Moleculaire Probe Optimization to Cell Sterfte Bepaal in een fotosynthetische organisme (

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe een protocol kan worden opgesteld dat de fysiologische toestand van cyanobacteriën effectief kan analyseren met behulp van flowcytometrie en moleculaire probes. Dit protocol kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de celphysiologie van microbiële gemeenschappen. Het belangrijkste voordeel van deze procedure is dat een geoptimaliseerd protocol met fluorescente probes de fysiologische toestanden van cyanobacteriën op individueel celniveau in realtime kan onderscheiden.

Deze procedure wordt gedemonstreerd door David Hartnell, een PhD-student die werkt in het cytometry-lab van de Bournemouth University. Plaats vóór aanvang van het experiment een lege hemolysebuis op de monsterinjectiesonde. Klik op unclog.

Voer vervolgens een backflush uit om het reinigingsproces van de flowcytometrie te starten. Laad aan het einde van de backflush een nieuwe hemolysebuis met 2 mL ultrafijn gefilterd water op de monsterinjectiesonde, of SIP, stel de tijdslimiet in op 10 tot 15 minuten en de vloeistofsnelheid op snel. Selecteer daarna een nieuwe datacel en stel de relevante fluorescentie- en lichtverstrooiingsdrempels in om de achtergrondruis te verminderen.

Klik vervolgens op run. Als het totaal aantal events per seconde niet lager is dan de aanbeveling van de fabrikant, laat dan twee milliliters decontaminatie-oplossing gedurende twee minuten op fast lopen. Herhaal daarna de stappen voor het backflushen en het spoelen met ultra puur water.

Om een primaire M.aeruginosa monocultuur voor te bereiden, autoclaveert u 98 milliliters ultra zuiver gefiltreerd water, gemengd met twee milliliters algenmedium, in een bekerglas van 250 milliliters gedurende 20 minuten bij 120 degrees Celsius. Wanneer een cultuur zich in een hoge steady-state dichtheid bevindt, desaggregeert u twee milliliters cellen door middel van vortexen. Breng de cellen vervolgens over naar de monsterinjectiesonde.

Bevestig met lichtmicroscopie dat de cellen gelijkmatig zijn verspreid. Selecteer vervolgens een histogramgrafiek in de software van de flowcytometer om de gegevens van de forward light scatter vast te leggen. Klik op log om de gegevens op een logaritmische schaal op de x-as weer te geven.

Stel in een aparte output een ander logaritmisch as-histogram in om de natuurlijke fluorescentie van de M.aeruginosa-cellen te registreren. Selecteer vervolgens een lichtbron die fycocyanine kan exciteren en een detector die de emissies van de resulterende fluorescentie kan filteren. Selecteer voor registratie met de hoogste resolutie de instellingen die het dichtst bij de kerngrootte van het doelorganisme liggen.

Stel een relatief lage stroomsnelheid in. Stel vóór de gegevensverwerving een drempelwaarde in om alle lichtverstrooiings- en fluorescentiesignalen die worden veroorzaakt door elektronische achtergrondruis of celdebris uit te sluiten. Selecteer vervolgens een nieuwe datacel.

Maak een dichtheidsplot met forward- en side-scatterparameters op een logaritmische schaal en klik op run. Pas nu de forward light scatter- en natuurlijke fluorescentiegate toe op de forward- versus side-scatterdata om alle scatter-signalen van een laag niveau uit te sluiten en alleen de relatief hogere fluorescentie-phycocyanine-signalen op te nemen. Verzamel vervolgens events totdat het monster is voltooid en gebruik de gegevens om het initiële celgetal te bepalen.

Om de cellulaire opname van de moleculaire probe te optimaliseren, stelt u de helft van de eerder voorbereide monocultuur bloot aan de juiste condities voor het genereren van een dode controle. Controleer de variaties in de micro-omgeving van het monster om de dood van de cultuur te bevestigen. Disaggregeer vervolgens de kolonievorming zoals zojuist gedemonstreerd.

Select vervolgens een 488-nanometer laser samen met een detector die fluorescentie van de groene en oranje nucleïnezuursondes kan registreren. Gebruik de 640-nanometer laser om de fycocyaninesignalen via hun respectievelijke detectoren vast te leggen. Stel in een nieuw gegevensblad een densiteitsplot op met parameters voor forward scatter en side scatter.

Maak vervolgens één histogram met behulp van het optische detectorkanaal van de betreffende moleculaire probe. Eén histogram om de fycocyanine-emissies te detecteren en één histogram voor forward scatter-gebeurtenissen, beide op een logaritmische schaal. Analyseer de cyanobacteriële monsters met verschillende concentraties en incubatietijden.

Maak een gate in het forward scatter-histogram om alleen events met de celgrootte van het doelorganisme op te nemen. Pas deze gate vervolgens toe op het bijbehorende fluorescentieprobe-kanaal. Maak daarna, in het fluorescentieprobe-kanaal, een andere inclusieve software-gate rond de hoogste piek in het histogram.

Gate vervolgens de overeenkomstige positieve probe-fluorescentie op het density plot. Vergelijk het aantal fluorescentiesignalen met het aantal dode controlecellen, waarbij het hoogste percentage opname van de nucleïnezuurprobe door de cellen wordt bepaald dat geen aspecifieke kleuring veroorzaakt. Selecteer voor het testen van de fluorescentie-interferentie-overlap door intrinsieke of aspecifieke celkleuring de data van de mengcultuur bestaande uit 50 procent levende en 50 procent dode cellen.

Verwijder vervolgens de fluorescentie-gates. Pas gates toe om alleen het forward scatter-histogram voor de celgrootte van het doelorganisme op het fycocyanine-kanaalhistogram te includeren. Gate de hoogste en laagste fycocyanine-pieken en label deze respectievelijk als 'levend' en 'dood'.

Pas vervolgens afzonderlijk de gates toe op de signalen van levende en dode fycocyanine. Noteer beide gemiddelde golflengten. Om de sensitiviteit van het protocol te bepalen, wordt de verhouding berekend tussen de gemiddelde golflengten van de positieve fluorescentie van de dode moleculaire probe en het intrinsieke aspecifieke signaal van de levende cellen.

Select ten slotte het geoptimaliseerde protocol waarbij de hoogste hoeveelheid dode cellen is gekleurd zonder dat er aspecifieke kleuring is opgetreden. In deze grafieken worden de representatieve outputs van de forward en side light scatter getoond voor de celgrootte en interne complexiteit van een batchcultuur van M.aeruginosa in de exponentiële fase. Gating kan worden uitgevoerd door de gegevens te verfijnen tussen bepaalde punten van de forward light scatter output.

Fycocyanine produceert een sterk signaal wanneer het wordt aangestuurd door een rode lichtbron, wat gebruikt kan worden om de populaties van belang verder te selecteren. Op basis van de forward light scatter en de fluorescentiesignalen kunnen de gegevens uit de oorspronkelijke output vervolgens worden gefilterd tot specifieke gegevens over het M.aeruginosa-monster voor de uiteindelijke cel tellingen. Wanneer levende controles met een hogere pigmentatie en dode controles met een lagere pigmentatie worden gemengd, wordt de afnemende verschuiving in autofluorescentie duidelijk.

In cellen met een aangetaste membraan produceren de nucleïnezuursondes een aanvullend signaal dat kan worden waargenomen via flowcytometrie en verder kan worden bevestigd met epifluorescentiemicroscopie. De fluorescentiedifferentiatie tussen levende en dode cellen neemt toe met de tijd bij concentraties tussen 0,05 en 0,5 µM, maar neemt af tussen de concentraties van 1 en 100 µM voor beide sondes. De optimale concentratie voor de groene nucleïnezuursonde lijkt inderdaad 0,5 µM te zijn met een incubatietijd van 30 minuten.

Voor de oranje nucleïnezuursonde is de optimale concentratie één micromolar voor een incubatie van 10 minuten. Zodra de methode onder de knie is, kan de optimalisatie voor elke moleculaire sonde in één dag worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de sonden in een stabiele omgeving moeten worden bewaard, onder de juiste temperatuur-, pH- en lichtomstandigheden.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de microbiologie om de heterogeniteit van gemeenschappen in fytoplankton te onderzoeken. Na het bekijken van de video zou u nu een goed begrip moeten hebben van hoe u een optimaal protocol ontwikkelt voor het beoordelen van de cellulaire fysiologie met behulp van flowcytometrie en moleculaire probes. Vergeet niet dat het werken met moleculaire probes en toxische organismen uiterst gevaarlijk kan zijn, en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van de juiste PBM en een volledig begrip van COSHH-materialen, altijd in acht genomen moeten worden tijdens het uitvoeren van deze procedure.