Name: Dubbelloops en concentrische micro-elektroden voor het meten van extracellulaire Ion Signalen in hersenweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Leer hoe je ion-selectieve micro-elektroden fabriceert en calibreert voor het meten van extracellulaire kalium- en natriumconcentraties in acute muizenhippocampus-snedes. Deze methode helpt onderzoekers ion-dynamiek en neuronale signalering te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen C. Roderigo bedanken voor de deskundige technische bijstand. Wij danken S. Köhler (Center of Advanced Imaging, Heinrich Heine Universiteit Düsseldorf) voor hulp bij het videoproductie. Onderzoek in het laboratorium van de auteur is gefinancierd door de Duitse Research Association (DFG: Ro 2327 / 8-1 te CRR), de Heinrich Heine Universiteit van Düsseldorf (NH) en door National Institutes of Health verlenen R01NS032123 (MC).

<ol><li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+regulation+in+the+brain%3A+implications+for+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li>
<li>Dietzel, I., Heinemann, U., Hofmeier, G., Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-induced+changes+in+extracellular+Na%2B+and+Cl-+concentration+in+relation+to+changes+in+the+size+of+the+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Stimulus-induced changes in extracellular Na+ and Cl- concentration in relation to changes in the size of the extracellular space.</a> Exp Brain Res. 46, 73-84 (1982).</li>
<li>Nicholson, C., ten Bruggencate, G., Stockle, H., Steinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+potassium+changes+in+extracellular+microenvironment+of+cat+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and potassium changes in extracellular microenvironment of cat cerebellar cortex.</a> J Neurophysiol. 41, 1026-1039 (1978).</li>
<li>Rice, M. E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-+and+aspartate-induced+extracellular+potassium+and+calcium+shifts+and+their+relation+to+those+of+kainate%2C+quisqualate+and+N-methyl-D-aspartate+in+the+isolated+turtle+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamate- and aspartate-induced extracellular potassium and calcium shifts and their relation to those of kainate, quisqualate and N-methyl-D-aspartate in the isolated turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 38, 295-310 (1990).</li>
<li>Prince, D. A., Lux, H. D., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+extracellular+potassium+activity+in+cat+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Measurement of extracellular potassium activity in cat cortex.</a> Brain Res. 50, 489-495 (1973).</li>
<li>Deitmer, J. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+regulation+and+proton+signalling+by+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">pH regulation and proton signalling by glial cells.</a> Prog Neurobiol. 48, 73-103 (1996).</li>
<li>Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+modulation+of+pH+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation and modulation of pH in the brain.</a> Physiol Rev. 83, 1183-1221 (2003).</li>
<li>Kofuji, P., Newman, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKofuji%2C+P+%22Regulation+of+potassium+by+glial+cells+in+the+central+nervous+system%22">Regulation of potassium by glial cells in the central nervous system</a>. , Springer. (2009).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48, 199-213 (1993).</li>
<li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+use+of+high-speed%2C+concentric+h%2B-+and+Ca2%2B-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fabrication and use of high-speed, concentric h+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophysiol. 96, 919-924 (2006).</li>
<li>Stephan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kir4.1+channels+mediate+a+depolarization+of+hippocampal+astrocytes+under+hyperammonemic+conditions+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Kir4.1 channels mediate a depolarization of hippocampal astrocytes under hyperammonemic conditions in situ.</a> Glia. 60, 965-978 (2012).</li>
<li>Haack, N., Rose, C. R. Preparation, Calibration and Application of Potassium-Selective Microelectrodes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaack%2C+N+%22Microelectrodes%22">Microelectrodes</a>. Lei, K. F. , Nova Science Publishers. 87-105 (2014).</li>
<li>Roos, A., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH.</a> Physiol Rev. 61, 296-434 (1981).</li>
<li>Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+Intracellular+Sodium+Imaging+Combined+with+UV-mediated+Focal+Uncaging+of+Glutamate+in+CA1+Pyramidal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li>
<li>Hertz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+astrocytic+Na+%2CK+-ATPase+and+glycogenolysis+for+K+homeostasis+in+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of astrocytic Na ,K -ATPase and glycogenolysis for K homeostasis in mammalian brain.</a> J Neurosci Res. , (2014).</li>
<li>Pumain, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-+and+amino+acid-induced+calcium+and+potassium+changes+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Stimulus- and amino acid-induced calcium and potassium changes in rat neocortex.</a> J Neurophysiol. 53, 1-16 (1985).</li>
<li>Vargova, L., Jendelova, P., Chvatal, A., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate%2C+AMPA%2C+NMDA+Induced+Changes+in+Extracellular+Space+Volume+and+Tortuosity+in+the+Rat+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Glutamate, AMPA, NMDA Induced Changes in Extracellular Space Volume and Tortuosity in the Rat Spinal Cord.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 21, 1077-1089 (2001).</li>
<li>Fellin, T., Gomez-Gonzalo, M., Gobbo, S., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+glutamate+is+not+necessary+for+the+generation+of+epileptiform+neuronal+activity+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic glutamate is not necessary for the generation of epileptiform neuronal activity in hippocampal slices.</a> J Neurosci. 26, 9312-9322 (2006).</li>
<li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322, 1551-1555 (2008).</li>
<li>Lux, H. D., Heinemann, U., Dietzel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+changes+and+alterations+in+the+size+of+the+extracellular+space+during+epileptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ionic changes and alterations in the size of the extracellular space during epileptic activity.</a> Adv Neurol. 44, 619-639 (1986).</li>
<li>Zanotto, L., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartate+and+glutamate+induced+reductions+in+extracellular+free+calcium+and+sodium+concentration+in+area+CA1+of+%27in+vitro%27+hippocampal+slices+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Aspartate and glutamate induced reductions in extracellular free calcium and sodium concentration in area CA1 of 'in vitro' hippocampal slices of rats.</a> Neurosci Lett. 35, 79-84 (1983).</li>
<li>Borrelli, M. J., Carlini, W. G., Dewey, W. C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+making+ion-selective+microelectrodes+suitable+for+intracellular+recording+in+vertebrate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for making ion-selective microelectrodes suitable for intracellular recording in vertebrate cells.</a> J Neurosci Methods. 15, 141-154 (1985).</li>
<li>Ammann, D., Anker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+carrier+sodium+ion-selective+microelectrode+for+extracellular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Neutral carrier sodium ion-selective microelectrode for extracellular studies.</a> Neurosci Lett. 57, 267-271 (1985).</li>
<li>Deitmer, J. W., Schlue, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Na%2B+and+Ca2%2B+in+leech+Retzius+neurones+during+inhibition+of+the+Na%2B-K%2B+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Intracellular Na+ and Ca2+ in leech Retzius neurones during inhibition of the Na+-K+ pump.</a> Pflugers Arch. 397, 195-201 (1983).</li>
<li>Schwiening, C. J., Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+intracellular+calcium+and+its+muffling+measured+by+calcium+iontophoresis+in+snail+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between intracellular calcium and its muffling measured by calcium iontophoresis in snail neurones.</a> J Physiol. 491 (Pt 3), 621-633 (1996).</li>
<li>Chesler, M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+of+astrocytes+increases+rapidly+with+cortical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation.</a> Am J Physiol. 253, R666-R670 (1987).</li>
<li>Ammann, D., Chao, P. S., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valinomycin-based+K%2B+selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74, 221-226 (1987).</li>
<li>Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicarbonate-dependent+changes+of+intracellular+sodium+and+pH+in+identified+leech+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Bicarbonate-dependent changes of intracellular sodium and pH in identified leech glial cells.</a> Pflugers Arch. 420, 584-589 (1992).</li>
<li>Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+recording+ion+specific+microelectrodes%3A+their+use+in+pharmacological+studies+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Fast recording ion specific microelectrodes: their use in pharmacological studies in the CNS.</a> Neuropharmacology. 13, 509-517 (1974).</li>
<li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li>
<li>Chesler, M., Chan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-induced+extracellular+pH+transients+in+the+in+vitro+turtle+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stimulus-induced extracellular pH transients in the in vitro turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 27, 941-948 (1988).</li>
<li>Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+sodium+activity+and+the+sodium+pump+in+snail+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail neurones.</a> J Physiol. 220, 55-71 (1972).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrentie-interes te hebben.

Vloeistof-carrier based, ion-selectieve elektroden zijn met succes toegepast voor decennia vele ionen, zeer specifieke sensoren beschikbaar 22-26. Bij gebruik in de extracellulaire ruimte (ECS) van gewervelde hersenen preparaten, moet men in gedachten houden, echter, dat dit een zeer invasieve techniek: terwijl de breedte van de ECS is slechts ongeveer 20-50 nm, de diameter van de ion-selectieve micro-elektroden is ongeveer 1 micrometer (dubbelloops elektroden) of groter (concentrische elektroden). De tips van de ion-selectieve microelectrodes zal dus niet alleen het weefsel beschadigen tijdens hun impalement van het weefsel, maar ook vergroting van de ECS, waarbij een onderschatting van ion transiënten. Ondanks deze valkuilen, extracellulaire ion transiënten in reactie op de neuronale activiteit zijn opmerkelijk consistent tussen de verschillende laboratoria 7,8, waaruit blijkt dat de betrouwbaarheid van deze methode. De prestaties en de geschiktheid van de ion-selectieve elektrodenis afhankelijk van hun gevoeligheid en selectiviteit, die wordt bepaald door de sensor cocktail (vloeibaar ionofoor membraan &quot;) gebruikt. Sensor cocktails bevatten een speciale vervoerder molecuul, bijvoorbeeld valinomycine voor K + selectieve micro-elektroden die een hoge selectiviteit voor kalium 27 vertoont. Niettegenstaande, kan cross-reactiviteit met andere ionen optreden en moeten worden getest. Valinomycin vertoont een significante kruisreactiviteit van ammonium, die moet worden gehouden bij het ​​interpreteren van resultaten (bijvoorbeeld 11,12). Bovendien, omdat de spanning-respons van de ionoforen volgt een Nernstian gedrag (zie vergelijking 1), de signaal-ruisverhouding en detectiegrens afhankelijk van de concentratie van de ionen te meten. Dus, terwijl kleine [K +] o transiënten roepen grote spanningsveranderingen tegen lage uitgangswaarde [K +] o, small [Na +] o transiënten veel moeilijker te detecteren tegen high basislijn [Na +] o (zie figuur 5 en 6). De prestaties van ion-selectieve elektroden wordt mede bepaald door de temporele resolutie, die grotendeels wordt bestuurd door de elektrische tijdconstante. Deze wordt vooral bepaald door de axiale weerstand van de sensor, en de verdeelde capaciteit over de lengte van de pipet tussen de interne oplossingen en de externe vloeistof. In de dubbelloops configuratie is de weerstand hoog, vanwege de lange kolom opgevuld ion sensor. Voor een gegeven isolerend diëlektricum (hier borosilicaatglas), wordt de capaciteit bepaald door de diëlektrische dikte. In dubbelloops elektroden, het diëlektricum breedte bedraagt ​​de glazen wand van de pipet. Als het glas verdunt dicht bij de tip, de diëlektrische breedte valt, en de capaciteit toeneemt. Deze factoren combineren om elektroden met reactietijden die variëren van enkele honderden milliseconden tot enkele producerenseconden, omdat deze factoren worden gevarieerd. Een belangrijk voordeel van concentrisch is dat zowel de axiale weerstand en de capaciteit om het bad sterk wordt verminderd. De concentrische pipet shunts grootste deel van de weerstand van de opgevuld ionenwisselaar, waardoor er slechts een overblijfsel in de laatste paar micrometer voor de tip. Bovendien wordt de vuloplossing in de concentrische pipet fysiek op afstand van het bad, gescheiden door de dikte van twee glazen wanden, de capaciteit sterk verminderen. Zoals eerder 10 aangetoond, het gecombineerde effect van verminderde weerstand en capaciteit is een verbetering in tijdresolutie twee orden van grootte. Bij concentrische Ca2 + en pH microelectrodes, 90% responstijden was zo laag als 10 10-20 msec. Een verwante voordeel van concentrisch is lager geluidsniveau (zie Figuur 8). Door de sterk verminderde weerstand, spanningspieken vanuit ambient ruis geminimaliseerd. Bovendien herstel van dergelijke overgangen is snel, vanwege de snelle tijdconstante. Dergelijke voorwerpen zijn derhalve klein en snel, en een minder verstorend effect op de fysiologische opnames (zie Figuur 8). Er zijn ook nadelen van de concentrische techniek. Ten eerste, de montage nog complexer en tijdrovender. Een tweede nadeel is de noodzaak om een ​​afzonderlijke referentie micro-elektrode plaatst bij zijn punt, meebrengen gebruik van een afzonderlijke micromanipulator of gespecialiseerde dubbele manipulator. Tenslotte kan dubbelloops micro-elektroden worden uitgebreid met een triple-loop ontwerp, waardoor detectie van twee verschillende soorten ionen tegelijk 28, hetgeen niet mogelijk concentrische elektroden. De meest voorkomende valkuilen Inefficiënt silanisatie. De belangrijkste stap, en de belangrijkste hindernis in de fabricage van een vloeistof-sensof op basis ion-selectieve micro-elektrode is de silanisatie procedure. Wanneer elektroden niet reageren op veranderingen in de specifieke ion concentratie, of reageren met een sub-Nernstian respons (dwz, ook minder dan 58 mV per tienvoudige concentratie verschil), slechte werkzaamheid van silanisering is meestal de oorzaak. In onze ervaring, kan dit gebeuren als de luchtvochtigheid te hoog of te laag is, typisch voor omstandigheden op de hoogte van de zomer of winter, respectievelijk. Als het mogelijk is om enige controle over vochtigheid kamer uitoefenen, kunnen deze problemen worden overwonnen. Elektrode weerstand te hoog is. Indien nodig, kan de weerstand van de ion-gevoelige barrel worden verminderd door afschuining. Daartoe blootgesteld zijn uiteinde een sterke straal schuurmiddel gesuspendeerd in water gedurende enkele seconden. Hierdoor wordt het meest bovenste uiteinde te breken en laat de weerstand tegen de gewenste waarde. Zoutbruggen. Zoutbruggen tussen de ionen en referentie-vaten resulteren in een slecht of geen reagerende elektroden en kan dus ook sterk verwarren hun prestaties in de kalibratie. Zoals hierboven vermeld (zie punt 1.6.), Dit is vooral een probleem bij dubbelloops theta glas wordt gekozen, maar het is een zeldzame gebeurtenis bij gebruik van de offset, gedraaide barrel techniek hier beschreven. Met gemak van fabricage in het achterhoofd, de oorspronkelijke dubbelloops ontwerp van Lux 29 kunnen vaak winstgevend gebruikt. Deze methode maakt gebruik van pre-vulling van de ion en referentie vaten met zout oplossingen, een snelle blootstelling aan een silaanoplossing door de zuigkracht en de verwijdering van de punt, gevolgd door incorporatie van ionenwisselaar, ook via de punt (zie 30,31) . Deze elektroden kunnen worden vervaardigd in ongeveer 10 minuten, maar het punt is gemiddeld 4 um of meer en zijn meer vatbaar voor falen tijdens een experiment. Daarentegen silanisering methoden omvatten blootstelling aan silaan damp en warmteING kan elektroden met kleinere tips die dagen duren, en soms weken te produceren. Samengevat, er zijn verschillende protocollen en zal over het ion-selectieve microelectrodes bereiden. Hier hebben we twee belangrijke procedures beschreven voor de productie van twisted dubbelloops evenals concentrische micro-elektroden die goed en betrouwbaar werken in onze laboratoria, met een totale slagingspercentage van bijna 100%. Belangrijk is dat deze technieken overdraagbaar meting van andere ionen soorten, waaronder pH of calcium, en ook toepasbaar op andere preparaten dan de hersenen, waaronder vocht gevulde holten of vloeistoffen in het algemeen. Last, but not least, ion-selectieve micro-elektroden laten bepalen van ionenconcentraties in de cellen. Vanwege hun betrekkelijk grote spuitopeningen (~ 1 micrometer) zal evenwel alleen mogelijk in cellen met een groot cellichaam, bijvoorbeeld zoals gevonden in ongewervelde preparaten 28,32.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

De elektrische signalering in de hersenen is gebaseerd op de stroom van ionen door plasmamembranen. Grote ionenbewegingen in en uit de extracellulaire ruimte worden niet alleen gemedieerd door passage door spanningsafhankelijke ionkanalen, maar ook door post-synaptische ionotropische receptoren en ionentransporters. Neuronale activiteit gaat dus gepaard met complexe veranderingen in de extracellulaire concentratie van alle belangrijke ionen 1. Bijvoorbeeld, de instroom van natrium in neuronen tijdens exciterende activiteit blijkt te resulteren in een afname van de extracellulaire natriumconcentratie ([Na+]o) 2. Hetzelfde geldt voor de extracellulaire calciumconcentratie omdat calciumionen snel zowel pre- als post-synaptische structuren binnendringen 3. Tegelijkertijd beweegt kalium in de tegenovergestelde richting en dit leidt tot een toename van de extracellulaire kaliumconcentratie ([K+]o) in het lage mM-bereik 4,5. Synaptische activiteit veroorzaakt ook veranderingen in de extracellulaire pH die gedeeltelijk worden gecompenseerd door gelijktijdige gliamembraanfluxen die de intragliële pH veranderen 6,7. Deze activiteitsgerelateerde veranderingen in extracellulaire ionenconcentraties hebben significante functionele consequenties. Bijvoorbeeld, zelfs kleine toenames in [K+]o depolariseren neuronen evenals gliacellen, waardoor de neuronale exciteerbaarheid wordt veranderd, en er bestaan verschillende mechanismen om overtollig kalium te verwijderen 8. Het falen hiervan kan resulteren in epileptiforme activiteit van neuronen of fenomenen zoals verspreidde depressie 1. 
Vanwege hun cruciale belang is kwantitatieve bepaling van extracellulaire ionenconcentraties vaak noodzakelijk en vereist om de functie en disfunctie van neurale netwerken onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden te begrijpen. Al decennia lang hebben dubbelbuisige ionselectieve micro-elektroden zich bewezen als uitstekende hulpmiddelen voor dergelijke metingen in hersenweefsel 9. Voor veel ionen zijn zeer specifieke sensoren met lage kruisreactiviteit voor andere ionen beschikbaar. Naast de klassieke dubbelbuisige elektroden werden recent zogenaamde concentrische elektroden geïntroduceerd. Deze laatste bieden een superieure tijdresolutie, maar vereisen iets meer tijd en moeite om te construeren 10. 
Hieronder zullen we de voorbereiding en kalibratie van deze twee typen ionselectieve micro-elektroden beschrijven. Vervolgens laten we zien hoe deze elektroden kunnen worden ingezet in hersensnedepreparaten voor het meten van veranderingen in [K+]o of [Na+]o veroorzaakt door exciterende activiteit na verschillende stimulatieparadigma's, inclusief bad- en drukappaplicatie van geneesmiddelen.

<table><tbody><tr><td>Abrasive&nbsp;&nbsp;</td><td>MicroPolish&nbsp;</td><td>Buehler GmbH</td><td>Dissolved in A.dest</td></tr><tr><td>Borosilicate-glass capillaries</td><td>1405059</td><td>Hilgenberg</td><td>Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries with filament</td><td>GC 150 F-15&nbsp;</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td><td>For the sensor of double-barreled microelectrodes&nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries with filament</td><td>GC100-F-15</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td><td>For the reference of double-barreled microelectrodes&nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries with filament</td><td>GB-200TF-15&nbsp;</td><td>Science Products</td><td>Concentric, outer channel. O.D. 2.0 mm&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries with filament</td><td>GB-120TF-10</td><td>Science Products</td><td>Concentric, inner channel. O.D. 1.2 mm</td></tr><tr><td>Digidata</td><td>1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Electrometer amplifier with headstage</td><td></td><td>Custom-made</td><td>Rin = 10 T&Omega; and Ibias=50 fA-1pA (commercially available&nbsp; alternatives: e.g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)</td></tr><tr><td>Experimental chamber</td><td></td><td>Custom-made</td><td>Commercially available from e.g. &nbsp; Warner Instruments,USA;&nbsp; Scientifica, UK</td></tr><tr><td>Furnace</td><td></td><td>Heraeus</td><td>Must stay constant at 200 &deg;C</td></tr><tr><td>Hard sticky wax / dental wax&nbsp;</td><td>Deiberit 502&nbsp;</td><td>Siladent Dr. Boehme &amp; Schoeps GmbH</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td></td><td>Custom-made</td><td>Must stay constant at 40 &deg;C</td></tr><tr><td>Microelectrodes holder made of plexiglas</td><td></td><td>Custom-made</td><td>Double-barreled: O.D. &nbsp;capillaries 1.5 mm, concentric: O.D.&nbsp; capillaries 2 mm</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td></td><td>Leitz</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>MD4R</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>M205C</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Objective</td><td>Plan 0.8xLWD</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Model PP-830</td><td>Narishige</td><td>Concentric microelectrodes&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Model P-97</td><td>Sutter Instruments&nbsp;</td><td>Sensor of concentric microelectrodes&nbsp;</td></tr><tr><td>Pneumatic drug ejection system</td><td>Picospritzter Type II</td><td>General Valve TM Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Travel dovetail stage</td><td>DT 25/M</td><td>Thorlabs</td><td></td></tr><tr><td>Two-component glue</td><td>&nbsp;Araldite</td><td>Huntsman advanced materials GmbH</td><td>One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together&nbsp;</td></tr><tr><td>Silverwire</td><td>99.9%&nbsp;</td><td>Wieland Edelmetalle</td><td></td></tr><tr><td>Slicer / Vibratome</td><td>Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>AxoScope 8.1&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Vertical puller&nbsp;</td><td>Type PE-2</td><td>Narishige Scientific Instruments</td><td>With a revolvable chuck for&nbsp; double-barreled microelectrodes</td></tr><tr><td>x/y translational stage</td><td></td><td>Custom-made</td><td></td></tr><tr><td>1(S),9(R)-(&minus;)-Bicuculline methiodide</td><td>Sigma aldrich</td><td>14343</td><td>Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>440191</td><td>CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin</td></tr><tr><td>L-Aspartic acid</td><td>Sigma aldrich</td><td>A9256</td><td>Activates NMDA and non-NMDA and EAATs</td></tr><tr><td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td><td>Sigma aldrich</td><td>G1626</td><td>Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R),&nbsp; mGluRs and EAATs</td></tr><tr><td>Potassium ionophore I - cocktail B</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>60403</td><td>Based on valinomycin; CAUTION toxic</td></tr><tr><td>Sodium ionophore II - cocktail A</td><td>Fluka&nbsp;&nbsp;</td><td>71178</td><td>Based on ETH 157</td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic</td></tr><tr><td>Water, ultra pure</td><td>Sigma aldrich</td><td>W3500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

dubbelloops en concentrische micro-elektroden voor het meten van extracellulaire ion signalen in hersenweefsel

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Elektrische activiteit in de hersenen gaat gepaard met significante ionenstromen door membranen, wat resulteert in complexe veranderingen in de extracellulaire concentratie van alle belangrijke ionen. Aangezien deze ionenverschuivingen significante functionele gevolgen hebben, is hun kwantitatieve bepaling vaak vereist om de functie en disfunctie van neurale netwerken onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden te begrijpen. In de huidige studie demonstreren we de fabricage en kalibratie van dubbel-gebarsten ion-selectieve micro-elektroden, die uitstekende tools zijn gebleken voor dergelijke metingen in hersenweefsel. Bovendien worden zogenaamde “concentrische” ion-selectieve micro-elektroden beschreven, die op basis van hun verschillende ontwerp een veel betere temporele resolutie van snelle ionenveranderingen bieden. Vervolgens laten we zien hoe deze elektroden kunnen worden toegepast in acute hersensnedenpreparaten van de hippocampus van muizen. Met behulp van dubbel-gebarsten, kalium-selectieve micro-elektroden worden veranderingen in de extracellulaire kaliumconcentratie ([K+]o) in reactie op exogeen toegediende glutamaatreceptoragonisten of tijdens epileptische activiteit aangetoond. Verder illustreren we de responskarakteristieken van natriumgevoelige, dubbel-gebarste en concentrische elektroden en vergelijken we hun detectie van veranderingen in de extracellulaire natriumconcentratie ([Na+]o) veroorzaakt door bad- of druktoediening van geneesmiddelen. Deze metingen tonen aan dat, hoewel de responsamplitudes vergelijkbaar zijn, de concentrische natriummicro-elektroden een superieur signaal-ruisverhouding en reactietijd vertonen in vergelijking met het dubbel-gebarste ontwerp. Over het algemeen zullen de gedemonstreerde procedures gemakkelijk overdraagbaar zijn naar de meting van andere ionensoorten, inclusief pH of calcium, en zullen ze ook toepasbaar zijn op andere preparaten.

<html> Voor het bewaken [K +] o veranderingen daarvan in respons op stimulerende activiteit, een dubbelloops kalium-selectieve micro-elektrode werd in de stratum radiatum van CA1 gebied. Een paar minuten na impalement, de ion-selectieve vat van de elektrode tot een stabiele basislijn (figuur 7A), wat overeenkomt met een [K +] o van ongeveer 2,8 mm, een waarde in de buurt van de [K +] van de ACSF gebruikt ( 2,5 mM). Bath toepassing van 0,5 mM glutamaat gedurende 10 seconden leidde tot een reversibele verhoging [K +] o ongeveer 4 mM, gevolgd door een onderschrijding hieronder basislijn bedrage van ~ 0,7 mM (Figuur 7A). Verlaging van de glutamaat concentratie 0,4, 0,3 en 0,2 mM leidde tot een overeenkomstige vermindering van de amplitude van zowel de tijdelijke toename en undershoot in [K +] o (Figuur 7A). OAD / 53.058 / 53058fig7.jpg &quot;/&gt; Figuur 7. Extracellulaire kalium transiënten in respons op stimulerende activiteit. (A) [K +] o transiënten, bestaande uit een stijging gevolgd door een onderschrijding onder de basislijn, geïnduceerd door bath toepassing van verschillende concentraties van glutamaat voor 10 seconden aangegeven. (B) Invloed van een perfusie met glutamaat receptor blokkers (CNQX, 100 uM, APV, 100 pM) en tetrodotoxine (TTX; 0,5 uM) met [K +] o transiënten opgewekt door bath toepassing van 0,5 mM glutamaat gedurende 10 sec. (C) Spontane [K +] o transiënten in aanwezigheid van 2 + 0 mg / BIC. Experimenten aangetoond in AC werden uitgevoerd met dubbelloops elektroden. Ter illustratie werden sporen glad gemaakt met een Sawitzky-Golay filter (breedte 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">Gelieve cl</a>ick hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Eerdere experimenten hebben aangetoond dat dergelijke glutamaat-geïnduceerde [K +] o-signalen worden niet significant gewijzigd tijdens het aanbrengen van TTX, en zijn dus in hoge mate onafhankelijk van de opening van spanningsafhankelijke natriumkanalen en neuronale actiepotentiaal generatie 15,16. Om de mechanismen achter de waargenomen [K +] o verandert in reactie op glutamaat studie werd toegepast glutamaat receptor blokkers, namelijk CNQX (100 uM, blocker van AMPA receptoren) en APV (100 uM, blocker van NMDA-receptoren) in aanwezigheid van TTX (0,5 uM). Bij het ​​bad perfusie met deze blokkers, glutamaat-geïnduceerde [K +] o veranderingen waren vrijwel afgeschaft, bevestigt hun afhankelijkheid van de opening van ionotrope glutamaat receptor kanalen zoals gerapporteerd vóór (bv 17; Figuur 7B). Om verder aan te tonen tHij relevantie van glutamaat excitatie voor het opwekken van extracellulair [K +] signalen werden segmenten geperfuseerd met nominaal Mg2 + -vrij zoutoplossing die 10 uM bicuculline methiodide (2+ 0 mg / BIC). Dit ontlast spanningsafhankelijke Mg2 + -blok van NMDA receptoren en dempt remming door het blokkeren van GABAA-receptoren, waardoor spontane terugkerende epileptische activiteit in het netwerk (bijvoorbeeld 18,19). Zoals verwacht 20, spontane, terugkerende [K +] o transiënten, ten bedrage van ongeveer 1,5 mm werden in 0mg 2+ / BIC zoutoplossing (Figuur 7C) gedetecteerd. Tussen deze reacties kleiner [K +] o transiënten met een gemiddelde amplitude van ongeveer 0,2 mM opgetreden (figuur 7C). In een tweede reeks experimenten, gebruikten we [Na +] -gevoelige micro-elektroden op [Na +] o veranderingen opgewekt door toepassing van vastglutamaat agonisten. Hier hebben we ook ten opzichte van de respons kenmerken van dubbelloops en concentrische micro-elektroden gebruik van twee verschillende toepassingsgebieden paradigma. [Na +] -gevoelige micro-elektroden werden geplaatst in de stratum radiatum op een diepte van ongeveer 50 uM. Na een stabiele basislijn was verkregen, werd de glutamaat agonist L-aspartaat toegepast per bad perfusie (10 mM, 120 sec, bad perfusie aan 2,5 ml / min). Zoals eerder 21 waargenomen, toepassing van aspartaat veroorzaakt een langzame daling van de [Na +] o met ongeveer 15 mm, dat ongeveer 5 minuten duurde en begon terug te vorderen van de uitgangswaarde (figuur 8A). Met name, terwijl de piek amplitudes en kinetiek van [Na +] o signalen bepaald door beide elektroden waren vrijwel identiek onder deze omstandigheden concentrische elektroden vertoonde een stabiele basislijn en een lager geluidsniveau (figuur 8A). Om de r te testen<html> esponse kenmerken van de verschillende elektroden onder een snellere toepassing paradigma we druk aangebracht glutamaat door een fijne glazen pipet gelegen in het stratum radiatum op een afstand van 20-40 urn van de punt van de ion-selectieve micro-elektrode. Zoals verwacht 21 toepassing van glutamaat (10 mM) gedurende 200 ms veroorzaakte een daling van de [Na +] o (Figuur 8B). De piek amplitudes van [Na +] o afname waren vergelijkbaar voor beide elektroden (dubbelloops: 4,5 - 13,5 mM, n = 14; concentrische: 2,0 - 19,1 mM, n = 15). In tegenstelling tot de met langzame bad perfusie (zie hierboven), niet alleen de signaal-ruisverhouding, maar ook het tijdsverloop van [Na +] o signalen gedetecteerd door de twee typen elektroden resultaten aanzienlijk verschilden. De gemiddelde tijd om de piek was 3,5 sec voor de dubbelloops en slechts 1,3 sec voor de concentrische micro-elektroden. ve_content &quot;&gt; Aldus tonen deze resultaten aan en bevestigen snellere reactie kinetiek concentrische vs. dubbelloops Na + selectieve micro-elektroden (zie figuur 6C en 8B), zoals werd opgemerkt voor Ca2 + en pH-selectieve tegenhangers 10 . In tegenstelling tot de vorige studie, waarin korte burst synaptische stimulatie werd uitgevoerd om snel synaptisch geïnduceerde ion transiënten roepen, was er slechts een tendens, maar geen significant verschil in gemiddelde piek amplitudes tussen concentrische en dubbelloops elektroden met onze applicatie paradigma. Dit was waarschijnlijk te wijten aan het feit dat de afstand van de aanvraag pipet uit de punt van de ion-selectieve micro-elektrode variëren met een factor twee (20-40 pm), en derhalve de maximale glutamaat concentratie aan het doelgebied niet hetzelfde in verschillende experimenten, belemmeren bestaande verschil piekamplituden. (A) Top sporen: Verandering in de voltage de verwijzing vaten (Vref) van een dubbelloops elektrode (zwarte gestippelde spoor) en een concentrische elektrode (grijze spoor) als reactie op veranderingen in het bad Na + concentratie ([Na +] b) zoals aangegeven. Merk op dat de spanning responsen van beide elektroden zijn vrijwel identiek. Bottom sporen: Veranderingen in de spanning van de Na + -potentiële (V Na +) van een dubbelloops elektrode (zwarte sporen) en een concentrische elektrode (grijze spoor) als reactie op veranderingen in [Na +] b. (B) Half-logaritmische grafieken van de [Na +] b ten opzichte van de V Na + van beide elektroden. Lineaire percelen van de gegevens blijkt dat er een helling van ongeveer 48 mV voor beide elektroden. (C) Reactie van de V Na + van een dubbelloops (zwart trace) en een concentrische elektrode (grijze spoor) om een snelle verandering in de [Na +] b van 152 mm tot 70 mm. Merk op dat de reactietijd van de concentrische elektrode significant faster. Ter illustratie werden sporen glad gemaakt met een Sawitzky-Golay filter (breedte 20). <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" /> Figuur 8: extracellulaire natrium transiënten zoals gedetecteerd door dubbelloops en concentrische elektroden. (A) Tijdelijke veranderingen in Vref en [Na +] o geïnduceerd door bad perfusie met 10 mM aspartaat voor 120 sec zoals aangegeven door de balk. De bovenste sporen vertonen een opname uitgevoerd met een dubbelloops elektrode, werden de lagere sporen opgenomen met een concentrische elektrode. (B) Tijdelijke veranderingen in Vref en [Na +] o geïnduceerd door plaatselijke drukuitoefening met 10 mM glutamaat gedurende 0,2 seconde, zoals aangegeven door de pijlpunt. De bovenste sporen vertonen een opname uitgevoerd met een dubbelloops elektrode, werden de lagere sporen opgenomen met een concentrische elektrode.Gestippelde rode lijnen geven lineaire aanvallen van de periode tussen het begin van het signaal naar zijn maximum. Merk op dat de reactietijd van de concentrische elektrode aanzienlijk sneller onder deze voorwaarde. Ter illustratie, werden sporen glad met een Sawitzky-Golay filter (breedte 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

We demonstreren de fabricage, kalibratie en eigenschappen van twee soorten ionen-selectieve micro-elektroden (dubbel-gerand en concentrisch) voor het meten van ionenconcentraties in hersenweefsel. Deze worden vervolgens gebruikt in de muis hippocampale plak voorbereiding om te laten zien dat exciterende activiteit zowel extracellulaire kalium- als natriumconcentraties verandert.

Dubbelloops en concentrische micro-elektroden voor het meten van extracellulaire Ion Signalen in hersenweefsel

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren en analyseren van ionendynamiek in de extracellulaire ruimte van hersenweefsel. De meting van iontransiënten wordt uitgevoerd met behulp van ionselectieve micro-elektroden, die kunnen worden vervaardigd op basis van een double-barreled of concentrisch ontwerp. Als eerste stap worden de micro-elektroden gekalibreerd in het experimentele bad.Vervolgens worden de elektroden in de acute hippocampale coupes van muizen geplaatst voor registratie; om extracellulaire ionverschuivingen op te wekken, wordt de neurotransmitter glutamaat of een glutamaatagonist toegediend. Glutamaat bindt aan en opent ionotrope receptoren bij de postsynaptische spines, wat leidt tot een instroom van natrium in de cellen en een uitstroom van kalium uit de cellen. Dit resulteert uiteindelijk in een afname van het extracellulaire natrium en een toename van het extracellulaire kalium, die worden gedetecteerd door de ionselectieve microelektroden.Deze methode wordt gebruikt om de regulatie van extracellulaire ionen en door activiteit geïnduceerde ijzer-transiënten in de hersenen te bestuderen. Hier beschrijven we de preparatie en kalibratie van twee typen ionselectieve micro-elektroden. We laten zien hoe deze kunnen worden ingezet in acute hersenplakjes om veranderingen in extracellulair kalium of natrium te meten als reactie op de toediening van neurotransmitters.De procedure wordt gedemonstreerd door Nicole Hark en Simon voor mijn laboratorium. Bereid ter voorbereiding van deze procedure een geboorde silicaatglascapillair met filament voor die gebruikt zal worden voor de iongevoelige barrel, en een andere voor de latere referentiebarrel. Gebruik vervolgens twee-componentenlijm of een klein stripje aluminiumfolie om de lange en korte capillair aan beide uiteinden aan elkaar te bevestigen.Verhit de dubbele capillair in een oven bij 60 °C gedurende één uur om resterend vocht te verwijderen. Bewaar de elektroden daarna in een desiccator tot gebruik. Plaats de dubbele capillair gecentreerd in een verticale puller met een revolverklem. Gebruik een klem om elongatie van de capillair te voorkomen.Houd de spoel voorzichtig vast totdat het glas zacht genoeg is om een horizontale rotatie van het revolvermechanisme mogelijk te maken. Draai na afkoeling 180 graden en verwijder de mechanische breuk. Pas een tweede verhittingsprotocol toe om de capillair uit te trekken, resulterend in twee scherpe dubbele capillairen.De tipdiameter van de dubbele capillair moet ongeveer één micron zijn. Vul nu het referentievat tot aan de tip met gedestilleerd water om kolonisatie te voorkomen. Plaats bij de volgende procedure een dubbele capillair met de tip naar boven op een speciaal vervaardigde houder.Plaats deze houder vervolgens op de wijdmondfles met het voorverwarmde HMDS en incubeer gedurende 70 minuten. Breng de capillair daarna over naar een metalen standaard. Plaats deze vervolgens gedurende twee uur in de voorverwarmde oven om beide buizen na kolonisatie te drogen; bewaar de capillair droog in de desiccator tot gebruik.Bereid op de dag van het experiment de ionselectieve elektrode voor door de punt van de gesiliconiseerde huls te vullen met twee tot drie µL van de ionselectieve sensor. Vul de huls vervolgens aan met 100 mM natriumchloride voor een natriumgevoelige micro-elektrode of 100 mM kaliumchloride-zoutoplossing voor een kaliumgevoelige micro-elektrode. Wees voorzichtig dat er tijdens deze procedure geen extra luchtbellen worden geïntroduceerd.Als de ionisatie succesvol is en de sensor correct is gevuld, moet het sensoroppervlak verschijnen als een duidelijk zichtbaar concaaf oppervlak tegen de backfill. Vul vervolgens het referentiekanaal, voeg daarna de gechloreerde zilverdraden in beide vaten in en verzegel elk vat met tandheelkundige was. Trek bij deze procedure een capillair van twee millimeter in de horizontale trekker om een korte taps toelopende vorm en een tipdiameter van vier micron te verkrijgen.Vul de gesiliconiseerde capillair vlak voor gebruik met 0,2 µL sensor. Trek voor de bereiding van de binnenste capillair een capillair met een kleine diameter zodanig dat er twee capillairen ontstaan met lange taps en scherpe punten. Vul deze vervolgens met 100 mM natriumchloride of 100 mM kaliumchloride zoutoplossing.Plaats de gevulde sensor en de met zoutoplossing gevulde capillairen direct in lijn met elkaar op een op maat gemaakte stopper van dekglasplaatjes. Voeg de kleinere capillair gedeeltelijk in de grotere capillair in. Fixeer vervolgens de capillairen op een ander dekglasplaatje.Breng de capillairen met behulp van boetseerklei over naar de tafel van een microscoop en visualiseer deze bij een 100x vergroting. Schuif de buitenste capillair met behulp van een glazen staafje dat is bevestigd aan een micromanipulator langzaam over de binnenste capillair, totdat de afstand tussen de uiteinden ongeveer vijf micron bedraagt. Fixeer het open uiteinde van de buitenste capillair aan de binnenste capillair met tandheelkundige was en voeg zilverdraad in.Om de referentie-elektrode voor te bereiden, trekt u een capillair met filament in een verticale trekker, gooit u de bovenste pipet weg, opent u vervolgens het onderste klemstuk en tilt u de onderste pipet ongeveer vijf millimeter op. Sluit het klemstuk opnieuw en til het op totdat de punt van de onderste elektrode zich ongeveer vijf millimeter boven de verwarmingsspiraal bevindt. Verwarm vervolgens de spiraal en gebruik een pincet om de punt ongeveer 45 graden opzij te buigen.Buig het opnieuw met ongeveer min 45 graden om de punt weer parallel aan de hoofdschacht te richten. Vul vervolgens het referentievat met heaps gebufferde zoutoplossing. Plaats er een verzilverde koperdraad in en verzegel het vat met tandheelkundige was.Bevestig in deze stap zowel de iongevoelige elektrode als de referentie-elektrode aan micromanipulatoren en breng deze naar beneden in een experimentele kamer die wordt geperfuseerd met A CSF. Verbind onder de stereomicroscoop de gechloreerde zilverdraden met de respectievelijke ingangen van de headstage van de differentiële versterker. Bepaal vervolgens de elektrodeweerstanden.Stel daarna de spanningssignalen in op nul en start de opname voor kalibratie. Nadat een stabiele basislijn is verkregen, wordt overgeschakeld naar de zoutoplossing die gedefinieerde concentraties van het te meten ion bevat. Plaats nu een 250 micron dikke hippocampusslice in de experimentele kamer en fixeer deze met een raster.Laat de gekalibreerde ionselectieve micro-elektrode zakken tot op het oppervlak van het slice. Breng de elektrode vervolgens nog ongeveer 50 microns verder naar beneden in het stratum radiatum van de CA1-regio. Om een transmitteragonist toe te dienen, vult u de applicatiepipet met 0,5 millimolair glutamaat.Bevestig de pipet aan een micromanipulator en koppel deze aan een apparaat voor druktoediening. Laat de applicatiepipet vervolgens in het weefsel zakken en plaats deze voorzichtig in de nabijheid van de punt van de ionselectieve micro-elektrode. Start de druktoediening bij 40 millibars.Hier wordt de verandering in spanning van de referentiebarrels van een dubbel-barrel elektrode en een concentrische elektrode getoond als reactie op veranderingen in de natriumconcentratie van het bad. En dit zijn de veranderingen in de spanning van het natriumpotentieel van een dubbel-barrel elektrode en een concentrische elektrode als reactie op veranderingen in de natriumconcentratie van het bad. Deze figuur toont de half-logaritmische plot van de natriumconcentratie van het bad tegenover de spanning van het natriumpotentieel van beide elektroden.De lineaire grafieken tonen een helling van ongeveer 48 millivolt voor beide elektroden. Hier is de respons van een dubbelkanaals electrode en een concentrische electrode op een snelle verandering in het bad. Natriumconcentratie van 152 millimolair naar 70 millimolair.Let op dat de responstijd van de concentrische elektrode aanzienlijk sneller is. Deze figuur toont de extracellulaire natriumtransiënt zoals gedetecteerd door dubbelwandige en concentrische elektroden; transiënte veranderingen in de spanning van de referentiebuisjes en de extracellulaire natriumconcentratie werden geïnduceerd door badperfusie met 10 millimol aspartaat gedurende 120 seconden, zoals aangegeven door de balk. En in deze figuur werden transiënte veranderingen in de spanning van de referentiebuisjes en de extracellulaire natriumconcentratie geïnduceerd door lokale druktoediening met 10 millimol glutamaat gedurende 0,2 seconden.Let op dat de responstijd van de conale elektrode onder deze conditie aanzienlijk sneller is. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om in gedachten te houden dat een correcte polijsting de cruciale stap is voor de succesvolle productie van ijzerselectieve micro-elektroden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u deze elektroden bereidt en gebruikt voor de detectie van extracellulair ijzer, transient in hersenweefsel.

double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Iontoforese van neurale agonisten en antagonisten tijdens...

Productie en gebruik van Piggy-back Multibarrel Elektroden voor<em&gt; In vivo</em&gt; Farmacologische Manipulaties van neurale responsies

This video demonstrates how to characterize the extracellular space in a brain slice by using ion-selective and iontophoresis microelectrodes to measure and compare electrical signals. This process helps determine the space's volume fraction and degree of twisting.

Characterizing Extracellular Space in a Brain Slice Using Ion-Selective and Iontophoresis Microelectrodes

Hier maken we een glazen pipette met twee functies: remming van diepe hersenstructuren door micro-injecties van geneesmiddelen en real-time monitoring van hun effecten door gelijktijdige elektrofysiologische opnames.

Gelijktijdig Elektrofysiologische opname en Micro-injecties van remmende middelen in de knaagdierhersenen

Transporters in celmembranen maken differentiële segregatie van ionen over celmembranen of cellagen mogelijk en spelen een cruciale rol tijdens weefselfysiologie, herstel en pathologie. We beschrijven de ion-selectieve zelfrefererende micro-elektrode die de meting van specifieke ionfluxen bij enkele cellen en weefsels in vivo mogelijk maakt.

Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek

We presenteren methoden voor de constructie van elektroden om gelijktijdig extracellulaire neurale activiteit op te nemen en meerdere neuroactieve stoffen in de buurt van de opnameplaatsen bij wakkere muizen vrij te geven. Deze techniek maakt de gedetailleerde analyse van veronderstelde lokale synaptische input naar de belangrijke neuron mogelijk.

Extracellulaire van neuronale activiteit Gecombineerd met Microiontophoretic Toepassing van neuroactive stoffen in Awake Muizen

Kalium ionen bijdragen tot de rustpotentiaal membraan van cellen en extracellulaire K+ concentratie is een cruciale regulator van cellulaire prikkelbaarheid. We beschrijven hoe te maken, te kalibreren en te gebruiken monopolaire K+-selectieve microelectrodes. Deze elektroden, kunt de meting van elektrisch evoked K+ concentratie dynamiek in volwassen hippocampal plakjes.

Maken, testen en het gebruik van kalium-Ion selectieve Microelectrodes in weefsel plakjes van volwassen hersenen

Hier beschrijven we een methode voor in vivo microdialysis analyseren aspartaat en glutamaat release in de ventrale hippocampus voor epileptische en niet-epileptische rats, in combinatie met EEG-opnames. Extracellulair concentraties aspartaat of glutamaat kunnen worden gecorreleerd met de verschillende fasen van de ziekte.

Microdialysis van Excitatory aminozuren tijdens EEG opnames in vrij bewegende ratten

Dit protocol heeft tot doel om aan te tonen hoe te in vitro micro-elektrode-arrays combineren met microfluidic apparaten voor het bestuderen van de actiepotentiaal transmissie in neuronale culturen. Data-analyse, namelijk de opsporing en karakterisering van teeltmateriaal van de actie potentieel, is uitgevoerd met behulp van een nieuwe geavanceerde, nog gebruikersvriendelijk en vrij beschikbaar zijn, computationele gereedschap.

Interfacing Microfluidics met micro-elektrode Arrays voor het bestuderen van de neuronale communicatie- en axonale signaal vermeerdering

Dit protocol beschrijft een procedure voor het construeren van koolstofvezel micro-elektrolectrode arrays voor chronische en acute in vivo elektrofysiologische opnames bij muizen(Mus musculus)en fretten(Mustela putorius furo) uit meerdere hersengebieden. Elke stap, na de aankoop van ruwe koolstofvezels voor micro-elektrode array implantatie, wordt in detail beschreven, met de nadruk op micro-elektrode array constructie.

Constructie en implementatie van koolstofvezel micro-elektrode arrays voor chronische en acute in vivo opnames

Het huidige protocol beschrijft de constructie van op maat gemaakte micro-elektrode arrays om lokale veldpotentialen in vivo van meerdere hersenstructuren tegelijkertijd vast te leggen.

Constructie van lokale veldpotentiaal micro-elektroden voor in vivo opnames van meerdere hersenstructuren tegelijkertijd

Een goedkoop elektro-encefalografisch registratiesysteem in combinatie met een millimetergrote spoel wordt voorgesteld om transcraniële magnetische stimulatie van het muizenbrein in vivo aan te sturen. Met behulp van conventionele schroefelektroden met een op maat gemaakt, flexibel, multi-elektrode arraysubstraat, kan multi-site opname worden uitgevoerd vanuit het muizenbrein als reactie op transcraniële magnetische stimulatie.

Goedkoop elektro-encefalografisch opnamesysteem gecombineerd met een millimetergrote spoel om het muizenbrein in vivo transcraniaal te stimuleren

Leer hoe je ion-selectieve micro-elektroden fabriceert en calibreert voor het meten van extracellulaire kalium- en natriumconcentraties in acute muizenhippocampus-snedes. Deze methode helpt onderzoekers ion-dynamiek en neuronale signalering te bestuderen.

Dubbelloops en concentrische micro-elektroden voor het meten van extracellulaire Ion Signalen in hersenweefsel

Meer video's verkennen