Name: Photopatterning eiwitten en cellen in een waterige omgeving met behulp van TiO 2 Photocatalysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Leer oppervlaktemodificatie van celkweekscaffolds met behulp van titaniumdioxide-fotokatalyse. Deze methode creëert microdomeinen voor collageenabsorptie en selectieve celadhesie in weefselengineering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken de heer Kotaro Okubo voor de vriendelijke assistentie met SEM-beelden. Dit werk werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021), en door onderzoeksbeurzen van de Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation en de Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.

1. Bereiding van TiO 2 gecoate dekglaasje <ol><li> Nummer de dekglaasjes met een diamant kraspen. Dit helpt niet alleen bij te houden van elke dekglaasjes maar ook voor zorgen dat de juiste zijde van het monster gericht. Reinig de dekglaasjes, eerste stromend DDH 2 O vervolgens door onderdompeling in piranha-oplossing (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). Na 10 minuten, spoel de dekglaasjes grondig 8 maal DDH 2 O. Droog de ​​dekglaasjes onder een stroom N2. </li><li> Stel TiO 2 doel in het radiofrequentie (RF) sputtering systeem. Bevestig de dekglaasjes op een monster houder van het sputteren apparatuur met behulp van een polyimide tape. Plaats de monsterhouder in de sputterkamer. Evacueren van de kamer tot de druk bereikt 2,0 x 10 -4 Pa. </li><li> Introduceren Ar gas in de kamer en stel de depositie druk tot 4,0 mTorr. Terwijl de sluiter gesloten, geleidelijk te verhogende RF-vermogen tot 70 W. </li><li> Open de sluiter en sputteren gedurende 15 minuten om een film te verkrijgen met een dikte van 120-150 nm (Figuur 1: Stap A). Groeisnelheid van de folie moet worden afgeleid voor elke machine. </li></ol> 2. Coating met Cell-afstotende Film <ol><li> Hydrofiliseren de TiO 2 oppervlak door behandeling van het monster met O2 plasma, volgens de instructies van de fabrikant van het plasma reactor. Wij behandelen het monster gedurende 5 minuten bij 200 W met O2 stroom van 100 sccm. Dompel het monster in DDH 2 O en controleer of het oppervlak is superhydrofiel. Droog het oppervlak grondig onder een stroom N2. </li><li> Bereid 1 mM octadecyltrichloorsilaan (OTS) door toevoeging van 39,6 ul OTS tot 100 ml tolueen. Dompel het monster in de oplossing gedurende 1 uur bij KT. Voeren deze stap in een N 2 -gevulde handschoen zak (Figuur 1: Stap B). </li><li> Om fysisch gesorbeerde moleculen te verwijderen, sonicate het monster in tolueen, aceton, ethanol, en DDH 2 O 5 minuten elk, in die volgorde. Spoel het monster vier maal in vers DDH 2 O en droog het oppervlak onder een stroom N2. De ondergrond moet hydrofoob met een contact hoek van 100-110 ° zijn. </li></ol> 3. Ex-situ Surface Patterning <ol><li> Werken in een laminaire stroming kap, trek enkele krassen met een diamant kraspen op het oppervlak. De markeringen helpen bij het bijhouden van de verwerkte regio&#39;s en ook het brengen van microscopen in beeld. Steriliseer de OTS-beklede TiO 2 door onderdompeling van het monster in 70% ethanol gedurende 5 minuten. Tweemaal Spoel vervolgens het monster in gesteriliseerde DDH 2 O. </li><li> Plaats het monster in een 35-mm schaal en voeg 2 ml van de PC12 groeimedium (zie stap 4.2). Incubeer gedurende 3 uur in een CO2-incubator (37 ° C). Deze procedure moet laten serumalbuminen absorberen op het oppervlak. Geadsorbeerd albuminen remmen daaropvolgende adsorptie van andere proteins en cellen (Figuur 1: Stap C). </li><li> Tijdens het wachten, het opzetten van de omgekeerde fluorescentie microscoop. <ol><li> Zet de booglamp, plaatst u de UV-filter kubus, en stel het objectief naar 20X. </li><li> Meet lichtintensiteit I (W cm -2) met UV-intensiteit meter en bereken bestralingstijd t (in seconden) voor een dosis van d (in J cm -2) als: t = d / I. Bijvoorbeeld, bestralen met een dosis van 200 J cm -2 behulp van een lichtbron van 600 mW cm -2 is 333 sec bestraling vereist. </li><li> Gebruik een micrometer en sluit het velddiafragma om de grootte van het gebied te bestralen, bijvoorbeeld 200 urn. </li></ol></li><li> Na 3 uur incubatie, het medium aangevuld met 200 pl 3,0 mg ml -1 type IV collageen (Col-IV; eindconcentratie 300 ug ml-1). </li><li> Breng de 35-mm schotel naar de microscoop podium. Vind de scratch mark, richten de microscoop op het monsteroppervlak en bestralen UV-licht bij een dosis van 200 J cm -2 (Figuur 1: Stap D). Het gebied van UV straling kan worden gewijzigd ofwel door aanpassing van de opening van het velddiafragma of door vervanging van het velddiafragma met een metalen masker van arbitraal geometrie. </li><li> Vervang het medium met vers kweekmedium (zonder Col-IV) en plaats het monster opnieuw in de incubator. </li></ol> 4. Cultuur van de Cel <ol><li> Routine cultuur van PC12 cellen wordt uitgevoerd op een collageen gecoate plastic schaaltje uitgevoerd. <ol><li> De vacht van een 60-mm weefselkweek schotel met Col-IV, eerst nat het oppervlak met DDH 2 O en zuig alle DDH 2 O. </li><li> Bereid 300 ug ml -1 Col-IV door verdunning van de oorspronkelijke oplossing (3 mg ml -1) 10x met DDH 2 O. </li><li> Voeg 200 ul van 300 ug ml-1 Col-IV per 60 mm schaal. Laat de oplossing verspreid over het oppervlak. </li><li> Droge tHij schotel in een laminaire stroming kap gedurende ongeveer 1 uur. </li><li> Tweemaal Spoel het oppervlak met 4 ml Dulbecco&#39;s fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS). Wanneer deze niet onmiddellijk met de gecoate schaal, spoel de schaal een keer met 4 ml van DDH 2 O. Na het opzuigen van DDH 2 O, slaan de schotel in de incubator. Probeer niet te houden opgeslagen voor meer dan twee weken. </li></ol></li><li> PC12-cellen worden gekweekt in een kweekmedium bestaande uit: Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (laag glucose) + 10% foetaal runderserum + 5% paardenserum + 1% penicilline-streptomycine-oplossing. Incubeer de cellen in een CO2 incubator (37 ° C, 5% CO 2) en plaats de helft van het medium elke andere dag. Passage cellen voordat ze samenloop. <ol><li> Zuig het groeimedium en voeg 2 ml PBS + (D-PBS + 10 mg ml -1 runderserumalbumine (BSA) + 10 mM EDTA) voorverwarmd tot 37 ° C. Incubeer 5 minuten bij 37 ° C. Tik voorzichtig de schotel naar alle ce loslls. </li><li> Verzamel cellen in een 15 ml conische buis. Spoel de schaal met 3 ml verse D-PBS, voorverwarmd tot 37 ° C. </li><li> Centrifugeer de buis bij 150 x g gedurende 4 min. </li><li> Zuig het supernatant en voeg 1 ml van het kweekmedium. </li><li> Voor routine cultuur, split de cellen 1: 3 tot 1: 5. </li></ol></li><li> Aan cellen plaat op de UV-gemodificeerde OTS / TiO 2 monster, tellen celdichtheid en voeg 3,0 x 10 5 cellen in een 35-mm schaal (Figuur 1: Stap E). Incubeer de schotel in de bevochtigde incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 1-2 dagen. Zowel naïef en zenuwgroeifactor (NGF) -differentiated PC12-cellen kunnen worden toegepast voor de patroonvorming experimenten. Voor NGF differentiatie, 100 ng ml -1 7S-NGF voor het uitplaten van de cellen op het monster wordt toegevoegd aan het groeimedium enkele dagen. NGF-differentiatie lijkt de adhesibility van de PC12-cellen te verhogen en vergemakkelijkt de manipulatie, met name bij de in-situ patroonvorming experiments. </li></ol> 5. In-Situ Surface Patterning <ol><li> Na 1-2 dagen van cultuur op de ex-situ gemodificeerd oppervlak, bevestigen dat de cellen hechten en alleen groeien op de UV-bestraalde gebied. Stel de microscoop, zoals beschreven in stap 3.4. </li><li> Breng het monster om een nieuwe 35-mm weefselkweek schaaltje met het groeimedium, 100 ng ml -1 NGF (bij gebruik van NGF-gedifferentieerde cellen) en Col-IV 100 ug ml-1. </li><li> Plaats de schotel op de microscoop podium. Zoek de juiste positie en bestralen UV licht met een dosis van 200 J cm -2 (Figuur 1: Stap F, G). De nieuw gecreëerde permissieve gebied wordt aangegeven met een sterretje in Figuur 1: Stap G. </li><li> Proberen om de verwerking van een enkel monster binnen 30 minuten te voltooien. Na bestraling overdracht van de sample in het medium zonder Col-IV. </li><li> Wees uiterst voorzichtig bij het uitvoeren van de schotel met cultured cellen en overbrengen van het monster van schotel naar schotel te voorkomen losmaken van de gevormde cellen. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53045/53045fig1highres.jpg" width="700" /> Figuur 1. Schematische weergave van het totale proces. Zie de tekst voor meer informatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53045/53045fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<ol><li>Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Patterning+on+Photolithographically+Defined+Parylene-C%3A+SiO2+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates.</a> J. Vis. Exp. (85), e50929(2014).</li>
<li>Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Outgrowth+of+Dissociated+Neurons+on+Patterned+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates.</a> J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).</li>
<li>Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Beam+Patterning+of+Fibronectin+Nanodots+that+Support+Focal+Adhesion+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation.</a> Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).</li>
<li>Tanii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Organosilane+Monolayer+Template+to+Quantitative+Evaluation+of+Cancer+Cell+Adhesive+Ability%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability.</a> Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01(2011).</li>
<li>Yamamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-Situ+Guidance+of+Individual+Neuronal+Processes+by+Wet+Femtosecond+Laser+Processing+of+Self-Assembled+Monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers.</a> Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).</li>
<li>Yamamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Neurite+Outgrowth+is+Required+for+Axon+Specification+by+Cultured+Hippocampal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons.</a> J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).</li>
<li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+Proteins+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (22), e1065(2008).</li>
<li>Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Two-Dimensional+Patterned+Substrates+for+Protein+and+Cell+Confinement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement.</a> J. Vis. Exp. (55), e3164(2011).</li>
<li>Singhvi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Cell+Shape+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineering Cell Shape and Function.</a> Science. 264, 696-698 (1126).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li>
<li>Degot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Visualization+and+Quantitative+Analysis+of+Drug+Effects+using+Micropatterned+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells.</a> J. Vis. Exp. (46), e2514(2010).</li>
<li>Nakanishi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+of+a+Substrate+for+Cell+Adhesion+under+Standard+Fluorescence+Microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressable+Micropatterning+of+Multiple+Proteins+and+Cells+by+Microscope+Projection+Photolithography+Based+on+a+Protein+Friendly+Photoresist%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist.</a> Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).</li>
<li>Deka, G., Okano, K., Kao, F. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Photopatterning+of+Cells+In+Situ+by+Q-Switched+Neodymium-Doped+Yttrium+Ortho-Vanadate%5BTitle%5D)+AND+%22Laser.+J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate.</a> Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012(2014).</li>
<li>Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Control+over+Cell+Adhesive+Properties+using+Molecular-Based+Surface+Engineering+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).</li>
<li>Choi, I., Yeo, W. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Monolayers+with+Dynamicity+Stemming+from+%28Bio%29chemical+Conversions%3A+From+Construction+to+Application%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application.</a> ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).</li>
<li>Nakanishi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switchable+Substrates+for+Analyzing+and+Engineering+Cellular+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Asian+J%22%5BJournal%5D)">Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions.</a> Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).</li>
<li>Yamamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Modification+of+Cell-Culture+Scaffolds+by+Photocatalytic+Decomposition+of+Organosilane+Monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers.</a> Biofabrication. 6, 035021(2014).</li>
<li>Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Modification+of+Cell+Scaffold+in+Aqueous+Solution+using+TiO2+Photocatalysis+and+Linker+Protein+L2+for+Patterning+Primary+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22e-J.+Surf.+Sci.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons.</a> e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).</li>
<li>Arima, Y., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Surface+Functional+Groups+on+Protein+Adsorption+and+Subsequent+Cell+Adhesion+using+Self-Assembled+Monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers.</a> J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).</li>
<li>Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TiO2+Photocatalysis+and+Related+Surface+Phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena.</a> Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).</li>
<li>Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Surface+Wettability+on+the+Adsorption+of+Proteins+and+Detergents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents.</a> J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+and+Photo-Patternable+Superhydrophobic+Film%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film.</a> Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+Hippocampal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing Hippocampal Neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In onze huidige protocol, werd TiO 2 film gevormd door RF-magnetron sputteren. Wij zijn voorstander van deze methode van afzetting, omdat het ons toelaat om reproduceerbaar te bereiden een fotokatalytische TiO 2 film met een sub-nm ruwheid. Hoewel sputterdepositie processen zijn bekend om materialen wetenschappers en elektronische ingenieurs, kan het niet zijn vrij toegankelijk voor biologen. In dat geval zou roterend bedekken TiO 2 film een alternatieve keuze 23 zijn. In deze...

Halfgeleiderlithografie processen en zijn derivaten - zoals fotolithografie 1,2, electron-beam lithografie 3-6 en microcontact afdrukken 7-10 - zijn inmiddels uitgegroeid tot een gevestigde praktijk in de celbiologie aan levende cellen te groeien in een bepaalde positie en geometrie. De patroon werkwijze berust op het gebruik van microfabricated substraten bestaande uit micro-eiland cel permissief coating in een niet-permissieve achtergrond. Dergelijke substraat dient als een template patroon van de cellen. Deze technologieën hebben ons de nieuwe werkwijzen om cellen en hun functie ingenieur bij enkel- en meercellige level, uittreksel de intrinsieke eigenschappen van de cellen, en de doorvoer van celgebaseerde drugonderzoek 11 verhogen. De mate-van-vrijheid in cel patroonvorming zou enorm toenemen als het patroon geometrie in situ kan worden veranderd, dat wil zeggen, terwijl cellen gekweekt op de sppervlakte. De conventionele werkwijzen voor patroonvorming niet direct hier toegepast, aangezien samples verwerken atmosfeer of in vacuüm. Daarom diverse nieuwe oppervlakte modificatie technieken zijn voorgesteld, die gebaseerd zijn, bijvoorbeeld op fotoreactieve verbindingen 12,13 of laser ablatie 5,14, om er maar een paar te noemen. De voorgestelde werkwijzen zijn goed beoordeeld door Robertus et al. 15, en recenter door Choi et al. 16 en 17 Nakanishi. Hier in dit artikel beschrijven we een nieuw protocol van in-situ modificatie van het oppervlak, die profiteren van de fotokatalytische afbraak van organische moleculen neemt een titaniumdioxide (TiO2) oppervlak 18,19. In deze werkwijze wordt een TiO 2 film ingevoegd tussen het glassubstraat en de organische film die de cellen interfaces en de organische film wordt ontleed in situ door het plaatselijk bestralen ultraviolette (UV)licht om een ​​gebied van belang (λ &lt;388 nm). We tonen aan dat het nieuwe protocol kan worden gebruikt om micropatterns van extracellulaire matrixeiwitten en levende cellen zowel ex situ als in situ te creëren. TiO 2 biocompatibel, chemisch stabiel, en optisch transparant, kenmerken waarvan maakt kinderen te voeren in cel-kweek-experimenten. Dit protocol voorziet in een materiaal-wetenschap gebaseerde alternatief voor het wijzigen van celcultuur steigers in celcultuur omgeving.

```html
<table><tbody><tr><td>Glazen dekglas</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-15R15</td><td>15 mm diameter, #1.5 dikte</td></tr><tr><td>Diamant graveerstift</td><td>Ogura Jewel Industry</td><td>D-Point Pen</td><td></td></tr><tr><td>RF sputtering systeem</td><td>ANELVA</td><td>SPC350</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 sputtering doel</td><td>Kojundo Chemical Lab</td><td>Titanium (IV) oxide, doel</td><td>Ruiheid, 99,9%</td></tr><tr><td>Plasma reactor</td><td>Yamato</td><td>PR301</td><td></td></tr><tr><td>n-octadecyltrichlorosilaan (OTS)</td><td>Aldrich</td><td>104817</td><td></td></tr><tr><td>Tolueen</td><td>Wako</td><td>204-01866</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekbakje (35&#160;mm)</td><td>Greiner</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekbakje (60&#160;mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Type-IV collageen</td><td>Nitta Gelatin</td><td>Cellmatrix Type IV</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's aangepast Eagle's medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td>Voor gebruik warmte-inactiveren en door een 0,22&#160;&#956;m filter halen</td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td>Voor gebruik door een 0,22&#160;&#956;m filter halen</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine (100x)</td><td>Nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>7S zenuwgroeifactor (NGF)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-130</td><td></td></tr><tr><td>Bovien serum albumine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo</td><td>N001</td><td>Voorraad oplossing in 0,5 M</td></tr><tr><td>TiO2 nanodeeltje</td><td>Tayca</td><td>TKD-701</td><td></td></tr></tbody></table>
```

photopatterning eiwitten en cellen in een waterige omgeving met behulp van tio<sub&gt; 2</sub&gt; photocatalysis

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

Organische verontreinigingen geadsorbeerd op het oppervlak van titaniumdioxide (TiO2) kan worden afgebroken door fotokatalyse onder ultraviolet (UV) licht. Hier beschrijven we een nieuw protocol toepassen van de TiO 2 fotokatalyse lokaal veranderen cell affiniteit van het substraatoppervlak. Voor dit experiment werd een dunne TiO 2-film werd sputter coating op een glazen dekglaasje en de TiO 2 oppervlak werd vervolgens gemodificeerd met een organosilaan monolaag afgeleid van octadecyltrichloorsilaan (OTS), die celadhesie remt. Het monster werd ondergedompeld in een celkweekmedium en gerichte UV licht werd bestraald met een achthoekige gebied. Wanneer een neuronale cellijn PC12-cellen werden uitgeplaat op het monster cellen gehecht alleen de UV-bestraalde gebied. We tonen verder aan dat deze modificatie van het oppervlak kan ook worden uitgevoerd in situ, dat wil zeggen, zelfs wanneer de cellen groeien op het substraat. Een juiste modificatie van het oppervlak vereist een extracellulaire matrix pProtein collageen aanwezig in het medium ten tijde van UV bestraling. De hier gepresenteerde techniek kan eventueel worden toegepast in patroonvorming meerdere celtypen te construeren gemengde cultuursystemen of willekeurig manipuleren cellen onder kweek.

Figuur 2A toont een dwarsdoorsnede scanning electron microscopy (SEM) beeld van sputteren afgezette TiO 2 film. Uit de waarnemingen, dikte van de film werd geschat op ongeveer 150 nm. Opvallend hierbij is de vlakheid van de afgezette TiO 2 film. Verdere analyse van atomaire kracht microscopie (AFM) bleek dat de wortel-gemiddelde-kwadraat (RMS) ruwheid van het oppervlak was 0,2 nm (figuur 2B). Wanneer de TiO 2 oppervlak gemodi...

We beschrijven een protocol voor het wijzigen van de celaffiniteit van een scaffoldoppervlak in een waterige omgeving. De methode maakt gebruik van titaandioxide fotokatalyse om organische film in het foto-bestraalde gebied af te breken. We laten zien dat het kan worden gebruikt om microdomeinen van scaffold-eiwitten te creëren, zowel ex situ als in situ.

Photopatterning eiwitten en cellen in een waterige omgeving met behulp van TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Photocatalysis

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het uitvoeren van een oppervlaktemodificatie van een celkweeksteunstructuur met behulp van de fotokatalytische activiteit van titaandioxide. Dit wordt bereikt door een dunne laag titaandioxide op een glazen dekglas aan te brengen, om dit vervolgens te coaten met een octadecylsilaan om het gehele oppervlak hydrofoob te maken. Als tweede stap wordt het substraat geblokkeerd door het onder te dompelen in celkweekmedium dat serumalbumine bevat.Het albumine hecht zich aan het oppervlak en maakt dit niet-permissief voor celadhesie. Vervolgens wordt het monster overgebracht naar een waterige oplossing die collageen bevat, waarna een gefocust UV-licht wordt gebruikt om het oppervlak te bestralen. Hierdoor kunnen collageenmoleculen selectief hechten aan het foto-bestraalde gebied, waardoor dit gebied permissief wordt voor celadhesie.Dit proces kan worden herhaald om meerdere eiwitten of celtypen te patroneren. We laten in deze video zien hoe de adhesieregio van PC 12-cellen selectief kan worden aangepast via UV-bestraling. We kregen het eerste idee voor deze methode toen we beseften dat fotokatalyse met titaandioxide commercieel wordt toegepast in zelfreinigende glazen ramen die organische verontreinigingen op het oppervlak verwijderen bij lichtbestraling, wat aantoont dat de procedure zal worden co-geleid door een promovendus uit mijn laboratorium.Begin met het nummeren van de dekglasjes met een diamantkraspen op een manier die helpt om te waarborgen dat de juiste zijde van het monster naar boven is gericht. Reinig de dekglasjes vervolgens eerst onder stromend dubbel gedestilleerd water en dompel ze daarna gedurende 10 minuten onder in piranha-oplossing. Spoel de dekglasjes na 10 minuten acht keer af met dubbel gedestilleerd water en droog ze onder een stroom stikstof.Plaats vervolgens een titaniumoxide-target in een radiofrequentie-sputtersysteem en bevestig daarna de schone dekglasjes op de monstertouhouder met polyamide tape. Plaats de monstertouhouder in de sputterkamer en vacuumeer de kamer totdat de druk 2,0 × 10⁻⁴ Pa bereikt. Introduceer vervolgens argongas in de kamer en stel de depositiedruk in op 4,0 mTorr terwijl de sluiter gesloten blijft. Verhoog het RF-vermogen geleidelijk naar 70 W.Open vervolgens het sluiter en sputter gedurende 15 minuten om een film te verkrijgen met een dikte van 120 tot 150 nanometers. Begin met het drogen van een glazen bekerglas en een pincet in een oven bij 120 °C gedurende 30 minuten. Plaats daarna de dekglasjes in een plasmareactor en behandel het titaandioxide-oppervlak met zuurstofplasma gedurende vijf minuten bij 200 watt met een zuurstofstroom van 100 standard cubic centimeters per minute om een meer hydrofiel oppervlak te creëren.Verwijder vervolgens de monsters en dompel ze onder in dubbel gedestilleerd water om te bevestigen dat het oppervlak superhydrofiel is, en droog het oppervlak grondig onder een stikstofstroom. Plaats daarna de monsters, het gedroogde bekerglas en de pincet in een stikstofgevulde glove bag en bereid een 1 mM oplossing van octadecyltrichloorethyleen opgelost in tolueen. Dompel het monster gedurende één uur bij kamertemperatuur in de oplossing om een zelfgeassembleerde monolaag op het titaniumoxide te vormen.Verwijder vervolgens eventuele fosformoleculen door het monster te spoelen in tolueen, aceton, ethanol en tot slot in dubbel gedestilleerd water, telkens gedurende vijf minuten. Spoel het monster daarna vier keer met vers dubbel gedestilleerd water en droog het oppervlak onder een stroom stikstof.Steriliseer de gecoate dekglasjes door de monsters vijf minuten onder te dompelen in 70% ethanol. Spoel de monsters vervolgens twee keer af met steriel dubbel gedestilleerd water. Plaats het monster daarna in een schaal van 35 millimeter en voeg twee milliliter PC 12 groeimedium toe.Incubeer de monsters gedurende ten minste drie uur in een CO2-gebufferde incubator bij 37 °C, zodat het serumalbumine in het medium kan adsorberen op het oppervlak van de dekglasjes. Stel de omgekeerde fluorescentiemicroscoop in door eerst de booglamp in te schakelen. Plaats vervolgens de UV-filterkubus en draai de objectieflens naar een lens met een 20 x vergroting.Meet de lichtintensiteit met een UV-intensiteitsmeter en bereken de bestralingstijd voor een dosis van 200 joules per square centimeter. Gebruik vervolgens een objectmicrometer en stel de diameter van het te bestralen gebied in op 200 microns door het velddiagram aan te passen. Voeg na de incubatie van drie uur 200 microliters van 3,0 milligrams per milliliter Type four collagen toe aan het medium dat de dekglasjes bedekt.Plaats vervolgens de 35 millimeter petrischaal op de objecttafel van de microscoop en stel de microscoop scherp op het oppervlak van het monster met behulp van de kraslijnen. Bestraal een gebied van het dekglas met UV-licht bij een dosis van 200 joules per vierkante centimeter. Vervang daarna het medium door twee milliliters vers groeimedium met NGF en zonder Type four collageen en plaats het monster terug in de incubator.Oogst de gekweekte NGF-gedifferentieerde PC 12-cellen in een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer de buis bij 150 ×g gedurende vier minuten. Aspireer vervolgens het supernatant en voeg één milliliter van het groeimedium toe. Resuspendeer de cellen door voorzichtig met een pipet op en neer te bewegen met behulp van een hemocytometer.Bepaal de celdichtheid en voeg 3,0 × 10⁵ cellen toe aan een schaal van 35 millimeter met de gemodificeerde dekglasjes. Incubeer de schaal gedurende één tot twee dagen in een 5%CO2-incubator bij 37 °C na één tot twee dagen cultuur op het XC2-gemodificeerde oppervlak. Gebruik een microscoop om te bevestigen dat de cellen zich alleen hechten en groeien op het UV-bestraalde gebied van de dekglasjes.Voeg vervolgens 67 µL collageen type IV toe aan de schaal met de gekweekte cellen, zodat de uiteindelijke concentratie collageen 100 µg/mL is, terwijl de microscoop is ingesteld voor oppervlaktepatronering. Plaats de schaal op de objecttafel van de microscoop en positioneer het bestralingsgebied naast de huidige locatie van de cellen. Bestraal het dekglas met UV-licht met een dosis van 200 J/cm².Vervang na bestraling het medium door een medium zonder collageen en plaats het monster terug in de incubator, waarbij getracht moet worden de verwerking van een enkel monster binnen 30 minuten te voltooien. Dit is een dwarsdoorsnede-scanningelektronenmicroscopiebeeld van de gesputterde titaniumdioxidefilm. Op basis van de waarneming werd de dikte van de film geschat op ongeveer 150 nanometers.Ook de vlakheid van de gedeponeerde titaniumdioxidefilm is hier opvallend. Verdere analyse via atoomkrachtmicroscopie onthulde dat de root mean square-ruwheid van het oppervlak slechts 0,2 nanometer bedroeg. Het type vier collageen en de oplossing adsorberen bij voorkeur aan het UV-bestraalde gebied waar de albuminen door de laser zijn verplaatst.Om de veelzijdigheid van deze aanpak aan te tonen, zijn ook andere eiwitten, zoals fibrine, met dezelfde techniek gepatroneerd. Hier groeien cellen op het gepatroneerde XC twee-gebied van het dekglas en direct daarnaast in het door de stippellijn gedefinieerde gebied. Het dekglas is onlangs in situ twee UV-bestraald en gecoat met type four collageen.Gedurende de volgende vijf dagen prolifereren de cellen en migreren ze om het nieuw gecodeerde gebied te bedekken. De hier gepresenteerde procedure kan worden gebruikt om cellen in cultuur willekeurig te manipuleren en potentieel om meerdere celtypen te patroneren voor de constructie van complexe co-cultuursystemen.

photopatterning-proteins-cells-aqueous-environment-using-tio2

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Niet-fouling PEG silaan monolaag werd gedesorbeerd uit individueel adresseerbare ITO elektroden op glas door toepassing van een reductieve potentieel. Elektrochemische strippen van de PEG-silaan laag van ITO-micro-elektroden toegestaan ​​voor celadhesie te laten plaatsvinden in een ruimtelijk bepaalde manier, met cellulaire patronen overeenkomt nauw aan bij elektrode patronen.

Patroonvorming Cellen op optisch transparant Indium Tin Oxide Elektroden

Dit protocol beschrijft een microfabrication-compatible methode voor cel-patroon op SiO 2. Een vooraf gedefinieerde Parylene-C ontwerp wordt fotolithografische gedrukt op SiO 2 wafels. Na incubatie met serum (of andere activering oplossing) cellen specifiek hechten aan (en te groeien volgens de conformiteit van) onderliggende parylene-C, terwijl wordt afgestoten door SiO 2 regio's.

Cel Patterning op fotolithografisch Defined Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrates

Procedures worden beschreven om gesegmenteerde en coaxiale nanodraden te bereiden via gesjabloneerd elektrodepositie in nanoporiën. Als voorbeelden werden gesegmenteerde nanodraden bestaande uit Ag en ZnO segmenten gemaakt, en coaxiale nanodraden bestaande uit een TiO2 schil en een Ag kern. De nanodraden werden gebruikt in experimenten met fotokatalytische waterstofvorming.

Bereiding en het gebruik van fotokatalytisch actieve Segmented Ag | ZnO en coax TiO<sub&gt; 2</sub&gt;-Ag Nanodraden Gemaakt door Templated Elektrodepositie

Er wordt een protocol gepresenteerd voor de fotochemische oxidatieve groei van kleine kristallijne iridiumoxide nanodeeltjes op het oppervlak van CdSe@CdS gezaaide staafnanodeeltjes.

Fotochemische oxidatieve groei van Iridium Oxide Nanodeeltjes op CdSe @ CdS nanorods

Dit artikel onderzoekt de geschiktheid van inkjetprinten voor de productie van kleurling gevoelige zonnepanelen. Een bindmiddelvrije TiO2 nanodeeltjesinkt werd geformuleerd en op een FTO-glassubstraat geprint. De gedrukte laag werd vervaardigd tot een cel met een actieve oppervlakte van 0,25 cm2 en een efficiëntie van 3,5%.

Digital Printing titaandioxide voor kleurstof zonnecellen

Een methode voor het volledig gedrukt te worden, fullereen-vrij, zeer lucht-stabiele, bulk-heterojunctie zonnecellen op basis van Ti alkoxiden als het elektron acceptor en het elektronen donerende polymeer fabricage wordt hier beschreven. Bovendien wordt een werkwijze voor het regelen van de morfologie van de fotoactieve laag door de moleculaire grote omvang van de Ti-alkoxide eenheden gerapporteerd.

Morfologie Control for Volledig Printable organisch-anorganische bulk-heterojunctie zonnecellen op basis van een Ti-alkoxide en halfgeleidende polymeer

Het algemene doel van dit project was om elektrospinning te gebruiken om een ​​fotoanode te vervaardigen met verbeterde prestaties voor kleurstofgevoeligte zonnecellen.

Elektrospinning van fotokatalytische elektroden voor kleurstofgevoeligte zonnecellen

Hier presenteren we een protocol ter voorbereiding van de gratis overdracht chromophores gebaseerd op een polyoxometalate/polymeer samengestelde membraan.

Voorbereiding van de Polyoxometalate gebaseerde foto-responsieve membranen voor de foto-activatie van mangaan Oxide katalysatoren

Hierin presenteren wij gedetailleerde protocollen voor oplossing-verwerkte zilver-bismut-jodium (Ag-Bi-I) ternaire halfgeleider dunne lagen vervaardigd op TiO2-gecoat transparante elektroden en hun potentiële toepassing als lucht-stable en loodvrij opto-elektronische apparaten.

Oplossing-verwerkte "Zilver-bismut-Iodine" ternaire dunne lagen voor fotovoltaïsche loodvrij absorptieflessen

We hebben rechtstreeks opgenomen een stilbene gebaseerde organische kleurstof in een cobaloxime-kern voor het genereren van een photosensitizer-katalysator dyad voor fotokatalytische H2 productie. We hebben ook een eenvoudige experimentele opstelling ontwikkeld voor het evalueren van de lichtgestuurde H2 -productie door fotokatalytische assemblages.

Ontwikkeling van Photosensitizer-Cobaloxime hybriden voor de productie op zonne-aangedreven H2 in waterige aërobe condities

Hier wordt een protocol gepresenteerd om een universele reeks experimentele procedures te verkennen voor uitgebreide laboratoriumevaluatie van fotokatalysatoren op het gebied van milieuzuivering, met behulp van het voorbeeld van fotokatalytische verwijdering van antibiotische organische verontreinigende moleculen uit water door ftalocyanine gesensibiliseerde zilverfosfaatcomposieten.

Een complete methode voor het evalueren van de prestaties van fotokatalysatoren voor de afbraak van antibiotica bij milieusanering

Leer oppervlaktemodificatie van celkweekscaffolds met behulp van titaniumdioxide-fotokatalyse. Deze methode creëert microdomeinen voor collageenabsorptie en selectieve celadhesie in weefselengineering.

Photopatterning eiwitten en cellen in een waterige omgeving met behulp van TiO

Meer video's verkennen