Gehakt Tissue in Compressed Collageen: A-cel met Biotransplant voor Single-geënsceneerde Reconstructieve Repair

Het algemene doel van de volgende procedure is het transplanteren van autoloog weefsel voor expansie tijdens reconstructieve chirurgie. Dit wordt bereikt door eerst een biopsie te nemen van het betreffende weefsel. Vervolgens wordt de biopsie fijngehakt en wordt een gecomprimeerd plastic polycaprolacton (PCL) collageen-autotransplantaat geconstrueerd.

De PCL en de autologe fijngehakte weefsels worden vervolgens geïntegreerd om het 3D-steunstructuur te creëren. We hebben een expansiesnelheid van één op zes gebruikt. Vervolgens wordt de steunstructuur teruggeplant in het subject.

Uiteindelijk kan de regeneratie van het autotransplantateweefsel worden beoordeeld via immunohistochemische analyse van de proliferatie en reorganisatie van de cellen binnen de scaffolds en gefijnmazde weefseldeeltjes. Deze methode zal worden gedemonstreerd in een diermodel, op de huid en op het urotheel. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de behandeling van ernstig misvormde weefsels of na trauma in gevallen waarin er een ernstig tekort aan weefsel is voor chirurgische reconstructie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals in vitro kweek, is dat deze methode als één enkele chirurgische ingreep kan worden uitgevoerd. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen van de weefselwinning tot de transplantatie onder steriele omstandigheden moeten worden uitgevoerd. Om een biopsie monster van een varkensblaas te verkrijgen, wordt de blaas eerst met de forceps vastgegrepen en wordt een gesteriliseerd meetlint gebruikt om de afmetingen van het weefsel te bepalen.

Gebruik vervolgens een gesteriliseerde pen om een ellipsvormige biopsie van twee bij één centimeter te markeren, met een beoogde expansiesnelheid van één tot zes. Excipeer daarna het gemarkeerde weefsel met een scalpel en plaats het blaasbiopsiemonster onder steriele omstandigheden in DMEM. Voor het winnen van een huidbiopsiemonster wordt een dermatome gebruikt om een monster van een partiële dikte van 0,3 millimeter te winnen.

Plaats het weefsel vervolgens in DMEM en dek het wondgebied af met een verband. Was daarna het blaasbiopt tweemaal met DMEM en breng het weefsel over naar een gesteriliseerde dissectieschaal, met de mucosa naar boven gericht. Fixeer één zijde van het monster met dissectiepennen aan de schaal en gebruik een fijne schaar en pincetten om het mucosale weefsel van de detrusorspier te scheiden.

Plaats vervolgens een hakapparaat op het slijmvlies en beweeg dit verticaal en horizontaal van het ene uiteinde van het weefsel naar het andere om gehakte weefselstukjes van 0,8 bij 0,8 millimeter te verkrijgen. Let erop dat het hakapparaat op het weefsel moet worden gedrukt terwijl u eroverheen beweegt. Om een gecomprimeerde collageen-autografts van kunststof voor te bereiden, voegt u eerst druppel voor druppel één normale natriumhydroxide toe aan 10X DMEM aangevuld met collageen type I totdat het medium van intens geel naar roze verandert.

Nadat een pH van 7,4 tot 8 is bevestigd, worden twee milliliter DMEM voorzichtig door de oplossing gemengd. Breng vervolgens ongeveer twee milliliter collageen aan in een putje van een rechthoekige stalen mal van 20x30x10 millimeter en incubeer het collageen gedurende tien minuten. Wanneer het collageen is gestold, wordt het juiste volume PCL-biomateriaal bovenop het gegelde collageen aangebracht en worden de resterende zes milliliter collageen over het PCL gegoten.

Plaats de mal voor nog eens 20 minuten terug in de incubator. Stapel vervolgens een dikke laag gazen pads op een steriel oppervlak. Plaats daarna een roestvrijstalen gaas met een dikte van 400 micron bovenop het gaas, gevolgd door een nylon gaasvel met een dikte van 110 micron.

Breng de collageengel voorzichtig over op het nylon gaas en verwijder voorzichtig de rechthoekige stalen mal. Breng het fijngehakte weefsel over op de collageen. Hierbij streven we naar een expansiesnelheid van één op zes.

Plaats vervolgens een nieuwe laag nylon gaas bovenop de collageengel en het weefsel, leg daarna een tweede stalen gaas op het nylon gaas en plaats daarop een belastingsplaat met een gewicht van minimaal 120 gram. Verwijder na vijf minuten het gewicht, de stalen gazen en het nylon van het autograft. Snijd voor de in vitro kweek van het autograft het uitgedunde construct eerst in stukken die klein genoeg zijn om in 12-wellplaten te passen.

Voeg vervolgens één milliliter keratinocytmedium toe aan elke put en incubeer de weefsels gedurende drie tot zes weken. Om een autotransplantaat met fijngehakte blaasmucosa naar een varkensblaas te transplanteren, bevochtig het transplantaat met DMEM. Bevestig vervolgens het construct aan het gezonde weefsel met fijne, lopende monofilament hechtingen.

Bevestig dat het transplantaat waterdicht is door de blaas via de verblijvende urinekatheter te vullen met zoutoplossing. Om een autotransplantaat met fijngehakte huidepidermis in een full-thickness wond te transplanteren, dient het transplantaat te worden bevochtigd met DMEM. Bevestig vervolgens het construct aan de bodem van de full-thickness huidwond met behulp van onderbroken hechtingen in de hoeken en in het midden van het autotransplantaat.

Bedek ten slotte de wond met een plastic verband om deze vochtig te houden. Zoals waargenomen in deze afbeelding van een gemalen huidautotransplantaat, kan de composiet biograft bestand zijn tegen vastpakken, hechten en chirurgische manipulatie. Immunohistochemie op verschillende tijdstippen tijdens de in vitro culture laat zien dat de cellen prolifereren, migreren en zich reorganiseren tot een continu epitheel met een microarchitectuur die typisch is voor het cel-fenotype.

Bijvoorbeeld, na twee weken is de cellaag op het oppervlak van het huidautotransplantaat ongeveer twee lagen dik. Rechts is het epitheel van de blaas na dezelfde cultuurperiode ongeveer acht lagen dik. Na vijf tot zes weken is het continue epitheel ongeveer acht tot tien cellagen dik in zowel de fijngehakte huidepitheel- als de fijngehakte blaasslijmvlies-autotransplantaten.

Vergeleken met weefselexpansie in vitro is deze methode snel, minder arbeidsintensief en vereist deze geen geavanceerde laboratoriumfaciliteiten. Bovendien zijn alle onderdelen FDA-goedgekeurd, waardoor ze kunnen worden gebruikt in een standaard chirurgische setting. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de gel, biotransplantaten en autologe weefsels onder steriele omstandigheden moeten worden voorbereid.

Naast deze procedure kunnen andere methoden, zoals in vitro-kweek van de cellen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over celproliferatie en -differentiatie te beantwoorden. Na de verdere ontwikkeling kan deze techniek de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van regeneratieve geneeskunde. Middels deze weg zouden we ernstige misvormingen van de huid of het urinair systeem kunnen behandelen met autologe, weefseltechnische transplantaten.