Name: Moleculaire Probe Optimization to Cell Sterfte Bepaal in een fotosynthetische organisme ( Microcystis aeruginosa) Met behulp van flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Leer hoe je celsterfte nauwkeurig bepaalt in Microcystis aeruginosa met geoptimaliseerde moleculaire probes en flowcytometrie. Deze methode analyseert fysiologische toestanden op individueel celniveau in real-time.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag promovendus Dave Hartnell en Bournemouth University erkennen voor steun en financiering voor onderzoek en faciliteiten.

1. Bereiding van de Molecular Probe en Flow Cytometer <ol><li> Verdunde voorraadoplossingen van de nucleïnezuur probes, die worden geleverd als een 5 mM oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) tot hoeveelheden van gewenste concentraties in ultrazuiver gefiltreerd H 2 O. </li><li> Bewaar de nucleïnezuur probes in het donker tussen -5 ° C en - 25 ° C tot gebruik. </li><li> Schakel de flowcytometer en de belasting softwarepakket (zie tabel van Materialen / Apparatuur voor FCM specificaties). </li><li> Plaats een lege hemolyse buis (12 x 75 mm) op het monster injectiesonde (SIP), klik ontstoppen en dan terug spoelen naar de FCM reinigingsproces te starten. OPMERKING: Sommige monster podia voor het SIP is geschikt voor verschillende soorten slangen, waaronder microcentrifugebuisjes. De moleculaire sonde verdunner en schede vloeistof gebruikt in de FCM apparaat is van een analytische kwaliteit &quot;type 1&quot; 0,22 pm membraan gefilterd bron. </li><li> Plaatseen frisse hemolyse buis met 2 ml ultrapuur gefilterd H 2 O op het SIP, een tijdslimiet voor 10 - 15 min en een fluïde snelheid te snel (of een debiet van&gt; 66 pl / min). </li><li> Selecteer een nieuwe data cel, op relevante drempels voor fluorescentie en lichtverstrooiing kanalen om ruis te verminderen en klik op &#39;run&#39;. </li><li> Als de totale gebeurtenissen per seconde, zijn niet onder de aanbeveling van de fabrikant, vervolgens een 2 ml monster van decontaminatie-oplossing gedurende 2 minuten op een snelle en herhaal de stappen 1.4 en 1.5. LET OP: Controleer aanbevelingen van de fabrikant voor FCM start-up reiniging protocollen, omdat ze kunnen variëren tussen de modellen. Testen op specifieke drempels moet ook in overeenstemming met de FCM model zoals bepaalde apparatuur kan de gebruiker spanningen krijgt de fotomultiplier buizen (PMT&#39;s) verhogen of verlagen van het elektrische signaal geregistreerd vanaf de optische detectors toepassen. De FCM-model gebruikt in deze ervament heeft PMT voltage vast en gebruikt een drempel van 80.000 naar voren lichtverstrooiing (FSC-H) tot deeltjes kleiner dan 2,0 micrometer en elektronische ruis uit te sluiten. </li></ol> 2. Voorbereiding van Culturen en Initial celtellingen <ol><li> Autoclaaf 98 ml ultrazuiver gefilterde H2O en 2 ml algen media (x50 concentratie) in een bekerglas van 250 ml gedurende 20 minuten bij 120 oC </li><li> Uit een eerste monocultuur van M.aeruginosa (PCC 7806) in een hoge steady state dichtheid plaats 2 ml van het monster in een buis onder de SIP. Disaggregeren elke kolonievorming door vortexen of sonificatie 20 en bevestig gelijkmatig verspreid cellen door lichtmicroscopie. OPMERKING: Overmatige blootstelling aan ultrasone golven kunnen leiden tot cellysis en moet met voorzichtigheid worden gebruikt. Sinds ultrasoonapparaat gasblaasjes kan instorten (zoals gevonden in soorten zoals M.aeruginosa) uitgangen, zoals kant lichtverstrooiing (SSC-H) intensiteit kan meer se gewordennsitive. </li><li> Binnen de FCM-software, selecteer een histogram plot gegevens van voorwaartse lichtverstrooiing (FSC-H) registreren en configureren van de plot specificaties door te klikken op &quot;log&quot; te bekijken in een log-schaal op de as. </li><li> In een aparte uitgang, selecteer een ander histogram (log-as) naar natuurlijke fluorescentie op te nemen, zoals de accessoire fotosynthetische pigment fycocyanine (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), gevonden in M.aeruginosa. </li><li> Gebruik een lichtbron die phycocyanine en een detector die de emissies van de resulterende fluorescentie kunt een filter kunnen prikkelen. OPMERKING: Fotosynthetische pigment zoals chlorofyl kan enthousiast met de meest gebruikte 488 nm blauwe laser, terwijl phycocyanine is enthousiast meer dan 600 nm en zal alleen worden gedetecteerd met een rode lichtbron 21. Neem contact op met de flowcytometers fabrikant voor excitatie lichtbronnen en de spectra van de emissie detectoren, hier zowel een 488 nm en 640 nm laser werden gebruikt samen meteen 675 ± 12,5 nm optische filter. </li><li> Voor het opnemen van de hoogste resolutie instellingen selecteren die het dichtst bij de kern grootte van het doelorganisme (10 pm) en een relatief lage stroomsnelheid (14 pl / min). OPMERKING: Voor de beste resolutie monsters moet worden uitgevoerd volgens de fabrikanten aanbeveling van de gebeurtenissen per seconde. </li><li> Alvorens gegevens te gebruiken een drempel naar gate uit lichtverstrooiing en / of fluorescentie signalen die worden veroorzaakt door elektronische ruis of celmonster puin. </li><li> Selecteer een nieuwe data cel, maken een dichtheid perceel met FSC-H en SSC-H parameters op een log schaal en op Uitvoeren. </li><li> Als monster dichtheid leidt tot een overmatige incidentie, kan verdunning maatregelen worden genomen om de nauwkeurigheid en precisie te verhogen. </li><li> Van de dichtheid perceel van toepassing software poorten van de vorige histogram te laag niveau scatter signalen, geproduceerd door achtergrondgeluiden of vuil (FSC &lt;320.000) sluiten. Omgekeerd is de poort van de hogere relatieve fluorescentiephycocyanine signalen van cellen en alleen onder deze gebeurtenissen (FL4, 56.000 - 1.950.000). </li><li> Met het aantal cellen die in de afgesloten ruimtes delen door het totale volume van het monster dat is gepasseerd door de FCM te werken hoeveel cellen per ml. Opmerking: De FCM model hier gebruikt heeft een microprocessor gestuurde peristaltische pompsysteem waardoor monstervolume te bepalen. Andere FCM apparatuur kan een gekalibreerde kralensuspensie of een berekening van H 2 O gewicht / volume verschillen totale monstervolume vereist verifiëren. </li><li> Voeg de vereiste hoeveelheid cellen aan de vers bereide media om een batch groeicyclus (250.000 cellen / ml) van M.aeruginosa starten. OPMERKING: Species verschillen in groei, afhankelijk van hun in-situ omgeving parameters en de beschikbaarheid van voedingsstoffen, zodat een batch cyclus moet vooraf opgenomen op life cycle fasen vast te stellen. </li></ol> 3. Optimordening der Molecular Probe Cel Opname <ol><li> Oogst de helft van de M.aeruginosa kweek bereid in stap 2 van een exponentiële fase en als een &#39;live&#39; control. Opmerking: De monsters verdund uit een hoge dichtheid kweek rechtstreeks naar een exponentiële fase kan beïnvloeden optimalisatie resultaten door dode celvernieuwing, vergeleken met die van culturen geïnoculeerd vanuit een aanvankelijke vertraging / inductiefase. </li><li> Bereid de andere helft als een &quot;dode&quot; controle door gebruik van werkwijzen zoals 70% ethanol, verwarming monsters bij 60 ° C gedurende 1 uur, of paraformaldehyde 4% formaldehyde gedurende 30 min 6,11,22. Controleer variaties in de micro monsters (bijv., PH). LET OP: De positieve, warmte-gedood &#39;dode&#39; controle M.aeruginosa wordt onderscheiden van een &#39;live&#39; monster door de daling van de phycocyanine signalen. Inducerende sterfte door andere methoden kunnen veroorzaken dezelfde output en zal vary in soorten. </li><li> Instellen gemengde monsters met verschillende verhoudingen van &#39;levende&#39; en &#39;dode&#39; samples (bijvoorbeeld 0%, 25%, 50%, 100%). </li><li> Disaggregeren kolonievorming door vortexen of sonificatie en controleer de pH. </li><li> Selecteer een 488 nm laser naast detectoren fluorescentie kunt opnemen van de groene (FL1, 530 ± 15 nm) en oranje (VT2, 585 ± 20 nm) nucleïnezuurprobes en de 640 nm laser om fycocyanine signalen op te nemen via haar respectieve detector. OPMERKING: Bij gebonden aan DNA, de groene nucleïnezuur probe heeft een geschatte fluorescentie excitatie golflengte van 504 nm en emissie maxima van 523 nm, terwijl de oranje nucleïnezuur probe heeft een excitatiegolflengte van 547 nm en emissie maxima van 570 nm. Een 488 nm argon ion solid state laser kan worden gebruikt voor zowel moleculaire probes wekken echter een groene laser (tot 547 nm) een hogere fluorescentie te produceren. </li><li> Als uitgangspunt, de invoering van demoleculaire sonde met fabrikanten aanbevolen concentratie tot de 50% &#39;live&#39; en 50% &#39;dode&#39; cultuur en incubeer in het donker. </li><li> Selecteer een nieuwe data cel, plaatst het monster onder het SIP met drempels en triggers die achtergrondgeluiden (FSC-H 80.000) zal verminderen. </li><li> Maak een dichtheid perceel met FSC-H en SSC-H parameters, en drie histogrammen. Een histogram met de desbetreffende moleculaire probe optische detector kanaal (FL1 of 2), een om fycocyanine emissies (FL4-H) en de andere FSC-H, allemaal op een logaritmische schaal detecteren. </li><li> Incubeer de monsters van M.aeruginosa met het nucleïnezuur probes in het donker voor 60 min, opnemen in afzonderlijke datacellen op verschillende tijdstippen (1, 5, 10, 15, 30 en 60 min). OPMERKING: Bij het ​​aanpassen van parameters zoals pH controle met produceert voor potentiële reacties van bepaalde chemische stoffen (voor de geteste nucleïnezuursondes een buffer kan niet fosfaten of hoge niveaus van monovalente of diva bevattengeleend kationen, zoals de binding met DNA wordt gereduceerd). </li><li> Breng een software-poort alleen de FSC-H histogram (320.000 - 1.500.000) voor de doelorganismen cel grootte, in de respectievelijke fluorescentie sonde kanaal histogram. Opmerking: De concentraties die in dit protocol waren 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 en 100 uM, die kan worden veranderd door ofwel verhogen of verlagen van het volume van M.aeruginosa monster of initiële voorraadoplossing van nucleïnezuur probes. </li><li> In de fluorescentie sonde kanaal gelden andere inclusief software poort naar de hoogste piek in het histogram (groen FL1-H, 240.000 - 1.650.000, oranje FL2-H, 30.000 - 165.000) en vervolgens de poort die positieve probe fluorescentie in de dichtheid plot. </li><li> Run stappen 3,1 - 3,11 bij 100% &quot;live&quot;, 100% &#39;dode&#39; en al mengcultuur monsters, het aanpassen van de concentraties moleculaire probe (bijvoorbeeld x 0,1 tot x 10) en / of de temperatuur en pH indien nodig. </li> &lt;li&gt; Vergelijk het aantal positieve moleculaire probe fluorescentiesignalen de oorspronkelijke celdichtheid van &quot;dode&quot; cellen (uit half totale FSC-H of 100% &#39;dode&#39; cultuur) om het totale percentage cellen gekleurd met het nucleïnezuur vinden probes. </li><li> Doe dit voor elke periode in elke concentratie om de optimale protocol voor het hoogste percentage van de cel nu- sonde opname vinden zonder dat niet-specifieke kleuring (gebruik van de middelen in een One-Way ANOVA of Kruskal-Wallis one-way variantie-analyse, als de gegevens niet-parametrische). </li></ol> 4. Molecular Probe Fluorescentie Discriminatie <ol><li> Voor het testen van de fluorescentie interferentie / overlap van intrinsieke of niet-specifieke cel kleuring selecteer de 50% &#39;live&#39; en 50% &#39;dode&#39; gemengde cultuur data en verwijder alle poorten. </li><li> Breng een software-poort alleen de FSC-H histogram (320.000 - 1.500.000) voor de doelorganismen cel grootte, in de phycocyaninekanaal histogram. </li><li> Poort de hoogste piek en phycocyanine label &#39;live&#39;, met toevoeging van de laagste piek aangeduid als &quot;dood&quot;. </li><li> Voer een verdere poort stap in de respectieve moleculaire probe fluorescentie histogram kanaal, via een op een moment, het &#39;live&#39; en vervolgens &#39;dode&#39; phycocyanine (FL4) signalen, waarop zowel de gemiddelde golflengtes. OPMERKING: De modus voor het induceren van sterfte in dit experiment werd gedaan door een warmtebehandeling, die op grond van dit protocol duidelijk afneemt phycocyanine signalen. Andere methoden voor het produceren van populaties van &#39;dode&#39; cellen kunnen verschillende uitgangen op in de verworven runs. </li><li> Verhouding van de gemiddelde golflengte van de positieve moleculaire probe fluorescentie (&quot;dode&quot;) en de intrinsieke / niet-specifiek signaal (&quot;levende&quot;) protocol gevoeligheid te bepalen. OPMERKING: Om de fluorescentie van discriminatie van &#39;live&#39; en &#39;dood&#39; Popul verbeterenaties, verhoging van de koolstofbron actieve vlek opname van nutriënten uitgeputte cellen of ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) aan celwand permeabiliteit en verkregen fluorescentiesignalen 6 verbeteren. Limited compensatie bepaalde FCM modellen spectrale overlap kan worden uitgevoerd door de gebruiker gemanipuleerd paarsgewijze correctie tijdens monsterverzameling (PMT voltage verandert) of uit post-analytische gespecialiseerde software. </li><li> Selecteer de geoptimaliseerde protocol, waar het hoogste bedrag van de &#39;dode&#39; cellen is gekleurd zonder het optreden van niet-specifieke kleuring. Als een aantal test vergelijkbare resultaten te aanvaarden van het protocol met de laagste concentratie en de incubatietijd, samen met een goede discriminatie fluorescentie signaal. Volg de instructies van de fabrikant voor de cytometer shutdown procedure. </li></ol>

<ol><li>Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+Activity+in+Readily+Culturable+Bacteria%3A+A+Review+and+Discussion+of+the+Practical+Issues%5BTitle%5D)+AND+%22Anton.+Leeuw.+Int.+J.+G%22%5BJournal%5D)">Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues.</a> Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).</li>
<li>Adams, D. G., Duggan, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tansley+Review+No.+107.+Heterocyst+and+Akinete+Differentiation+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria.</a> New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).</li>
<li>Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Physiological+Heterogeneity+in+Microbial+Population+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior.</a> Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).</li>
<li>Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Nutrient-Replete+Microcystis.+PCC+7806+Cultures+is+Inhibited+by+an+Extracellular+Signal+Produced+by+Chlorotic+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures.</a> Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).</li>
<li>Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+Microbial+Viability+Using+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).</li>
<li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life%2C+Death%2C+and+In-Between%3A+Meanings+and+Methods+in+Microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microb%22%5BJournal%5D)">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li>
<li>Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+Flow+Cytometry%22">Practical Flow Cytometry</a>. , 273-410 (2003).</li>
<li>Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-Cytometric+Total+Bacterial+Cell+Counts+as+a+Descriptive+Microbiological+Parameter+for+Drinking+Water+Treatment+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes.</a> Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past%2C+Present+and+Future+Applications+of+Flow+Cytometry+in+Aquatic+Microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology.</a> Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).</li>
<li>Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+Flow+Cytometry+of+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria.</a> Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).</li>
<li>Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Applicability+of+Fluorescent+Vitality+Probes+on+Phytoplankton%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton.</a> J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).</li>
<li>Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Viability+and+Antibiotic+Susceptibility+Testing+with+SYTOX+Green+Nucleic+Acid+Stain%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).</li>
<li>Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Senescence+and+Death+in+Emiliania+huxleyi.+and+Thalassiosira+pseudonana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Staining%2C+Chlorophyll+Alterations%2C+and+Dimethylsulfoniopropionate+%28DMSP%29+Metabolism.+Limnol.+Oceanogr%22%5BJournal%5D)">Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana.</a> Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).</li>
<li>Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+SYTOX+Green+Stain+for+Bacterial+Viability+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).</li>
<li>Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Activity+and+Membrane+Integrity+Changes+in+Microcystis+aeruginosa.-+New+Findings+on+Hydrogen+Peroxide+Toxicity+in+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria.</a> Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).</li>
<li>Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Experimentally+Generated+Turbulence+on+the+Mash01+Unicellular+Microcystis+aeruginosa+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain.</a> Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).</li>
<li>Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Microcystin+production+in+the+Cell+Cycle+of+Microcystis+viridis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+toxicol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis.</a> Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).</li>
<li>Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Control+of+HAB+Species+using+Low+Biosurfactant+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+Algae%22%5BJournal%5D)">On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations.</a> Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).</li>
<li>Bouchard, J. N., Purdie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Elevated+Temperature%2C+Darkness%2C+and+Hydrogen+Peroxide+Treatment+on+Oxidative+Stress+and+Cell+Death+in+the+Bloom-Forming+Toxic+Cyanobacterium+Microcystis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis.</a> J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).</li>
<li>Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+Natural+Microcystis+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Phycol.+J%22%5BJournal%5D)">Enumeration of Natural Microcystis Populations.</a> Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).</li>
<li>Marie, D., Simon, N., Vaulot, D. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarie%2C+D+%22Algal+culturing+techniques%22">Algal culturing techniques</a>. Andersen, R. A. , Academic press. 253-268 (2005).</li>
<li>Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+method+for+the+assessment+of+the+minimal+inhibitory+concentrations+of+antibacterial+agents+to+Mycoplasma+agalactiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae.</a> Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).</li>
<li>Davey, H. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting+of+Heterogeneous+Microbial+Populations%3A+The+Importance+of+Single-Cell+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+rev%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses.</a> Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).</li>
<li>Franklin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explaining+the+Causes+of+Cell+Death+in+Cyanobacteria%3A+What+Role+for+Asymmetric+Division%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plankton+Res%22%5BJournal%5D)">Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division?</a> J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).</li>
<li>Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+the+Physiological+Heterogeneity+within+Starved+Cultures+of+Micrococcus+luteus.+by+Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).</li>
<li>Waggoner, A. Fluorescent probes for cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaggoner%2C+A+%22Flow+cytometry+and+sorting%22">Flow cytometry and sorting</a>. Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. , 2nd, Wiley-Liss Inc. New York. 209-225 (1990).</li>
<li>Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Sleeping+Beauty%22%3A+Quiescence+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">"Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).</li>
<li>Keer, J. T., Birch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Methods+for+the+Assessment+of+Bacterial+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability.</a> J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Het toegenomen aantal publicaties behulp van moleculaire probes aangeeft dat betrouwbare en informatieve gegevens kunnen worden verkregen 5,6,8 - 15,19,22,23. Tot nu toe is er geen perfecte vlek voor de levensvatbaarheid van de cellen die effectief kan zijn in alle soorten met dezelfde concentratie en incubatietijd 6,10. Zelfs hetzelfde type probe met gewijzigde fluorescentie-emissie blijkt het nodig de juiste concentratie en incubatietijd (tabellen 1 en 3) va...

De cel is een complex systeem dat continu reageert op het milieu door beïnvloeding van de fysiologische parameters en de functie ervan te veranderen. De populatie dynamica van isogene microbiële populaties zowel qua aard als het laboratorium worden beïnvloed door de ontwikkeling van subpopulaties, optredende zelfs onder betrekkelijk constante milieuomstandigheden 1 - 3. De variabiliteit van natuurlijke microbiële gemeenschappen ontstaat als gevolg van de sterk variabele aard van omgevingsomstandigheden. Deze soms stochastische processen vervolgens produceren subpopulaties die zijn heel anders dan de gemiddelde bevolking. Recent bewijs is gebleken dat deze fysiologische subpopulaties verschillend reageren op milieu-omstandigheden en kan het signaal verbindingen of remmers die drastisch beïnvloeden en invloed hebben op de totale 3,4 bevolking te produceren. De oprichting van een methode om heterogeniteit binnen een populatie te definiëren is de sleutel tot understanding de ecologie van microben in verschillende omgevingen en is essentieel bij het ​​bouwen kennis overlast cyanobacteriën, zoals toxische Microcystis, die grote gevolgen hebben voor de menselijke waterzekerheid. Soorten zoals Anabaena morfologische heterogeniteit weergegeven in reactie op omgevingschommelingen ontwikkelen gespecialiseerde cellen zoals heterocysten en akinetes 2. In tegenstelling, doe Microcystis cellen niet duidelijk morfologische heterogeniteit tonen tijdens een reactie op stress. Het onderscheid tussen levensvatbare en niet-levensvatbare cellen is het belangrijkste fysiologische differentiatie en maakt een beter begrip van microbiële populatie. Echter, de conceptuele probleem van de bacteriële levensvatbaarheid zelf blijft moeilijk en slecht gekenmerkt 1,5,6. Flowcytometrie (FCM) is een betrouwbare en snelle werkwijze voor het analyseren van afzonderlijke cellen. Om het begrip van enkele cel fysio verhogenlogie met FCM, zijn moleculaire probes werden gebruikt voor een aantal metabolische en biochemische processen 7 onderscheiden. Dit heeft geleid tot een grotere kennis van de soorten op cellulair en populatieniveau en op zijn beurt hielp waterbeheer 8,9. Echter organismen verschillen in moleculaire opname en efflux probe vanwege de poriën en pompen in celwanden en membranen, die hebben geleid tot een aantal moleculaire ontwerp probe en protocolimplementatie 6,10,11. Moleculaire probes beschikbaar voor commerciële en onderzoeksdoeleinden worden vaak voorzien van een generiek protocol die van toepassing kunnen zijn voor een heel ander celtype. Men moet zeer voorzichtig overdracht protocollen ontwikkeld één celtype tot een ander 6, is het daarom een essentiële taak moleculaire probes optimaal effectief voor gebruik. De groene en oranje nucleïnezuur probes binden aan zowel dubbel- en enkelstrengs nucleïnezuren met minimale base selecterentiviteit en worden gebruikt om de plasma membraan integriteit van de cellen te beoordelen. De groene nucleïnezuur probe een duidelijk verbeterde cel labeling fluorescentiesignaal vergeleken met andere moleculaire probes, zoals propidium-jodide gebaseerde verbindingen 12, die ook kan fungeren als een indicator van de levensvatbaarheid van de cellen. De term &quot;cell rentabiliteit&quot; Hier neemt aan dat DNA degradatie optreedt na het verlies van plasmamembraan integriteit. De nucleïnezuurprobes zijn asymmetrisch cyaninekleurstoffen met drie positieve ladingen en kan niet cellen met intacte membranen te voeren onder gekenmerkt concentraties in zowel eukaryotische 11,13 en 14,15 prokaryotische organismen. De binding van een nucleïnezuur probe nucleïnezuren kunnen leiden tot een&gt; 500-voudige toename van fluorescentie-emissie van endogene signalen in cellen die hun membraan integriteit aangetast. Hoewel moleculaire probes zoals de groene nucleïnezuurprobe een goede indicator van de enkelvoudige celfysiologie kan zijn, is er behoefte to optimaliseren elke sonde met het beoogde doel organisme, zoals incubatietijd hebben varieerden van 7 min - 30 min en concentratie varieert van 0,1 uM - 0,5 micrometer in Microcystis experimenten alleen 15-19. Hier presenteren we een protocol om de cytometrische analyses van groen en de relatief nieuwe oranje nucleïnezuurprobes (die tot op heden niet getest op de cyanobacteriën soort M.aeruginosa) te optimaliseren. De volgende ontwikkelde methodologie kan worden overgedragen naar andere soorten en gebruikt als een platform voor het optimaliseren van protocollen in andere moleculaire probes, waardoor het begrip van microben en ecologische gedrag verhogen.

<table><tbody><tr><td>Cyanobacteria Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3061-500ML</td><td>BG-11 Zoetwater geconcentreerde oplossing (x50 verdunning)</td></tr><tr><td>Decontaminatievloeistof</td><td>BD Biosciences</td><td>653155</td><td>Loop gedurende 2 min wanneer de uitvoer meer dan 12 gebeurtenissen per seconde op snel of een stroomsnelheid van 66 &micro;l/min.&nbsp; Gevolgd door 2 min van omhulsel H2O.</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>op verzoek</td><td>BD Accuri C6</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Life Technologies</td><td>S7020</td><td>Nucleinzuurvlek &ndash; 5 mM oplossing in DMSO</td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Life Technologies</td><td>S11368</td><td>Nucleinzuurvlek &ndash; 5 mM oplossing in DMSO</td></tr></tbody></table>

moleculaire probe optimization to cell sterfte bepaal in een fotosynthetische organisme (<em&gt; microcystis aeruginosa</em&gt;) met behulp van flowcytometrie

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Microbiële subpopulaties in veld en laboratoriumstudies bleek een hoge heterogeniteit in morfologische en fysiologische parameters weergegeven. Het bepalen van de actuele toestand van een microbiële cel overstijgt levende of dode categorieën, zoals microben kan voorkomen in een slapende toestand, waarbij celdeling en metabolische activiteiten verminderd. Gezien de noodzaak voor detectie en kwantificering van microben flowcytometrie (FCM) met moleculaire probes verschaft een snelle en nauwkeurige methode om te bepalen algemene levensvatbaarheid populatie. Door het gebruik van SYTOX Groen en SYTOX Oranje in het model cyanobacterie Microcystis aeruginosa te membraanintegriteit ontdekken, ontwikkelen we een overdraagbare methode voor een snelle indicatie van enkele cel sterfte. De moleculaire probes die in dit tijdschrift worden genoemd groen of oranje nucleïnezuur probes respectievelijk (hoewel er andere producten met gelijke excitatie en emissie golflengten die vergelijkbare functies hebben action, we specifiek naar de voorgrond genoemde sondes). Protocollen met behulp van moleculaire probes verschillen tussen soorten verschillen voornamelijk in concentratie en incubatietijd. Na dit protocol beschreven op M.aeruginosa de groene nucleïnezuurprobe geoptimaliseerd in concentraties van 0,5 uM na 30 min incuberen en de oranje nucleïnezuurprobe bij 1 uM na 10 min. In beide sondes concentraties lager dan hier vermeld geleid tot onder rapportage van cellen met membraanschade. Omgekeerd 5 uM concentraties en hoger in beide probes vertoonden een type niet-specifieke kleuring, waarbij &#39;levende&#39; cellen die een doel fluorescentie, wat leidt tot een oververtegenwoordiging van &quot;niet-levensvatbaar&quot; celaantallen. De positieve controles (warmte gedode) die toetsbaar dode biomassa, hoewel de geschiktheid van controle generatie blijft onderwerp van discussie. Door het aantonen van een logische opeenvolging van stappen voor het optimaliseren van de groene en oranje nucleïnezuurprobes we demonstrate hoe een protocol dat kan worden gebruikt voor cyanobacteriën fysiologische toestand effectief te analyseren creëren.

Voorwaartse lichtverstrooiing (FSC) en kant lichtverstrooiing (SSC) uitgangen van een M.aeruginosa batch cultuur in exponentiële fase geeft informatie over de grootte cel (diameter) en de interne granulariteit respectievelijk (Figuur 1A). FSC kunnen cellen die te groot en / of klein M.aeruginosa te onderscheiden zijn. Deze discriminatie of gating kan door raffinage van gegevens tussen bepaalde punten van FSC uitgang (figuur 1C). Phycocy...

Microbiële populaties bevatten aanzienlijke cel heterogeniteit, die de algehele gedrag kan dicteren. Moleculaire probe analyse door middel van flowcytometrie kan fysiologische staten van cellen te bepalen, maar de toepassing ervan varieert tussen soorten. Deze studie geeft een protocol naar cel sterfte binnen een cyanobacterie bevolking nauwkeurig bepalen, zonder onderschatten of opname vals positieve resultaten.

Moleculaire Probe Optimization to Cell Sterfte Bepaal in een fotosynthetische organisme (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Met behulp van flowcytometrie

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe een protocol kan worden opgesteld dat de fysiologische toestand van cyanobacteriën effectief kan analyseren met behulp van flowcytometrie en moleculaire probes. Dit protocol kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de celphysiologie van microbiële gemeenschappen. Het belangrijkste voordeel van deze procedure is dat een geoptimaliseerd protocol met fluorescente probes de fysiologische toestanden van cyanobacteriën op individueel celniveau in realtime kan onderscheiden.Deze procedure wordt gedemonstreerd door David Hartnell, een PhD-student die werkt in het cytometry-lab van de Bournemouth University. Plaats vóór aanvang van het experiment een lege hemolysebuis op de monsterinjectiesonde. Klik op unclog.Voer vervolgens een backflush uit om het reinigingsproces van de flowcytometrie te starten. Laad aan het einde van de backflush een nieuwe hemolysebuis met 2 mL ultrafijn gefilterd water op de monsterinjectiesonde, of SIP, stel de tijdslimiet in op 10 tot 15 minuten en de vloeistofsnelheid op snel. Selecteer daarna een nieuwe datacel en stel de relevante fluorescentie- en lichtverstrooiingsdrempels in om de achterg

molecular-probe-optimization-to-determine-cell-mortality

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Bijhouden kleine veranderingen in de progressie en kinetiek van celcyclus stadia worden door gebruik van een combinatie van metabolische labeling van nucleinezuren met BrdU en totaal genomisch DNA kleuring via propidium jodide. Deze methode wordt voorkomen dat van de chemische synchronisatie van fietsen cellen, waarbij de introductie van niet-specifieke DNA-schade die op zijn beurt invloed celcyclus.

Het meten van voortgang van de celcyclus Kinetics met metabolische labeling en Flow cytometrie

Source: Chapman, I. J., et al., Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the method for distinguishing live and dead Microcystis aeruginosa cells by combining fluorescent probe labeling with flow cytometric analysis of phycocyanin autofluorescence and probe signal.

Viability Analysis of Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

This video demonstrates a flow cytometry assay to quantify the ROS levels in 3D intestinal organoids obtained from GFP-expressing transgenic mice. This method provides an in vitro experimental model to investigate the efficacy of test compounds on ROS production.

Flow Cytometry Assay to Quantify Oxidative Stress: An Assay to Quantify Reactive Oxygen Species in Intestinal Organoids Using Fluorogenic Probes

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Optisch bestuurde stoffen zijn krachtige hulpmiddelen om signaalroutes te bestuderen. Om het spectrum van mogelijke experimenten uit te breiden, hebben we een apparaat ontwikkeld voor het bestuderen van optisch bestuurde stoffen in realtime met behulp van flowcytometrie: de LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - De combinatie van optogenetics met flowcytometrie

Flow cytometrische analyse heeft waardevol voor het onderzoeken van zuivere culturen en controle van de microbiële Gemeenschap dynamiek bewezen. Wij presenteren drie uitgebreide werkstromen, van monsterneming tot data-analyse, voor zuivere culturen en complexe gemeenschappen in duidelijke medium zoals in uitdagende matrices, respectievelijk.

Wezenlijke Microbiome Dynamics – Stroom Cytometry gebaseerd werkstromen van reinculturen aan natuurlijke gemeenschappen

Een protocol voor fluorescerende, flowcytometrische kwantificering van senescente kankercellen geïnduceerd door chemotherapiegeneesmiddelen in celkweek of in muizentumormodellen wordt gepresenteerd. Optionele procedures omvatten co-immunostaining, monsterfixatie om grote batch- of tijdpuntanalyse te vergemakkelijken en de verrijking van levensvatbare senescente cellen door flowcytometrische sortering.

Verrode fluorescentie-geassocieerde β-galactosidase-sonde voor identificatie en verrijking van senescente tumorcellen door flowcytometrie

Dit protocol richt zich op het gebruik van flowcytometrie en het tellen van kralen om bacteriële sporen te kwantificeren die zijn gelabeld met ethidiumbromide. De methode is ook efficiënt voor het analyseren van de covalente koppeling van eiwitten op het oppervlak van intacte sporen.

Verbetering van Bacillus subtilis sporentelling en labelanalyse in flowcytometrie

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en kosteneffectieve methode om celdood in menselijke colonorganoïden te onderzoeken en te kwantificeren als reactie op cytotoxische perturbagens zoals cytokines. De aanpak maakt gebruik van een fluorescerende celdoodkleurstof (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), live fluorescentiemicroscopie en open-source beeldanalysesoftware om enkelvoudige organoïde reacties op cytotoxische stimuli te kwantificeren.

Kwantificering van cytokine-geïnduceerde celdood in menselijke colonorganoïden met behulp van live fluorescentiemicroscopie

Hier presenteren we een protocol om de overleving na stress in gistmonsters te kwantificeren. De test maakt gebruik van twee fluorescerende kleurstoffen, SYTO 9 en propidiumjodide (PI), om de integriteit van het plasmamembraan te kwantificeren. Het maakt gebruik van flowcytometrie om kwantitatieve en reproduceerbare schattingen te geven van de levende, dode en beschadigde celfracties voor monsters na oxidatieve stress.

Een geoptimaliseerde LIVE/DEAD-test in combinatie met flowcytometrie voor het kwantificeren van overleving na stress in gistcellen

Leer hoe je celsterfte nauwkeurig bepaalt in Microcystis aeruginosa met geoptimaliseerde moleculaire probes en flowcytometrie. Deze methode analyseert fysiologische toestanden op individueel celniveau in real-time.

Moleculaire Probe Optimization to Cell Sterfte Bepaal in een fotosynthetische organisme ( Microcystis aeruginosa) Met behulp van flowcytometrie (Video) | JoVE Journal

Moleculaire Probe Optimization to Cell Sterfte Bepaal in een fotosynthetische organisme (

Meer video's verkennen