Moleculaire Probe Optimization to Cell Sterfte Bepaal in een fotosynthetische organisme ( Microcystis aeruginosa) Met behulp van flowcytometrie
29 januari 2016
Microbiële populaties bevatten aanzienlijke cel heterogeniteit, die de algehele gedrag kan dicteren. Moleculaire probe analyse door middel van flowcytometrie kan fysiologische staten van cellen te bepalen, maar de toepassing ervan varieert tussen soorten. Deze studie geeft een protocol naar cel sterfte binnen een cyanobacterie bevolking nauwkeurig bepalen, zonder onderschatten of opname vals positieve resultaten.
Het algemene doel van deze procedure is om te demonstreren hoe je een protocol kunt maken dat het fysiologische toestand van cyanobacteriën effectief kan analyseren, met behulp van flowcytometrie en moleculaire sondes. Dit protocol kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de celfysiologie van microbiële gemeenschappen. Het belangrijkste voordeel van deze procedure is dat een geoptimaliseerd fluorescentie-sondeprotocol kan onderscheid maken tussen de fysiologische toestanden van cyanobacteriën op individueel celniveau in real-time.
De demonstratie van deze procedure zal worden uitgevoerd door David Hartnell, een promovendus die werkt in het cytometrie-laboratorium van Bournemouth University. Plaats voor het begin van het experiment een lege hemolysebuis op de monsterinjectie-sonde. Klik op ontstoppen.
En spoel vervolgens terug om het schoonmaakproces van de flowcytometrie te starten. Aan het einde van het terugspoelen, laadt u een nieuwe hemolysebuis met twee milliliter ultrapuur gefilterd water op de monsterinjectie-sonde, of SIP, en stelt u de tijdslimiet in op 10 tot 15 minuten, en de vloeistofsnelheid op snel. Selecteer vervolgens een nieuwe gegevenscel en stel de relevante fluorescentie- en lichtverstrooiingsdrempels in om de achtergrondruis te verminderen.
Klik vervolgens op uitvoeren. Als het totale aantal gebeurtenissen per seconde niet minder is dan de aanbeveling van de fabrikant, draai dan twee milliliter ontsmettingsoplossing gedurende twee minuten op snel. En herhaal de terugspoel- en ultrapuur water spoelstappen.
Om een primaire M.aeruginosa monocultuur te bereiden, sterieliseer 98 milliliter ultrapuur gefilterd water, gemengd met twee milliliter algenmedium, in een 250-milliliter beker gedurende 20 minuten bij 120 graden Celsius. Wanneer een cultuur zich in een hoge stabiele dichtheidstoestand bevindt, disaggregeer twee milliliter cellen door te vortexen. En breng vervolgens de cellen onder de monstersteeknaald over.
Bevestig dat de cellen gelijkmatig verspreid zijn door lichtmicroscopie. Selecteer vervolgens een histogramplot in de flowcytometersoftware om de voorwaartse lichtverstrooiingsgegevens te registreren. En klik op log om de gegevens in een logaritmische schaal op de x-as te bekijken.
In een aparte uitvoer stelt u een andere logaritmische histogramas in om de natuurlijke fluorescentie van de M.aeruginosa-cellen op te nemen. Selecteer vervolgens een lichtbron die phycocyanine kan exciteren en een detector die de emissie van de resulterende fluorescentie kan filteren. Voor opname met de hoogste resolutie, selecteert u de instellingen die het dichtst bij de kerngrootte van het doelorganisme liggen.
En stel een relatief lage stroomsnelheid in. Voordat u de gegevens verwerft, stelt u een drempel in om alle lichtverstrooiing en fluorescentiesignalen die worden veroorzaakt door elektronische achtergrondruis of celmonsterdebris uit te sluiten. Selecteer vervolgens een nieuwe gegevenscel.
Maak een dichtheidsplot met voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsparameters op een logaritmische schaal en klik op uitvoeren. Pas nu de voorwaartse lichtverstrooiing en natuurlijke fluorescentiepoort toe op de voorwaartse door zijwaartse verstrooiingsgegevens om alle lage niveauverstrooiingssignalen uit te sluiten, en om alleen de hogere relatieve fluorescentie phycocyanine signalen op te nemen. Verzamel vervolgens gebeurtenissen totdat het monster is afgelopen, en gebruik de gegevens om het aantal cellen in het begin te bepalen.
Om de opname van moleculaire sondes in de cellen te optimaliseren, stelt u de helft van de eerder bereide monocultuur bloot aan de juiste omstandigheden voor het genereren van een dode controle. Controleer de variaties in de micro-omgeving van het monster om de dood van de cultuur te bevestigen. En disaggregeer vervolgens de kolonievorming zoals zojuist is gedemonstreerd.
Selecteer vervolgens een 488-nanometer laser naast een detector die fluorescentie kan registreren van de groene en oranje nucleïnezuursondes. En de 640-nanometer laser om de phycocyanine-signalen op te nemen via hun respectievelijke detectoren. Stel in een nieuwe gegevensblad een dichtheidsplot in met voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsparameters.
Maak vervolgens één histogram met behulp van de respectieve optische detectorkanaal van de moleculaire sonde. Eén histogram om de phycocyanine-emissies te detecteren, en één histogram voor voorwaartse verstrooiingsgebeurtenissen, allemaal op een logaritmische schaal. Voer de cyanobacteriële monsters uit met verschillende concentraties en incubatietijden.
Maak een poort in het voorwaartse verstrooiingshistogram om gebeurtenissen alleen met de celgrootte van het doelorganisme op te nemen. En pas het toe op het corresponderende fluorescentie-sondekanaal. Maak vervolgens in het fluorescentie-sondekanaal nog een inclusieve software-poort tegen de hoogste piek in het histogram.
En poort vervolgens de corresponderende positieve sondefluorescentie op het dichtheidsplot. Vergelijk het aantal fluorescentiesignalen met het aantal dode controlecellen, waarbij het hoogste percentage opname van celnucleïnezuursonde dat geen niet-specifieke kleuring produceert. Voor het testen van de overlap van fluorescentieinterferentie van intrinsieke of niet-specifieke celkleuring, selecteert u de 50 procent levende en 50 procent dode gemengde cultuurgegevens.
En verwijder de fluorescente poorten. Pas poorten toe om alleen de voorwaartse verstrooiingshistogram voor de celgrootte van het doelorganisme op het phycocyaninekanaal histogram op te nemen. Poort de hoogste en laagste phycocyanine pieken en label ze respectievelijk levend en dood.
Pas vervolgens de poorten afzonderlijk toe op de levende en dode phycocyanine signalen. En noteer beide gemiddelde golflengten. Om de gevoeligheid van het protocol te bepalen, verhoud de gemiddelde golflengten van de positieve dode moleculaire sondefluorescentie en het intrinsieke niet-specifieke levende signaal.
Selecteer tenslotte het geoptimaliseerde protocol waarbij de hoogste hoeveelheid dode cellen is gekleurd zonder het optreden van niet-specifieke kleuring. In deze grafieken worden de representatieve voorwaartse en zijwaartse lichtverstro
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het analyseren van de fysiologische toestanden van cyanobacteriën met behulp van flowcytometrie en moleculaire sondes. De methode heeft tot doel de celmortaliteit binnen microbiële populaties nauwkeurig te bepalen en gaat in op uitdagingen bij celheterogeniteit.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Flow Cytometrie
Achtergrond
- Microbiële populaties vertonen significante celheterogeniteit.
- Flow cytometry kan fysiologische toestanden beoordelen, maar varieert per soort.
- Accurate meting van celmortaliteit is cruciaal voor het begrijpen van microbiële gemeenschappen.
- Geoptimaliseerde fluorescerende sondes kunnen de analyse op individueel celniveau verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor het beoordelen van de fysiologie van cyanobacteriën.
- Om de nauwkeurigheid van celmortaliteitsbepaling te verbeteren.
- Om real-time analyse van fysiologische toestanden in cyanobacteriën mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Flow cytometry voor celanalyse.
- Molecuulsondes om fysiologische toestanden te onderscheiden.
- Protocoloptimalisatie voor nauwkeurige resultaten.
- Demonstratie door een PhD-student in een cytometrielab.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol onderscheidt effectief fysiologische toestanden in cyanobacteriën.
- Accurate bepaling van celmortaliteit werd bereikt.
- Real-time analyse leverde inzichten op in microbieel gedrag.
- De resultaten ondersteunen het begrip van cyanobacteriële populaties.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol verbetert de analyse van cyanobacteriële fysiologie.
- Het gaat eerdere beperkingen bij het meten van celmortaliteit aan.
- Deze methode kan worden toegepast in verschillende microbiële studies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate assessment of cellular viability in microbial systems supports early-stage target validation by enabling reliable phenotypic screening and mechanistic de-risking. Flow cytometry with optimized molecular probes provides quantitative, single-cell resolution data that improves predictive confidence in lead identification campaigns. This approach addresses heterogeneity challenges in discovery biology, facilitating data-driven go/no-go decisions and reducing late-stage biological risk in antimicrobial or anti-infective pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by distinguishing viable from non-viable cells in microbial populations.
- Operational Value: Supports functional target validation through membrane integrity assessment using SYTOX Green and SYTOX Orange probes.
- Predictive Value: Optimized probe concentrations (0.5 µM green, 1.0 µM orange) minimize false negatives and non-specific staining, enhancing assay reliability.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible fluorescence readouts for high-throughput compound screening in antimicrobial discovery.
- Quantitative Output: Enables precise measurement of probe uptake as a dependent variable for dose-response modeling.
- Scalability: Protocol optimization in Microcystis aeruginosa provides a transferable framework for other cyanobacterial or microbial systems.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports preclinical modeling of antimicrobial efficacy by quantifying compound-induced mortality in target pathogens.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase viability screening to preclinical validation through consistent, flow cytometry-based endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in lead optimization by providing real-time, single-cell physiological data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights that inform compound progression decisions.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by correlating compound treatment with changes in cellular viability.
- Screening: Delivers assay standardization and reproducibility through optimized probe incubation and concentration parameters.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence measurements enabling statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking membrane integrity readouts to compound mechanism of action.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cytometry platform applicable across microbial targets in anti-infective programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false viability readings through probe optimization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories via defined probe concentrations and incubation times.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of compounds lacking target-specific activity.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds with genuine antimicrobial effects versus assay artifacts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry operation and fluorescence compensation for multi-parameter detection.
- Dependent on access to flow cytometers with 488 nm laser compatibility and appropriate detection channels for SYTOX dyes.
- Necessitates cross-team protocol standardization to ensure consistent probe handling, storage, and application.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to Gram-positive or Gram-negative bacterial models.
- Includes practical limitations such as probe toxicity and the need for biosafety containment when working with toxic organisms like Microcystis aeruginosa.
