Photopatterning eiwitten en cellen in een waterige omgeving met behulp van TiO

Het algemene doel van het volgende experiment is het uitvoeren van een oppervlaktemodificatie van een celkweeksteunstructuur met behulp van de fotokatalytische activiteit van titaandioxide. Dit wordt bereikt door een dunne laag titaandioxide op een glazen dekglas aan te brengen, om dit vervolgens te coaten met een octadecylsilaan om het gehele oppervlak hydrofoob te maken. Als tweede stap wordt het substraat geblokkeerd door het onder te dompelen in celkweekmedium dat serumalbumine bevat.

Het albumine hecht zich aan het oppervlak en maakt dit niet-permissief voor celadhesie. Vervolgens wordt het monster overgebracht naar een waterige oplossing die collageen bevat, waarna een gefocust UV-licht wordt gebruikt om het oppervlak te bestralen. Hierdoor kunnen collageenmoleculen selectief hechten aan het foto-bestraalde gebied, waardoor dit gebied permissief wordt voor celadhesie.

Dit proces kan worden herhaald om meerdere eiwitten of celtypen te patroneren. We laten in deze video zien hoe de adhesieregio van PC 12-cellen selectief kan worden aangepast via UV-bestraling. We kregen het eerste idee voor deze methode toen we beseften dat fotokatalyse met titaandioxide commercieel wordt toegepast in zelfreinigende glazen ramen die organische verontreinigingen op het oppervlak verwijderen bij lichtbestraling, wat aantoont dat de procedure zal worden co-geleid door een promovendus uit mijn laboratorium.

Begin met het nummeren van de dekglasjes met een diamantkraspen op een manier die helpt om te waarborgen dat de juiste zijde van het monster naar boven is gericht. Reinig de dekglasjes vervolgens eerst onder stromend dubbel gedestilleerd water en dompel ze daarna gedurende 10 minuten onder in piranha-oplossing. Spoel de dekglasjes na 10 minuten acht keer af met dubbel gedestilleerd water en droog ze onder een stroom stikstof.

Plaats vervolgens een titaniumoxide-target in een radiofrequentie-sputtersysteem en bevestig daarna de schone dekglasjes op de monstertouhouder met polyamide tape. Plaats de monstertouhouder in de sputterkamer en vacuumeer de kamer totdat de druk 2,0 × 10⁻⁴ Pa bereikt. Introduceer vervolgens argongas in de kamer en stel de depositiedruk in op 4,0 mTorr terwijl de sluiter gesloten blijft. Verhoog het RF-vermogen geleidelijk naar 70 W.

Open vervolgens het sluiter en sputter gedurende 15 minuten om een film te verkrijgen met een dikte van 120 tot 150 nanometers. Begin met het drogen van een glazen bekerglas en een pincet in een oven bij 120 °C gedurende 30 minuten. Plaats daarna de dekglasjes in een plasmareactor en behandel het titaandioxide-oppervlak met zuurstofplasma gedurende vijf minuten bij 200 watt met een zuurstofstroom van 100 standard cubic centimeters per minute om een meer hydrofiel oppervlak te creëren.

Verwijder vervolgens de monsters en dompel ze onder in dubbel gedestilleerd water om te bevestigen dat het oppervlak superhydrofiel is, en droog het oppervlak grondig onder een stikstofstroom. Plaats daarna de monsters, het gedroogde bekerglas en de pincet in een stikstofgevulde glove bag en bereid een 1 mM oplossing van octadecyltrichloorethyleen opgelost in tolueen. Dompel het monster gedurende één uur bij kamertemperatuur in de oplossing om een zelfgeassembleerde monolaag op het titaniumoxide te vormen.

Verwijder vervolgens eventuele fosformoleculen door het monster te spoelen in tolueen, aceton, ethanol en tot slot in dubbel gedestilleerd water, telkens gedurende vijf minuten. Spoel het monster daarna vier keer met vers dubbel gedestilleerd water en droog het oppervlak onder een stroom stikstof.

Steriliseer de gecoate dekglasjes door de monsters vijf minuten onder te dompelen in 70% ethanol. Spoel de monsters vervolgens twee keer af met steriel dubbel gedestilleerd water. Plaats het monster daarna in een schaal van 35 millimeter en voeg twee milliliter PC 12 groeimedium toe.

Incubeer de monsters gedurende ten minste drie uur in een CO2-gebufferde incubator bij 37 °C, zodat het serumalbumine in het medium kan adsorberen op het oppervlak van de dekglasjes. Stel de omgekeerde fluorescentiemicroscoop in door eerst de booglamp in te schakelen. Plaats vervolgens de UV-filterkubus en draai de objectieflens naar een lens met een 20 x vergroting.

Meet de lichtintensiteit met een UV-intensiteitsmeter en bereken de bestralingstijd voor een dosis van 200 joules per square centimeter. Gebruik vervolgens een objectmicrometer en stel de diameter van het te bestralen gebied in op 200 microns door het velddiagram aan te passen. Voeg na de incubatie van drie uur 200 microliters van 3,0 milligrams per milliliter Type four collagen toe aan het medium dat de dekglasjes bedekt.

Plaats vervolgens de 35 millimeter petrischaal op de objecttafel van de microscoop en stel de microscoop scherp op het oppervlak van het monster met behulp van de kraslijnen. Bestraal een gebied van het dekglas met UV-licht bij een dosis van 200 joules per vierkante centimeter. Vervang daarna het medium door twee milliliters vers groeimedium met NGF en zonder Type four collageen en plaats het monster terug in de incubator.

Oogst de gekweekte NGF-gedifferentieerde PC 12-cellen in een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer de buis bij 150 ×g gedurende vier minuten. Aspireer vervolgens het supernatant en voeg één milliliter van het groeimedium toe. Resuspendeer de cellen door voorzichtig met een pipet op en neer te bewegen met behulp van een hemocytometer.

Bepaal de celdichtheid en voeg 3,0 × 10⁵ cellen toe aan een schaal van 35 millimeter met de gemodificeerde dekglasjes. Incubeer de schaal gedurende één tot twee dagen in een 5%CO2-incubator bij 37 °C na één tot twee dagen cultuur op het XC2-gemodificeerde oppervlak. Gebruik een microscoop om te bevestigen dat de cellen zich alleen hechten en groeien op het UV-bestraalde gebied van de dekglasjes.

Voeg vervolgens 67 µL collageen type IV toe aan de schaal met de gekweekte cellen, zodat de uiteindelijke concentratie collageen 100 µg/mL is, terwijl de microscoop is ingesteld voor oppervlaktepatronering. Plaats de schaal op de objecttafel van de microscoop en positioneer het bestralingsgebied naast de huidige locatie van de cellen. Bestraal het dekglas met UV-licht met een dosis van 200 J/cm².

Vervang na bestraling het medium door een medium zonder collageen en plaats het monster terug in de incubator, waarbij getracht moet worden de verwerking van een enkel monster binnen 30 minuten te voltooien. Dit is een dwarsdoorsnede-scanningelektronenmicroscopiebeeld van de gesputterde titaniumdioxidefilm. Op basis van de waarneming werd de dikte van de film geschat op ongeveer 150 nanometers.

Ook de vlakheid van de gedeponeerde titaniumdioxidefilm is hier opvallend. Verdere analyse via atoomkrachtmicroscopie onthulde dat de root mean square-ruwheid van het oppervlak slechts 0,2 nanometer bedroeg. Het type vier collageen en de oplossing adsorberen bij voorkeur aan het UV-bestraalde gebied waar de albuminen door de laser zijn verplaatst.

Om de veelzijdigheid van deze aanpak aan te tonen, zijn ook andere eiwitten, zoals fibrine, met dezelfde techniek gepatroneerd. Hier groeien cellen op het gepatroneerde XC twee-gebied van het dekglas en direct daarnaast in het door de stippellijn gedefinieerde gebied. Het dekglas is onlangs in situ twee UV-bestraald en gecoat met type four collageen.

Gedurende de volgende vijf dagen prolifereren de cellen en migreren ze om het nieuw gecodeerde gebied te bedekken. De hier gepresenteerde procedure kan worden gebruikt om cellen in cultuur willekeurig te manipuleren en potentieel om meerdere celtypen te patroneren voor de constructie van complexe co-cultuursystemen.