H &amp; E gekleurde dwarsdoorsnede van de muis oog die de structuren met een naald route voor de subretinale injectie aangegeven (gestippeld vierkant). Vergroting: 40X, Schaal bar:<html> 500 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53030/53030fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="9"><li> Injecteer de virale vectoren (dat wil zeggen, 1 x 10 6 TU / ul) voorzichtig in de subretinale ruimte zonder tremor om ongewenste weefselschade te voorkomen en de naald zachtjes trekken. Houd de oogbol vast tijdens de injectie zoals beschreven in 2.4. </li><li> Let op de vorming van subretinale bleb na de injectie onder operationele microscoop om ervoor te zorgen dat er geen netvlies bloeden. </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53030/53030fig2.jpg" /> Figuur 2. Subretinal Belb Vorming zonder retinale bloeding. Microscopische mening van subretinale belb na de subretinale injectie onder operatiemicroscoop blijkt succesvolle blaar vorming zonder retinale bloeding.m / files / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <ol start="11"><li> Sluit voorzichtig het ooglid aan de injectieplaats voor zelfdichtende dekken. Terug de muizen naar huis kooi en levend houden totdat de evaluatie. OPMERKING: Nadat de onderzoekers wennen aan de procedures, kunnen ze de herhaalbare resultaten met snelle procedures komen door het overslaan van deze stappen (2,5, 6 en 10) </li></ol> 3. Evaluatie van de werkzaamheid van Gene Levering in retinaal pigment epitheel <ol start="1"><li> Offer de muizen in de CO 2 kamer. Ophelderen met een schaar de ogen. </li><li> Bevestig de ogen in 4% paraformaldehyde oplossing bij 4 ° C gedurende ten minste 1 uur tot enkele dagen. </li><li> Pak het hoornvlies met fijne pincet en punctie het hoornvlies met micro-schaar. Verwijder de cornea na scharende langs de limbus. Verwijder de lens met een tang. </li><li> Trim de ciliaire lichaam met mICRO-schaar waardoor netvliesloslating. Trek de hele netvlies van de RPE / choroid / sclera complex. Snijd de RPE / choroid / sclerale complex radiaal vanaf de omtrek naar het centrum Bij oogzenuw meerdere malen 4-8 bladeren voor vlakke montage maken. </li><li> Flip de RPE / choroïd / sclerale complex RPE naar beneden te maken, en trim alle resterende weefsels aan de sclerale zijkant waaronder de spieren, bindweefsel en de oogzenuw. Deze stap is belangrijk om een ​​vlakke RPE / choroïd / sclerale complexer omdat het resterende weefsel maakt het complex ongelijk. </li><li> Incubeer het complex met primaire en secundaire antilichaam voor uw specifieke onderzoeksdoeleinden (optioneel, zie de verwijzingen voor gedetailleerde methoden). Flat-mount de RPE / choroïd / sclerale complexen op het glas glijbaan en absorberen de PBS met een absorberende spons. </li><li> Voeg 30 ul van de montage-oplossing en plaats de deksel dia. Observeer het monster voor de werkzaamheid van vector levering onder fluoresceïne microscoop. Laat de monsters inde koelkast voor verdere observatie. </li></ol>

<ol><li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber%27s+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li>
<li>Jacobson, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations%3A+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).</li>
<li>Conlon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+potency+and+safety+studies+of+an+AAV2-mediated+gene+therapy+vector+for+the+treatment+of+MERTK+associated+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).</li>
<li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+gene+therapy+in+patients+with+choroideremia%3A+initial+findings+from+a+phase+1%2F2+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial.</a> Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).</li>
<li>Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+platforms+for+gene+therapy+of+inherited+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies.</a> Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).</li>
<li>Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+delivery+of+recombinant+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Intraocular delivery of recombinant virus.</a> Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).</li>
<li>Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+injection+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Intravitreal injection of therapeutic agents.</a> Retina. 29 (7), 875-912 (2009).</li>
<li>Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+detachment+model+in+rodents+by+subretinal+injection+of+sodium+hyaluronate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+injection+of+gene+therapy+vectors+and+stem+cells+in+the+perinatal+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li>
<li>Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+transplantation+of+MACS+purified+photoreceptor+precursor+cells+into+the+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina.</a> J Vis Exp. (84), e50932(2014).</li>
<li>Sahel, J. A., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for blindness.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).</li>
<li>Allocca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adeno-associated+virus+serotypes+efficiently+transduce+murine+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors.</a> J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+transduction+of+ocular+cells+with+a+bovine+immunodeficiency+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector.</a> Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).</li>
<li>Rolling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapeutic+prospects+in+early+onset+of+severe+retinal+dystrophy%3A+restoration+of+vision+in+RPE65+Briard+dogs+using+an+AAV+serotype+4+vector+that+specifically+targets+the+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Mem+Acad+R+Med+Belg%22%5BJournal%5D)">Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium.</a> Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).</li>
<li>Le Meur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+vision+in+RPE65-deficient+Briard+dogs+using+an+AAV+serotype+4+vector+that+specifically+targets+the+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium.</a> Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).</li>
<li>Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+and+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors and the retina.</a> Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).</li>
<li>Puche, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+factors+associated+with+reticular+pseudodrusen+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration.</a> Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).</li>
<li>Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+for+neovascular+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration.</a> Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+amyloid+beta+alters+the+tight+junction+of+retinal+pigment+epithelium+in+5XFAD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice.</a> Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).</li>
<li>Shin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+cleavage+of+amyloid+beta+by+a+viral+protease+NIa+prevents+amyloid+beta-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity.</a> PLoS One. 9 (6), e98650(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze video artikel beschreven we de limbale-aanpak subretinale injectietechniek in detail met representatieve resultaten van RPE / choroïd / sclerale flat-mount. Dit is een eenvoudige en handige techniek voor subretinale injectie van virale vectoren in RPE. Directe visualisatie van bleb formatie tijdens de injectie is een belangrijke stap voor accurate levering voor de beginners. Er zijn enkele subretinale injectie technieken geïntroduceerd in Journal of Visualized Experimenten 8-10. Subretinale ruimte is ...

Oogheelkunde, heeft gentherapie ontpopt als de behandeling modaliteit in monogene erfelijke retinopathieën. Er zijn geërfd retinopathieën geassocieerd met genen in retinale pigment epitheel (RPE), met inbegrip van Leber congenitale amurosis 1,2, retinitis pigmentosa 3 en choroideremia 4. Het onderzoek gebied van gentherapie is uit te breiden, zowel in preklinische studies en klinische proeven met behulp van virale vectoren zoals adeno-geassocieerde virus (AAV), lentivirus (LV) en adenovirus (Ad) 5. Verschillende virale vectoren hebben verschillende tropisme in de retina. Voor een veilige en effectieve gentherapie, virale vectoren moeten zorgvuldig worden geselecteerd op basis van doelcellen en doelgenen. De route van genoverdracht is ook belangrijk voor effectieve genoverdracht aan doelcellen dus moet zorgvuldig worden eveneens gekozen. De twee meest voorkomende methoden voor intra-oculaire aflevering van virale vectoren zijn subretrechtelijke injectie en intravitreale injectie 6. Laatstgenoemde, intravitreale injectie, is op grote schaal gebruikt om geneesmiddelafgifte te choroïdale neovascularisatie in natte leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) en maculair oedeem bij diabetische retinopathie 7 behandelen. Intravitreale route verschaft blootstelling van virale vectoren voor glasvocht en binnenste retina, maar de diffusie van de vectoren naar de buitenste retina beperkt. Anderzijds, de subretinale route biedt rechtstreekse afgifte van virale vectoren aan de mogelijke ruimte tussen retina en RPE, induceren een gelokaliseerd bleb. Daarom wordt subretinale injectie momenteel beschouwd als meer efficiënte route voor het richten RPE en fotoreceptorcellen. Qua chirurgische benadering, pars plana wordt gekozen als een veilig gebied voor intravitreale injectie retinale schade bij menselijke patiënten te voorkomen. Door simpelweg het wijzigen van deze aanpak aan muizen, konden we virale vectoren subretinally of intravireally injecteren via limbale aanpak. In deze videoartikel tonen we een eenvoudige en handige methode van subretinale injectie van virale vectoren in muizen RPE. Na enkele punctie bij posterior aan limbus met een 30 G 1/2 naald wordt een 33 G stompe naald uitgerust microliter spuit ingevoegd in de subretinale ruimte via de limbale prikplaats. De virale vectoren van 1,5-2 ul volume geïnjecteerd om de potentiële ruimte tussen retina en RPE induceren subretinale blebs. Deze werkwijze kan onder directe visualisatie worden uitgevoerd middels chirurgische microscoop. Herhaalde praktijk zal garanderen reproduceerbare resultaten, zelfs zonder directe visualisatie van de blaar formatie. Dit zal helpen de onderzoekers om nauwkeurige en tijdbesparende experimenten uit te voeren voor subretinale gentherapie bij muizen RPE.

<table><tbody><tr><td>TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS</td><td>WPI</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>VANNAS Scissors S/S, 105 mm</td><td>WPI</td><td>555583S</td><td></td></tr><tr><td>33 G Blunt needle</td><td>WPI</td><td>NF33BL-2</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil Syringe, 10 microliter&nbsp;</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>RPE-KIT</td><td>WPI</td><td>RPE-KIT</td><td>Voor eenvoudige injectie met één hand</td></tr><tr><td>30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle</td><td>BD</td><td>305107</td><td>Initiële punctie voor subretinale injectie</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0720&nbsp; (CS-3R)</td><td></td></tr><tr><td>Leica operating microscope</td><td>Leica</td><td>LM M80</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceïne microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>Thermo scientific</td><td>TMO.LV-Ctr</td><td>Gebruikt om vectoren te verdunnen</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>Gebruikt om vectoren te verdunnen</td></tr><tr><td>Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%)</td><td>Hanmi</td><td></td><td>Voor dilatatie</td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Steriele)</td><td>Bausch&amp;Lomb</td><td></td><td>Voor topische anesthesie</td></tr><tr><td>Healon GV OVD</td><td>Abbott Medical Optics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoletil 50 (tiletamine hypochloride en zolazepam hypochloride)</td><td>Virbac</td><td></td><td>Voor algemene anesthesie</td></tr><tr><td>Rompun injectie (Xylazine HCl)</td><td>Bayer</td><td></td><td>Voor algemene anesthesie</td></tr></tbody></table>

limbale aanpak-subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in muizen retinaal pigment epitheel

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Het oog is een klein en afgesloten orgaan, wat het een ideaal doelwit maakt voor gentherapie. Recentelijk zijn verschillende strategieën toegepast op gentherapie bij retinopathieën door gebruik van niet-virale en virale genoverdracht naar het netvlies en het retinale pigmentepitheel (RPE). Subretinale injectie is de beste aanpak om virale vectoren rechtstreeks aan RPE-cellen te leveren. Voordat de klinische proef van een gentherapie wordt uitgevoerd, is het onvermijdelijk om de werkzaamheid van de therapie te valideren in diermodellen van verschillende retinopathieën. Daarom wordt subretinale injectie in muizen een fundamentele techniek voor een oculaire gentherapie. In dit protocol bieden we de eenvoudige en reproduceerbare techniek voor subretinale injectie van virale vectoren bij experimentele muizen. Deze techniek is aangepast van de intravitreale injectie, een techniek die veel wordt gebruikt in oogheelkundige klinieken. De representatieve resultaten van RPE/choroid/scleral complex flat-mount zullen helpen om de werkzaamheid van deze techniek te begrijpen en het volume en de titer van virale vectoren aan te passen voor de mate van gentransductie.

Om de effectiviteit van de subretinale injectie op viraal gen transductie evalueren van dit protocol, gebruikten we in de handel verkrijgbaar LV vectoren met CMV promoter die zowel GFP en RFP de indicator. Ogen werden enucleated na de juiste tijd volgens het onderzoek doel. Voor representatieve resultaten zijn ogen enucleatie 10 weken en 20 weken na de subretinale injectie. Na volledige verwijdering van de retina volgens de hierboven beschreven werkwijze, de vlakke onderstel van RPE / choroid / sclera complex werd geëva...

Subretinale injectie is een chirurgische techniek voor effectieve genoverdracht naar het retinale pigmentepitheel in het oog van de muis. Hier beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor subretinale injectie van virale vectoren naar het retinale pigmentepitheel bij experimentele muizen.

Limbale Aanpak-Subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in Muizen retinaal pigment epitheel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Het algemene doel van deze procedure is om een doelgen over te brengen naar het retinaal pigmentepitheel in een levende muis. Dit wordt bereikt door eerst het ooglid te openen en de oogbol naar buiten te drukken om de equator bloot te leggen. De volgende stappen bestaan uit het maken van een klein gaatje posterieur aan de limbus.Injecteer de virale vectoren met een stompe naald in de subretinale ruimte en observeer de vorming van een subretinale bleb. Ten slotte wordt immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om de expressie aan te tonen van fluorescentiemarkers, afgeleverd door het geïnjecteerde virus, in het retinale pigmentepitheel. Dit is een efficiënte en handige techniek voor subretinale injectie van virale vectoren in het retinale pigment.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien subretinale injectietests moeilijk uit te voeren zijn voor beginners. Bereid eerst een microliterspuit voor met een stompe naald van 33 gauge, gesteriliseerd met ethyleenoxidegas.Bereid vervolgens in een microcentrifugebuisje een verdunning van de virale vectoren in PBS voor met een titer van ongeveer 1 miljoen eenheden per microliter. Spoel de spuit nu meerdere keren met de oplossing bij het vullen om alle dode ruimte in de spuit te verwijderen. Maak 1,5 tot 2 microliter van de virale vectorinjectie klaar voor injectie.Anestheseer een volwassen muis via een intraperitoneale injectie van diazepam en zoutoplossing; bevestig dat het dier is geanestheseerd door de afwezigheid van reflexen. Zodra de anesthesie is bevestigd, worden de pupillen verwijdt met een druppel 0,5% fenylefrine en 0,5% idrochondroïne. Open vervolgens onder een operatiemicroscoop het ooglid en protrudeer het oog om de equator bloot te leggen.Houd het oog in deze positie door uw vingers buiten de orbitale rand te plaatsen. Breng vervolgens een oogheelkundige visco-elastische oplossing aan op het hoornvliesoppervlak en plaats een klein rond dekglas over het hoornvlies. Hierdoor kan het netvlies nu worden bekeken, iets posterior ten opzichte van de limbus en inferieur in het rechteroog of superieur in het linkeroog.Gebruik een steriele naald van 30 gauge (halve naald) om een klein gaatje te maken, tijdelijk of nasaal geplaatst. Gaten zijn geen goede keuzes omdat ze moeilijk af te dekken zijn. Vermijd bij het doorprikken het raken van het limbaal vat of de lens, en voer bij subretinale injecties niet de volledige lengte van de naald in.Steek de naald voor vectorinjectie via het gat onder een hoek van 45 graden ten opzichte van het irisvlak in. Duw de naald posterior richting het peripapillaire gebied, waarbij het aangegeven pad wordt gevolgd om de glasvochtruimte te doorkruisen.Voer de naald in de subretinale ruimte in totdat er een lichte weerstand wordt gevoeld, wat aangeeft dat de RPE-laag is bereikt. Voorkom dat het scleraweefsel met overmatige druk wordt gepenetreerd, aangezien de naald in de potentiële subretinale ruimte moet worden geplaatst. Als de naald het scleraweefsel met te veel kracht doorboort, komt deze zonder weerstand in de extraoculaire orbitale ruimte terecht. Injecteer nu voorzichtig de virale vector in de subretinale ruimte.Houd de naald zeer stil om weefselschade te voorkomen, wat van groot belang is. Trek de naald vervolgens net zo voorzichtig terug. Nu kan de oogbol worden losgelaten.Subretinale blaarvorming, wat duidt op vectoraccumulatie, zou zichtbaar moeten zijn. Sluit tot slot voorzichtig het ooglid om de injectieplaats te bedekken. Het gat zal zichzelf dichten.Om de genoverdracht te evalueren, worden de muizen opgeofferd via koolstofdioxide-asfyxie. Nadat de euthanasie is bevestigd, worden de ogen met een schaar geënucleerd. Fixeer de ogen in 4% PFA bij vier graden Celsius gedurende ten minste een uur, maar bij voorkeur een paar dagen.Pak het hoornvlies vast en punctureer het met een pincet en microschaartjes. Knip vervolgens langs de limbus om het hoornvlies te verwijderen nadat het hoornvlies is losgemaakt. Gebruik een pincet om de lens te verwijderen.Trim vervolgens het ciliaire lichaam. Trek daarna het gehele netvlies los van het complex van het RPE, het vaatvlies en de sclera na verwijdering van het netvlies. Snijd het complex radiaal van de periferie naar het centrum nabij de oogzenuw om vier tot acht bloembladvormige segmenten te maken en om de structuur vlak te maken voor montage.Draai het complex nu om zodat de RPE-zijde naar beneden wijst en trim alle resterende weefsels aan de sclera-zijde weg, inclusief spieren, het conjunctiva en de oogzenuw. Dit resulteert in een plattere flat mount van het RPE Cort sclera-complex op een glazen objectglas. Absorbeer het overtollige PBS met een absorberende spons.Breng ongeveer 30 µL monteermedium aan en dek het complex af met een dekglas. Bewaar het preparaat bij 4 °C wanneer het niet wordt bekeken. Met behulp van het beschreven protocol werden commercieel verkrijgbare LV-vectoren met CMV-promotoren die zowel GFP als RFP tot expressie brengen, geïnjecteerd.De ogen werden na 10 weken geënucleerd en er werden preparaten gemaakt van RPE flat mounts. De signaalintensiteiten van GFP en RFP varieerden tussen de RPE-cellen op de injectieplaats, en de transductie was beperkt tot het gebied waar het injectiebloed zich had verzameld. Door de vergroting te verhogen van vier DX naar 400 x was het mogelijk om de pathologie van de I met een nog hogere resolutie te evalueren.Hoewel hier niet getoond, drukten de getransduceerde cellen de vector nog steeds uit, zelfs 36 weken na de injectie. Eenmaal beheerst kan deze techniek in vijf minuten worden uitgevoerd als deze correct wordt toegepast.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de naald voorzichtig en nauwkeurig in de subretinale ruimte te plaatsen nadat deze is ontwikkeld. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de oogheelkunde om gentherapie te verkennen voor de behandeling van congenitale, monogene erfelijke pathieën en maculadegeneratie gerelateerd aan leeftijd.

limbal-approach-subretinal-injection-viral-vectors-for-gene-therapy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze chirurgische techniek illustreert de injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de subretinale ruimte van de muis oog.

Subretinale Injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de Mouse Eye

Source: Park, S. W., et al. Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (2015)The video describes the method for subretinal injection of viral vectors into the retinal pigment epithelium (RPE) in a mouse model. It details the procedure from anesthesia and eye preparation to precise lentiviral vector delivery, ensuring gene integration and expression in the RPE.

Subretinal Injection of Viral Vectors into the Retinal Pigment Epithelium in a Mouse Model

Hier presenteren we een door de gemeenschap geaccepteerd protocol in multimedia-formaat voor het subretinaal injecteren van een bolus RPE-cellen bij ratten en muizen. Deze aanpak kan worden gebruikt voor het bepalen van reddingspotentieel, veiligheidsprofielen en overlevingscapaciteiten van getransplanteerde RPE-cellen bij implantatie in diermodellen van retinale degeneratie.

Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension

Subretinale injecties zijn de meest gebruikte techniek voor het afleveren van grote therapeutische middelen zoals eiwitten en virale vectoren aan fotoreceptoren en het retinale pigmentepitheel. Hier wordt een alternatieve methode bij muizen beschreven die met succes de subretinale ruimte target met minimale nevenschade en snelle hersteltijden.

Een alternatief en gevalideerd injectiemethode voor toegang tot de Subretinal Space<i&gt; via</i&gt; Een Transcleral Posterior Approach

Hier tonen we een nieuwe benadering voor het gebruik van hoge resolutie spectrale domein optische coherentie tomografie (HR-SD-OCT) helpen levering van gen-therapie-agenten in de subretinal ruimte, beoordelen van haar areal dekking en karakteriseren fotoreceptor vitaliteit.

Met resolutie muis optische coherentie tomografie steun intraoculaire injectie in het netvlies gentherapie onderzoek

In dit manuscript wordt subconjunctivale injectie gedemonstreerd als een geldige vectorafgiftemethode voor oculaire weefsels bij muizen met behulp van een injectiesysteem bestaande uit een infusie/opzuigspuitpomp en een gasdichte verwijderbare spuit in combinatie met micro-injectienaalden. Dit injectiesysteem is ook aanpasbaar voor andere intraoculaire toedieningsroutes.

Subconjunctivale toediening van Adeno-geassocieerde virusvectoren in modellen met kleine dieren

Intravitreale injecties werden uitgevoerd in het schapenoog met als doel virale gemedieerde gentherapie op het netvlies af te leveren.

Intravitreale injecties in het schapenoog

Dit protocol presenteert een transpupillaire zichtgeleide transsclerale benadering om veilig en nauwkeurig subretinale cellulaire transplantaten af te leveren, met een laag aantal chirurgische complicaties, bij muizenontvangers met of zonder retinale degeneratie.

Transpupilgeleide transsclerale transplantatie van subretinale transplantaten in een muismodel voor retinale degeneratie

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de bereiding van post-gecryopreserveerde hESC-afgeleide fotoreceptor-voorlopercellen en de subretinale afgifte van deze cellen in rd10-muizen .

Subretinale toediening van van menselijke embryonale stamcellen afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen bij RD10-muizen

Subretinale injecties zijn een onmisbare techniek voor de preklinische ontwikkeling van therapieën voor fotoreceptor- en RPE-ziekten. We beschrijven een geoptimaliseerde transsclerale subretinale injectietechniek bij muizen die de intraoperatieve slagingspercentages verbetert en schade aan het netvlies minimaliseert.

Geoptimaliseerde minimaal invasieve transsclerale subretinale injectietechniek bij muizen

Leer een subretinale injectietechniek voor gentherapie in muizenretina met virale vectoren. Deze methode levert doelgenen effectief af aan het retinale pigmentepitheel en ondersteunt onderzoek naar oogaandoeningen.

Limbale Aanpak-Subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in Muizen retinaal pigment epitheel

Meer video's verkennen