Name: Generatie en kwantitatieve analyse van Pulsed Low Frequency Ultrasound om de Sonic Gevoeligheid van Onbehandelde Bepaal en behandeld neoplastische cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Leer hoe je pulsed low frequency ultrasound toepast op humane leukemiecellen om sonische schade te beoordelen, met of zonder methyl beta cyclodextrin. Deze methode helpt onderzoekers nieuwe therapeutische strategieën voor kanker te ontwikkelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de staf van de workshop van het Syracuse University Department of Physics bedanken voor hun innovatieve bijstand in zaken die betrekking hebben op ons systeem ontwerp.

1. Reinigen Cell Sonifier System <ol><li> Reinig de unie tussen de hoorn en converter met chloroform en een uitstrijkje van katoen. Breng een lichte olie of minerale olie aan op de schroefdraad van de hoorn en de converter om opbouw van metalen spaanders, roest, of oxidatie verder te verwijderen. </li><li> Gebruik chloroform om de olie en andere verontreinigingen uit de vereniging na het afvegen van de draden met olie. </li></ol> 2. weer in elkaar zetten van de Cel Sonifier en het opzetten van het systeem <ol><li> Bevestig de hoorn op de converter. Om goed koppel het systeem verwijdert de verzamelde converter en hoorn uit de beker samenstel door aan de hoorn uit de bodem van de beker (Figuur 2A). Plaats een slot sleutel in één van de drie kleine gaten bij de bovenkant van de converter (Figuur 2B). Vervolgens plaatst u een momentsleutel uitgerust met de voet een ½ inch kraai op het langwerpige deel van de hoorn (Figuur 2B). Draai in standaard klok mee, totdat het draaimoment meterstanden 54,23 N. m (figuur 2C), het koppel door de fabrikant aanbevolen 16. Monteer de aangescherpte converter en hoorn terug in de beker, en monteer de hoorn en converter om een ​​ring stand in een rechtopstaande positie. Bevestig de omvormer op de voeding voordat u het systeem voor de experimentele pulse dosering. </li><li> Stel het systeem voor de pulse doseren met behulp van 1 sec van sonicatie met 1 seconde tussen de pulsen. Verschillende dosering modellen kunnen worden gebruikt voor andere experimentele omstandigheden. Vele variabelen, zoals water volume en hoorn diameter zou mogelijk wijzigingen in deze dosering. De hiervoor genoemde celmonster types, volume en concentratie empirische gegevens en observatie heeft geleid tot het formuleren van dit doseringsschema. </li><li> Stel het systeem om de gewenste amplitude. In dit protocol gebruikt 33% en 50% amplitude om volledige celvernietiging, die het effect aantonen van sonosensit, te voorkomenizers moeilijk of onmogelijk te meten. LET OP: In deze studie wordt de amplitudes worden vergeleken. </li></ol> 3. Het beoordelen System Intensity en functie <ol><li> Houd de cavitatie meter van 1,5 cm, de hoogte van het monster sonicatie. Let op de metingen te beoordelen of het systeem draait op een verwachte intensiteit. Met behulp van het huidige systeem en waterstanden, verwachten tussen 100-110 W / cm 2 voor 33% amplitude en 115-125 W / cm 2 voor 50% amplitude. Let op de cavitatie meterstanden van de meter display dat cavitatie energie vertegenwoordigt in W / cm 2 direct. Neem deze metingen aan het oppervlak van het water en zodat er geen luchtbellen aan de voorzijde van de meter probe. OPMERKING: Het is belangrijk op te merken dat deze procedures worden gedaan zonder de dop voor de toegang boven de hoorn. Zij behoeven niet te worden herhaald na elke sonicatie. Integendeel, ze moeten alleen worden uitgevoerd na het reinigen, monteren, en het opzetten van het systeem. </li&gt; <li> Plaats de hydrofoon in een monsterflesje met 12,5 ml water om de hydrofoonsensor volledig onderdompelen. Hang de hydrofoon met behulp van de ring staan. </li><li> Bevestig de hydrofoon met de ingang van de oscilloscoop om pulsgolf beoordelen. Onderzoek de oscilloscoop voor een duidelijke sinus, zoals afwijkende golven van de frequentie van het systeem kan veranderen van de specificaties van de fabrikant. Zowel de cavitatie meter en oscilloscoop geven leesfrequentie, maar alleen de oscilloscoop afwijkende golven die wijzen op een defecte systeem of onjuiste samenstel tonen. </li></ol> 4. Voorbereiding van de Cellen en Medium <ol><li> Bereid het medium met 240 ml Iscove&#39;s gemodificeerd Dubecco&#39;s medium (IMDM) en 50 ml foetaal runderserum. Niet ontdooien foetaal runderserum in een warmwaterbad, zoals snelle stijging van de temperatuur kan leiden tot een compromis in het serum stabiliteit. Combineer 240 gl gentamicine 50 mg / ml en 5 ml penicilline/ Streptomycine 100x in een standaard kweekkolf, en aan het medium. Bewaar het medium bij 4 ° C. </li><li> Zaad U937 cellen op ~ 4 x 10 4 cellen / ml in een 25 cm2 kolf het bereide medium. Beoordelen cellen voor de concentratie en de levensvatbaarheid gebruik van een TC20 celgetalmeter en trypaanblauw uitsluiting door het plaatsen van 15-20 ul van cellen en 15-20 pi trypan blauw in een micro-centrifugebuis en het mengen van de inhoud. Pipette15-20 ul van dit mengsel in een TC20 sampling glijbaan, en initiëren tellingen door het plaatsen van de dia in de TC20 cel teller. </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2, en controleer op levensvatbaarheid van de cellen met behulp van trypan blauw uitsluiting en de TC20 cel teller. Wanneer de cellen bij een geschikte concentratie en / of zijn behandeld met sonosensitizers gedurende een geschikte tijd, overdracht 3 ml cellen uit de kolf naar een 20 ml glazen scintillatieflesje. In dit protocol, groei U937 cellen gedurende 48 uur en daarna behandel met 0,5, 1,of 5 mM MeβCD gedurende 30 minuten voldoende afbrekende de cholesterol van de cellen voorafgaand aan sonicatie. </li></ol> 5. Cell Sonicatie <ol><li> Degas gedeïoniseerd, gedestilleerd water met behulp van een vacuüm en Buchner kolf. Breng het water aan de beker hoorn en vult tot een niveau van 15 mm boven de bovenzijde van de hoorn. De sonicatie werkwijze veroorzaakt verdere ontgassing van het water gedurende enkele minuten, en kan leiden tot inconsistenties in de loop van het experiment als het systeem niet wordt uitgevoerd voorafgaand aan sonicatie proeven. Daarom lopen het systeem voor de ~ 7 min voorafgaand aan sonicatie proeven. </li><li> Bevestig de scintillatieflesje met daarin de cellen aan de vasthoudinrichting. Maak dan de vasthoudinrichting aan de bovenkant van de beker hoorn en ingesteld op een hoogte van 15 mm vanaf de bovenkant van de hoorn (aan het wateroppervlak met het schuifmechanisme). </li><li> De cellen worden typisch gesonificeerd met behulp van drie 1 sec pulsen van ultrageluid met 1 sec tussenruimte tussen elk van deze pulsen. Hiervoorprotocol, ultrasone trillingen cellen bij 33% en 50% amplitude met de bovenvermelde pulse dosering. </li></ol> 6. Beoordeling van Cellen voor Schade Post-ultrasoonapparaat <ol><li> Beoordelen van de geschorste cellen voor schade en levensvatbaarheid met trypanblauw en de TC20 cel teller. Daarnaast analyseert het monster met behulp van een Z2 teller. Voor Z2 teller analyse, pipet 100 ul celsuspensie in 20 ml isotone zoutoplossing (200: 1 verhouding). Voorafgaand aan analyse, spoelen de opening van de Z2 deeltjesanalysator ten minste tweemaal met een isotone zoutoplossing. Plaats de Z2 monster in de teller houder, en het platform om het diafragma te verhogen voor het begin telt. </li><li> Verwerven van de gegevens van de TC20 en Z2-teller met behulp van software van de fabrikant. Analyseer deze gegevens voor beschadiging van cellen, de levensvatbaarheid, en de oprichting van cellulaire puin van sonicatie. </li></ol> 7. XTT Assay aan levensvatbaarheid van de cellen bepalen en mitochondriale activiteit van de behandelde U937 en THP1 Cellen <ol><li> Prior de XTT testen groeien U937 en THP1 cellen onder dezelfde omstandigheden. Voorbehandelen cellen met dezelfde concentratie reeks MeβCD gedurende 30 minuten voorafgaand aan sonicatie. Gebruik dezelfde ultrasone parameters als hiervoor, behalve dat de cellen nu gesonificeerd met behulp van diverse 1-3 een seconde pulsen op afstand één seconde uit elkaar om verschillende schade XTT kit evaluatiesysteem opzetten. Opmerking: Veel van deze stappen worden direct uit de XTT-kit manual genomen en worden alleen herhaald voor het gemak van geïnteresseerde laboratoria. </li><li> Verzamel cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 10 min. Resuspendeer celpellet in het groeimedium eerder beschreven. Resuspendeer cellen op ~ 1 x 10 5 cellen / ml. Zaad U937 cellen bij 100 gl per putje in een platte-bodem 96-putjes microtiterplaat in drievoud, en herhaal voor THP1 cellen met een afzonderlijke 96-wells plaat. Omvat 3 controleputjes met 100 ul compleet groeimedium alleen als blanco absorptiemetingen. Vervolgens incubeer de geënte platen voor 24 uur. </li><li> Ontdooi twee aliquots van de XTT-reagens en de activering reagens bij 37 ° C vóór gebruik. Swirl porties zachtjes tot heldere oplossingen worden verkregen. Voeg 0,1 ml van de activatie reagens 5,0 ml van de XTT-reagens, die voldoende geactiveerde XTT oplossing voor een 96-well microtiter plate assay vormt. Doe hetzelfde voor de andere plaat. </li><li> Voeg 50 ul van de geactiveerde XTT-oplossing in elk putje. Zet de plaat om de celkweek CO 2 incubator gedurende 2 uur. Schud de plaat voorzichtig na de incubatietijd in de positieve putten gelijkmatig te verdelen de oranje kleur. Meet de absorptie van de test wells met de cellen en de blanco achtergrond controleputjes bij een golflengte van 450-500 nm met behulp van een microtiter plaatlezer. </li><li> Ofwel nul de microtiter plaatlezer met de blanco controle wells of aftrekken de gemiddelde waarde van de specifieke resultaten. Meet de absorptie van alle wells assay weer een wavelength tussen 630-690 nm en aftrekken van de waarden van 450-500 nm verkregen waarden. Opmerking: Deze tweede absorptie bepaling helpt niet-specifieke lezingen uit de test resultaten te elimineren. De XTT assay werd vier maal herhaald voor beide cellijnen. </li></ol>

<ol><li>Trendowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+sonodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The promise of sonodynamic therapy.</a> Cancer Metastasis Rev. 33 (1), 143-160 (2014).</li>
<li>Semins, M. J., Trock, B. J., Matlaga, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+shock+wave+rate+on+the+outcome+of+shock+wave+lithotripsy%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">The effect of shock wave rate on the outcome of shock wave lithotripsy: A meta-analysis.</a> J Urol. 179 (1), 194-197 (2008).</li>
<li>Pace, K. T., Ghiculete, D., Harju, M., Honey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shock+Wave+Lithotripsy+at+60+or+120+shocks+per+minute%3A+A+randomized%2C+double-blind+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Shock Wave Lithotripsy at 60 or 120 shocks per minute: A randomized, double-blind trial.</a> J Urol. 174 (2), 595-599 (2005).</li>
<li>McClain, P. D., Lange, J. N., Assimos, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+shock+wave+lithotripsy%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">Optimizing shock wave lithotripsy: a comprehensive review.</a> Rev Urol. 15 (2), 49-60 (2013).</li>
<li>Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healing+sound%3A+the+use+of+ultrasound+in+drug+delivery+and+other+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications.</a> Nat Rev Drug Discov. 4 (3), 255-260 (2005).</li>
<li>Cordeiro, E. R., Cathelineau, X., Thüroff, S., Marberger, M., Crouzet, S., de la Rosette, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-intensity+focused+ultrasound+%28HIFU%29+for+definitive+treatment+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">High-intensity focused ultrasound (HIFU) for definitive treatment of prostate cancer.</a> BJU Int. 110 (9), 1228-1242 (2012).</li>
<li>Li, P. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-intensity+focused+ultrasound+treatment+for+patients+with+unresectable+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+Pancreat+Dis+Int%22%5BJournal%5D)">High-intensity focused ultrasound treatment for patients with unresectable pancreatic cancer.</a> Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 11 (6), 655-660 (2012).</li>
<li>Xiaoping, L., Leizhen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+of+high+intensity+focused+ultrasound+%28HIFU%29+for+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Hyperthermia%22%5BJournal%5D)">Advances of high intensity focused ultrasound (HIFU) for pancreatic cancer.</a> Int J Hyperthermia. 29 (7), 678-682 (2013).</li>
<li>Lukka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-intensity+focused+ultrasound+for+prostate+cancer%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oncol+%28R+Coll+Radiol%29%22%5BJournal%5D)">High-intensity focused ultrasound for prostate cancer: a systematic review.</a> Clin Oncol (R Coll Radiol). 23 (2), 117-127 (2011).</li>
<li>So, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIFU+ablation+is+not+a+proven+standard+treatment+for+localized+prostate+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Can+Urol+Assoc+J%22%5BJournal%5D)">HIFU ablation is not a proven standard treatment for localized prostate cancer).</a> Can Urol Assoc J. 5 (6), 424-426 (2011).</li>
<li>Crouzet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-gland+ablation+of+localized+prostate+cancer+with+high-intensity+focused+ultrasound%3A+oncologic+outcomes+and+morbidity+in+1002+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Whole-gland ablation of localized prostate cancer with high-intensity focused ultrasound: oncologic outcomes and morbidity in 1002 patients.</a> Eur Urol. 65 (5), 907-914 (2014).</li>
<li>Tezel, A., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+inertial+cavitation+bubbles+with+stratum+corneum+lipid+bilayers+during+low-frequency+sonophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Interactions of inertial cavitation bubbles with stratum corneum lipid bilayers during low-frequency sonophoresis.</a> Biophys J. 85, 3502-3512 (2003).</li>
<li>Tang, H., Wang, C. C., Blankschtein, D., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+the+role+of+cavitation+in+low-frequency+ultrasound-mediated+transdermal+drug+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">An investigation of the role of cavitation in low-frequency ultrasound-mediated transdermal drug transport.</a> Pharm Res. 19 (8), 1160-1169 (2002).</li>
<li>Ueda, H., Mutoh, M., Seki, T., Kobayashi, D., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+cavitation+as+an+enhancing+mechanism+of+low-frequency+sonophoresis+for+transdermal+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Acoustic cavitation as an enhancing mechanism of low-frequency sonophoresis for transdermal drug delivery.</a> Biol Pharm Bull. 32 (5), 916-920 (2009).</li>
<li>Trendowski, M., Yu, G., Wong, Y., Aquafondata, C., Christen, T., Fondy, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real+deal%3A+Using+cytochalasin+B+in+sonodynamic+therapy+to+preferentially+damage+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">The real deal: Using cytochalasin B in sonodynamic therapy to preferentially damage leukemia cells.</a> Anticancer Res. 34 (5), 2195-2202 (2014).</li>
<li>Sonifier Cell Disrupter Model SLPeEDP. , Branson Ultrasonics Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.emersonindustrial.com/en-US/documentcenter/BransonUltrasonics/Sonifier_Brochure.pdf">http://www.emersonindustrial.com/en-US/documentcenter/BransonUltrasonics/Sonifier_Brochure.pdf</a> (2010).</li>
<li>Lagneaux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic+low-energy+treatment%3A+A+novel+approach+to+induce+apoptosis+in+human+leukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic low-energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells.</a> Exp Hematol. 30 (11), 1293-1301 (2002).</li>
<li>Krasovitskia, B., Frenkelb, V., Shohama, S., Kimmel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembrane+cavitation+as+a+unifying+mechanism+for+ultrasound-induced+bioeffects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Intramembrane cavitation as a unifying mechanism for ultrasound-induced bioeffects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (8), 3258-3263 (2011).</li>
<li>Sundaram, J., Mellein, B. R., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+analysis+of+ultrasound-induced+permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes.</a> Biophys J. 84 (5), 3087-3101 (2003).</li>
<li>Mizrahi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+intensity+ultrasound+perturbs+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Low intensity ultrasound perturbs cytoskeleton dynamics.</a> Soft Matter. 8 (8), 2438-2443 (2012).</li>
<li>Chen, X., Leow, R. S., Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-site+sonoporation+disrupts+actin+cytoskeleton+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Single-site sonoporation disrupts actin cytoskeleton organization.</a> J R Soc Interface. 11 (95), 20140071(2014).</li>
<li>Trendowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+enlargement+of+leukemia+cells+using+cytoskeletal-directed+agents+and+cell+cycle+growth+control+parameters+to+induce+sensitivity+to+low+frequency+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Preferential enlargement of leukemia cells using cytoskeletal-directed agents and cell cycle growth control parameters to induce sensitivity to low frequency ultrasound.</a> Cancer Lett. In press, (2015).</li>
<li>Dumontet, C., Sikic, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+and+resistance+to+antitubulin+agents%3A+Microtubule+dynamics%2C+drug+transport%2C+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents: Microtubule dynamics, drug transport, and cell death.</a> J Clin Oncol. 17 (3), 1061-1070 (1999).</li>
<li>Verrills, N. M., Kavallaris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+targeting+of+tubulin-binding+agents%3A+lessons+from+drug+resistance+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Improving the targeting of tubulin-binding agents: lessons from drug resistance studies.</a> Curr Pharm Des. 11 (13), 1719-1733 (2005).</li>
<li>Trendowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inherent+metastasis+of+leukaemia+and+its+exploitation+by+sonodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">The inherent metastasis of leukaemia and its exploitation by sonodynamic therapy.</a> Crit Rev Oncol Hematol. In press, (2014).</li>
<li>Trendowski, M., Wong, V., Wellington, K., Hatfield, S., Fondy, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerated+doses+in+zebrafish+of+cytochalasins+and+jasplakinolide+for+comparison+with+tolerated+doses+in+mice+in+the+evaluation+of+pre-clinical+activity+of+microfilament-directed+agents+in+tumor+model+systems+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Tolerated doses in zebrafish of cytochalasins and jasplakinolide for comparison with tolerated doses in mice in the evaluation of pre-clinical activity of microfilament-directed agents in tumor model systems in vivo.</a> In Vivo. 28 (6), 1021-1031 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Om optimale resultaten te bereiken, moet bijzondere zorg worden genomen om zorgvuldig te positioneren het monster en het reinigen van de converter-hoorn unie. De plaatsing van het monster in de hoorn is belangrijk voor het verkrijgen van consistente celdestructie, het veranderen van de afstand tussen de hoorn de akoestische foci wijzigen en derhalve de energie het monster bloot te wijzigen. De akoestische energie in de beker hoorn kan worden toegewezen met de cavitatie meter om de positie van maximale cavitatie vinden. Bovendien, de cavitatie meter, samen met de oscilloscoop zijn essentieel voor het bepalen van de geluidsintensiteit de cellen worden blootgesteld, en de homogeniteit van de golfvorm. Daarom dienen deze instrumenten worden gebruikt om problemen te ontdekken met het systeem, en te bepalen welke problemen kunnen nodig zijn om systeeminstabiliteit corrigeren. Zoals eerder vermeld, kan de laagfrequente systeem gedurende het experiment als niet gedraaid treden verder ontgast waterenkele minuten voorafgaand aan sonicatie proeven. Deze eerste run moet worden uitgevoerd om een ​​relatief ontgast sonicatie medium en dus consistente resultaten tijdens de experimenten opleveren. Bovendien moeten de cellen niet gesoniceerd op of nabij het maximum amplitude bij de beoordeling van de werkzaamheid van sonosensitizers, als ware omvang van sensibilisatie moeilijk te beoordelen zijn. Met 33% amplitude over het 40 kHz-systeem een ideale instelling waarbij produceert aanzienlijke schade, maar biedt sonosensitizers voldoende ruimte om de werkzaamheid aan te tonen, zoals aangetoond met MeβCD tegen U937 en THP1 cellen (figuur 7). Deze gegevens bevestigen ook dat MeβCD sensibiliseert meerdere leukemie lijnen laagfrequente ultrageluid op een dosisafhankelijke wijze. Er zijn een aantal experimenten uitgevoerd met een hogere frequentie in het bereik van 0,75 MHz tot 8 MHz die tekenen van intramembrane cavitatiebubbels door middel van sonicatie 17-19 gegenereerd zijn. Echter, VRAGEnS nog met betrekking tot het exacte mechanisme van door ultrageluid geïnduceerde cellyse 18 blijven. We hebben een verband aangetoond tussen fluïdiseren het cytoskelet en verhoogde gevoeligheid sonic middels laagfrequente ultrageluid 15, een verschijnsel blijkt uit andere laboratoria 20, 21. Verder hebben we vastgesteld dat de gloeidraad verstoren middelen zoals cytochalasine B potentiëren ultrasone gevoeligheid in meerdere leukemie lijnen, maar niet hHSCs of leukocyten 22, hetgeen suggereert dat remming van actine polymerisatie kan een sonosensitizing mechanisme van bijzonder belang. We hebben ook waargenomen dat vincristine, een microtubule-verstorende middel dat tubulinepolymerisatie 23, 24 remt, aanzienlijk verhoogt de ultrasone gevoeligheid van verschillende types leukemie in vitro waaronder acute myeloïde leukemie, chronische myeloïde leukemie en acute lymfatische leukemie. Daarentegen-cytoskelet gerichte middelen die cytoskelet componenten stabiliseren (paclitaxel eend jasplakinolide) lijken cellen resistent tegen sonicatie, weerspiegeld door de lagere tarieven van cellysis 22 te maken. Tezamen ondersteunen deze gegevens de hypothese dat het cytoskelet componenten van neoplastische cellen fluïdiserende inderdaad een belangrijke factor bij het ​​vergroten van de effectiviteit van SDT 25. De onderhavige studie toont ook aan dat cholesterol depletie andere methode om verder te versterken de ultrasone gevoeligheid van neoplastische cellen, MeβCD behandelde U937 cellen aanzienlijk gevoelig zijn voor 40 kHz ultrageluid kan zijn. Terwijl onze sonicatie protocollen aanzienlijke antineoplastische activiteit in vitro hebben aangetoond, is de huidige methode voor werk dat in cultuur kleine vertebrate modellen die kunnen passen in de flesjes voor ultrasoonapparaat zijn. We hebben aangetoond dat zebravis veilig worden gesonificeerd met behulp van gepulseerde lage ultrasone trillingen (20 kHz) en dat de tolerantie voor chemotherapeutische middelen kwantitatief vergelijkbaardoses getolereerd door knaagdiermodellen 26, wat suggereert dat tumordragende zebravis worden gebruikt vooronderzoek de in vivo antineoplastische activiteit van deze protocols evalueren. Niettemin toedienen chemotherapeutische middelen voorafgaand aan sonicatie van Zoogdiermodellen gerapporteerd in de 1 MHz, en dergelijke protocollen kan waarschijnlijk worden uitgebreid tot lage frequenties ultrageluid, en cholesterol kunnen aantasten en cytoskelet gerichte middelen bevatten. Potentiële klinische toepassingen van deze vorm van SDT kunnen extracorporele bloed sonicatie waarin taxanen intraveneus toegediend (iv) voorafgaand aan het bloed worden verwijderd ultrasoonapparaat 25 omvatten. Deze methode verwijdert mogelijke geluidsschermen&#39;s van menselijke anatomie, en kunnen een effectieve manier om leukemische ontploffing, alsook metastasen beschadigen van vaste tumoren. Het is ook mogelijk dat cholesterol-aantasten en cytoskelet gerichte middelen kunnenworden gebruikt HIFU protocollen die reeds in de kliniek onderzocht in een poging om de werkzaamheid van deze behandelingsmodaliteit te verbeteren. De in deze studie beschreven methoden zijn in staat van de beoordeling van de waarde van de potentiële sonosensitizers, en verder het systeem verfijning kan dit hulpprogramma verbeteren. Er zijn echter vele variabelen te overwegen bij het gebruik van dergelijke ultrasone inrichtingen, inclusief voeding kwaliteit, akoestische foci en variaties tussen converters. Daarom zal toekomstig onderzoek zich richten op het visualiseren van de geluidsgolven en het begrijpen van hun invloed op de resultaten. SDT heeft aangetoond dat cellysis in vitro te versterken en kan blijken klinisch haalbaar als meer in vivo data in zoogdierlijke modellen verkregen worden. Experimenten om andere potentieel bruikbare kenmerken van kwaadaardige cellen, en verschillende gecombineerde modaliteiten waarbij meerdere agentia en ultrageluid verder in ons laboratorium.

Ultrasound verwijst naar elke oscillerende geluidsdrukgolf met een frequentie hoger dan de bovengrens van het menselijk oor capaciteit (~ 20 kHz) 1. Laagfrequente ultrageluid in de 20-60 kHz is gebruikt in het laboratorium voor de opwekking van emulsies, voorbereiding celmonsters voor nucleïnezuurextractie voor weefselontwrichting, en voor verschillende andere tests. Het nut van laagfrequente ultrageluid is ook uitgebreid om de industriële omgeving voor het lassen, het reinigen diverse materialen, en materialen verwerken. In de handel verkrijgbare echografie generatoren komen frequenties variërend 18-60 kHz, en full-scale wattages van 100-1200 W. Hoewel ultrasound lang gebruikt in de klinische setting voor diagnostische beeldvorming, is toegepast als therapeutische modaliteit onlangs. Echografie ≥1 MHz in staat is veilig verstoren urinewegen (nierstenen) en gal calculi (stenen in the galblaas of de lever) bij patiënten met symptomen 2,3 verminderen. Deze benadering bekend als extracorporale schokgolf lithotripsie (ESWL) wordt nu algemeen toegepast in de kliniek (meer dan een miljoen patiënten per jaar behandeld met ESWL in de Verenigde Staten alleen 4), en biedt een modaliteit waarmee op niet-invasieve breken met calculi minimale bijkomende schade door het gebruik van uitwendig aangelegde, geconcentreerd, hoge intensiteit akoestische pulsen 2-4. Door de unieke directe afschuifkrachten, alsmede cavitatiebellen gegenereerd door een hoge intensiteit ultrageluid, zijn deze methodieken in kankertherapie onderzocht voor de behandeling van castratieresistente prostaatcarcinoom en pancreas adenocarcinoom in een benadering bekend als high intensity focused ultrasound (HIFU ) 5-8. Op een wijze vergelijkbaar met ESWL, HIFU gebruikt meerdere ultrageluidbundels en richt ze op een geselecteerde concentratiegebied aan temperaturen van 60 ° C of hig genererenhaar door het gebruik van akoestische energie, coagulatieve necrose induceren in het doelweefsel 5. Hoewel andere modaliteiten thermische ablatie momenteel bestaan ​​(radiofrequente ablatie en microgolf ablatie), HIFU biedt een duidelijk voordeel ten opzichte van deze methoden, dat is de enige niet-invasieve hyperthermisch modaliteit 5. HIFU heeft bereikt gemengde resultaten in de kliniek en is momenteel alleen beschikbaar in klinische studies 8-11. Niettemin hebben het beperkte succes dat heeft bereikt, en de veelbelovende in vivo data verkregen van preklinische zoogdieren modellen van het potentieel van ultrageluid in de behandeling van kanker aangetoond. In een poging om HIFU verbeteren hebben onderzoekers geprobeerd om ultrageluid te combineren met geschikte antineoplastische middelen een vorm van sonochemotherapy genereren. Sonodynamic therapie (SDT) is een veelbelovende nieuwe behandeling modaliteit heeft aangetoond indrukwekkende antineoplastische activiteit in zowel in vitro en <em&gt; In vivo studies 1. Het is aangetoond dat ultrageluid voorkeur schade kwaadaardige cellen op basis van het verschil grootte tussen dergelijke cellen en die van normale histologie 1,5. SDT bevat gespecialiseerde agenten bekend als sonosensitizers om de omvang van de preferentiële schade die wordt uitgeoefend door ultrageluid tegen neoplastische cellen te verhogen. Terwijl therapeutische toepassingen van SDT eerder zijn onderzocht, ultrasone systemen maken gebruik doorgaans hogere frequentie ultrageluid (≥1 MHz), en de gevolgen van lage kHz ultrasone trillingen is nog niet volledig onderzocht. Lagere frequenties van ultrageluid worden vaak bedreven in het produceren inertiale cavitatie, een verschijnsel dat resulteert in de vernietiging van de cellen door de snelle instorten microbellen induceren fysicochemische schade 14/12. Dit verschil in de vorming van inertiale cavitatie tussen MHz en lage kHz ultrasound is toegeschreven aan het feit dat lagere golffrequenties mogelijk microbelletjesis meer tijd om te groeien door verholpen diffusie in de uitbreiding halve cyclus, dus het produceren van meer gewelddadige instortingen tijdens de volgende compressie halve cyclus 12. We hebben eerder aangetoond dat U937 humane monocytische leukemie cellen zijn gevoelig voor lage frequenties ultrageluid (23,5 kHz) en dat deze gevoeligheid sterk kan worden verhoogd door toepassing van taxanen die het cytoskelet 15 verstoren. Verder hebben we aangetoond dat cellen worden beschadigd bij voorkeur op basis van grootte, met grotere cellen vertonen hogere ultrasone gevoeligheid. Daarnaast normale humane hematopoïetische stamcellen (hHSCs) en leukocyten bij vergelijkbare celgrootte zijn veel beter bestand tegen sonicatie dan hun tegenhangers neoplastische 15, voorlopig suggereert dat lage frequentie ultrageluid kan worden gebruikt om bij voorkeur beschadigen kwaadaardige cellen in de aanwezigheid van normaal weefsel. Om verder te onderzoeken van de unieke propschappen laagfrequent ultrageluid voor potentiële therapeutische toepassing hebben we het schoonmaken en stabilisatie procedures ontwikkeld om de effectiviteit en de betrouwbaarheid van één van de huidige sonicatie leiden en zo de Branson Model SLPe 150 W, 40 kHz Cell Disrupter, uitgerust met een 20 mm hoorn aangebracht in een 7,62 cm cup. Verder zijn we in staat om nauwkeurige sample cavitatie energieën en samenhangende golfvormen en amplitude binnen het 40 kHz met een cavitatie meter en oscilloscoop hydrofoon was bepaald. Door raffinage en systematiseren onze protocollen, zijn we in staat om de consistentie te vestigen in onze experimentele sonicaties, waardoor we kwantitatief vergelijken de sonische gevoeligheden van neoplastische en normale cellen van verschillende histogenetic geslachten geweest. Ons protocol voor de 40 kHz-systeem wordt gepresenteerd in uitgebreide detail om voor geïnteresseerde laboratoria in staat zijn van het uitvoeren van vergelijkbare experimenten, en onze bevindingen van de antineoplastische effecten uitgelokt door te evaluerenlage frequentie echografie. Verder wordt ingegaan op de dosisafhankelijke effecten van methyl-β-cyclodextrine (MeβCD Figuur 1), een cholesterol-afbrekende middel, op een verbeterde ultrasone gevoeligheid van U937 en THP1 humane monocytische leukemiecellen.

<table><tbody><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 &amp; 25mM Hepes&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12440079</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B Solution&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x Solution&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12105</td><td></td></tr><tr><td>Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>101-063-726</td><td>sonication device</td></tr><tr><td>Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000 ml Beaker Heater</td><td>Brisk Heat</td><td>SDCJF1A-GBH1000-1</td><td>heater used for temperature control</td></tr><tr><td>Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp&reg; Software</td><td>Beckman-Coulter</td><td>6605700</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin 50 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml &amp; 25 ml Vented Culture Flasks</td><td>Fisher Scientific</td><td>353082</td><td></td></tr><tr><td>Lonza L-Glutamine 200 mM 0.85% NaCl</td><td>Lonza</td><td>17-605C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Vials and caps</td><td>Beckman-Coulter</td><td>&nbsp;A35473</td><td></td></tr><tr><td>AccuJet Pro Auto Pipet&nbsp;</td><td>BrandTech Scientific</td><td>26330</td><td></td></tr><tr><td>USA Scientific 10 ml Disposable Serological Pipets</td><td>USA Scientific</td><td>1071-0810</td><td></td></tr><tr><td>Tip One 100 &#956;l and 1,000 &#956;l Filter Tips</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1840, 1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>100 &#956;l Micropipette&nbsp;</td><td>Wheaton</td><td>851164</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &#956;l Micropipette</td><td>Wheaton</td><td>851168</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Dual Chamber Counting Slides</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0015</td><td></td></tr><tr><td>Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator</td><td>Forma Scientific</td><td>3131</td><td></td></tr><tr><td>Tektronix&nbsp; DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>DPO2002B</td><td>used to measure the ultrasonic waveform</td></tr><tr><td>PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter</td><td>PPB Megasonics</td><td>PB-500&nbsp;</td><td>used to assess the sound intensity in W/cm2</td></tr><tr><td>Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone</td><td>Teledyne</td><td>TC4013-1&nbsp;</td><td>connects to the oscilloscope&nbsp;</td></tr><tr><td>Wheaton 250 ml Flasks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z364827</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Glass Scintillation Vials&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z190527</td><td></td></tr><tr><td>Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>N/A</td><td>diluent for Z2 counter</td></tr><tr><td>Chloroform 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof Anhydrous&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XTT Cell Proliferation Assay Kit</td><td>ATCC</td><td>30-1011K</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Microplate Reader</td><td>Cole-Palmer</td><td>&nbsp;EW-13055-54</td><td></td></tr><tr><td>U937 Human Monocytic Leukemia Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL&shy;1593.2</td><td></td></tr><tr><td>THP1 Human Monocytic Leukemia Cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie en kwantitatieve analyse van pulsed low frequency ultrasound om de sonic gevoeligheid van onbehandelde bepaal en behandeld neoplastische cellen

Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

Ultrageluid met lage frequentie in het bereik van 20 tot 60 kHz is een nieuwe fysische modaliteit waarmee selectieve cellyse en dood in neoplastische cellen kan worden geïnduceerd. Bovendien kan deze methode worden gebruikt in combinatie met gespecialiseerde middelen, bekend als sonosensitisatoren, om de mate van preferentiële schade die door ultrageluid wordt uitgeoefend op neoplastische cellen te vergroten, een benadering die wordt aangeduid als sonodynamische therapie (SDT). De methodologie voor het genereren en toepassen van ultrageluid met lage frequentie in een preklinische in vitro omgeving wordt gepresenteerd om aan te tonen dat reproduceerbare celdestructie kan worden bereikt om de effecten van sonicatie op neoplastische en normale cellen te onderzoeken en te vergelijken. Dit biedt een middel om op een betrouwbare manier neoplastische cellen te soniceren op een niveau van consistentie dat vereist is voor preklinische therapeutische beoordeling. Bovendien worden de effecten van cholesterolverlagende en cytoskelet-gerichte middelen op het versterken van de ultrasone gevoeligheid in neoplastische cellen besproken om mechanismen van actie te verduidelijken die bevorderlijk zijn voor sonochemotherapeutische benaderingen.

Stabiliteit van het systeem is van groot belang bij het verkrijgen van reproduceerbare en betrouwbare resultaten. De juiste torsie specificatie van 54,23 N. M bereikte goede koppeling van de transducer en sonotrode 2, met de consistentie van de golfvorm door middel van een oscilloscoop en hydrofoon (figuur 3A) wordt beoordeeld. Figuur 3B toont metingen in het monsterbuisje en Figuur 3C beoordeelt stabiliteit binnen de beker hoorn. Zoals verwacht, werd de amplitude enigszins verminderd als gevolg van wat energie wordt geabsorbeerd door de glazen. Echter, de golfvorm niet verstoord of vervormd in ofwel B paneel of C, die nodig zijn voor betrouwbare levering van sonische energie op het monster. Een golfvorm die niet worden weergegeven als een duidelijke enkelvoud sinus duidt op een defecte transducer of oneigenlijk setup. Dit wordt uitgedrukt in Figuur 3D waarbij meerdere afwijkende golven toont een duidelijke afwezigheid van een sinus, en een frequentie lezen geent verwacht met een goed functionerend systeem. De cavitatie meter gebruikt om de cavitatie-energie (figuur 4) te meten vonden de geluidsintensiteit tot 100-110 W / cm2 bij 33% amplitude, en 125-130 W / cm2 bij 50% amplitude. Zodra het 40 kHz-systeem op geschikte wijze geijkt en werd geassembleerd in zijn geheel (figuur 5), werd als betrouwbaar celvernietiging gemakkelijk bereikt, zoals bepaald door zowel de TC20 en Z2 tellers (figuur 6). Zoals verwacht, was uitgebreider celbeschadiging waargenomen in celpopulaties gesonificeerd bij 50%, in plaats van op 33% amplitude. Niettemin, 33% amplitude is bruikbaar als een startpunt om potentiële sonische effect van toegediende middelen te detecteren, aangezien het produceert zichtbare schade, maar laat ruimte voor meer schade wordt gedetecteerd wanneer middelen worden toegepast op de versterking van ultrasone gevoelige karakter ervan. Dit wordt aangetoond in figuur 7A, waarbij hetdosisafhankelijke effecten van MeβCD voor potentiëren de ultrasone gevoeligheid van U937 cellen worden gepresenteerd. Hoewel niet gesonificeerd MeβCD-behandelde cellen waren zeer vergelijkbaar in levensvatbaarheid niet gesonificeerd, onbehandelde cellen, de levensvatbaarheid sterk gedaald na drie pulsen van 1 seconde 40 kHz ultrasoon toegepast. Bovendien wordt de afname in levensvatbaarheid na sonicatie dosisafhankelijk te zijn, zoals 5 mM MeβCD produceerde de grootste daling in aantal cellen, gevolgd door 1 mM, en 0,5 mM MeβCD. Soortgelijke effecten op cellevensvatbaarheid en mitochondriale activiteit werden waargenomen bij zowel U937 en THP1 cellen die werden behandeld met variërende concentraties MeβCD vóór sonicatie, zoals gemeten met de XTT-kit (Figuur 7B). Hoewel THP1 cellen blijken iets sonic resistenter dan U937 cellen is, worden zowel menselijke leukemie leidingen beschadigd op een dosisafhankelijke wijze. Hogere concentraties van MeβCD en meer pulsen van ultrageluid produced de laagste reductie van XTT tot een oplosbaar, felgekleurde oranje derivaat zowel U937 en THP1 cellen, overeenkomend levensvatbaarheid van de cellen en mitochondriale activiteit verlagen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig1.jpg" /> Figuur 1. Moleculaire structuur van methyl- β-cyclodextrine. (A) volledige constructie van methyl-β-cyclodextrine (MeβCD). (B) MeβCD is een polymeer van zeven herhalingseenheden met een R groep hetzij H of CH3. Moleculaire Formule: C 56 H 98 O 35. Moleculair gewicht = 1.331,36. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig2.jpg" /> Figuur 2. Goed koppelmanchet de 40 kHz ultrasoundsysteem. (A) De claxon converter verwijderd uit de beker PRIof koppelmanchet. (B) Plaats de sleuf sleutel en momentsleutel op hun respectievelijke posities. (C) Breng 54,23 N. M van het koppel in een richting van de klok voordat opnieuw bevestigen van de hoorn en converter om de beker. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig3.jpg" /> Figuur 3. Gebruik van een oscilloscoop voor de golfvorm van het ultrasone systeem karakteriseren. (A) Een oscilloscoop met hydrofoon kan worden gebruikt om de amplitude en golfvorm consistentie evalueren. (B) een opname die met de kop boven de hoorn op 1,5 cm en gesteld op 33% amplitude. (C) De golfvorm hier afgebeeld is uit te lezen verworven wanneer de hydrofoon wordt geplaatst binnen de 20 ml glazen scintillatieflesje. Het flesje wordt gepositioneerd op 1,5 cm boven de hoorn en opnieuw vastgesteld op 33% amplitude. (D) Een oscilloscoop screenshot ofa-systeem met afwijkende frequenties zoals zou worden verwacht met een defecte systeem of onjuiste koppeling van de hoorn converter unie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig4.jpg" /> Figuur 4. Toepassing van een cavitatie meter om de geluidsintensiteit van het ultrasone systeem te karakteriseren. De cavitatie meter gezien hier wordt gebruikt om cavitatie te energie representeren in W / cm 2. Dit is een zeer belangrijk instrument om consistentie van energie ten opzichte van het monster. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig5.jpg" /> Figuur 5. Belangrijke onderdelen van de 40 kHz echo-systeem. De ultrasone systeem is compleet met kop hoorn getoond ( <strong&gt; A), verwarmingsinrichting (B), de module (C) en monster positioneringsmechanisme (D). Dit ontwerp zorgt voor een gemakkelijke plaatsing van het monster (E) boven de hoorn (F). <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig6.jpg" /> Figuur 6. Effect van verschillende amplitude van de ultrasone lysis van U937-cellen met de TC20 en Z2 tellers. Cellen werden gesoniceerd met 40 kHz cel dismembrator bij 33% amplitude (100-110 W / cm 2) of 50% amplitude (125-130 W / cm 2) met behulp van drie 1 sec pulsen van ultrageluid met 1 sec afstand tussen elke van deze pulsen. (A) Een screenshot van de teller Z2 software toont het effect van sonicatie op U937 cellen. (B) De gegevens van de TC20 teller werden in een grafiek opgesteld om de reproduceerbaarheid van de resultaten te tonens. Deze gegevens omvatten het totale en levende celtellingen, alsmede de trypan blue cellevensvatbaarheid geëvalueerd. Bars weerspiegelen de standaardafwijking van het gemiddelde (SEM) voor 4 onafhankelijke celpopulaties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig7.jpg" /> Figuur 7. Effect van methyl- β-cyclodextrine op potentiërende de ultrasone gevoeligheid van U937 en THP1 cellen. (A) U937-cellen werden behandeld met variërende concentraties van MeβCD gedurende 30 min voorafgaand aan wordt gesonificeerd bij 40 kHz ultrasound (105 W / cm 2 ) met behulp van drie 1 sec pulsen afstand 1 sec elkaar. Celpopulaties werden gegroepeerd in ≥12 um en ≥17 um. (B) U937 of THP1 cellen werden opnieuw behandeld met variërende concentrantsoen MeβCD gedurende 30 minuten alvorens te worden gesoniceerd met 40 kHz systeem met 1-3 pulsen van 1 seconde ultrasone afstand 1 sec elkaar. Levensvatbaarheid van de cellen en mitochondriale activiteit werden gemeten met de XTT-kit. 100 gl cellen per well in een platte-bodem 96-putjes microtiterplaat. De plaat werd gedurende 24 uur voorafgaande aan de toevoeging van XTT-oplossing. Cellen werden daarna gedurende nog eens 2 uur voor de golflengte werd gelezen. Bars weerspiegelen SEM voor 4 onafhankelijke celpopulaties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Selectieve schade aan menselijke leukemiecellen kan worden bereikt door middel van een nieuwe aanpak van het toepassen van laagfrequente echografie, zowel met als zonder chemotherapeutische voorbehandeling van leukemische en normale hematopoietische cellen.

Generatie en kwantitatieve analyse van Pulsed Low Frequency Ultrasound om de Sonic Gevoeligheid van Onbehandelde Bepaal en behandeld neoplastische cellen

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de effectiviteit en reproduceerbaarheid van gepulseerd, laagfrequent echografisch onderzoek te beoordelen bij het beschadigen van menselijke leukemiecelpopulaties in afwezigheid of aanwezigheid van een cholesterol-depleterend middel. Dit wordt bereikt door het sonicatiesysteem te reinigen en de stabiliteit ervan te evalueren. De menselijke leukemiecellen worden vervolgens gesonicateerd in afwezigheid en aanwezigheid van methyl-bèta-cyclodextrine.Vervolgens worden automatische celtellers gebruikt om de celviabiliteit en de effecten van sonicatie en cholesteroluitputting te beoordelen. De mitochondriale activiteit van leukemiecellen wordt geëvalueerd met een XTT-assay. Uiteindelijk suggereren de gegevens dat laagfrequent ultrageluid kan worden gebruikt om maligne cellen te beschadigen, wat wordt versterkt door het gebruik van een cholesteroluitputtend middel.Ons laboratorium is geïnteresseerd in sonadynamische therapie, een nieuwe therapeutische modaliteit die de antineoplastische effecten van echografie combineert met gespecialiseerde middelen om de effecten van geluid te versterken. Ons protocol beoordeelt de sonische gevoeligheid van zowel neoplastische als normale cellen om potentiële sonochemische benaderingen te bepalen die verdere preklinische onderzoek rechtvaardigen. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met de apparatuur die wordt gebruikt om de stabiliteit van het sonische systeem te beoordelen, aangezien het enige tijd kan kosten om te leren hoe deze apparaten optimaal kunnen worden toegepast.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de gebruikte reinigings- en stabilisatieprocedures voor het beoordelen van het sonicatiesysteem noodzakelijk zijn voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten. Gebruik vóór aanvang van een experiment chloroform en een wattenstaafje om de verbinding tussen de hoorn en de converter te reinigen. Breng vervolgens een lichte olie aan op de schroefdraad van de hoorn en de converter.Om eventuele metaalschilfers, roest of oxidatie-aanslag verder te verwijderen, reinig de verbinding vervolgens met meer chloroform om de olie en andere verontreinigingen te verwijderen en bevestig de hoorn opnieuw aan de converter. Om het systeem correct aan te draaien, trekt u de hoorn uit de onderkant van de beker en plaatst u een sleutelsleutel in een van de drie kleine gaatjes nabij de bovenkant van de converter. Positioneer nu een momentsleutel, voorzien van een half inch klauwvoet, op het gleufgedeelte van de hoorn en draai deze aan in de standaard rechtsomdraaiende richting totdat de momentmeter 39.99 foot pounds aangeeft.Plaats na het vastdraaien de converter en de hoorn terug in de beker en monteer de onderdelen in rechtopstaande positie op een ringstatief, sluit de converter opnieuw aan op de voeding en stel het systeem vervolgens in voor pulserende dosering. Gebruik één seconde sonicatie met één seconde tussen de pulsen, en stel het systeem daarna in op de gewenste amplitudes om de intensiteit en werking van het sauna Fire-systeem te beoordelen. Begin door de cavitatiemeter op 1,5 centimeter vast te houden, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen bellen aanwezig zijn aan het oppervlak van de meterprobe.Lees het scherm van de cavitatiemeter af om te bevestigen dat het systeem op de juiste intensiteit draait. Dompel vervolgens de hydrofoonsensor volledig onder in een monsterbuisje met 12,5 milliliters water en gebruik het statief om de hydrofoon op te hangen. Om de stabiliteit van de golfvormkarakteristieken te bevestigen, sluit u de hydrofoon aan op de ingang van de oscilloscoop en bevestigt u de aanwezigheid van een duidelijke sinusgolf, aangezien aberrante golven de frequentie van het systeem kunnen beïnvloeden.Om de cellen voor sonicatie voor te bereiden, worden ze eerst gezaaid in een kolf van 25 vierkante centimeter met vers bereid medium, tegen een dichtheid van vier keer 10⁴ cellen per milliliter. Nadat het aantal levensvatbare cellen is bepaald via trypan blue-exclusie, wordt de cultuur geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2 totdat de cultuur de gewenste concentratie heeft bereikt. Wanneer de cellen klaar zijn voor sonicatie, wordt een volume gedeïoniseerd gedestilleerd water ontgast met behulp van een vacuümpomp en een Büchnerkolf.Gebruik vervolgens het water om de cup horn te vullen tot 15 millimeter boven de bovenkant van de horn. Laat het systeem ongeveer zeven minuten draaien met het ontgaste water. Draag vervolgens drie milliliter cellen over naar een glazen scintillatiebuisje van 20 milliliter en bevestig het buisje aan de houder.Bevestig vervolgens de houder aan de bovenkant van de cup-hoorn en gebruik het schuifmechanisme om de houder op een hoogte van 15 millimeters boven de bovenkant van de hoorn bij het wateroppervlak in te stellen. Sonicate nu de cellen met drie pulsen ultrasoon geluid van één seconde, met een tussenpoos van één seconde tussen elke puls bij 33 en 50% amplitude, en beoordeel de celviabiliteit na sonicatie via trypaanblauw-uitsluiting. Om de celschade te beoordelen, spoelt u de opening van een Z2-deeltjesanalyser ten minste twee keer met isotoon zoutoplossing.Voeg vervolgens 100 µL van de gesoniceerde cellen toe aan 20 mL isotonische zoutoplossing en breng het celmonster over naar de houder van de teller. Til daarna het platform naar de opening en analyseer de celschade, levensvatbaarheid en het debris volgens de instructies van de fabrikant. Om de levensvatbaarheid van de gesoniceerde cellen via een XTT-assay te beoordelen, worden de cellen gesoniceerd met een bereik van één tot drie.Gebruik pulsen van één seconde met een tussenpoos van één seconde om een reeks schade te veroorzaken die met de XTT-kit kan worden beoordeeld; centrifugeer vervolgens de cellen en resuspendeer de pellets tot 1 × 10⁵ cellen per milliliter in vers bereid groeimedium. Zaai daarna 100 µL cellen per putje in individuele 96-wells microtiterplaten met een vlakke bodem en in triplo, inclusief drie controleputjes met enkel 100 µL volledig groeimedium voor blanco absorbantie-metingen.Incubeer de cellen gedurende 24 uur op de ochtend van de assay, draai aliquots van op 37 °C voorverwarmde XTT en activeringsreagentia voorzichtig tot de oplossingen helder zijn. Voeg vervolgens 0,1 ml van het activeringsreagens toe aan 5 ml Eloqua van het XTT-reagens. Voeg daarna 50 µL van de geactiveerde XTT-oplossing toe aan elke well van de geinoculeerde U 9 37- en THP 1-platen en plaats de cellen terug in de celkweekincubator.Schud de platen na twee uur voorzichtig om de oranje kleurstof in de positieve putjes gelijkmatig te verspreiden en meet de absorbentie met een microtiterplaatlezer tussen 450 en 500 nanometer. Meet tenslotte de absorbentie van alle assayputjes opnieuw, tussen 630 en 690 nanometer. Zoals verwacht wordt er uitgebreidere celschade waargenomen in de celpopulatie die is gesoneerd bij een amplitude van 50% dan bij 33%.Een amplitude van 33% maakt echter de detectie van verdere schade mogelijk wanneer reagentia worden toegepast. Zo werd in dit experiment geëvalueerd hoe de dosisafhankelijke effecten van het cholesterol-depleterende agens methyl-beta-cyclodextrine de ultrasone gevoeligheid van U 9 37-cellen versterken.Hoewel de cellen die niet met methyl-beta-cyclodextrine waren behandeld een vergelijkbare levensvatbaarheid vertoonden als de onbehandelde cellen, daalde de levensvatbaarheid aanzienlijk nadat drie pulsen van één seconde ultrasound van 40 kHz waren toegepast. Bovendien leek de afname in levensvatbaarheid na sonicatie dosisafhankelijk te zijn, aangezien vijf millimolair van het cholesterol-depletiemiddel de grootste daling in celgetal veroorzaakte, gevolgd door behandelingen met één millimolair en 0,5 millimolair methyl-beta-cyclodextrine, zoals beoordeeld via de XTT-assay. Hoewel de THP-1-cellen iets sonicatie-resistenter leken te zijn dan de U937-cellen, werden beide humane leukemie-cellijnen op een dosisafhankelijke wijze beschadigd.Daarnaast leidde de combinatie van hogere concentraties methyl-beta-cyclodextrine met een groter aantal ultrasone pulsen tot de laagste reductie van XTT tot een oplosbaar, helder oranje derivaat voor zowel de U 9 37- als de THP one-cellen, wat overeenkomt met een lagere cellevensvatbaarheid en mitochondriale activiteit voor beide cellijnen. Na deze procedure kunnen andere sonische sensibiliseringsmiddelen, zoals middelen die op het cytoskelet zijn gericht of reactieve zuurstofverbindingen produceren, worden beoordeeld op hun potentiering van de sonische gevoeligheid, om zo nieuwe therapeutische benaderingen vast te stellen die kunnen worden onderzocht op hun preklinische werkzaamheid. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de SON-gegevens die zijn verkregen van de TC- en Z two-tellers correct te organiseren, aangezien deze gedetailleerde informatie verslaan over de effectiviteit van het behandelprotocol die anders verloren kan gaan.Indien er geen logistiek schema wordt gebruikt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe laagfrequente ultrasone golven in combinatie met potentiële ano-sensitizers kunnen worden gebruikt in preklinische in vitro-modellen om hun potentiële therapeutische nut te beoordelen.

generation-quantitative-analysis-pulsed-low-frequency-ultrasound-to

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Insonation van microbellen is een veelbelovende strategie voor tumor ablatie op kortere gemiddelde akoestische bevoegdheden, alsmede voor de gerichte toediening van geneesmiddelen. Het doel van deze studie is het ontwikkelen van low duty cycle echografie pulserende strategieën en nanocarriers aan niet-thermische microvasculair ablatie en laadvermogen levering aan subcutane C6 glioma te maximaliseren.

Contrast Echografie doelgerichte behandeling van gliomen in Muizen via Drug-Bearing Nanodeeltje Levering en microvasculaire Ablation

Dit protocol beschrijft de stimulatie van de gekweekte fibroblasten met een lage-intensiteit gepulseerd ultrageluid, die focal adhesion vorming en Rac1 activering door het nabootsen van betrokkenheid van de transmembraan-receptor matrix, syndecan-4-drives. Deze benadering maakt het onderzoek van een succesvolle klinische techniek op cellulair niveau, waardoor het bieden van mogelijkheden voor verfijning van de therapie.

Inductie van Adhesie-afhankelijke signalen met behulp van lage-intensiteit ultrageluid

This video describes the selective damage of human leukemia cells by using low frequency ultrasound. This application of low frequency ultrasound in a preclinical in vitro condition demonstrates that cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on leukemia and normal cells.

Low Frequency Ultrasound Application: A Method to Determine the Effect of Sonication on Human Leukemia Cells

This article describes the protocol for XTT assay which is a colorimetric assay to assess cell viability and mitochondrial activity.

XTT Assay: A Colorimetric Assay to Assess Cell Viability and Mitochondrial Activity

Dit protocol beschrijft de toepassing van hoogfrequente ultrageluid (HFUS) voor imaging muizen cervicale lymfeknopen. Deze techniek optimaliseert visualisatie en kwantificatie van cervicale lymfeknopen morfologie, volume en de bloedstroom. Beeld-geleide biopsie van cervicale lymfeklieren en verwerking van lymfeweefsel voor histologische evaluatie wordt ook aangetoond.

Hoge-frequentie Ultrasound Imaging van de muis cervicale lymfeklieren

Tumorbehandelingsvelden (TTFields) zijn een effectieve anti-tumorbehandelingsmodaliteit die wordt geleverd via de continue, niet-invasieve toepassing van lage intensiteit, intermediaire frequentie, afwisselende elektrische velden. TTFields applicatie op cellijnen door gebruik te maken van een TTFields in vitro applicatiesysteem maakt het mogelijk de optimale frequentie te bepalen die leidt tot de hoogste reductie in celtellingen.

Het bepalen van de optimale frequentie voor remmende kankercellen gebruiken Tumor Behandeling Fields (TTFields)

Hier beschrijven we de techniek van de hoge frequentie echografie voor in vivo analyse van foetussen in muizen. Met deze methode kunt de opvolging van foetussen en de analyse van de placenta parameters evenals moederlijk en foetaal bloedstroom in de gehele zwangerschap.

Hoge frequentie echografie voor de analyse van de ontwikkeling van de foetus en placenta In Vivo

Low-Intensity Pulsed echografie stimulatie (LIPUS) is een modaliteit voor niet-invasieve mechanische stimulatie van endogene of gemanipuleerde cellen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie. In dit artikel wordt beschreven hoe implementeren van LIPUS om een epi-fluorescentie Microscoop en minimaliseren van akoestische impedantie mismatch langs het pad van de echografie om te voorkomen dat ongewenste mechanische artefacten.

Multiplexing gericht echografie stimulatie met fluorescentie microscopie

De bloed-hersenbarrière (BBB) kan tijdelijk worden verstoord met microbubble-gemedieerde gerichte echografie (FUS). Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor BBB-opening met hoge doorvoer in vivo met behulp van een modulair FUS-systeem dat toegankelijk is voor niet-echografie-experts.

Een high-throughput beeldgeleide stereotactische neuronavigatie en gericht echografiesysteem voor het openen van bloed - hersenbarrière bij knaagdieren

Het gepresenteerde experimentele protocol kan worden gebruikt om real-time metingen uit te voeren van cavitatieactiviteit in een celkweekapparaat met als doel onderzoek mogelijk te maken naar de voorwaarden die nodig zijn voor een succesvolle medicijnafgifte en/of andere bio-effecten.

Cavitatie verbeterde therapie bestuderen

Melanoom is een zeer agressieve ziekte die zich snel verspreidt naar andere organen. Dit protocol beschrijft de toepassing van ultra-hoogfrequente echografie, gekoppeld aan 3D-rendering, om het volume van de inguinale lymfeklieren in het Braf / Pten-muismodel van gemetastaseerd melanoom te bewaken.

Analyse van het lymfekliervolume door ultra-hoogfrequente echografie in het Braf / Pten genetisch gemanipuleerde muismodel van melanoom

Leer hoe je pulsed low frequency ultrasound toepast op humane leukemiecellen om sonische schade te beoordelen, met of zonder methyl beta cyclodextrin. Deze methode helpt onderzoekers nieuwe therapeutische strategieën voor kanker te ontwikkelen.

Generatie en kwantitatieve analyse van Pulsed Low Frequency Ultrasound om de Sonic Gevoeligheid van Onbehandelde Bepaal en behandeld neoplastische cellen (Video) | JoVE Journal

Generatie en kwantitatieve analyse van Pulsed Low Frequency Ultrasound om de Sonic Gevoeligheid van Onbehandelde Bepaal en behandeld neoplastische cellen

Meer video's verkennen