Name: Verrijking van extracellulaire matrix eiwitten uit weefsels en de spijsvertering in peptiden voor massaspectrometrie Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Leer extracellulaire matrix-eiwitten verrijken uit weefsels via decellularisatie en spijsvertering in peptiden voor massaspectrometrie-analyse. Deze methode karakteriseert ECM-samenstelling in normaal en ziek weefsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Drs. Amanda Del Rosario en Guillaume Carmona bedanken voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Department of Defense DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240 naar ROH); het National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); het Broad Institute of MIT en Harvard; het Howard Hughes Medical Institute, waarvan ROH een onderzoeker is; en gedeeltelijk door de ondersteuningssubsidie van het National Cancer Institute aan het Koch Institute for Integrative Cancer Research bij MIT (P30-CA14051). AN ontving postdoctorale beurzen van het Howard Hughes Medical Institute en het Ludwig Center for Cancer Research bij MIT.

OPMERKING: De procedure kan worden uitgevoerd op vers of flash ingevroren weefsels. We raden perfusie vaatrijke weefsels met PBS op het moment van dissectie rode bloedcellen en plasma-eiwitten te elimineren. We raden niet aan het uitvoeren van de procedure op vaste weefsels als fixatie (dwz chemische verknoping) interfereert met decellularisatie en kan ook aanzienlijk compromis daaropvolgende massaspectrometrie analyse. Voor de gehele procedure, raden we het gebruik van lage-retentie buizen en pipet tips om eiwitten en peptiden herstel te maximaliseren. 1. Decellularisatie van weefsels of tumoren OPMERKING: Voordat Bereid reagentia en voeg proteaseremmers (geleverd bij het compartiment Protein Extraction kit) om het gewenste volume van elke buffer. Alle buffers en monsters moeten worden bewaard op ijs gedurende de duur van het experiment behalve Buffer CS dat moet bij kamertemperatuur worden gehouden SDS neerslag voorkomenitation. Opmerking: Het protocol maakt gebruik van een reeks incubatie in buffers met verschillende pH en met verschillende hoeveelheid zouten en detergentia extract intracellulaire eiwitten opeenvolgend verrijken onoplosbare ECM eiwitten (Figuur 1, Tabel 1; zie tevens alternatieven voor het gebruik van de commerciële kit hier beschreven). De hoeveelheden reagentia worden hieronder gegeven voor 100 mg van weefsels of tumoren (zie tabel 1) en moeten dienovereenkomstig aangepast. <ol><li> Homogeniseer 100 mg weefsel in 500 pl buffer C met proteaseremmers met een tissue homogenisator totdat het weefsel volledig wordt verstoord en een homogene suspensie wordt verkregen. OPMERKING: Voeg deoxyribonuclease I (eindconcentratie: 200 ug / ml, gereconstitueerd volgens de instructies van de fabrikant) en ribonuclease A (eindconcentratie 20 ug / ml, opgelost volgens de instructies van de fabrikant) omBuffer N. </li><li> Sequentiële extractie van intracellulaire oplosbare proteïnen <ol><li> Extractie van cytosolische eiwitten. Incubeer het homogenaat op een buis rotator gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Sla een kleine hoeveelheid (10 pl tot 20 pl) van het homogenaat voor daaropvolgende Western blot-analyse (zie Verwachte resultaten doorsnede en figuur 2). </li><li> Centrifugeer het homogenaat bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof in een schone buis, zal dit de cytosolische (C) fractie van de Western blot-analyse vormen. Flash bevriezen deze fractie en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Te wassen, resuspendeer de pellet in 400 pl buffer W bevattende proteaseremmers en incubeer het monster op een buis rotator gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het homogenaat bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. </li><li> Het afzuigen, kerneiwitten, resuspendeer de pellet in 150 pl buffer N bevattende proteaseremmers, deoxyribonuclease I en ribonuclease A en incubeer het monster op een buis rotator gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer het monster bij 16.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en verzamel de bovenstaande vloeistof in een schone buis. Herhaal deze stap eenmaal: Na het centrifugeren van het monster voor de tweede maal, voeg de supernatant aan de vorige supernatant: dit zal de kern (N) fractie van de Western blot-analyse vormen. Flash bevriezen deze fractie en bewaar bij -80 ° C. Dan, wassingen presteren als per stap 1.2.3. </li><li> Membraaneiwitten te extraheren, resuspendeer de pellet in 100 pl buffer M bevattende proteaseremmers en incubeer het monster op een buis rotator gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het monster bij 16.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C </li><li> Verzamel de bovenstaande vloeistof in een schone buis: dit zal het membraan (M) fractie van de Western blot-analyse vormen. Flash bevriezen deze fractie en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Om cytoskeleteiwitten extraheren, resuspendeer de pellet in 200 ui buffer CS bevattende proteaseremmers en incubeer het monster op een buis rotator gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Merk op dat de pellet niet volledig oplost. Wij stellen voor het verstoren van de pellet door en neer te pipetteren totdat waarnemen verstoring van de pellet. </li><li> Centrifugeer het monster bij 16.000 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Verzamel de bovenstaande vloeistof in een schone buis. Hierbij aan een verdere scherpe afname van de grootte van de pellet (zie video). </li><li> Resuspendeer de pellet in 150 ul buffer C met proteaseremmers en incubeer het monster op een buis rotator gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het monster bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. </li><li> Verzamel de bovenstaande vloeistof toevoegen aan het vorige supernatant: dit zal het cytoskelet (CS) fractie van de Western blot-analyse vormen. Flash bevriezen deze fractie en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Voer extra wasbeurten. Resuspendeer de pellet in 500 pl PBS met proteaseremmers and incuberen van het monster op een buis rotator gedurende 5 min bij 4 ° C. Centrifugeer het monster bij 16.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Herhaal deze stap drie keer. Opmerking: Alle sporen van detergentia moeten worden verwijderd door uitgebreid wassen voorafgaand aan digestie van de eiwitten in peptiden (zie sectie 3). Op dit punt kan de ECM-verrijkte pellet snel bevroren en bij -80 ° C bewaard. Merk op dat de grootte van de pellets is afhankelijk van de hoeveelheid onoplosbare (ECM) proteïnen in het uitgangsmateriaal en de efficiëntie van de decellularisatie. </li></ol></li></ol> 2. Monitoring van de kwaliteit van de Decellularisatie / ECM Verrijking door SDS-PAGE en Western Blot <ol><li> Meng 10-20 pl aliquot van de totale weefselextract en 50 pi aliquots van tussenproduct fracties met Laemmli buffer bevattende 100 mM DTT. Resuspendeer de ECM-verrijkte, onoplosbare fractie in 3 x Laemmli buffer bevattende 100 mM DTT. Let op: hij verhoogde concentratiesDTT en SDS helpen bij het oplosbaar maken van ECM eiwitten die relatief onoplosbaar zijn. </li><li> Scheid de eiwitten door SDS-PAGE en overgebracht naar nitrocellulose membranen. </li><li> Voer immuun-blots met behulp van antilichamen voor eiwitten die representatief zijn voor elk van de cytosolische, kern, membraan, cytoskelet en ECM fracties monitor (zie Representatieve resultaten sectie tabel 2 en figuur 2). </li></ol> 3. In-oplossing vertering van eiwitten te peptiden voor massaspectrometrie Analyse Opmerking: Het na het van cellen ontdoen behandeling en verwijdering van SDS pellet sterk verrijkt in onoplosbare ECM eiwitten voor verdere analyse door massaspectrometrie deze eiwitten moeten worden gedigereerd tot peptiden. Merk op dat, als gevolg van ECM eiwitten onoplosbaarheid is het niet mogelijk deze stap aan de eiwitconcentratie van het monster te meten. We bieden dus volumes van de reagentia aan de ECM-enri verterenChed samples in peptiden op basis van de grootte (mm) of drooggewicht van het ECM-verrijkte pellet (tabel 3). De oplossingen van ammonium bicarbonaat, ureum, DTT, joodacetamide en trifluorazijnzuur moeten allemaal vers worden bereid. <ol><li> Resuspendeer de ECM-verrijkte monster door het toevoegen van de juiste hoeveelheid van 8 M ureum op de ECM-verrijkte pellet en voeg DTT in een eindconcentratie van 10 mM (zie Tabel 3). Incubeer onder continu roeren bij 1400 rpm gedurende 2 uur bij 37 ° C. LET OP: op dit punt de ECM eiwitten niet volledig zal worden opgelost en de zichtbare grote eiwitdeeltjes mag niet door centrifugeren of filtratie worden weggegooid. De schorsing zal duidelijk op deglycosylatie en de spijsvertering (zie video). </li><li> Alkylering <ol><li> Bereid de joodacetamide oplossing in HPLC-grade water. Laat het monster tot kamertemperatuur en voeg de joodaceetamide tot een eindconcentratie van 25 mM. Voor volledige alkylering, de DTT: moet iodoacetamide verhouding tussen 1: 2.5 en 1: 3. </li><li> Incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Deglycosylatie: Opmerking: deglycosylatie is nodig koolhydraatzijketens die interfereren met de identificatie van peptiden gemodificeerd door N-gebonden glycosylering te verwijderen. <ol><li> Verdun tot 2 M ureum met 100 mM ammoniumbicarbonaat pH 8,0 en voeg de juiste hoeveelheid PNGaseF (zie tabel 3). Incubeer onder continu roeren bij 1400 rpm gedurende 2 uur bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Spijsvertering <ol><li> Voeg Lys-C en incubeer onder continu roeren bij 1400 rpm gedurende 2 uur bij 37 ° C. Voeg de trypsine en incubeer onder continu roeren bij 1400 rpm O / N bij 37 ° C. LET OP: de ECM-rijke schorsing die troebel bij eerste reconstructie in 8M ureum begon verschijnt duidelijk na O / N spijsvertering (zie video). </li><li> Voeg een tweede portie van het monster met trypsine en incubeer onder continu roeren bij 1400 rpm gedurende nog 2 uur bij 37 ° C. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Verzuring <ol><li> Na voltooiing van de vertering, het trypsine te inactiveren door aanzuren van het monster met vers bereide 50% trifluorazijnzuur (TFA). Het monster moet pH &lt;2. bereikt Wij stellen voegen 1-1,5 pi 50% TFA in een tijd en onder gebruikmaking van 1 pl van de peptide-oplossing om de pH van de oplossing met pH-papier (zie video) te meten. </li><li> Centrifugeer het aangezuurde monster bij 16.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel de bovenstaande vloeistof in een schone low-retentie buis. Op dit punt kan de peptide oplossing worden bewaard bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Ontzouten Merk op: dat de laatste stap wordt gewoonlijk uitgevoerd bij een massaspectrometrie faciliteit naar eigen voorkeurswerkwijzen. <ol><li> Vóór proteomics analyse ontzouten de monsters en peptiden geëlueerd met vers bereide 60% acetonitril, 0,1% trifluorazijnzuur, gevolgd door concentreren in vacuüm concentrator. Resuspendeer de peptiden in vers bereide 3% acetonitrile, 0,1% trifluorazijnzuur 8. OPMERKING: dat na ontzouting, de concentratie van de peptide-oplossing kan worden gemeten door spectrofotometrie (zie verwachte resultaten sectie). </li><li> Nu analyseren de steekproef door massaspectrometrie, opnieuw volgens de optimale procedures van de massaspectrometrie faciliteit. LET OP: We moedigen onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het karakteriseren van de samenstelling van de ECM&#39;s met behulp van massaspectrometrie om te verwijzen naar onze andere publicaties 8 - 10 en de website die een meer gedetailleerde uitleg, met inbegrip van LC-MS / MS parameters, massa-spectrometrie zoeken gegevens voor de identificatie en data-eiwit analyses met behulp van de in silico matrisome annotatie instrument dat we ontwikkeld 8. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hynes, R. O., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+matrisome--an+inventory+of+extracellular+matrix+constituents+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (1), a004903(2012).</li>
<li>Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+assembly%3A+a+multiscale+deconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), (2014).</li>
<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).</li>
<li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).</li>
<li>Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnological+strategies+for+engineering+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanotechnological strategies for engineering complex tissues.</a> Nat Nanotechnol. 6 (1), 13-22 (2011).</li>
<li>Wilson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+an+underexplored+but+important+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: an underexplored but important proteome.</a> Expert Rev Proteomics. 7 (6), 803-806 (2010).</li>
<li>Naba, A., Hoersch, S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+definition+of+an+ECM+parts+list%3A+an+advance+on+GO+categories%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards definition of an ECM parts list: an advance on GO categories.</a> Matrix Biol. 31 (7-8), 371-372 (2012).</li>
<li>Naba, A., Clauser, K. R., Hoersch, S., Liu, H., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+matrisome%3A+in+silico+definition+and+in+vivo.+characterization+by+proteomics+of+normal+and+tumor+extracellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The matrisome: in silico definition and in vivo. characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices.</a> Mol. Cell Proteomics. 11 (4), M111.014647(2012).</li>
<li>Naba, A., Clauser, K. R., Whittaker, C. A., Carr, S. A., Tanabe, K. K., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+signatures+of+human+primary+metastatic+colon+cancers+and+their+metastases+to+liver%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver.</a> BMC Cancer. 14 (1), 518(2014).</li>
<li>Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+signatures+of+human+mammary+carcinoma+identify+novel+metastasis+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters.</a> eLife. 3, e01308(2014).</li>
<li>Naba, A., Ding, H., Whittaker, C. A., Hynes, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+altered+extracellular+matrix+turnover+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> Mol. Cell Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).</li>
<li>Tsuchiya, T., Balestrini, J. L., Mendez, J. J., Calle, E. A., Zhao, L., Niklason, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pH+on+extracellular+matrix+preservation+during+lung+decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization.</a> Tissue Eng Part C Methods. 20 (12), 1028-1036 (2014).</li>
<li>Byron, A., Humphries, J. D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+extracellular+matrix+using+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Defining the extracellular matrix using proteomics.</a> Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).</li>
<li>Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+profiling+of+cartilage+extracellular+matrix+formation+and+maturation+using+sequential+extraction+and+label-free+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).</li>
<li>Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+mouse+growth+plate+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of mouse growth plate cartilage.</a> Proteomics. 6 (24), 6549-6553 (2006).</li>
<li>Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Doménech, N., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+extraction+methodology+for+cardiac+extracellular+matrix+prior+to+proteomics+analysis.+In%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Proteomics%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. In.</a> Heart Proteomics: Methods and Protocols. 1005, 215-223 (2013).</li>
<li>Hansen, K. C., Kiemele, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-solution+ultrasonication-assisted+digestion+method+for+improved+extracellular+matrix+proteome+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An in-solution ultrasonication-assisted digestion method for improved extracellular matrix proteome coverage.</a> Mol. Cell Proteomics. 8 (7), 1648-1657 (2009).</li>
<li>Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+characterization+of+extracellular+space+components+in+the+human+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta.</a> Mol. Cell Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).</li>
<li>Lennon, R., Byron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+reveals+the+complexity+of+the+human+glomerular+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 25 (5), 939-951 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Wijzigingen Hoewel we in dienst deze exacte procedure om de ECM verrijken van tien weefsel en tumor types 8-10, dienen wijzigingen van het protocol te worden beschouwd in de volgende gevallen: 1) Detectie van ECM eiwitten in de tussenliggende fracties. Extracellulaire matrix van verschillende weefsels of tumorsoorten kunnen verschillen in hun extraheerbaarheid / onoplosbaarheid, zoals hierboven besproken voor fibronectine en lamininen. Bijvoorbeeld wordt aangenomen dat de ECM van fibrotische weefsels of verbouwen weefsels keert zeer dynamisch en daardoor zou men zich aan een groter deel van ECM eiwitten in die weefsels gemakkelijker extraheerbaar 12 zijn. Afhankelijk van de fractie waarin ECM eiwitten worden gedetecteerd, stellen we het verminderen van de incubatietijd van de trede waardoor de winning van ECM eiwitten of weglaten van deze stap. 2) Detection van een aanzienlijk deel van intracellulaire componenten in de ECM-verrijkte pellet. In sommige weefsels of tumorsoorten de verhouding cellen: ECM is bijzonder hoog (bijvoorbeeld lever, milt, non-desmoplastisch tumoren). In dat geval kan een aanzienlijke verontreiniging van het ECM-verrijkte fractie door intracellulaire eiwitten (met name cytoskelet proteïnen en / of histonen) worden waargenomen. Om intracellulaire eiwitten efficiënt, raden we herhalen tweemaal de incubatie in buffer M en / of Buffer CS (beide met detergenten, deze put meestal overvloedige intracellulaire eiwitten) afbreken. Een ander alternatief zou zijn om alternatieve buffers met hogere concentraties detergent, met het voorbehoud dat dit kan leiden tot de uitputting van relatief beter oplosbaar ECM eiwitten en (zie volgende paragraaf). 3) Methode voor het gebruik van een commerciële kit. We waren niet in staat om eigen redenen om de precieze samenstelling van de buffers weer te verkrijgenm de leverancier van de Compartimentele Protein Extraction kit. We hebben echter in Tabel 1 toelichting basis van eigen ervaring met zelfgemaakte buffers met gedefinieerde detergens (NP-40, natriumdeoxycholaat en SDS) concentraties vergelijkbare extracties voeren. Een recente studie benadrukt ook het belang van de pH van decellularisatie buffers aan ECM eiwitten 13 te behouden. Beperkingen van de techniek De hier gepresenteerde methode berust op het feit dat ECM eiwitten intrinsiek niet oplosbaar dan de meeste intracellulaire eiwitten. Echter, hier beschreven de decellularisatie methode zeker onttrekt oplosbare componenten aanwezig binnen de ECM zoals sommige groeifactoren of-ECM remodeling enzymen. Hoewel ECM-geassocieerde eiwitten nauw verbonden met ECM eiwitten werden gedetecteerd door proteomics in monsters bereid zoals beschreven kan deze werkwijze te streng zijn volledig het profiel van de samenstelling van matrisome geassocieerdeeiwitten. Betekenis van de techniek met betrekking tot andere methoden Het voordeel van de hier gepresenteerde boven andere methoden werkwijze is dat deze kan worden aangepast aan de aard van de ECM plaats: tussenstappen kunnen worden overgeslagen of herhaald om het verlies van ECM eiwitten voorkomen of verhogen uitputting van respectievelijk verontreinigende intracellulaire eiwitten. Deze werkwijze gebruikt ook slechts minimale hoeveelheden detergentia die worden afgespoeld hun interferentie met latere peptide preparaat en massaspectrometrie voorkomen. Ten slotte is de hier beschreven ECM-rijke eiwitten te verteren preparaten in peptiden methode heeft ook het voordeel dat er geen eiwitten oplosbaar en kunnen worden uitgevoerd op &quot;eenvoudige&quot; ECM-verrijkte fracties. Alternatieve werkwijzen die gebruik maken van cellen ontdoen chaotrope middelen (bijvoorbeeld guanidine hydrochloride) de samenstelling van ECM door massaspectrometrie bestuderen bEen gerapporteerd in de literatuur (besproken in 14) en zijn gebruikt in combinatie met massaspectrometrie de ECM samenstelling van kraakbeen 15,16, hart 17, borstklier 18 en vasculaire 19 en 20 glomerulaire basale membranen karakteriseren. Aanbevelingen Decellularisatie werkwijzen die gebruik trypsine verteerbaar uit cellen mag niet worden gebruikt wanneer ECM&#39;s worden verrijkt voor daaropvolgende proteomics analyses, zoals trypsine resulteert in partiële digestie ECM en verlies van ECM eiwitten en peptiden. Evenzo, als collagenase digestie zou worden gebruikt weefselverstoring steun, zou zorgvuldig moeten worden gevolgd zoals veroorzaakt ECM vertering en verlies van ECM eiwitten en peptiden. In water dan in-gel digestie? ECM eiwitten zijn verknoopt en hoogst onoplosbaar, zelfs wanneer geresuspendeerd in 3 x Laemmli buffer (die 6% SDS) en 100 mM DTT, aparte poOrly op SDS gels. Dus in-gel digestie geen voorkeur. Toekomstige toepassingen Opgemerkt zij dat, hoewel hier niet besproken, de samenstelling van elk van de halfproducten tijdens het van cellen ontdoen verzameld kan ook worden geanalyseerd door massaspectrometrie. Dit kan met name waardevol zijn bij het ​​bestuderen van zeer kleine monsters (bijvoorbeeld, menselijke biopsies) of achterhaalde informatie gewenst andere celfracties.

De extracellulaire matrix (ECM) is een complex maaswerk verknoopt en geglycosyleerde eiwitten die bouwkundige ondersteuning en verankering van cellen en definieert bepaalt gedeeltelijk biomechanische eigenschappen weefsels &quot;1,2. ECM eiwitten ook signaal aan de cellen hetzij direct via hun receptoren (bijvoorbeeld integrinen syndecans, enzovoort) of door het moduleren groeifactor signalering 3. De ECM geeft dus biofysische en biochemische signalen die belangrijke regulatoren van cellulaire processen zoals proliferatie, overleving, polarisatie, differentiatie, migratie, etc. De ECM speelt een belangrijke rol in de fysiologie, ontwikkeling en veroudering 4. Bovendien verschillende pathologieën, zoals hart- en vaatziekten, fibrose, spier-skelet ziekten, kanker, veroorzaakt door of resulteren in ECM wijzigingen. Bovendien is de ECM bijdraagt ​​tot de instandhouding van stamcelniches vastgelegd en de belangrijkste ECM moleculen thop steun stemness zal directe toepassing in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde 5 hebben. Ondanks het belang ervan, is de ECM gebleven tot voor kort onderbelichte 6. In silico analyse is gebleken dat de matrisome, gedefinieerd als het geheel van ECM en ECM-geassocieerde eiwitten omvat de produkten van honderden genen in zowel het menselijke genoom en de muis 1,7,8. Echter, de onoplosbaarheid van ECM eiwitten systematische karakterisering van de samenstelling van in vivo extracellulaire matrices van normale en pathologische monsters belemmerd. We hebben onlangs aangetoond dat deze onoplosbaarheid kan worden gedraaid voordelig worden gebruikt voor ECM proteïnen verrijken 8-10. Wij en anderen verder aangetoond dat massaspectrometrie is een voorkeurswerkwijze voor de samenstelling van ECM&#39;s te karakteriseren 8 - 10, 13. Webeschrijf hier een decellularisatie procedure die bestaat uit opeenvolgende incubaties in buffers van verschillende pH en zout en afwasmiddel concentraties. Deze procedure resulteert in de extractie (of depletie) cytosolisch, nucleaire membraan en cytoskeleteiwitten en verrijking van ECM eiwitten. Vervolgens beschrijven we hoe ECM-verrijkte eiwitpreparaten verteren in peptiden voor verdere analyse door middel van massaspectrometrie. De gedetailleerde procedures en hier weergegeven hebben we met succes verrijkt en gekenmerkt met massaspectrometrie de extracellulaire matrices uit tien verschillende weefsels en soorten tumoren Normale muizen long 8, menselijke en murine colon 8,9, humane lever 9, humane colorectale tumoren en afgeleide levermetastasen 9, melanoom xeno-transplantaten 8, mammaire tumor xenotransplantaten 10 van muis pancreaseilandjes en murine insulinomen (Naba et al., ongepubliceerd). Vergelijking van de verschillende matrisomes geopenbaard weefsel- en tumorspecifieke ECM handtekeningen die verder kan worden gebruikt als potentiële diagnostische of prognostische biomarkers. We geloven dat deze procedure kan worden toegepast op andere monsters zonder of met relatief kleine aanpassingen.

<table><tbody><tr><td>Tissu homogenisator: Bullet blender + beads</td><td>Next Advance</td><td><a href="http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender">BB24-AU</a></td><td></td></tr><tr><td>Compartiment Extractiekit</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145">2145</a></td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en&amp;region=US">DN25</a></td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease A</td><td>Qiagen</td><td><a href="http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/">19101</a></td><td></td></tr><tr><td>HPLC-kwaliteit water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en&amp;region=US">34877</a></td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en&amp;region=US">U4883</a></td><td></td></tr><tr><td>Dithiotreitol (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td><a href="http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt">20291</a></td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonaat (NH4HCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en&amp;region=US">9830</a></td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en&amp;region=US">A3221</a></td><td></td></tr><tr><td>Peptide-N-Glycosidase F (PNGaseF)</td><td>New England Biolabs</td><td><a href="https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f">P0704S</a></td><td></td></tr><tr><td>Endoproteinase LysC, massaspectrometrie-kwaliteit&nbsp;</td><td>Wako</td><td><a href="http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm">125-05061</a></td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, massaspectrometrie-kwaliteit&nbsp;</td><td>Promega</td><td><a href="https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/">V5111</a></td><td></td></tr><tr><td>Trifluoro-azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en&amp;region=US">T6508</a></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril, massaspectrometrie-kwaliteit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td><a href="http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade">51101</a></td><td></td></tr><tr><td>Ontzoutingskoloms: Oasis HLB 1&nbsp;cc, 10 mg Sorbent per Cartridge</td><td>Waters</td><td><a href="http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383">186000383</a></td><td></td></tr></tbody></table>

verrijking van extracellulaire matrix eiwitten uit weefsels en de spijsvertering in peptiden voor massaspectrometrie analyse

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

De extracellulaire matrix (ECM) is een complex maaswerk van verknoopte eiwitten die biofysische en biochemische signalen die belangrijke regulatoren van celproliferatie, overleving, migratie, etc. Het ECM speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling en in diverse pathologieën waaronder hart- en voorziet en aandoeningen van het bewegingsapparaat ziekten, fibrose en kanker. Aldus karakteriseren van de samenstelling van ECM&#39;s van normale en zieke weefsels kunnen leiden tot de identificatie van nieuwe prognostische en diagnostische biomarkers en potentiële nieuwe therapeutische doelwitten. Echter, de aard van ECM eiwitten (groot in omvang, verknoopt en covalent gebonden, zwaar geglycosyleerd) biochemische analyse van ECM uitdagende gesmolten. Om deze uitdaging te overwinnen, ontwikkelden we een methode om ECM verrijken van verse of diepgevroren weefsels en tumoren die gebruik maakt van de onoplosbaarheid van ECM eiwitten. We beschrijven hier in detail de cellen ontdoen procedure die bestaat uit opeenvolgende incubations in buffers van verschillende pH en zout en afwasmiddel concentraties en dat resulteert in 1) de winning van intracellulaire (cytosolisch, nucleaire, membraan en cytoskelet) eiwitten en 2) de verrijking van ECM eiwitten. Vervolgens beschrijven we hoe deglycosylate en te verteren-ECM verrijkt eiwitpreparaten in peptiden voor verdere analyse door middel van massaspectrometrie.

Kwaliteitscontrole van de decellularisatie procedure De efficiëntie van de decellularisatie kan worden gevolgd door het analyseren van het eiwitgehalte van elke fractie met western blot. Tabel 2 lijsten eiwitten van diagnostische waarde voor de kwaliteit van de cellen ontdoen procedure te beoordelen. Figuur 2A toont de efficiënte extractie de halfproducten cytosolische (GAPDH ), kern (histonen), membraan (β1 integrine) en cytoskelet (actine) eiwitten, terwijl geen ECM eiwitten (collageen I) gedetecteerd in deze fracties (Figuur 2). Op zijn beurt wordt de definitieve pellet verrijkt aan ECM eiwitten en grotendeels ontdaan van intracellulaire eiwitten (Figuur 2A). Figuur 2B toont bevredigende intracellulair proteïne afbraak (geen histone wordt gedetecteerd in de ECM-fractie), ofschoon actine nog steeds kan worden gedetecteerd in de ECM-rijke fractie en de depletie van monomeer collageen I- Schijnbaar molecuulgewicht ~ 110 kDa, vermoedelijk overeenkomend met gemonteerde collageen I - kan worden waargenomen in de CS fractie. We hebben ook regelmatig andere ECM eiwitten zoals fibronectine en laminine bewaken, hoewel in sommige weefsels kunnen deze componenten gedeeltelijk opgelost in eerdere fracties 8-10. Bijvoorbeeld, fibronectine komt voor als oplosbare plasma fibronectine dat niet in de ECM opgenomen. Perfusie van het weefsel vóór de extractie vermindert plasma fibronectine concentratie maar niet altijd elimineren. In sommige weefsels, worden laminins gevonden losjes verbonden aan het celoppervlak of de ECM en extract in intermediaire fracties. Als dit gebeurt kan worden aangepakt door een wijziging van de extractie (zie Discussie). Merk op dat de verrijking van ECM eiwitten en gelijktijdige depletie van intracellulaire componenten is gebaseerd op de relatieve oplosbaarheid van eiwitten in de verschillende buffers. This verschilt tussen verschillende weefsels - in sommige gevallen de histonen en actine zijn gemakkelijker geëxtraheerd dan in andere. Merk ook op dat hoewel histonen worden verwacht in de N fractie (Figuur 2B) te extraheren, zien we vaak een volledige depletie van histonen in de M of CS fractie (figuur 2A en B). Indicatieve peptide concentratie verwacht De concentratie van de peptide oplossing verkregen na digestie, aanzuring en ontzouten kan worden gemeten door spectrofotometrie of door de absorptie van de peptideoplossing met de 280 nm golflengte overeenkomend met tryptofaan, tyrosine, of met de 205 nm golflengte die overeenkomt met de absorptie van het peptide obligaties. We maten de concentratie van de uit de cellen ontdoen van drie muizen long monsters peptideoplossingen (82 mg, 100 mg en 100 mg, respectievelijk) preparrood in parallel, verkregen uit elk: 424 ng / ul, 450 ng / ul en 580 ng / ul peptiden resp. Identificatie van ECM peptiden met behulp van massaspectrometrie Massaspectrometrische analyse van de samenstelling van ECM-eiwit verrijkte monsters, bereid zoals hier beschreven, toonde aan dat&gt; 70% van de signaalsterkte overeenkomt met ECM en ECM-geassocieerde eiwitten 10/08. Tabel 1. Volume reagentia uit Compartimentele Extraction kit om 100 mg (nat gewicht) van weefsel of tumor decellularize. Deze tabel geeft de samenstelling en het volume van elke buffer gebruikt voor de decellularisatie van 100 mg weefsel of tumor voeren. Een cocktail van proteaseremmers wordt geleverd als 50x oplossing en moet worden toegevoegd aan elke buffer 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagentia van compartiment Protein Extraction Kit </td><td> Volume voor 100 mg van het weefsel </td><td> Samenstelling (op basis van Millipore datasheet cat # 2145 1) </td></tr><tr><td> Buffer C </td><td> 500 gl </td><td> HEPES (pH 7,9 3), MgCl2, KCl, EDT 4, sucrose, glycerol, natriumorthovanadaat 5 </td></tr><tr><td> Buffer W </td><td> 400 gl </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sucrose, glycerol, natriumorthovanadaat </td></tr><tr><td> Buffer N </td><td> 150 ul 2 x </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl2, NaCl, EDTA, glycerol, natriumorthovanadaat </td></tr><tr><td> Buffer W </td><td> 400 gl </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sucrose, glycerol, natriumorthovanadaat </td></tr><tr><td> Buffer M </td><td> 100 gl </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sucrose, glycerol, natrium deoxycholaat (DOC) 6, NP-40 6 </sup&gt;, Natriumorthovanadaat </td></tr><tr><td> Buffer CS </td><td> 200 gl </td><td> PIPES (pH 6,8), MgCl2, NaCl, EDTA, sucrose, natriumdodecylsulfaat (SDS) 7, natriumorthovanadaat </td></tr><tr><td> Buffer C </td><td> 150 gl </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sucrose, glycerol, natriumorthovanadaat </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> 500 pl / wasbeurt </td><td> - </td></tr></tbody></table> Opmerkingen: 1 Voor eigen redenen, we waren niet in staat om de precieze samenstelling van de buffers van de leverancier van de kit te krijgen, maar we zijn onder andere hier wat aantekeningen op basis van onze eigen ervaring met behulp van zelfgemaakte buffers om soortgelijke extracties uit te voeren. 2 Protease inhibitor: het is wenselijk om een verscheidenheid van remmers tegen cysteïne, serine en threonine peptidasen, serine-esterasen, divalente kationen omvatten metalloproteasen etc.Vele commercieel verkrijgbare protease-inhibitor cocktail bestaan. 3 pH boven 7,0 is een effectieve remmer van lysosomale proteasen. 4 EDTA (meestal gebruikt bij een 2 mM) is een effectieve remmer van divalente kationen proteases. 5 natriumorthovanadaat een fosfatase-inhibitor. Een typische effectieve concentratie zou 0,5-5 mM. 6 NP40 0.1% -0,5% voldoende om de meeste membraanlipiden oplosbaar. De combinatie van NP40 en DOC - vaak in gelijke concentraties (bijvoorbeeld 0,5% van elk) - wordt vaak gebruikt als een strengere extractie die nog laat vele eiwit-eiwit interacties intact. 7 SDS is een strengere ionisch detergens (CMC 0,1%). Het kan ook worden gebruikt in combinatie met de andere twee detergentia SDS / NP40 / DOC 0,1 / 0,5 / 0,5% als gemiddelde stringentie buffer. Tabel 2. Diagnostische eiwittenbewaken van de kwaliteit van de cellen ontdoen procedure. Deze tabel geeft voorbeelden van eiwitten die kenmerken van elk subcellulair compartiment (cytosol, nucleus, plasmamembraan, cytoskelet en ECM) die kunnen worden gebruikt om de kwaliteit van de cellen ontdoen procedure en de doelmatigheid van het toezicht ECM-verrijking. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Intracellulaire compartiment </td><td> Diagnostic Eiwitten </td></tr><tr><td> Cytosolische eiwitten </td><td> Glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) </td></tr><tr><td> Kerneiwitten </td><td> Histonen, lamins, Nucleoporin </td></tr><tr><td> Membraaneiwitten </td><td> Integrinen, transferrinereceptor </td></tr><tr><td> Cytoskeleteiwitten </td><td> Actine, tubuline, Vimentin </td></tr><tr><td> Basaal membraan ECM eiwitten </td><td> Collageen IV, Nidogens, laminins </td></tr><tr><td> Interstitiële ECM eiwitten (interstitiële) </td><td> Collageen I, collageen III, collageen VI, Fibronectine </td></tr></tbody></table> Voor aanbeveling over antilichamen, zie onze publicaties 8-10. Tabel 3. Volume van de reagentia te ECM verrijkte monsters in peptiden te verteren. Deze tabel geeft de reagentia gebruikt om ECM verrijkt eiwit monsters mengen en te verminderen, alkylaat, deglycosylate en te verteren eiwitten monsters in peptiden voor massaspectrometrie analyse. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagentia </td><td> Voorbereiding </td><td> Uiteindelijke concentratie / bedrag voor 1 mm dik pellet (~ 5-10 mg droog gewicht) </td><td> Volume 1 mm dik pellet (~ 5-10 mg droog gewicht) </td></tr><tr><td> Ammoniumbicarbonaat (NH 4 HCO 3) </td><td> 100 mM oplossing in HPLC-grade water </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Ureum </td><td> 8 M oplossing in 100 mM ammoniumbicarbonaat </td><td> 8 M </td><td> 50 gl </td></tr><tr><td> Dithiothreitol </td><td> Reconstrueren in HPLC-grade water bij 500 mM </td><td> 10 mM </td><td> 1 gl </td></tr><tr><td> Joodacetamide </td><td> Reconstrueren in HPLC-grade water bij 500 mM </td><td> 25 mM </td><td> 2,5 pl </td></tr><tr><td> Peptide N -Glycosidase F (PNGaseF) </td><td> Commercieel oplossing bij 500 U / gl </td><td> 1.000 U </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> Endoproteinase LysC, massaspectrometrie-grade </td><td> Reconstrueren in HPLC-grade water bij 0,5 ug / ul </td><td> 1 ug </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> Trypsine, massaspectrometrie-grade (rond 1) </td><td> Commercieel oplossing bij 0,5 ug / ul </td><td> 3 ug </td><td> 6 pi </td></tr><tr><td> Trypsine, massaspectrometrie-waardering (ronde 2) </td><td> Commercieel oplossing bij 0,5 ug / ul </td><td> 1.5 ug </td><td> 3 gl </td></tr><tr><td> Trifluorazijnzuur (TFA) </td><td> 50% oplossing in HPLC-grade water </td><td> - </td><td> 2-5 pi </td></tr><tr><td> Acetonitril (elutie) </td><td> 60% oplossing met een 0,1% TFA in HPLC-grade water </td><td> - </td><td> 500 gl </td></tr><tr><td> Acetonitril (reconstitutie) </td><td> 3% oplossing met een 0,1% TFA in HPLC-grade water </td><td> - </td><td> 100 gl </td></tr></tbody></table><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig1highres.jpg" width="600" /> Figuur 1. Schema van de experimentele procedure. Schematische workflow van de protocol aan weefsels (deel 1) decellularize, controle van de kwaliteit van de decellularisatie en evalueren van de ECM verrijking (hoofdstuk 2) en te verteren-ECM verrijkt eiwit monsters in peptiden voor massaspectrometrie analyse (hoofdstuk 3). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig2highres.jpg" width="500" /> Figuur 2. Kwaliteitscontrole van de decellularisatie procedure met western blot Western blots werden uitgevoerd op muizen long (A) en humaan borstcarcinoom xenograft (B) monsters met de volgende antilichamen:. Konijn anti-actine (kloon 14-1) en konijn anti- -β1 integrine antilichamen die in ons laboratorium; konijn anti-collageen I, muis anti-GAPDH en konijn anti-pan-histonen antilichamen waren van Millipore. Na primaire antilichaam incubatie werden de membranen gewassen en geïncubeerd in de aanwezigheid van HRP-geconjugeerd geit anti-konijn of geit anti-mouse secundair antilichaam van Jackson ImmunoResearch Laboratory. Tenslotte werden de membranen gewassen en geïncubeerd in Western Lightning Chemiluminescence Reagent ™ (PerkinElmer LAS). * Geeft minimal residual histon verontreiniging van de ECM-fractie. ** Geeft gedeeltelijke uitputting van monomeer (vermoedelijk niet gemonteerd) collageen I in de CS-fractie. *** Geeft resterende actine verontreiniging van de ECM-fractie. De gedetecteerd met de anti-collageen-antilichaam vlek vertegenwoordigt verschillende post-translationele modificaties (bijvoorbeeld verknoping, glycosylering).

Dit protocol beschrijft een procedure voor het verrijken van ECM-eiwitten uit weefsels of tumoren en het deglycosyleren en verteren van de ECM-verrijkte preparaten in peptiden om hun eiwitsamenstelling door middel van massaspectrometrie te analyseren.

Verrijking van extracellulaire matrix eiwitten uit weefsels en de spijsvertering in peptiden voor massaspectrometrie Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Het algemene doel van deze procedure is om de samenstelling van extracellulaire matrixen uit weefsels te karakteriseren door middel van massaspectrometrie. Dit wordt bereikt door eerst het geselecteerde weefsel te verstoren totdat het volledig gehomogeniseerd is. De tweede stap omvat het decellulariseren van het weefsel om extracellulaire matrixeiwitten te verrijken en tegelijkertijd alle intracellulaire componenten te verminderen.Vervolgens wordt het ECM-verrijkte eiwitmonster in de laatste stap gedenatureerd, het gedenatureerde ECM-verrijkte eiwitmonster wordt gedec glycosyleerd en verteerd in peptiden. Westerse bloedanalyse wordt gebruikt om de kwaliteit van de decellularisatie en ECM-eiwitverrijking te bewaken. Uiteindelijk maakt analyse door massaspectrometrie van de peptiden karakterisering van de samenstelling van de ECM voor dat specifieke weefsel mogelijk.Deze methode kan inzicht geven in de samenstelling van de extracellulaire matrix van normale weefsels, maar kan ook worden toegepast op andere systemen zoals ziek weefsel zoals kanker. Om te beginnen, bereidt u alle buffers voor zoals aangegeven in het tekstprotocol. Tabel één, inclusief de toevoeging van proteaseremmers.Vervolgens verstoren 100 milligram weefsel in 500 microliter buffer C met een weefselhomogenisator tot een uniforme suspensie wordt verkregen. Breng het homogenaat over in een buisrotator en incubeer gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Pipet 10 tot 20 microliters van het monster in een buis gelabeld als totaal weefselextract of startmateriaal. Vries het monster in vloeibare stikstof in en bewaar het bij min 80 graden Celsius.Centrifugeer vervolgens het homogenaat bij 16.000 keer G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel de supernatant in een schone buis en label het als de cytosolische of C-fractie.Vries de C-fractie in en bewaar deze bij min 80 graden Celsius.Pipet daar. Suspendeer het pellet in 400 microliter buffer dubbel en incubeer het gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius op een buisrotator. Centrifugeer vervolgens het monster en gooi de supernatant weg om eerst de nucleaire eiwitten te extraheren.Resuspendeer het pellet in 150 microliter buffer N en incubeer het gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius op een buisrotator. Centrifugeer vervolgens het monster en verzamel de supernatant in een schone buis. Herhaal de incubatie in buffer N na centrifusie.Combineer de supernatanten en label ze als de nucleaire of N-fractie.Vries de N-fractie in voor opslag bij min 80 graden Celsius. Voeg 100 microliter buffer M toe en resuspendeer het pellet.Incubeer vervolgens het monster op een buisrotator gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius voordat u het centrifugeert. Verzamel de supernatant in een schone buis en label het als de membraan- of M-fractie.Vries de M-fractie in en bewaar deze bij min 80 graden Celsius.Re suspendeer het pellet in 200 microliter buffer CS door krachtig te pipetten en incubeer vervolgens het monster op een buisrotator gedurende 30 minuten. Centrifugeer het monster gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en verzamel de supernatant in een schone buis en label het als de cytoskeletaal of CS-fractie. Het pellet zou nu aanzienlijk kleiner moeten zijn.Re suspendeer het pellet in 150 microliter buffer C.Breng het monster over naar een buisrotator en incubeer het gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius en verzamel de supernatant. Combineer vervolgens de supernatant met degene uit de CS-buffer in de buis die al gelabeld is als de cytoskeletaal of CS-fractie.Vries de CS-fractie in en bewaar deze bij min 80 graden Celsius. Om het pellet te wassen, resuspendeer het in 500 microliter PBS en incubeer het vervolgens gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius op een buisrotator.Centrifugeer de buis en gooi de supernatant weg. Was in totaal drie keer. Om de ECM-verrijkte pellet te verkrijgen, bewaar een kleine fractie van de ECM-fractie voor Western blok QC-analyse van het experiment.Vries de fracties in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij min 80 graden Celsius. Om de vertering te beginnen. Re suspendeer eerst het ECM-verrijkte pellet in acht molaire ureum en voeg een oplossing van Dihi drie etol in water toe om een ​​eindconcentratie van 10 millimolair te maken.Breng de buis over naar een incubator en schud hem gedurende twee uur bij 37 graden Celsius op 1400 RPM. Koel vervolgens het monster af tot kamertemperatuur en voeg een oplossing van gereconstitueerd iota acetamide in water toe tot een eindconcentratie van 25 millimolair. Incubeer het mengsel in het donker gedurende 30 minuten.Bij kamertemperatuur verdun tot een twee molaire ureumconcentratie met 100 millimolair ammoniumbicarbonaat en voeg vervolgens P PGA F toe.Breng het monster over naar een incubator en schud het gedurende twee uur op 1400 RPM. Voeg endo protease, slice C toe aan het mengsel en schud gedurende twee uur bij 37 graden Celsius op 1400 RPM. Voeg vervolgens trypsine toe en schud gedurende de nacht bij 37 graden Celsius op 1400 RPM.De troebele oplossing zou helder moeten worden na de nachtelijke vertering bij een tweede deli quad van trypsine en schud nog twee uur om de trypsine te inactiveren. Pipet 50% tri fluorazijnzuur in de mix in stappen van één microliter totdat de pH minder dan twee is. Controleer de pH door een microliter van de peptideoplossing op pH-papier te spotten. Centrifugeer de oplossing gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Verzamel tenslotte de supernatant in een schone, laag retentietbuis. Bewaar de ECM-peptideoplossing bij min 20 graden Celsius. De Western blots van de decellularisatie van spiegelende longweefsels tonen extractie van intracellulaire componenten zoals ASIN beta een actine GA, dh en histonen in de tussenliggende fracties.Deze componenten ontbreken bijna volledig in de ECM-fractie, hoewel er enige kleine histonverontreiniging aanwezig blijft. Daarentegen is collageen een sterk verrijkt in de ECM-fractie, maar wordt niet gedetecteerd in de andere fracties, wat suggereert dat er geen collageen verloren gaat tijdens de tussenliggende

enrichment-extracellular-matrix-proteins-from-tissues-digestion-into

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Stabiele Isotopen Normen en Capture door Anti-peptide antilichamen (SISCAPA) paren affiniteit verrijking van peptiden met stabiele isotoop verdunning massaspectrometrie (MRM-MS) voor kwantitatieve meting van peptiden te bieden als surrogaat voor hun respectievelijke eiwitten. Hier beschrijven we het protocol met behulp van magnetische deeltjes in een deels geautomatiseerde formaat.

Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

Wij ontwikkelden een technologie op basis van silica mesoporeuze dunne film voor het selectief herstel van laagmoleculaire peptiden en eiwitten van humaan serum. De fysisch-chemische eigenschappen van onze mesoporeuze chips zijn volledig afgestemd op grote controle in peptide verrijking 'en derhalve profiel van de serum proteoom voor diagnostische doeleinden.

Laag moleculair gewicht eiwitverrijking op mesoporeuze silica dunne films voor de ontdekking van biomarkers

Nauwkeurige massa meting betekent een belangrijke stap tijdens het onderzoek van eiwitten. Matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie (MS) kan worden gebruikt voor deze vaststelling en van zijn belangrijkste voordeel is de tolerantie voor zouten, detergentia en verontreinigingen. Hier tonen we een toegankelijke benadering voor de analyse van eiwitten groter dan 100 kDa door MALDI-MS.

Matrix-laserdesorptie / ionisatie Time of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa

De extracellulaire matrix speelt een belangrijke rol bij het definiëren van de micro-omgeving van cellen en bij het moduleren van celgedrag en fenotype. We beschrijven een snelle methode voor de isolatie van cel-afgeleide extracellulaire matrix, die kan worden aangepast aan verschillende schalen voor microscopische, biochemische, proteomische of functionele studies.

Een snelle, schaalbare methode voor het isoleren, functionele studie en analyse van cel-afgeleide extracellulaire matrix

Dit artikel beschrijft een methode cardiovasculaire weefselmonsters voor MS analyse mogelijk maakt (1) de analyse van ECM eiwitsamenstelling, (2) het identificeren van glycosyleringsplaatsen, en (3) de samenstelling karakterisering van glycan vormen moeten worden bereid. Deze methodologie kan worden toegepast, met kleine modificaties, voor de studie van de ECM in andere weefsels.

Glycoproteoomanalyses van de extracellulaire matrix: Een methode voor Intact Glycopeptide analyse met behulp van massaspectrometrie

De verrijking van bacteriële lipoproteins met behulp van een fase van de niet-ionogene oppervlakteactieve stof partitioneren methode wordt beschreven voor direct gebruik in TLR testen of andere toepassingen. Verdere stappen zijn gedetailleerd voor te bereiden al lipopeptides van N-terminale structurele karakterisering door massaspectrometrie.

Verrijking van Lipoproteins van de bacteriële en de bereiding van N-terminal Lipopeptides voor structurele bepaling door massaspectrometrie

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om te isoleren van kleine extracellulaire blaasjes (EVs) hele weefsel, met inbegrip van hersenen en tumor exemplaren. Deze methode biedt een reproduceerbare techniek om EVs extract van solide weefsel voor verder stroomafwaarts analyses.

Winning van extracellulaire blaasjes uit hele weefsel

Het beschreven protocol biedt een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-analyse van weefselmonsters met behulp van twee benaderingen: labelgebaseerde en labelvrije kwantificering. Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten, terwijl een labelvrije aanpak kosteneffectiever is en wordt gebruikt om honderden monsters van een cohort te analyseren.

Uitgebreide workflow van op massaspectrometrie gebaseerde Shotgun Proteomics van weefselmonsters

Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide posttranslationele modificatie die meerdere biologische routes reguleert. Massaspectrometrie is de beste technologie om het R-methylproteoom wereldwijd te profileren, wanneer gekoppeld aan biochemische benaderingen voor gemodificeerde peptideverrijking. De workflow die is ontworpen voor de identificatie met hoge betrouwbaarheid van globale R-methylatie in menselijke cellen wordt hier beschreven.

Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse

Posttranslationele modificaties (PTM's) veranderen eiwitstructuren en -functies. Methoden voor de gelijktijdige verrijking van meerdere PTM-typen kunnen de dekking in analyses maximaliseren. We presenteren een protocol met behulp van dual-functionele Ti(IV)-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie gevolgd door massaspectrometrie voor de gelijktijdige verrijking en analyse van eiwit N-glycosylatie en fosforylering in pancreasweefsels.

Een spin-tipverrijkingsstrategie voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels

Leer extracellulaire matrix-eiwitten verrijken uit weefsels via decellularisatie en spijsvertering in peptiden voor massaspectrometrie-analyse. Deze methode karakteriseert ECM-samenstelling in normaal en ziek weefsel.

Verrijking van extracellulaire matrix eiwitten uit weefsels en de spijsvertering in peptiden voor massaspectrometrie Analyse

Meer video's verkennen