Dubbelloops en concentrische micro-elektroden voor het meten van extracellulaire Ion Signalen in hersenweefsel

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren en analyseren van ionendynamiek in de extracellulaire ruimte van hersenweefsel. De meting van iontransiënten wordt uitgevoerd met behulp van ionselectieve micro-elektroden, die kunnen worden vervaardigd op basis van een double-barreled of concentrisch ontwerp. Als eerste stap worden de micro-elektroden gekalibreerd in het experimentele bad.

Vervolgens worden de elektroden in de acute hippocampale coupes van muizen geplaatst voor registratie; om extracellulaire ionverschuivingen op te wekken, wordt de neurotransmitter glutamaat of een glutamaatagonist toegediend. Glutamaat bindt aan en opent ionotrope receptoren bij de postsynaptische spines, wat leidt tot een instroom van natrium in de cellen en een uitstroom van kalium uit de cellen. Dit resulteert uiteindelijk in een afname van het extracellulaire natrium en een toename van het extracellulaire kalium, die worden gedetecteerd door de ionselectieve microelektroden.

Deze methode wordt gebruikt om de regulatie van extracellulaire ionen en door activiteit geïnduceerde ijzer-transiënten in de hersenen te bestuderen. Hier beschrijven we de preparatie en kalibratie van twee typen ionselectieve micro-elektroden. We laten zien hoe deze kunnen worden ingezet in acute hersenplakjes om veranderingen in extracellulair kalium of natrium te meten als reactie op de toediening van neurotransmitters.

De procedure wordt gedemonstreerd door Nicole Hark en Simon voor mijn laboratorium. Bereid ter voorbereiding van deze procedure een geboorde silicaatglascapillair met filament voor die gebruikt zal worden voor de iongevoelige barrel, en een andere voor de latere referentiebarrel. Gebruik vervolgens twee-componentenlijm of een klein stripje aluminiumfolie om de lange en korte capillair aan beide uiteinden aan elkaar te bevestigen.

Verhit de dubbele capillair in een oven bij 60 °C gedurende één uur om resterend vocht te verwijderen. Bewaar de elektroden daarna in een desiccator tot gebruik. Plaats de dubbele capillair gecentreerd in een verticale puller met een revolverklem. Gebruik een klem om elongatie van de capillair te voorkomen.

Houd de spoel voorzichtig vast totdat het glas zacht genoeg is om een horizontale rotatie van het revolvermechanisme mogelijk te maken. Draai na afkoeling 180 graden en verwijder de mechanische breuk. Pas een tweede verhittingsprotocol toe om de capillair uit te trekken, resulterend in twee scherpe dubbele capillairen.

De tipdiameter van de dubbele capillair moet ongeveer één micron zijn. Vul nu het referentievat tot aan de tip met gedestilleerd water om kolonisatie te voorkomen. Plaats bij de volgende procedure een dubbele capillair met de tip naar boven op een speciaal vervaardigde houder.

Plaats deze houder vervolgens op de wijdmondfles met het voorverwarmde HMDS en incubeer gedurende 70 minuten. Breng de capillair daarna over naar een metalen standaard. Plaats deze vervolgens gedurende twee uur in de voorverwarmde oven om beide buizen na kolonisatie te drogen; bewaar de capillair droog in de desiccator tot gebruik.

Bereid op de dag van het experiment de ionselectieve elektrode voor door de punt van de gesiliconiseerde huls te vullen met twee tot drie µL van de ionselectieve sensor. Vul de huls vervolgens aan met 100 mM natriumchloride voor een natriumgevoelige micro-elektrode of 100 mM kaliumchloride-zoutoplossing voor een kaliumgevoelige micro-elektrode. Wees voorzichtig dat er tijdens deze procedure geen extra luchtbellen worden geïntroduceerd.

Als de ionisatie succesvol is en de sensor correct is gevuld, moet het sensoroppervlak verschijnen als een duidelijk zichtbaar concaaf oppervlak tegen de backfill. Vul vervolgens het referentiekanaal, voeg daarna de gechloreerde zilverdraden in beide vaten in en verzegel elk vat met tandheelkundige was. Trek bij deze procedure een capillair van twee millimeter in de horizontale trekker om een korte taps toelopende vorm en een tipdiameter van vier micron te verkrijgen.

Vul de gesiliconiseerde capillair vlak voor gebruik met 0,2 µL sensor. Trek voor de bereiding van de binnenste capillair een capillair met een kleine diameter zodanig dat er twee capillairen ontstaan met lange taps en scherpe punten. Vul deze vervolgens met 100 mM natriumchloride of 100 mM kaliumchloride zoutoplossing.

Plaats de gevulde sensor en de met zoutoplossing gevulde capillairen direct in lijn met elkaar op een op maat gemaakte stopper van dekglasplaatjes. Voeg de kleinere capillair gedeeltelijk in de grotere capillair in. Fixeer vervolgens de capillairen op een ander dekglasplaatje.

Breng de capillairen met behulp van boetseerklei over naar de tafel van een microscoop en visualiseer deze bij een 100x vergroting. Schuif de buitenste capillair met behulp van een glazen staafje dat is bevestigd aan een micromanipulator langzaam over de binnenste capillair, totdat de afstand tussen de uiteinden ongeveer vijf micron bedraagt. Fixeer het open uiteinde van de buitenste capillair aan de binnenste capillair met tandheelkundige was en voeg zilverdraad in.

Om de referentie-elektrode voor te bereiden, trekt u een capillair met filament in een verticale trekker, gooit u de bovenste pipet weg, opent u vervolgens het onderste klemstuk en tilt u de onderste pipet ongeveer vijf millimeter op. Sluit het klemstuk opnieuw en til het op totdat de punt van de onderste elektrode zich ongeveer vijf millimeter boven de verwarmingsspiraal bevindt. Verwarm vervolgens de spiraal en gebruik een pincet om de punt ongeveer 45 graden opzij te buigen.

Buig het opnieuw met ongeveer min 45 graden om de punt weer parallel aan de hoofdschacht te richten. Vul vervolgens het referentievat met heaps gebufferde zoutoplossing. Plaats er een verzilverde koperdraad in en verzegel het vat met tandheelkundige was.

Bevestig in deze stap zowel de iongevoelige elektrode als de referentie-elektrode aan micromanipulatoren en breng deze naar beneden in een experimentele kamer die wordt geperfuseerd met A CSF. Verbind onder de stereomicroscoop de gechloreerde zilverdraden met de respectievelijke ingangen van de headstage van de differentiële versterker. Bepaal vervolgens de elektrodeweerstanden.

Stel daarna de spanningssignalen in op nul en start de opname voor kalibratie. Nadat een stabiele basislijn is verkregen, wordt overgeschakeld naar de zoutoplossing die gedefinieerde concentraties van het te meten ion bevat. Plaats nu een 250 micron dikke hippocampusslice in de experimentele kamer en fixeer deze met een raster.

Laat de gekalibreerde ionselectieve micro-elektrode zakken tot op het oppervlak van het slice. Breng de elektrode vervolgens nog ongeveer 50 microns verder naar beneden in het stratum radiatum van de CA1-regio. Om een transmitteragonist toe te dienen, vult u de applicatiepipet met 0,5 millimolair glutamaat.

Bevestig de pipet aan een micromanipulator en koppel deze aan een apparaat voor druktoediening. Laat de applicatiepipet vervolgens in het weefsel zakken en plaats deze voorzichtig in de nabijheid van de punt van de ionselectieve micro-elektrode. Start de druktoediening bij 40 millibars.

Hier wordt de verandering in spanning van de referentiebarrels van een dubbel-barrel elektrode en een concentrische elektrode getoond als reactie op veranderingen in de natriumconcentratie van het bad. En dit zijn de veranderingen in de spanning van het natriumpotentieel van een dubbel-barrel elektrode en een concentrische elektrode als reactie op veranderingen in de natriumconcentratie van het bad. Deze figuur toont de half-logaritmische plot van de natriumconcentratie van het bad tegenover de spanning van het natriumpotentieel van beide elektroden.

De lineaire grafieken tonen een helling van ongeveer 48 millivolt voor beide elektroden. Hier is de respons van een dubbelkanaals electrode en een concentrische electrode op een snelle verandering in het bad. Natriumconcentratie van 152 millimolair naar 70 millimolair.

Let op dat de responstijd van de concentrische elektrode aanzienlijk sneller is. Deze figuur toont de extracellulaire natriumtransiënt zoals gedetecteerd door dubbelwandige en concentrische elektroden; transiënte veranderingen in de spanning van de referentiebuisjes en de extracellulaire natriumconcentratie werden geïnduceerd door badperfusie met 10 millimol aspartaat gedurende 120 seconden, zoals aangegeven door de balk. En in deze figuur werden transiënte veranderingen in de spanning van de referentiebuisjes en de extracellulaire natriumconcentratie geïnduceerd door lokale druktoediening met 10 millimol glutamaat gedurende 0,2 seconden.

Let op dat de responstijd van de conale elektrode onder deze conditie aanzienlijk sneller is. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om in gedachten te houden dat een correcte polijsting de cruciale stap is voor de succesvolle productie van ijzerselectieve micro-elektroden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u deze elektroden bereidt en gebruikt voor de detectie van extracellulair ijzer, transient in hersenweefsel.