Studeren Eiwit functie en de rol van veranderde eiwitexpressie door Antibody Interferentie en driedimensionale Reconstructies
21 april 2016
Het regelen van eiwitexpressie is niet alleen essentieel voor elk levend organisme, maar ook een belangrijke strategie om eiwitfuncties in cellulaire modellen te onderzoeken. Het gepresenteerde protocol toont de toepassing van antilichaaminterferentie in zoogdiercellen, inclusief primaire hippocampale neuronen, en demonstreert het gebruik van driedimensionale reconstructies bij het bestuderen van eiwitfuncties.
Het algemene doel van het volgende experiment is om eiwitfuncties en de rol van veranderde eiwitexpressie op een efficiënte en strikt gecontroleerde manier te bestuderen. Dit wordt bereikt door antilichamen toe te passen om de hoeveelheid functioneel eiwit die beschikbaar is voor de cel te verminderen. Om dit te bereiken, worden antilichamen gekoppeld aan een peptide genaamd Chariot, dat een doorgang over cellulaire membranen bemiddelt.
Vervolgens worden cellulaire structuren van belang geïmager en 3D-gereconstrueerd om de effecten van de behandeling te evalueren. De resultaten tonen aan dat Chariot-peptiden bijzonder geschikt zijn om nucleaire eiwitten te targeten door middel van antilichaaminterferentie. De belangrijkste voordelen van deze techniek boven bestaande methoden zoals RNA-interferentie zijn dat de antilichamen die in de cel worden getransporteerd onmiddellijk effectief zijn, en dat de onderzoeker de mate van interferentie strikt kan controleren door de antilichaamdosissen aan te passen.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in eiwitfuncties in vele celtypen, is het bijzonder interessant voor het targeten van eiwitten in primaire neuronale culturen, die erg gevoelig zijn voor behandelingen maar Chariot goed verdragen. Bereid in voorbereiding gelyofiliseerd Chariot-peptidepoeder op in steriel water bij twee microgram per microliter. Tik voorzichtig op de buis om het poeder in oplossing te mengen.
Bereid vervolgens kleine werkoplossingen, slechts twee microliters zijn nodig voor elke reactie, en bewaar de oplossingen bij 20 graden Celsius. Bereid vervolgens zoogdiercellen voor op transfectie door ze in een 24-wellplaat te zaaien met een halve milliliter medium met antibiotica. Bij gebruik van neuronen, zaai de cellen alleen in de twee centrale rijen en met een lage dichtheid.
De lege wells zijn later handig. Wees snel. Gecultiveerde neuronen mogen niet langer dan een paar minuten buiten de incubator zijn.
Totdat de neuronen zich in het gewenste ontwikkelingsstadium bevinden, ververs ongeveer een kwart tot de helft van hun medium twee keer per week. Niet-neuronale culturen moeten worden gebruikt wanneer de cellen op 50%confluentie zijn. De volgende procedure wordt getoond voor zes tests en zes controlemonsters.
Voor elke lading, bereid een verdunning van 0,1 tot 2 microgram in 50 microliter 1X PBS per monster. Macromoleculaire complexen van vooraf gebonden primaire en secundaire antilichamen kunnen ook als lading worden gebruikt. Meng de oplossing voorzichtig met een voorzichtige vortex, gevolgd door een korte centrifugatie.
Verdun vervolgens twee microliters Chariot-stockoplossing in 50 microliter PBS voor elke reactie. Gebruik aparte buisjes voor elk monster om zelfassociatie van Chariot te voorkomen. Combineer nu de bereide eiwitten in de Chariot-verdunningen.
Meng en centrifugeer de gecombineerde eiwitten. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de vorming van Chariot-cargocomplexen mogelijk te maken. De optimale hoeveelheid eiwitpeptide hangt af van de lading en het gebruikte celtype.
Daarom moet deze hoeveelheid empirisch worden bepaald. Bereid vooraf wat groeimedium zonder additieven en 1X PBS met 0,5 millimolair magnesiumchloride en calciumchloride voor op 37 graden Celsius. Om te beginnen, verdunt u nu de bereide Chariot-complexen met 100 microliter medium.
Verwijder het medium van de geplateerde cellen en breng het over naar de lege wells voor hergebruik. Was vervolgens de cellen voorzichtig met 500 microliter voorverwarmde 1X PBS, calcium, magnesiumchloride-oplossing. Breng het medium met de Chariot-complexen aan op de cellen en schudden de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van de oplossing te garanderen.
Plaats de cellen snel terug in de incubator en wacht een uur voordat u verdergaat. Voor neuronen, na een uur incubatie, brengt u het opgeslagen medium over naar de wells. Voor alle andere cellen, voegt u serum toe tot een eindconcentratie van 10%. Gecultiveerde neuronen zijn erg gevoelig, bijvoorbeeld voor veranderingen in mediumtemperatuur en pH.
Daarom moeten deze cellen worden gewassen en voorzichtig worden getransfecteerd met voorverwarmde oplossingen en zo snel mogelijk terug in de incubator worden gebracht. Continueer de incubatie zolang als nodig, afhankelijk van de getransfecteerde lading en het celtype. Na de incubatie, bewerk de cellen voor verdere analyses zoals gebruikelijk.
Fixatieprotocollen, evenals levend beeldvorming, zijn beide compatibel met deze techniek. Gebruik een laserscanermkroscoop met een 63X lens om beelden te maken op een afstand van ongeveer 0,25 tot 0,5 micron om Z-stacks met voldoende detail te verkrijgen terwijl bleken wordt vermeden. De precieze laagsafstand hangt af van de grootte van de te reconstrueren structuur en moet individueel worden bepaald.
Voor beeldreconstructie, open de LSM-bestanden in Imaris. Met deze software wordt de Escape-knop gebruikt om te schakelen tussen Selecteren en Navigeren. Ook kunnen meerdere objecten worden geselecteerd door de Control-toets ingedrukt te houden.
Gebruik de Weergave-aanpassing om in elk kanaal te gaan en de contrast aan te passen totdat de helderste structuren verzadiging bereiken. Deze aanpassing heeft geen invloed op de oppervlakteconstructie, maar helpt wel bij het drempelen van het beeld. Als het object dat moet worden geconstrueerd in verschillende bestanden is opgenomen, gebruik dan de Bewerk en Voeg plakken toe-functie om de overeenkomstige bestanden te combineren.
Klik vervolgens op het pictogram Nieuwe oppervlakken toevoegen en selecteer Slechts een gebied van belang segmenteren. Pas nu de marges van het selectievakje aan om het object van belang te passen. Pas de vorm en kant van de rechthoekige vorm aan totdat alle vereiste structuren binnen het vak zijn.
De selectie moet in elk beeld door de Z-vlak worden aangepast. Ongewenste objecten kunnen later worden verwijderd. Selecteer vervolgens een geschikt kanaal.
Gebruik voorts het drempelingsgereedschap om de structuur van belang te reconstrueren. Het detailniveau van het oppervlaktegebied, of de diameter van de bol, moet worden ingesteld om overeen te komen met de structuren die worden gereconstrueerd. Afhankelijk van de signaalkarakteristieken kan absolute intensiteit of lokale contrast worden gebruikt.
Over het algemeen werkt lokaal contrast beter voor diffuse signalen. Vanwege de kenmerken van dit signaal wordt
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het beheersen van eiwitexpressie in zoogdiercellen, met een specifieke focus op primaire hippocampale neuronen. Er wordt ingegaan op het gebruik van antilichaaminterferentie en driedimensionale reconstructies om eiwitfuncties te bestuderen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Analyse van Proteïnefunctie
Achtergrond
- Proteïne-expressie is essentieel voor de cellulaire functie.
- Het onderzoeken van proteïnefuncties helpt bij het begrijpen van cellulaire mechanismen.
- Antilichaaminterferentie is een innovatieve benadering om proteïneniveaus te manipuleren.
- Driedimensionale beeldvorming verbetert de analyse van cellulaire structuren.
Doel van de studie
- Om eiwitfuncties op een gecontroleerde manier te bestuderen.
- Om de effecten van een veranderde eiwitexpressie te evalueren.
- Om de effectiviteit van antilichaaminterferentie in zoogdiercellen aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Toepassing van antilichamen gekoppeld aan Chariot-peptiden.
- Transport van antilichamen door cellulaire membranen.
- Imaging van cellulaire structuren van belang.
- Driedimensionale reconstructie van de geïmageerde structuren.
Belangrijkste resultaten
- Chariot-peptiden richten zich effectief op kernproteïnen.
- Antilichaaminterferentie zorgt voor onmiddellijke effecten op proteïneniveaus.
- Onderzoekers kunnen de mate van interferentie beheersen door aanpassingen in de dosering.
- Deze methode biedt voordelen ten opzichte van traditionele RNA-interferentietechnieken.
Conclusies
- Antilichaaminterferentie is een veelbelovende techniek voor het bestuderen van eiwitfuncties.
- Het maakt een nauwkeurige controle over de eiwitexpressieniveaus mogelijk.
- Deze benadering kan het begrip van cellulaire mechanismen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Precieze modulatie van eiwitexpressie is cruciaal voor targetvalidatie in een vroeg stadium en mechanische risicoreductie in biopharma R&D. Antilichaaminterferentie met behulp van Chariot-peptiden maakt een onmiddellijke, instelbare reductie van eiwitfuncties in gevoelige cellulaire systemen mogelijk, wat een snelle hypothese-toetsing ondersteunt. Deze aanpak verhoogt het voorspellende vertrouwen op belangrijke beslismomenten tijdens de discovery-fase, in het bijzonder voor nucleaire en soma-gelokaliseerde targets in neuronale en mammaliaanse modellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe bevraging van de eiwitfunctie mogelijk door onmiddellijke antilichaam-gemedieerde knockdown.
- Ondersteunt functionele validatie van targets in ziekterelevante neuronale en zoogdiercelmodellen.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door dosisafhankelijke modulatie van de eiwitactiviteit mogelijk te maken.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen voor portfolio-triage door snelle, kwantitatieve readouts te bieden.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde cellulaire systemen voor voor downstream compound-screening en fenotypische assays.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten via 3D-reconstructie en op beelden gebaseerde analyse.
- Maakt assay-standaardisatie mogelijk door controle over de antilichaamdosis en het tijdstip van interferentie.
- Ondersteunt de betrouwbare evaluatie van compound-effecten in sensitieve primaire neuronale culturen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante systemen door compatibiliteit met primaire neuronale culturen aan te tonen.
- Biedt continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door middel van robuuste functionele assays.
- Vermindert het translationele risico door gedetailleerde analyse van proteïnefuncties in fysiologisch relevante modellen mogelijk te maken.
- Ondersteunt de afstemming van biomarkers via kwantitatieve beeldvorming en volumetrische analyse.
Pipeline- & Workflowintegratie
Deze workflow voor antilichaaminterferentie en 3D-reconstructie integreert in de vroege fasen van discovery en targetvalidatie, en loopt door tot in de assayontwikkeling en het translationele onderzoek.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door onmiddellijke, instelbare eiwit-knockdown mogelijk te maken.
- Screening: Biedt assay-klare, reproduceerbare systemen met kwantitatieve imaging-outputs voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Levert volumetrische, oppervlakte- en intensiteitsmetingen voor een robuuste statistische vergelijking van experimentele condities.
- Translational Research: Behoudt continuïteit naar preklinische modellen door compatibiliteit met primaire neuronen aan te tonen.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar platform voor snelle functionele interrogatie van diverse eiwitdoelen en celtypen.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare workflows voor de analyse van eiwitfuncties.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënte portfolio-ontwikkeling mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering door het leveren van snelle, kwantitatieve functionele gegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met antilichamen, celcultuur en geavanceerde beeldanalyse.
- Toegang tot confocale microscopie en 3D-reconstructiesoftware is nodig voor kwantitatieve resultaten.
- Vereist standaardisatie van antilichaamdoses en beeldparameters tussen teams.
- Aanpasbaar aan diverse zoogdier- en neuronale celmodellen via empirische optimalisatie.
- Afhankelijk van de gevoeligheid van het celtype en de compatibiliteit met peptide-gemedieerde aflevering.
