Name: Wijze van Studeren Palatal Fusion met statische Organ Cultuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: Leer een methode voor palatiumdissectie en statische orgaancultuur om gehemelteontwikkeling te bestuderen. Deze techniek maakt het mogelijk om geneesmiddelen te testen en fusieprocessen te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben geen erkenningen.

Alle procedures beschreven moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften voor het gebruik van gewervelde dieren, met inbegrip van de voorafgaande goedkeuring door de lokale Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Voorbereiding van ontleden Instruments en Cultuur Media <ol><li> VOORWAS alle instrumenten voor gebruik in dissectie met 3% waterstofperoxide en daarna autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min. Filter BGJb media met antibiotica en antimycotische oplossing om met een 0,22 pm porie-sized filter met afzuiging in een kap. </li></ol> 2. Voorbereiding van Cultuur Equipment <ol><li> Snijd membraanfilters van polycarbonaat dat de palatal organen zal ondersteunen in kleine driehoekjes, spray met 70% alcohol en laat ze drogen. Bereid Center-Well Organ Culture Dish (60x15 mm) door het plaatsen van een schone en gesteriliseerd gelijkzijdige driehoek-vormige draadrooster (20 mm) over de orgelcultuur plaat. Vul dan het goed met 1 ml van BGJB mediacultuur media. OPMERKING: De media moet voldoende zijn om het niveau van het rooster te bereiken zonder de smaakpapillen te dompelen. Plaats de filters membraan, glanzende zijde omlaag, boven op het rooster (3-4 membranen per raster) .Depending het experiment, kan de behandeling (eiwitten, antilichamen of remmers) worden toegevoegd aan de media </li></ol> 3. Mouse embryoteams en Voorbereiding voor Cultuur <ol><li> Met wild-type muis embryo&#39;s te verkrijgen, gebruik getimede 13,5 zwanger CD-1 muis genetische achtergrond stam. Reinig de dissectie met 70% ethanol. OPMERKING: Andere muizenstammen kunnen worden gebruikt. Wij geven de voorkeur CD-1 muizen, vanwege de grotere nest nummer. </li><li> Euthanaseren zwangere muizen op E13.5 DPC (dagen na de coïtus) met 5% Isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie aan de dood te verzekeren met behulp van goedgekeurde protocollen. </li><li> Spray 70% ethanol aan de ventrale buikoppervlak te voorkomen dat de Buikhaar vasthouden aan de instrumenten. Open vervolgens de buikholte ventraalmet een scherp-botte operating schaar en micro ontleden tang om de baarmoeder te lokaliseren. Met behulp van de tang, til de gehele baarmoeder en scheiden van het lichaam door te snijden in de baarmoeder lichaam en de uiteinden van de baarmoederhoorns een lichte werkende schaar. </li><li> Plaats de baarmoeder op een schone papieren handdoek over ijs (Volgens het protocol gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren). Bedek de baarmoeder met een andere schone papieren handdoek om besmetting te voorkomen. Steriliseren van de instrumenten met behulp van 70% ethanol spuiten voordat verder te gebruiken. De baarmoeder en de embryo kan worden getransporteerd naar het laboratorium op ijs. </li><li> In een open laminaire stroming kap, voorzichtig een kleine opening in de dooierzak met scherpe stompe operating schaar en micro ontleden tang. Maak de opening breder en vervolgens voorzichtig duw hem naar het embryo uit de dooierzak exterioriseren. </li><li> Breng de embryo&#39;s onmiddellijk naar een petrischaal met koude fosfaatgebufferde zoutoplossing 1X (PBS) pH 7,4. Om de juiste podium, ex verzekerenamine het embryo onder een stereomicroscoop voor het lichaam, hoofdomvang en leden morfologie. OPMERKING: Embryo&#39;s die niet in het juiste stadium van ontwikkeling worden niet gebruikt voor het experiment. </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig2.jpg" /> Figuur 2. Limb Bud morfologie. De voor- en achterpoten worden gecontroleerd op de mate van singels inkeping tussen de cijfers. Bij E13.5, alle cijfers verdichtingen zijn prominent aanwezig, met de singels en distale inkepingen tussen de cijfers te zien zijn zeer verschillend. De achterpoten cijfers achter door een halve dag 12 Bovenste rij:. Voorpoot, onderste rij: achterste ledematen. 4. Palate Dissection <ol><li> Plaats één embryo per keer in een petrischaal met PBS onder de stereomicroscoop. Met behulp van kleine ontleden schaar en pincet scheiden het hoofd van het lichaam van het embryo. </li><li> Zorgvuldig met de muis schedel boven ooghoogte met een pincet (vermijdende bovenkaak proces) maken twee incisies aan beide zijden van de lip lijn. Verwijder vervolgens de onderkaak en tong. Isoleer de bovenkaak proces regio door het maken van een snede op ooghoogte en verwijder de hersenen, de ogen, neustussenschot en omliggende weefsels. </li></ol><img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig3.jpg" /> Figuur 3. Palate weefsel van 13,5 embryo&#39;s, wanneer het gehemelte schappen had verheven verzameld, maar contact niet gemaakt. De palatal planken werden op een filter in de lucht media-interface voor 72 uur in de statische model in orgelcultuur geplaatst. (A) Niveau van dissectie op E13.5 embryo. (B) Blauw sterren bakenen gebieden om het weefsel met een tang tijdens dissectie te houden. (C) Weergave van ontleed palatal planken geplaatst op een trapeziumvormige filter membraan. (D) Zijaanzicht van de cultuur schotel na plaatsing van de ontleed smaakpapillen en toevoeging van de cultuur media. <ol start="3"><li> Plaats de palatinale orale kant op en verwijder het neustussenschot en het weefsel eromheen, het houden van de primaire gehemelte bevestigd te oriënteren helpen van anterior naar posterior. Gebruik een lepel spatel en heel voorzichtig overdracht van de palatal planken (neus naar beneden) naar de voorbereide filters op de roosters in de cultuur gerechten. LET OP: Stel het volume van de media om een ​​goede lucht-media-interface mogelijk te maken. </li><li> Onder de stereo microscoop, ontleden de primaire gehemelte en gebruiken pincet om de palatal schappen dicht bij elkaar te plaatsen. De palatal planken zal niet smelten als ze niet in contact worden gebracht. Snijd de driehoekige membraanfilter waarbij het voorste gedeelte van de tong ligt. De trapezium vorm zal helpen bij het lokaliseren van het voorste deel van het gehemelte. </li><li> Cultuur palatini alleen of met twee of drie in hetzelfde orgaan kweekschaal gebruikt BGJb kweekmedia. </li></ol> 5. Het kweken Muis Palatal Planken <ol><li> Incubeer de tissus bij 37 ° C in een bevochtigde gasmengsel (5% CO2 en 95% lucht) gedurende 72 uur, en verandert het medium elke 24 uur. </li></ol> 6. Palate Verwerking voor histologische analyse <ol><li> Bevestig de smaakpapillen na 72 uur in kweek met 4% formaldehyde / fosfaat gebufferde zoutoplossing O / N bij 4 ° &#160; C. vervolgens voorzichtig met een transferpipet wast het weefsel in de kweekschaal met PBS. Wikkel de fijnproevers in een stuk van laboratorium doekjes en plaats in het inbedden van cassettes. LET OP: Het verpakken van de fijnproevers in het laboratorium doekjes voorkomen hun verlies tijdens het droogproces. </li><li> Dehydrateer het weefsel na 70%, 80% en tot 100% ethanol wasbeurten gedurende 1 uur, gevolgd door de normale paraffine inbedding procedure. Voor het inbedden plaatst het voorste deel van het gehemelte tegenover de lade. </li><li> Snijd Serial 6 micrometer secties in het coronale oriëntatie van anterior naar posterior. Een complete sectie gehemelte zal 350-450 secti opleverenons. Vlekken op de secties met hematoxyline en eosine (H &amp; E). 10 Score elke 20 ste sectie in de eerder beschreven Mean Fusion Score (MFS) schaal (Tabel 1). 8 </li></ol>

<ol><li>Nawshad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palatal+seam+disintegration+to+die+or+not+to+die+that+is+no+longer+the+question%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).</li>
<li>Strong, E. B., Buckmiller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+the+cleft+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Facial+plastic+surgery+clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Management of the cleft palate.</a> Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).</li>
<li>Witt, P. D., Marsh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+assessing+outcome+of+surgical+repair+of+cleft+lip+and+cleft+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate.</a> Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).</li>
<li>4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).</li>
<li>Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+epithelial+adhesion+molecule+CEACAM1+is+important+for+palate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation.</a> PloS one. 8, e61653(2013).</li>
<li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro+an+analysis+by+DiI+labelling+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy.</a> Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).</li>
<li>Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+cultured+palatal+shelves+from+alligator+chick+and+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+record%22%5BJournal%5D)">Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos.</a> The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).</li>
<li>San Miguel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin+reverse+signaling+controls+palate+fusion+via+a+PI3+kinase+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).</li>
<li>Kang, P., Svoboda, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI+3+kinase+activity+is+required+for+epithelial+mesenchymal+transformation+during+palate+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).</li>
<li>RD, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRD%2C+L+%22Histopathologic+Technic+and+Practical+Histochemistry%22">Histopathologic Technic and Practical Histochemistry</a>. , 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+Atlas+of+Mouse+Development%22">The Atlas of Mouse Development</a>. , Elsevier. (1992).</li>
<li>Taher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+analysis+of+murine+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Global gene expression analysis of murine limb development.</a> PloS one. 6, e28358(2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen enkele concurrerende financiële belangen.

Het protocol in dit artikel een werkwijze voor het ontleden palatal planken uit embryo&#39;s op embryonale dag 13,5. Palatini van muizenembryo&#39;s werden gekweekt in een serumvrij kweekmedium in een atmosfeer van 95% O 2 5% CO2 bij 37 ° C. Succesvol palatinale dissectie kritisch afhankelijk van meerdere factoren bij elke stap tijdens de procedure van de embryonale moment van de muizen gedood om de voltooiing van de kweek. Een van de belangrijkste factoren palatinale fusie is de tijd voor de orgel...

Orofacial kloven zijn de meest overheersende craniofaciale aangeboren afwijkingen. Ook rekening houdend met alle mogelijke craniofaciale afwijkingen, dit zijn de tweede meest voorkomende geboorte afwijkingen bij pasgeborenen 2. Gespleten gehemelte optreden bij ongeveer 1 op elke 700 geboorten in de Verenigde Staten (VS) per jaar, de incidentie van gespleten gehemelte is gelijk aan 475 kinderen geboren met een gespleten gehemelte per maand of 15 kinderen met spleten per dag 3. Ongeveer 1% van de kinderen geboren in de wereld elk jaar vertonen een bepaalde vorm van craniofaciale dysmorfologie. Spleten van het gehemelte en de lip hebben een zeer dure en ingewikkelde procedure levenslange gevolgen voor patiënten die deze anomalie. De geschatte kosten voor elke patiënt met orale gespleten is ongeveer $ 100.000 4. De behandeling van een patiënt met schisis vereist een team van artsen, waaronder craniofaciale chirurgen, otolaryngologists, genetici, anesthesisten,spraak-taal pathologen, voedingsdeskundigen, orthodontisten, prosthodontists, psychologen, neurochirurgen en oogartsen. In palatogenesis de secundaire gehemelte rijst gepaarde uitwassen, die aanvankelijk verticaal groeien ondergaan palatale elevatie boven het dorsum van de tong. Na verhoging, de gepaarde palatal schappen groeien naar de middellijn (op E14.5 -E15 bij muizen en week 9 bij de mens). De mediale rand epitheel (MEE), die de plank tip dekt houdt zich het vormen van de middellijn epitheliale naad. Dit wordt gevolgd door epitheliale naar mesenchymale overgang en / of apoptose laten mesenchymale confluentie. Hechting van tegengestelde MEE is een belangrijk evenement waarvan wijziging veroorzaakt gespleten gehemelte. Echter, slechts weinig studies onderzochten de initiële hechting van palatal planken 5. Het harde gehemelte vormen door differentiatie van mesenchymale cellen in osteoblasten. De abnormale ontwikkeling van het gehemelte kunnen sleutel producerent smaakpapillen met of zonder betrokkenheid van de lip. Gehemelte orgelcultuur technieken werden op grote schaal gebruikt voor vele laboratoria in de afgelopen 30 jaar 6,7. In dit protocol beschrijven we in detail een werkwijze palatale dissectie en statische orgaankweek. Het voordeel van een bewegingloze orgaankweek is dat het mogelijk palatini fuseren. Deze techniek werd met succes gebruikt in ons laboratorium voor vele fusie-experimenten en signalering 8,9. Het toepassingsgebied van de techniek is enorm en kan worden gebruikt als statische orgaankweek systeem nodig en een evaluatie van respons op exogene chemische stoffen, de gevolgen van regulerende groeifactoren in verschillende trajecten en specifieke eiwitten. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig1.jpg" /> Figuur 1. Mouse Palatogenesis. Ontwikkelingsstadia van de muizen gehemelte. (BF) Scanning elecTRON microfoto (SEM) van de secundaire gehemelte bij representatief ontwikkelingsstoornissen tijden. Rode pijlen: tonen de oorspronkelijke deel van palatale hechting en fusion. Gele pijlen wijzen op de ruimte tussen de primaire en secundaire fijnproevers die zal verdwijnen na fusie (herdrukt van Kaufman 11 met toestemming van PLoS ONE).

<table><tbody><tr><td>BGJb</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-602E</td><td>100X</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>100 x15 mm</td></tr><tr><td>Center-well orgaankweekschaal</td><td>Falcon&nbsp;</td><td>#353037</td><td>60 x15 mm</td></tr><tr><td>Draaddriehoekig raster</td><td>Op maat gemaakt met roestvrij staal gaasdraad om in de orgaankweekschaal te passen. &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonaatfilter</td><td>GE&amp; Water and Process Technologies</td><td>K04BP04700</td><td>Zwart 0,4 micron, 47 mm</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>ZEISS&nbsp; Stemi SR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kultuurkap</td><td>NUAIRE Laminar Flow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microdissectietang</td><td>Dumont Medical&nbsp;</td><td></td><td>#5</td></tr><tr><td>Microdissectiescharen</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INS14003-G</td><td>Vannas Scharen, recht, 8 cm lang, 0,1mm uiteinden, 5 mm messen, Duits gemaakt</td></tr><tr><td>Microdissectiescharen</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INS500086</td><td>Vannas Scharen, recht, 8,5 cm lang, 0,025 mm x 0,015 mm uiteinden, 7 mm messen</td></tr><tr><td>Microdissectiescharen</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INS14127-G</td><td>Verenschaar gebogen gebogen, 10,5 cm lang, 8 mm messen, Duits gemaakt</td></tr><tr><td>Chirurgische curette (lepel spatel)</td><td>Hu-friedy</td><td></td><td>CM 2/4</td></tr><tr><td>Laboratoriumkapbeschermer</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Farma</td></tr><tr><td>Series11 watermantel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10010-023&nbsp;</td><td>1X</td></tr><tr><td>Vezel optische lichtbron</td><td>Fiber-light&nbsp; Dolan-Jenner</td><td>PL-750</td><td></td></tr><tr><td>Inbeddingscassette&nbsp;</td><td>Statlab</td><td>EC301</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>VWR</td><td>470173-504</td><td></td></tr></tbody></table>

wijze van studeren palatal fusion met statische organ cultuur

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Schisis behoren tot de meest voorkomende van alle aangeboren afwijkingen. De secundaire gehemelte vormen van mesenchymale planken bedekt met epitheel die voldoet aan de middellijn epitheliale naad (MES). De theorieën suggereren dat MES cellen volgen een epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT), apoptose en migratie, het maken van een gesmolten smaak 1. Volledige desintegratie van de MES is de laatste essentiële fase van palatal samenloop met omliggende mesenchymale cellen. Wij bieden een methode voor het gehemelte orgelcultuur. De ontwikkelde in vitro protocol maakt het onderzoek mogelijk van het biologische en moleculaire processen tijdens fusion. De toepassingen van deze techniek zijn talrijk, inclusief het evalueren respons op exogene chemische agentia, van regulerende en groeifactoren en eiwitten. Palatal orgelcultuur heeft een aantal voordelen, waaronder manipulatie in verschillende stadia van ontwikkeling die niet mogelijk is met in vivo studies.

De techniek kan worden toegepast op verschillende soorten experiments.The volgende studie werd ontworpen om de teratogene effecten van nicotine in vitro op palatale fusie te testen. Twee stammen van muizen werden gebruikt voor dit experiment, CD1 en C57.Palatal weefsel werd behandeld met 0,06 en 6 mM concentraties van nicotine hemisulfaat. Waargenomen werd dat palatinale fusie patronen en timing waren in de twee verschillende stammen. In CD1 muizen palatal planken uit de controlegroep bleef fusie in ti...

Studies van gehemelte ontwikkeling worden gemotiveerd door de incidentie van gespleten gehemelte, een aangeboren afwijking die een enorme gezondheid last oplegt en kunnen verlaten blijvende verminking. We tonen hier een techniek om cultuur palatini die kunnen worden gebruikt om verschillende signaalwegen betrokken bij palatinale ontwikkeling en fusie bestuderen.

Wijze van Studeren Palatal Fusion met statische Organ Cultuur

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Het algemene doel van deze procedure is het beschrijven van een methode voor palatale dissectie en statische organkweek. Dit wordt bereikt door eerst muizenembryo's te verzamelen. In de tweede stap wordt de onderkaak verwijderd en het palatum gedisseceerd.In de laatste stap worden de palatumplaten geplaatst in een statische organkweek. Uiteindelijk kunnen de effecten van specifieke medicijnen van belang op de palatinale fusie worden geëvalueerd door de gemiddelde fusiescore van de kweek te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de ontwikkeling van het gehemelte, zoals welke factoren betrokken zijn tijdens het fusieproces.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de palatinale fusie bij zoogdierachtige muizen, kan deze ook worden toegepast op andere modelorganismen, zoals kippenpalaten, volgens Maria Serrano en Israel Ibrahim. Mijn promovendi zullen deze procedure voor het oogsten van de muizenembryo's demonstreren.Begin met het reinigen van het ventrale buikoppervlak van een zwangere muis (13,5 dagen post coitum) met 70% ethanol. Open vervolgens de buikholte met scherpe, stompe operatiescharen en microdissectiepincetten. Til daarna de volledige uterus op en gebruik fijne operatiescharen om te knippen bij het uteruslichaam en bij de uiteinden van de uterine hoorns om de uterus uit de lichaamsholte te scheiden, waarbij ethanol-gesteriliseerde scherpe, stompe operatiescharen en microdissectiepincetten worden gebruikt.Maak voorzichtig een eerste kleine opening in de dooierzak. Verbreed vervolgens de opening en druk zachtjes op het weefsel van de dooierzak om de embryo's naar buiten te brengen, gevolgd door de onmiddellijke overdracht van de embryo's naar een Petrischaal met koud PBS. Om de palata één voor één te dissekeren, brengt u de embryo's onder een dissectiemicroscoop over naar een nieuwe Petrischaal met vers PBS.Nadat de kop van het eerste embryo is verwijderd, gebruikt u een pincet om de schedel van de muis voorzichtig boven de ogen vast te pakken en maakt u twee incisies aan beide zijden van de liplijn. Verwijder de onderkaak en de tong. Maak vervolgens een snede op ooghoogte en verwijder de hersenen, de ogen, het neustussenschot en het aangrenzende weefsel om de regio van het maxillaire proces te isoleren.Plaats de palatale platen met de neuszijde naar boven en verwijder het neustussenschot en het omringende weefsel, waarbij het primaire palatum bevestigd blijft om de oriëntatie te behouden. Breng vervolgens de palatale platen met een lepelspatel zeer voorzichtig met de neuszijde naar beneden over naar een voorbereid filter op de bovenkant van een rooster in een kweekschaal met medium. Pas het mediumvolume aan om een juiste lucht-mediuminterface te faciliteren.Snijd vervolgens onder de dissectiescoop het driehoekige membraan door waar het voorste gedeelte van het palatum zich bevindt. Orienteer het weefsel in het voorste gedeelte en gebruik een pincet om de palatale platen dicht bij elkaar te plaatsen. Kweek tot slot maximaal drie palata in hetzelfde organkweekschaaltje met BGJB-kweekmedium bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende 72 uur, waarbij het medium elke 24 uur wordt ververst.In dit experiment werd het teratogene effect van nicotine op de palatinale fusie in vitro onderzocht bij twee verschillende muizenstammen, waarbij gebruik werd gemaakt van palata geïsoleerd van CD1-muizen. De met de controle behandelde palatinale platen fuseerden verder op een tijdsafhankelijke wijze, terwijl de met nicotine behandelde palata een vertraagde fusie vertoonden, in het bijzonder bij een nicotineconcentratie van 6 millimolair in de palata van de C57-muis. De palatinale platen in de controlegroep fuseerden na 48 uur eveneens op een tijdsafhankelijke wijze; echter vertoonden de palatinale platen van deze muizenpalata die slechts met 0,6 millimolair nicotine waren behandeld een verminderde fusie in vergelijking met de palata van controledieren, wat wijst op een hogere mate van gevoeligheid van C57-muizen voor de effecten van nicotinebehandeling vergeleken met de CD1-dieren.Tijdens het uitvoeren van deze methode is het zeer belangrijk om te onthouden dat het weefsel voorzichtig gemanipuleerd moet worden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een statische organcultuur uitvoert.

method-of-studying-palatal-fusion-using-static-organ-culture

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze procedure beschrijft een methode voor de isolatie en de cultuur van het muriene orgaan van Corti, met of zonder de spiraal limbus en spiraal ganglion neuronen. We tonen ook aan een methode voor de expressie van een exogeen reportergen in het orgaan van Corti explant door elektroporatie.

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

We presenteren een protocol voor structurele en analyse van de samenstelling van natuurlijke orale biofilm van orthodontische apparatuur...

Orale Biofilm Analyse van de Palatal Expanders door middel van fluorescentie in-situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie

Ons doel was om een ​​reproduceerbare protocol voor het isoleren en onderhouden van lange termijn culturen van menselijke fungiform smaak papillen cellen te ontwikkelen. Cellen uit menselijk fungiform papillen, verkregen uit biopsie werden met succes gehandhaafd in cultuur voor meer dan acht passages (12 maanden) zonder verlies van levensvatbaarheid.

Isolatie en Cultuur van de Mens Fungiform Smaak papillen Cellen

Hier presenteren we een protocol om faryngeale bogen te kweken om de biologie van hart- en spiervoorlopercellen en hun micro-omgeving te bestuderen.

Ex Vivo Cultuur van pharynxbogen to Heart en Muscle voorouders en hun niche Studie

Hier presenteren we een protocol voor live imaging van muis secundaire paletfusie met behulp van confocale microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt in combinatie met een verscheidenheid aan fluorescerende reporter muis lijnen, en met pathway inhibitors voor mechanistisch inzicht. Dit protocol kan aangepast worden voor livebeelden in andere ontwikkelingssystemen.

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Driedimensionale organotypic culturen van de lymfkliertest utricle en het slakkenhuis in optisch duidelijk collageen ik gels behouden aangeboren weefsel morfologie, toestaan voor mechanische stimulatie via aanpassing van matrix stijfheid en virus-gemedieerde gene levering toestaan.

Driedimensionale Organotypic culturen van vestibulaire en auditieve zintuigen

Dit artikel beschrijft methoden voor weefselvoorbereiding, kleuring en analyse van hele fungiforme, circumvallaat- en gehemelte-smaakpapillen die consequent hele en intacte smaakpapillen opleveren (inclusief de zenuwvezels die ze innerveren) en de relaties tussen structuren in smaakpapillen en de omliggende papilla onderhouden.

Whole-Mount kleuring, visualisatie en analyse van fungiforme, circumvallaat en gehemelte smaakpapillen

We presenteren een protocol voor isolatie en kweek van primaire muisembryogene palatale mesenchymale cellen voor time-lapse beeldvorming van tweedimensionale (2D) groei- en wondhersteltests. We bieden ook de methodologie voor de analyse van de time-lapse beeldvormingsgegevens om de vorming van celstromen en directionele beweeglijkheid te bepalen.

Isolatie en time-lapse beeldvorming van primaire muisembryo's van palatale mesenchymcellen om collectieve bewegingskenmerken te analyseren

Het huidige protocol beschrijft de isolatie en cultuur van orale keratinocyten afgeleid van het volwassen muizengehemelte. Een evaluatiemethode met behulp van immunostaining wordt ook gemeld.

Isolatie en kweek van primaire orale keratinocyten uit het volwassen muizengehemelte

Een gedetailleerd protocol wordt hier gepresenteerd om een in vitro organoïde model van menselijke neusepitheelcellen te beschrijven. Het protocol heeft opties voor metingen die standaard laboratoriumapparatuur vereisen, met extra mogelijkheden voor gespecialiseerde apparatuur en software.

Cultuur en beeldvorming van menselijke nasale epitheliale organoïden

Leer een methode voor palatiumdissectie en statische orgaancultuur om gehemelteontwikkeling te bestuderen. Deze techniek maakt het mogelijk om geneesmiddelen te testen en fusieprocessen te analyseren.

Wijze van Studeren Palatal Fusion met statische Organ Cultuur

Meer video's verkennen