Name: Studeren Eiwit functie en de rol van veranderde eiwitexpressie door Antibody Interferentie en driedimensionale Reconstructies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Leer eiwitfunctie bestuderen door antilichaaminterferentie met Chariot-peptiden in primaire hippocampale neuronen. Deze methode biedt onmiddellijke effecten en strikte controle over eiwitexpressieniveaus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De gepresenteerde werk werd in delen ondersteund door de financiering van de Canadese Institutes of Health Research / Fragile X Research Foundation van Canada partnership programma om RD, Jerome Lejeune Stichting RD, de Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung van de Universiteit Erlangen-Neurenberg naar RD en van de Deutsche Forschungsgemeinschaft naar RD en RE. De auteurs willen Ingrid Zenger bedanken voor technische bijstand met celkweek onderhoud, alsmede Prof. M. Wegner voor het maken van een pCMV5-FLAG vector beschikbaar. De auteurs verder wil in het bijzonder bedanken Nadja Schroeder voor de behulpzame ondersteuning op de video-opnamen.

1. Voorraadoplossingen <ol><li> Resuspendeer de gevriesdroogde actieve motief poeder in steriel H 2 O tot een eindconcentratie van 2 ug / ul. Tik zorgvuldig te mengen. </li><li> Bereid kleine hoeveelheden (bijvoorbeeld 12 pi elk 2 pl vereist per reactie) en bewaar ze bij -20 ° C. </li></ol> 2. Bereiding van Cellen <ol><li> Seed zoogdiercellen zoals HEK293 cellen of primaire neuronen op een plaat met 24 putjes in 500 ul groeimedium waaronder antibiotica. LET OP: Bij het gebruik van neuronen, het zaad van de cellen bij lage dichtheid en alleen gebruik maken van de twee middelste rijen van de 24 wells plaat. Elk goed zal dus een lege tegenhanger van het medium haven tijdens incubatie (stap 4.2). Bij het hanteren van neuronen, er altijd voor zorgen dat de cellen niet buiten de incubator worden gehouden voor meer dan een paar minuten. </li><li> Kweken van de cellen bij geschikte omstandigheden (bevochtigd, 5% CO2 en 37 ° C) tot de cellen app. 50%confluent. NB: Bij gebruik van neuronen, de cultuur van de cellen tot het gewenste ontwikkelingsstadium wordt bereikt en app te wijzigen. 25-50% van het medium tweemaal per week. Medium: Neurobasal medium (bestaande uit 1x B27, 5 mM L-glutamine en 1x penicilline en streptomycine; vergelijken met ref 16). </li></ol> 3. Chariot Complex Formation <ol><li> Per reactie verdund 0,1-2 ug van de POI of de overeenkomstige antilichaam en het controle-eiwit of controle antilichaam, respectievelijk in 50 pl PBS. LET OP: De techniek werkt ook met macromoleculaire complexen, bestaande uit pre-gebonden primaire en secundaire antilichamen (cp &#39;Representatieve resultaten &quot;, figuur 1.). Mix en spin. </li><li> Voor elk monster, verdund 2 pi Chariot voorraadoplossing in 50 pl PBS gebruik van afzonderlijke buizen om zelfassociatie van Chariot voorkomen. Mix en spin. </li><li> Breng de verdunde POI of antilichaam (stap 3.1) naar de Chariot verwatering door pipetTing. Mix en spin. </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (Chariot POI-complexen zullen vormen). </li></ol> 4. Transfectie van cellen <ol><li> Verdun de Chariot complexen (stap 3,4) in 100 ul voorverwarmde groeimedium (37 ° C, zonder toevoegingen). Verwijder het medium en de cellen eenmaal te wassen met behulp voorverwarmd 1x PBS. OPMERKING: Bij het gebruik van neuronen, hoeft het medium niet weg, zal het worden hergebruikt. Houd het bij 37 ° C. Voor het wassen Gebruik PBS bevattende 0,5 mM MgCl2 en CaCl2. Suggestie: houd het medium in lege putten, terwijl incubatie van de plaat (stap 4.5). </li><li> Breng de Chariot complexoplossing (stap 4,1) aan de cellen en rock de cellen zachtjes te zorgen voor een gelijkmatige verdeling van de oplossing. Kweek de cellen onder standaardomstandigheden (stap 2,2) gedurende 1 uur. serum aan een eindconcentratie van 10%. Bij gebruik neuronen, voeg het medium van stap 4,1. Groeien de cellen gedurende 1 tot 2 uur. Merk opoptimale incubatietijd afhankelijk van de grootte en de eigenschappen van de lading en moet deze empirisch worden aangepast. De volgende suggesties kunnen als leidraad dienen: Voor peptiden, 1 uur is meestal voldoende, voor eiwitten 1-2 uur worden aanbevolen, op antilichamen 2 uur, en voor de transfectie van neuronen met antilichamen 4 uur. </li><li> Werkwijze cellen voor analyse zoals gebruikelijk. Let op: de techniek is compatibel met experimenten met fixatie-protocollen en live imaging. </li></ol> 5. Imaging <ol><li> Met behulp van een laser scanning microscoop neemt z-stapels van cellen en / of celcompartimenten plaats via circa 0,25-0,5 urn afstand. De precieze afstandslaag afhankelijk van de grootte van de structuur te reconstrueren en moet individueel bepaald. </li></ol> 6. Wederopbouw <ol><li> In de volgende stappen, gebruik maken van de Esc bodem om te schakelen tussen Select en Navigeren, Cntr om meerdere objecten te selecteren door te klikken on hen en Shift-toets ingedrukt te snijden objecten (cp. stap 6.10). </li><li> Open het LSM-bestand in Imaris. </li><li> Met behulp van de aanpassing van de weergave voor elk kanaal, het contrast van de foto tot de helderste structuren te bereiken verzadiging. Houd er rekening mee dat deze aanpassing heeft geen invloed op het oppervlak bouw, het alleen dient om de onderzoeker te helpen bij drempelvorming het beeld. </li><li> Klik op het icoon toevoegen Surfaces. Een wizard wordt geopend. </li><li> Selecteer: Segment slechts een Region of Interest. Ga door naar de volgende stap. </li><li> Stel de marge van de selectie box om uw object van belang past. Gelieve er rekening mee dat het beeld heeft 3 dimensies en dat de selectie moet worden aangepast aan de z vliegtuig ook. Als de rechthoekige vorm van de selectie box het voorwerp van belang niet goed zou overeenkomen, zet het object en / of vergroten van de doos totdat alle vereiste structuren zijn ingebed. Ongewenste voorwerpen kunnen later worden verwijderd (cp. Stap 6.10). Doorgaan. </li><li> Selecteer de juiste chAnnel. De oppervlakte Detailniveau of bol diameter moet worden ingesteld op overeenkomen met de structuren wordt gereconstrueerd. Afhankelijk van het signaal kenmerken, kan zowel Absolute Intensity of Local Contrast worden gebruikt. In het algemeen, Local Contrast werkt beter voor diffuse signalen. In elk geval moeten de instellingen worden afzonderlijk voor elk signaal of de structuur van belang respectievelijk aangepast. </li><li> Met behulp van de Thresholding gereedschap, reconstrueren de structuur van belang. </li><li> Voltooi de reconstructie door te klikken op de groene pijl onderaan. </li><li> Pas het object verder met behulp van het potlood te snijden en oppervlakken te verwijderen indien nodig. Het is alleen mogelijk om de afbeelding in noord-zuid richting gesneden, dus kantelen om het gewenste object te snijden. </li><li> Het verkrijgen van metingen van volume, oppervlakte en intensiteiten voor elk oppervlak door het selecteren van Statistiek, gedetailleerde statistieken en gemiddelde waarden. </li><li> (Optionele stap) Om kleurcode statistieken observeren (cp. Figuur 2E </sTrong&gt; en F), selecteert u het tabblad kleur van het betreffende oppervlak en markeer &#39;Statistiek Coded&#39; in plaats van &#39;Base&#39;. Verschillende opties worden weergegeven. </li></ol>

<ol><li>Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSantoro%2C+MR+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22">Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease</a>. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).</li>
<li>Jiang, T. F., Chen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+two+lysosome+degradation+pathways+of+alpha-synuclein+in+Parkinson%27s+disease%3A+potential+therapeutic+targets%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets?</a> Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).</li>
<li>Howlett, D. R., Richardson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+APP+transgenic+mice%3A+a+model+of+Alzheimer%27s+disease+or+simply+overexpression+of+APP%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP?</a> Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).</li>
<li>Carlson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Modification+of+the+Phenotypes+Produced+by+Amyloid+Precursor+Protein+Overexpression+in+Transgenic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice.</a> Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).</li>
<li>Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+mRNA-secapping+regulator+implicated+in+X-linked+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation.</a> Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).</li>
<li>Fukami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+member+of+a+gene+family+on+Xp22.3%2C+VCX-A%2C+is+deleted+in+patients+with+X-linked+nonspecific+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation.</a> Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).</li>
<li>Van Esch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+VCX-A+due+to+NAHR+plays+a+major+role+in+the+occurrence+of+mental+retardation+in+patients+with+X-linked+ichthyosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis.</a> Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).</li>
<li>Sebat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+association+of+de+novo+copy+number+mutations+with+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Strong association of de novo copy number mutations with autism.</a> Science. 316, 445-449 (2007).</li>
<li>Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+edge%3A+a+link+between+gene+expression+levels+and+aggregation+rates+of+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins.</a> Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li>
<li>Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+therapeutics+and+applications+of+microRNAs+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment.</a> Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).</li>
<li>Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+RNA+interference-based+therapeutics+and+application+of+multi-target+small+interfering+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs.</a> Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).</li>
<li>DeVincenzo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise%2C+pitfalls+and+progress+of+RNA-interference-based+antiviral+therapy+for+respiratory+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Ther%22%5BJournal%5D)">The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses.</a> Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).</li>
<li>Fellmann, C., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+RNA+interference+rules+for+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable RNA interference rules for silencing.</a> Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).</li>
<li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).</li>
<li>Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Characterisation+of+Simiate%2C+a+Novel+Protein+Linked+to+the+Fragile+X+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome.</a> PLoS One. 8, e83007(2013).</li>
<li>Derlig, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simiate+is+an+Actin+binding+protein+involved+in+filopodia+dynamics+and+arborisation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).</li>
<li>Loudet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-covalent+delivery+of+proteins+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Biomol+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells.</a> Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).</li>
<li>Nagel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+microspheres+as+protein+transduction+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Polymeric microspheres as protein transduction reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).</li>
<li>Selim, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-osteoactivin+antibody+inhibits+osteoblast+differentiation+and+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Eukaryot+Gene+Expr%22%5BJournal%5D)">Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro.</a> Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).</li>
<li>Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Rho+GTPase+activity+alleviates+chondroitin+sulfate+proteoglycan-dependent+inhibition+of+neurite+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension.</a> J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).</li>
<li>Watanabe, S., Wakasugi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+function+of+human+neuroglobin+is+correlated+with+its+guanine+nucleotide+dissociation+inhibitor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity.</a> Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).</li>
<li>Eguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+nuclear+localization+signal+for+nuclear+transport+of+DNA-encapsulating+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles.</a> J Control Release. 104, 507-519 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een protocol om het belang van proteïne expressieniveaus bestuderen regelen cellulaire functies in een dosis aangedreven wijze. De beschreven protocol zorgt voor een verfijnde manipulatie van eiwitexpressie in zoogdierlijke verschillende celtypen, waaronder hippocampale neuronen, dus het vergemakkelijken van gedetailleerde studies eiwitfunctie op celniveau. Hoewel RNA interferentie een bekende strategie om neerwaarts reguleren POI vertegenwoordigt, heeft zijn nadelen (cp....

Een strakke controle van eiwitexpressie is essentieel voor elk levend organisme om haar ontwikkeling commando en te reageren op omgevingssignalen. Derhalve is een veelheid van mechanismen uitgevonden tijdens evolutie naar het expressieniveau van elk eiwit wordt gecodeerd door de applicatie nauwkeurig regelen. 20.000 genen bestaan ​​in eukaryotische cellen op elk moment van zijn leven. Die op verschillende stadia van eiwitproductie, regulerende mechanismen variëren van het beheer van chromatinestructuur, transcriptie en RNA hanteren richting posttranslationele eiwit modificaties, transport en degradatie. Het is dan ook niet verwonderlijk dat storingen in de onderliggende moleculaire machines en veranderde eiwit expressie niveaus zijn in verband gebracht met diverse ziekten zoals kanker of een verstandelijke beperking. Inderdaad, kijkend naar de uitstaande complexiteit van neuronale ontwikkeling en zoogdier hersenfunctie, de Sensiteit van deze geavanceerde systemen om veranderingen in eiwitexpressie manifesteert zich in een aantal bekende intellectuele tekorten, waaronder de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson (AD en PD) evenals autisme spectrum stoornissen (ASS), zoals het fragiele X syndroom (FXS). Laatstgenoemde ziekte wordt gekenmerkt door een uitgebreide misexpression van een verscheidenheid van eiwitten, die door het verlies van een enkele translatie regelende proteïne, FMRP (fragile X mental retardation proteine) 1-4. Bovendien chromosomale herschikkingen die de variabele kosten X-gebonden eiwit A (VCXA), een eiwit dat mRNA stabiliteit en de vertaling door het modificeren van mRNA aftopping 5 beheert, zijn onlangs in verband gebracht met een mentale achterstand, terwijl puntmutaties niet bij patiënten die werden geïdentificeerd met cognitieve beperkingen vanaf nu 6, 7, wat erop wijst dat de waargenomen mentale stoornissen afkomstig VCXA veranderde expressie en ontregelde expressie van het doelwit proteins. In lijn met deze bevindingen van een onderzoek naar de vraag of de novo copy number variations genen geassocieerd zijn met ASS vastgesteld dat nieuw gen duplicaties en deleties zijn een belangrijke risicofactor voor ASD 8, dus het idee dat verhoogde of verminderde eiwit expressie niveaus kan leiden tot het ondersteunen van intellectuele tekorten. Opmerkelijk is verder recent onderzoek aangetoond dat het expressieniveau van een bepaald eiwit nauwkeurig aangepast zijn aggregatie als gevolg van grote hoeveelheden eiwit voorkomen vrijwel zonder veiligheidsmarges 9. Daarom is voorgesteld dat zelfs kleine stappen volstaan ​​om ziekten zoals AD en PD 9 induceren. Hoewel de verscheidenheid van de moleculaire machines die bijdragen aan eiwit expressie controle suggereert een complexe regelgeving systeem in het licht van deze bevindingen, een onderzoek naar de expressie van meer dan 5.000 zoogdiergenen 10 aangetoond datde natuur de voorkeur aan een meer spaarzame regeling: De cellulaire overvloed aan eiwitten werd aangetoond dat voornamelijk worden geregeld op het niveau van de vertaling 10, dus illustreren dat het beheer van RNA beschikbaarheid dient voornamelijk te fine-tunen eiwitexpressie. Het bestuderen van de dosis van proteïnen (POI&#39;s) is dus niet alleen belangrijk voor het begrip van de endogene functie van een eiwit, maar ook om het onderzoek van vele ziekten en de ontwikkeling van therapieën. Zo hebben de laatste decennia is de opmars van verschillende strategieën door middel van RNA interferentie om POI dosering te manipuleren gezien. Hoewel RNA interferentie veel gebruikt om eiwitfunctie te bestuderen en zelfs in klinische proeven worden toegepast voor de behandeling van kanker of oculaire ziekten en antivirale therapie bij patiënten 11-13 oefenen, kan een aantal problemen voordoen die de strategie onmogelijk zouden maken. Bijvoorbeeld, het zaad sequentie die de knockdown aandrijft door homologie vergelijkbaarheidble kort, dus het bevorderen van off-target effecten. Aangezien zeer efficiënt sequenties zijn zeldzaam en moeten worden gevonden tussen duizenden opties (besproken in 14), het identificeren van de juiste volgorde kan tijdrovend en kostbaar, maar de resultaten kunnen nog steeds teleurstellend. Een andere mogelijkheid is direct gericht op de NP op antilichamen. Hier illustreren we het gebruik van de eiwitdrager Chariot (geproduceerd door Active Motif) om cellulaire beschikbaarheid eiwit te verminderen, en de tewerkstelling van driedimensionale reconstructies eiwit functie na knock-down te bestuderen. De actieve motief van Chariot, zelf een 2,8 kDa peptide wordt gebruikt shuttle peptiden, eiwitten en antilichamen in membranen van zoogdiercellen 15. Het peptide associeert met POI&#39;s door het vormen van niet-covalente wijze gekoppeld macromoleculaire complexen met behulp van hydrofobe interacties, waarna Chariot-POI complexen worden geïnternaliseerd in cellen in een endosoom-independent manier. Belangrijker Chariot werd aangegeven geen invloed op de intracellulaire lokalisatie van shuttled eiwitten, noch cytotoxische effecten uitoefenen of de biologische activiteit van de lading 15 beïnvloeden.

<table><tbody><tr><td>Chariot</td><td>Active Motif</td><td>30025</td><td>bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life technologies</td><td>21103-049</td><td>opwarmen tot 37 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>1x B27</td><td>Life technologies</td><td>17504044</td><td>bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life technologies</td><td>25030-149</td><td>bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Penicillin en Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td>bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane</td><td>n.v.t.</td><td>duur, maar ongeëvenaard</td></tr><tr><td>Laser Scanning Microscope</td><td>Zeiss</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr></tbody></table>

studeren eiwit functie en de rol van veranderde eiwitexpressie door antibody interferentie en driedimensionale reconstructies

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Een strikt beheer van eiwitexpressie is niet alleen van belang voor elk organisme leven, maar ook een belangrijke strategie om proteïnefuncties onderzoeken in cellulaire modellen. Daarom recente onderzoek bedacht verschillende instrumenten om eiwitexpressie in zoogdierlijke cellijnen of diermodellen, waaronder RNA en interferentie antilichaam targeten. Terwijl de eerste strategie veel aandacht heeft verzameld gedurende de laatste twee decennia peptiden mediëren een translocatie antilichaam ladingen in celmembranen en in cellen, verkregen veel minder belang. In deze publicatie geven we een gedetailleerd protocol hoe een peptidedrager genoemd Chariot in humane embryonale niercellen en primaire hippocampale neuronen gebruiken antilichaam interferentie experimenten en de toepassing van driedimensionale reconstructies illustreren het analyseren eiwitfunctie. Onze resultaten suggereren dat Chariot is, waarschijnlijk door zijn nucleaire lokalisatiesignaal, particularly goed geschikt voor eiwitten die in de soma en de kern te richten. Opvallend bij de toepassing Chariot primaire hippocampale kweken, het reagens bleek te zijn verrassend goed door gedissocieerde neuronen aanvaard.

In de volgende paragrafen, voorbeeldige resultaten ter illustratie van een functionele knock-down van een POI (Simiate, voor meer informatie zie 16, 17) met behulp van Chariot reagens en interferentie antilichaam worden gepresenteerd. De resultaten tonen aan dat verminderde expressie van Simiate schaadt transcriptionele activiteit en, in een dosering afhankelijke wijze induceert apoptose, culminerend sterftecijfer van meer dan 99% of hoger antilichaam hoeveelheden (&gt; 1 ug antilichaam)...

Het regelen van eiwitexpressie is niet alleen essentieel voor elk levend organisme, maar ook een belangrijke strategie om eiwitfuncties in cellulaire modellen te onderzoeken. Het gepresenteerde protocol toont de toepassing van antilichaaminterferentie in zoogdiercellen, inclusief primaire hippocampale neuronen, en demonstreert het gebruik van driedimensionale reconstructies bij het bestuderen van eiwitfuncties.

Studeren Eiwit functie en de rol van veranderde eiwitexpressie door Antibody Interferentie en driedimensionale Reconstructies

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om eiwitfuncties en de rol van veranderde eiwitexpressie op een efficiënte en strikt gecontroleerde manier te bestuderen. Dit wordt bereikt door antilichamen toe te passen om de hoeveelheid functioneel eiwit die beschikbaar is voor de cel te verminderen. Om dit te bewerkstelligen, worden antilichamen gekoppeld aan een peptide genaamd Chariot, dat de passage door cellulaire membranen faciliteert.Vervolgens worden de relevante cellulaire structuren afgebeeld en in 3D gereconstrueerd om de effecten van de behandeling te evalueren. De resultaten tonen aan dat Chariot-peptiden bijzonder geschikt zijn voor het targeten van nucleaire eiwitten via antilichaaminterferentie. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals RNA-interferentie zijn dat de de cel in getransporteerde antilichamen onmiddellijk effectief zijn, en dat de onderzoeker de mate van interferentie strikt kan beheersen door de doseringen van de antilichamen aan te passen.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in eiwitfuncties in vele celtypen, is het bijzonder interessant voor het targeten van eiwitten in primaire neuronale culturen, die zeer gevoelig zijn voor behandelingen maar Chariot zeer goed tolereren. Suspendeer ter voorbereiding het geliofiliseerde Chariot-peptidepoeder in steriel water op een concentratie van 2 µg/µL. Tik voorzichtig tegen de buis om het poeder op te lossen.Bereid vervolgens kleine werkaliquoten voor, waarbij slechts 2 µL per reactie nodig zijn, en bewaar deze aliquoten bij 20 °C. Bereid daarna mammaliaanse cellen voor op transfectie door ze uit te zaaien in een 24-well plaat met een halve milliliter medium dat antibiotica bevat. Bij het gebruik van neuronen moeten de cellen alleen in de twee middelste rijen en met een lage dichtheid worden uitgezaaid.De lege putjes zijn later nuttig. Werk snel. Gekweekte neuronen mogen niet langer dan enkele minuten buiten de incubator zijn.Vervang twee keer per week ongeveer een kwart tot de helft van het medium totdat de neuronen het gewenste ontwikkelingsstadium hebben bereikt. Niet-neuronale culturen moeten worden gebruikt wanneer de cellen een confluentie van 50% hebben bereikt. De volgende procedure wordt weergegeven voor zes testmonsters en zes controlemonsters.Bereid voor elke lading een verdunning van 0,1 tot 2 micrograms in 50 microliters 1X PBS per monster. Macromoleculaire complexen van vooraf gebonden primaire en secundaire antilichamen kunnen eveneens als lading worden gebruikt. Meng de oplossing met een zachte vortex, gevolgd door een korte centrifugatie.Verdun vervolgens twee µL van de Chariot-stamoplossing in 50 µL PBS voor elke reactie. Gebruik voor elk monster aparte buisjes om zelfassociatie van Chariot te voorkomen. Voeg nu de voorbereide eiwitten toe aan de Chariot-verdunningen.Meng en centrifugeer de gecombineerde eiwitten. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de vorming van Chariot-vrachtcomplexen mogelijk te maken. De optimale hoeveelheid eiwitpeptide hangt af van de vracht en het gebruikte celtype.Daarom moet deze hoeveelheid empirisch worden bepaald. Verwarm vooraf een hoeveelheid groeimedium zonder additieven, evenals 1X PBS met 0,5 millimol magnesiumchloride en calciumchloride, voor tot 37 °C. Verdun vervolgens de bereide Chariot-complexen met 100 µL medium om te beginnen.Verwijder het medium van de geplaatste cellen en breng dit over naar de lege putjes voor hergebruik. Was de cellen vervolgens voorzichtig met 500 µL voorverwarmde 1X PBS, calcium, magnesiumchloride-oplossing. Voeg het medium met de Chariot-complexen toe aan de cellen en schud de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van de oplossing te waarborgen.Plaats de cellen snel terug in de incubator en wacht een uur voordat u verdergaat. Voor neuronen: breng na een uur incubatie het bewaarde medium over naar de wells. Voor alle andere cellen: voeg serum toe tot een eindconcentratie van 10% Gekweekte neuronen zijn zeer gevoelig, bijvoorbeeld voor veranderingen in de temperatuur en pH van het medium.Daarom moeten deze cellen voorzichtig worden gewassen en getransfecteerd met voorverwarmde oplossingen en zo snel mogelijk worden teruggeplaatst in de incubator. Zet de incubatie voort voor de benodigde duur, afhankelijk van de getransfecteerde lading en het celtype. Verwerk de cellen na de incubatie zoals gebruikelijk voor verdere analyses.Zowel fixatieprotocollen als live-imaging zijn compatibel met deze techniek. Maak met een laser-scanning microscoop met een 63X lens beelden met een tussenpoos van ongeveer 0,25 tot 0,5 micron om Z-stacks met voldoende detail te verkrijgen en tegelijkertijd bleaching te voorkomen. De exacte laagafstand is afhankelijk van de grootte van de te reconstrueren structuur en moet individueel worden bepaald.Open voor beeldreconstructie de LSM-bestanden in Imaris. In deze software wordt de Escape-toets gebruikt om te schakelen tussen Selecteren en Navigeren. Daarnaast kunnen meerdere objecten worden geselecteerd door de Ctrl-toets ingedrukt te houden.Ga via de Display Adjustment naar elk kanaal en pas het contrast aan totdat de helderste structuren verzadiging bereiken. Deze aanpassing heeft geen invloed op de oppervlakteconstructie, maar helpt wel bij het drempelwaarde-instellen (thresholding) van het beeld. Als het object dat moet worden gereconstrueerd in verschillende bestanden staat, gebruik dan de functie Edit and Add Slices om de betreffende bestanden te combineren.Klik vervolgens op het icoon Add New Surfaces en selecteer Segment only a Region of Interest. Pas nu de marges van het selectiekader aan zodat dit het object van belang omsluit. Pas de vorm en de kanteling van de rechthoek aan totdat alle benodigde structuren zich binnen het kader bevinden.De selectie moet in elke afbeelding over het gehele Z-vlak worden aangepast. Ongewenste objecten kunnen later worden verwijderd. Selecteer vervolgens een geschikt kanaal.Om verder te gaan, gebruikt u de drempelwaarde-tool (thresholding tool) om de structuur van belang te reconstrueren. Het detailniveau van het oppervlak, of de sfeerdiameter, moet worden ingesteld om overeen te komen met de structuren die worden gereconstrueerd. Afhankelijk van de signaalkenmerken kan er gebruik worden gemaakt van ofwel de absolute intensiteit of het lokale contrast.Over het algemeen werkt lokaal contrast beter voor diffuse signalen. Vanwege de kenmerken van dit signaal wordt lokaal contrast gebruikt om het eiwit in de kern te reconstrueren. In ieder geval moeten de instellingen afzonderlijk worden aangepast voor elk signaal of elke structuur van belang.Voltooi de reconstructie door op de groene pijl onderaan het scherm te klikken. Pas het object vervolgens verder aan met het Potlood-gereedschap. Vergelijk de reconstructies zorgvuldig met het originele signaal en snijd oppervlakken weg door de afbeeldingen naar behoefte te kantelen, zodat het Snij-gereedschap nauwkeurig kan worden gebruikt.Meet nu het volume, het oppervlak en de intensiteiten van elk oppervlak door Statistiek, Gedetailleerde statistieken en Gemiddelde waarden te selecteren. Indien gewenst kunnen kleurgecodeerde statistieken worden gegenereerd door het tabblad Kleur van het betreffende oppervlak te selecteren en de geselecteerde optie te wijzigen van Basis naar Statistiekgecodeerd. Met behulp van de tool Snapshot maken kunnen afbeeldingen worden vastgelegd voor publicatie.Als er meerdere objecten binnen dezelfde regio gereconstrueerd moeten worden, kan de functie Store Parameters worden gebruikt om de informatie op te slaan. Simiate tot expressie gebracht in HEK293-cellen werd specifiek gedetecteerd door Simiate-antilichamen die de cellen in werden getransporteerd door Chariot-peptiden. Na toepassing dringen de Simiate-antilichaamcomplexen zowel het soma als de nucleus binnen, waar ze specifiek co-lokaliseren met FLAG-Simiate, zoals aangegeven door de gele pijlen.Op een dosisafhankelijke wijze induceerden Simiate-antilichamen massale apoptose in HEK293-cellen, terwijl controle-antilichamen geen effect hadden. Gezien het feit dat neuronen zeer gevoelig zijn voor toxische effecten, werd de techniek toegepast op primaire hippocampale culturen, waarbij geen effect op de levensvatbaarheid van de neuronen werd waargenomen bij de vergelijking tussen mock- (of onbehandelde) en Chariot-behandelde cellen. Volgens hetzelfde toepassingsschema werden goat anti-guinea pig Alexa568-antilichaamcomplexen waargenomen in ongeveer 83% van de cellen, waarbij ze in variërende mate voorkwamen in zowel de somata als de kernen.Deze observaties werden verder ondersteund door een 3D-analyse, die in overeenstemming was met de resultaten van de HEK293-cellen. Bijgevolg kan de Chariot-techniek succesvol worden gebruikt om gedissocieerde primaire hippocampale neuronen te transfecteren. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in drie tot zes uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.De complexvorming van Chariot en het eiwit van belang duurt ongeveer 40 minuten. Om de cellen met deze complexen te transfecteren, is 70 minuten nodig en daarna nog één tot vier uur, afhankelijk van de grootte en de eigenschappen van de cargo. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd om de functie van een eiwit in meer detail te analyseren, zoals live imaging en motiliteitsassays, analyse en elektrofysiologische registraties.

studying-protein-function-role-altered-protein-expression-antibody

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Meer dan de helft van de eiwitten zijn kleine eiwitten (moleculaire massa &lt;200 kDa) die zijn uitdagend voor zowel de elektronenmicroscoop beeldvorming en driedimensionale reconstructies. Geoptimaliseerde negatieve kleuring is een robuuste en high-throughput protocol hoog contrast en relatief hoge resolutie (~ 1 nm) beelden van kleine asymmetrische eiwitten of complexen onder verschillende fysiologische omstandigheden te verkrijgen.

Geoptimaliseerd Negatieve kleuring: een High-throughput protocol voor de behandeling Kleine en Asymmetric Protein Structure door Electron Microscopy

Een protocol voor het online onderzoek van eiwitsequentie-structuur-dynamiek relaties met behulp van Bio3D-web wordt gepresenteerd.

Onderzoek naar eiwitsequentie-structuur-dynamiek Relaties met Bio3D-web

Gepresenteerd hier zijn twee antilichaam gebaseerde eiwit-eiwit interactie onderzoekstechnieken: immunofluorescentie en immunoprecipitation. Deze technieken zijn geschikt voor de studie van de fysieke interacties tussen eiwitten voor de ontdekking van nieuwe onderdelen van cellulaire signaalroutes en begrip eiwit dynamiek.<br...

Studie van eiwit-eiwitinteractie in Autophagy onderzoek

Benaderingen voor de biofysische en structurele karakterisatie van glycoproteïnen presenteren wij met de immunoglobuline vouw door biolayer interferometrie, isothermische titratie calorimetrie en röntgendiffractie.

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

De Spectrometrie van de massa (MS) heeft ontpopt als een belangrijk instrument voor het onderzoek naar de structuur en de dynamiek van macromoleculaire assemblages. Hier, wij op basis van MS om te ondervragen eiwit complexvorming en ligand bindende benaderingen worden geïntegreerd.

Analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-Ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie

Hier presenteren we hoe kleine Angle X-Ray Scattering (SAXS) kan worden gebruikt om informatie op lage resolutie enveloppen die vertegenwoordigen de macromoleculaire structuur te verkrijgen. Wanneer gebruikt in combinatie met hoge resolutie structurele technieken zoals röntgendiffractie en nucleaire magnetische resonantie, bieden SAXS gedetailleerde inzichten in multidomain eiwitten en macromoleculaire complexen in-oplossing.

Structurele Studies van macromoleculen in oplossing met behulp van kleine Angle X-Ray Scattering

Structureel verwante proteïnen oefenen vaak verschillende biologische functies. De uitwisseling van gelijkwaardige gebieden van deze proteïnen te creëren chimeer eiwitten vormt een innovatieve aanpak ter identificatie van de kritische eiwit-regio's die verantwoordelijk voor hun functionele verschillen zijn.

Identificatie van functionele eiwit regio's via chimeer eiwit bouw

Het huidige protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van de structuur en dynamiek van twee modeleiwitten die een belangrijke rol spelen in de menselijke gezondheid. De techniek combineert bench-top biofysische karakterisering met neutronenspinechospectroscopie om toegang te krijgen tot de dynamiek op tijd- en lengteschalen die relevant zijn voor eiwitinterdomeinbewegingen.

Studie van eiwitdynamica via neutronenspinechospectroscopie

Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

Hier presenteren we een protocol om het vastleggen en identificeren van ziektespecifieke eiwit-eiwitinteracties van natuurlijke cellen en weefsels mogelijk te maken met behulp van chemische sondes en massaspectrometrie. De resulterende interactiedatasets worden geanalyseerd via een speciaal webgebaseerd platform om dynamische netwerkdisfuncties en routeveranderingen die verband houden met ziekte aan het licht te brengen.

In kaart brengen van disfunctionele eiwit-eiwitinteracties bij ziekte

Leer eiwitfunctie bestuderen door antilichaaminterferentie met Chariot-peptiden in primaire hippocampale neuronen. Deze methode biedt onmiddellijke effecten en strikte controle over eiwitexpressieniveaus.

Studeren Eiwit functie en de rol van veranderde eiwitexpressie door Antibody Interferentie en driedimensionale Reconstructies

Meer video's verkennen