Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells
30 maart 2016
Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van hepatologie en toxicologie te beantwoorden en ons de mogelijkheid bieden voor de ontwikkeling van nieuwe in vitro co-cultuur en door weefseltechniek ontwikkelde levermodellen. Het voordeel van deze nieuwe techniek is om alle levercelpopulaties van dezelfde donor en hetzelfde kleine stukje leverweefsel te isoleren. Om deze procedure te beginnen, weegt u het vers ontleed leverweefsel onder stile-omstandigheden en plaatst u het leverweefselmonster in de kap met gelaagd luchtstroom.
Ruimen vervolgens het bloed van het oppervlak van het weefselmonster. Flus vervolgens de canules met 1X perfusieoplossing een. Gebruik de weefsellijm om de olijven van de canules in de grotere bloedvaten te fixeren.
Vervolgens test u de perfusie en controleert u op lekken van de canules. Sluit vervolgens alle bloedvaten die lekken met heldere 1X perfusieoplossing een met weefsellijm. Plaats vervolgens het canuleerde leverweefselmonster in de Buchner-trechter.
Stel vervolgens de stroomsnelheid van de peristaltische pomp in tussen de 7,5 en 14,6 milliliter per minuut, afhankelijk van het aantal gebruikte canules en de weerstand van het leverweefsel. Perfuseer het weefsel tot het hele bloed eruit is gespoeld gedurende ten minste 20 minuten en maximaal 30 minuten. In sommige gevallen kan het nodig zijn om een van de canules te klemmen met plastic klemmen of om de binnendruk van een gebied te verhogen door zachtjes tegen de levercapsule te drukken met een spatel om de perfusie te optimaliseren.
Een volledige kleurverandering van bruinrood naar lichtbruin of lichtgeel duidt op een goede perfusie. Vervolgens verandert u de perfusieoplossing in een verteringsoplossing met collagenase P. Vervolgens schik de opstelling voor de verteringsstap. Voer vervolgens een circulaire stroom van verteringsoplossing uit gedurende maximaal 15 minuten.
Stop periodiek de perfusie en controleer de mate van vertering. Het is essentieel dat de perfusie met verteringsoplossing onmiddellijk wordt gestopt wanneer het leverweefselmonster voldoende is verteerd. Haal de lever uit het apparaat als het klaar is en plaats het in een glazen schaal.
Spoel de buitenkant van het weefselmonster met ijskoude stopoplossing. Verwijder de canules van het leverweefselmonster. Gebruik vervolgens een scalpel om het leverweefselmonster te openen door het midden van het gebied in te snijden waar de canules waren bevestigd en zorg ervoor dat de Glisson's capsule intact blijft.
Spoel de binnenkant van het weefselmonster en bedek vervolgens het hele weefselmonster met stopoplossing. Schud vervolgens het weefsel voorzichtig om de cellen eruit te laten komen. Verzamel vervolgens de celsuspensie en filter deze door een gaasdoek in 10 50-milliliter plastic buizen.
Voeg meer stopoplossing toe aan het leverweefselmonster totdat een eindvolume van 500 milliliter is verbruikt. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie, verzamel het supernatant voor NPC-isolatie later en verzamel de celpellets in 250-milliliter plastic buizen. Was vervolgens de celpellets met PBS.
Centrifugeer voor die doeleinden de celsuspensie. Verzamel het supernatant, verzamel de pellets en suspendeer de pellet in hepatocyten incubatiemedium. Bepaal vervolgens het aantal cellen en de levensvatbaarheid in de resulterende celsuspensie met behulp van Trypanblauw-kleuring.
Om de niet-parenchymale levercellen te isoleren, centrifugeert u de verzamelde supernatant om de resterende erytrocyten en hepatocyten te elimineren. Verzamel de supernatanten en centrifugeer ze twee keer om de celpellets te krijgen voor de sedimentatie van HCS, LEC, gedeeltelijk KC en de resterende KC. Resuspendeer vervolgens de pellets in HBSS. Bereid vervolgens een 25%en een 50%dichtheidsgradiënt voor door de dichtheidsgradiëntoplossing en PBS te mengen voor dichtheidsgradiënt centrifugatie.
Plaats de 25%dichtheidsgradiëntoplossing voorzichtig op de laag van de 50%dichtheidsgradiëntoplossing. Leg vervolgens de NPC-suspensie voorzichtig en langzaam op de laag van de 25%dichtheidsgradiëntoplossing om een duidelijke scheiding van beide lagen te bereiken. Centrifugeer de celsuspensie op de dichtheidsgradiënt zonder te breken.
De NPC bevindt zich in de interfase tussen de 25%en 50%dichtheidsgradiëntlagen. Zuig de dode cellen en celresten uit de bovenste laag en verzamel de interfase voorzichtig. Na dubbele centrifugatie, voer een celtelling uit voor de KC- en de MPC-fractie.
Centrifugeer vervolgens de NPC-fractie met de eerder beschreven dubbele centrifugatiestap en resuspendeer de NPC in Kupffer-celzaaimedium. Zaai de KC-bevattende fractie op de plastic cellcultuurvaten met een dichtheid van vijf maal 10 tot de 5e KC per vierkante centimeter. Incubeer de KC-culturen gedurende 20 minuten in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius 5%kooldioxide.
Primaire KC moet binnen een korte tijd op de cellcultuurplastics hechten. Verzamel vervolgens de supernatant met de niet-gehechte NPC die voornamelijk uit LEC en HSC bestaat. Om LEC van HSC te scheiden, begint u met een centrifugatie van de supernatant.
Was vervolgens de pellet met PBS. Na de tweede centrifugatie, suspendeer de cellen in stellate cel endotheelcelscheidingsmedium en voer een celtelling uit voor alle resterende cellen. Resuspendeer vervolgens 10 miljoen cellen in één milliliter stellate cel endotheelcelscheidingsmedium.
Voeg vervolgens 20 microliter blokkeringsoplossing van de MAX-kit en 20 microliter van de CD31 microbeads toe voor immuno-labeling en incubeer de resulterende suspensie gedurende 15 minuten bij een temperatuur van vier graden Celsius. Scheid vervolgens LEC van HSC zoals beschreven in het protocol van de fabrikant voor het magnetisch geactiveerde celsorteersysteem max en verzamel de HSC-fractie. Eluteer de magnetisch vastgehouden CD31 positieve LEC en suspendeer ze in stellate cel endotheelcelcultuurmedium.
Deze afbeeldingen tonen de verschillende geïsoleerde levercelpopulaties direct na het isolatieproces in fasecontrastmicroscopieweergave. Deze reeks afbeeldingen presenteert de geïsoleerde en gekweekte cellen na 24 uur cultivatie. De
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een techniek voor het isoleren van menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor. De methode is erop gericht een hoge opbrengst en levensvatbaarheid van levercellen te bereiken, die essentieel zijn voor functionele levermodellen en weefselengineering.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Hepatologie
- Toxicologie
- Tissue Engineering
Achtergrond
- De isolatie van levercellen is cruciaal voor onderzoek en therapeutische toepassingen.
- Huidige methoden leveren mogelijk niet alle levercelpopulaties van een enkele donor op.
- Het verbeteren van de cellevensvatbaarheid en de opbrengst kan in vitro-modellen verbeteren.
- Deze techniek pakt de beperkingen van bestaande isolatiemethoden aan.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het isoleren van alle levercelpopulaties uit een enkel stuk leverweefsel.
- Het verbeteren van de levensvatbaarheid en opbrengst van geïsoleerde levercellen.
- Het faciliteren van de ontwikkeling van nieuwe in vitro co-cultuursystemen.
Gebruikte methoden
- Het wegen van vers gedissecteerd leverweefsel.
- Het verwijderen van bloed van het weefseloppervlak.
- Het doorspoelen van canules met perfusie-oplossing.
- Het gebruik van weefsellijm om canules in bloedvaten te fixeren.
Belangrijkste resultaten
- De techniek isoleert met succes meerdere typen levercellen.
- Er werd een hoge opbrengst en levensvatbaarheid van cellen bereikt.
- Het potentieel voor verbeterde in vitro levermodellen werd aangetoond.
- De methode maakt het mogelijk om leverfunctie en toxiciteit te bestuderen.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbare manier om levercellen te verkrijgen voor onderzoek.
- Het opent nieuwe wegen voor tissue engineering en geneesmiddelentesten.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek benutten voor diverse toepassingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Toegang tot gezuiverde primaire menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van een enkele donor maakt de reconstructie mogelijk van fysiologisch relevante menselijke levermodellen voor onderzoek naar drugmetabolisme en toxiciteit. Deze mogelijkheid ondersteunt mechanische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase door een ziekterelevant systeem te bieden dat de hepatocytfunctie behoudt via paracriene signalering van Kupffercellen, leverendotheelcellen en hepatische stellaire cellen. De methode vergroot het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen door de biologische variabiliteit te verminderen die geassocieerd wordt met gededifferentieerde monocultures.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken in een multicellulaire levermicro-omgeving die de in vivo pathofysiologie weerspiegelt.
- Operationele waarde: Biedt een hernieuwbare bron van fenotypisch stabiele hepatocyten en NPC's voor consistente assays voor target engagement.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de functionele validatie van targets die betrokken zijn bij door geneesmiddelen geïnduceerde leverschade via co-culturemodellen die cel-celcommunicatie vastleggen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gekwalificeerde biologische systemen met een gedefinieerde cellulaire samenstelling voor assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid.
- Operationele waarde: Genereert kwantitatieve outputs zoals albuminesecretie, ureaproductie en CYP450-activiteit voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert fenotypische screening in 3D- of co-cultureformaten die klinische hepatotoxiciteit beter voorspellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterelateerd systeem voor het bestuderen van de pathofysiologie van de lever en het evalueren van therapeutische kandidaten in een menselijke context.
- Operationele waarde: Maakt translationele biomarkerontdekking mogelijk door in vitro read-outs te correleren met klinische uitkomsten.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de bijdrage van individuele celpopulaties aan leverbeschadigingspaden te isoleren.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De geïsoleerde celpopulaties integreren in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische veiligheidsbeoordeling, waardoor een continue bron van menselijke leverbiologie wordt geboden voor iteratieve modelverfijning.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van signaalpaden door functionele readouts mogelijk te maken in co-culturen die de leversinuzoek nabootsen.
- Screening: Levert assay-klare cellen met een hoge levensvatbaarheid en gestandaardiseerde isolatie voor reproduceerbare screeningscampagnes van verbindingen.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen, zoals metabolietvorming, reactieve zuurstofcomponenten en cytokineretentie, voor comparatieve analyse van condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt bevindingen uit discovery-onderzoek met preklinische validatie via een schaalbare bron van primaire menselijke levercellen die belangrijke functionele markers behouden.
- Bedrijfsvoering en Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar isolatieplatform dat de afhankelijkheid van variabele weefselbronnen vermindert en de consistentie tussen projecten ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid bij de beoordeling van hepatotoxiciteit door de differentiatie en functie van hepatocyten te behouden via NPC-cocultuur.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en schaalbaarheid van de productie van levercellen uit monsters van één donor, waardoor de variabiliteit tussen batches wordt verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdige, mens-relevante veiligheidsgegevens te verschaffen die uitval in een laat stadium door levertoxiciteit verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van mechanistische leverrisicoprofielen afgeleid van fysiologisch relevante modellen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in perfusietechnieken, dichtheidsgradiëntcentrifugatie en celisoleringsprocedures.
- Afhankelijk van toegang tot vers menselijk leverweefsel en gespecialiseerde apparatuur zoals peristaltische pompen en magnetische celseparators.
- Necessiteert standaardisatie van isolatieprotocollen tussen teams om een consistente celkwaliteit en levensvatbaarheid over verschillende locaties te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij het opschalen van kleine weefselmonsters naar grootschalige productie voor multi-well screeningformaten.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit tussen weefseldonoren en de tijdgevoelige aard van celisolatie na resectie, wat beheerd moet worden via gestandaardiseerde SOP's.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:33
Perfusion and Digestion of Liver Tissue Sample
2:36
Isolation of Hepatocytes
3:56
Isolation of Non-parenchymal Liver Cells
5:16
Separation of Kupffer Cells, Endothelial Cells, and Stellate Cells
7:07
Results: Morphology of Human Parenchymal and Non-parenchymal Liver Cells in Suspension and After Adherence
7:57
Conclusion
