Name: Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Leer een protocol voor de isolatie van primaire menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van één donor. Deze methode biedt hoge opbrengst en viabiliteit voor in vitro levermodellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag bedanken Li Jia Liu voor hun steun in de creatie van Figuur 1. Deze studie werd ondersteund door het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek project (BMBF) Virtual Lever: 0.315.741.

Let op: Alle cellen werden geïsoleerd uit resected non-tumor menselijke lever weefsel, dat bleef na gedeeltelijke leverresectie met primaire of secundaire levertumoren. Geïnformeerde toestemming van de patiënten werd verkregen volgens de ethische richtlijnen van de Charité - Universitätsmedizin Berlijn. 1. Voorbereiding van de materialen en oplossingen <ol><li> Steriliseren alle instrumenten en materialen vooraf bacteriële besmetting tijdens de isolatie te vermijden. </li><li> Bereid de oplossingen die voor de perfusie van de lever weefsel monster, de isolatiewerkwijze van hepatocyten en niet-parenchymale levercellen en de kweek van primaire humane levercellen volgens de tabellen 1 en 2, met uitzondering van spijsvertering-oplossing die vers is bereid voorafgaand aan gebruik. Alle oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C en het wordt aanbevolen om deze binnen 4 weken na bereiding gebruikt. </li><li> Steriliserenalle oplossingen met behulp van een 0,22 pm fles top filter. </li></ol> 2. Voorbereiding van de perfusie Equipment <ol><li> Opgezet uitrusting voor perfusie en digestie van het leverweefsel monster zoals weergegeven in figuur 1A. </li><li> Stel het waterbad temperatuur tot 39 ° C om een ​​optimale collagenase P activiteit mogelijk tijdens de perfusie en de spijsvertering. </li></ol> 3. Perfusie en de spijsvertering van de lever weefselmonster (1,5 uur) <ol><li> Selecteer een weefselmonster met een intacte Glisson de capsule uit de uitgesneden leverweefsel. Bij het snijden van het weefselmonster, probeer dan een klein snijvlak met een goed zichtbare schepen te verkrijgen. Vermijd warme ischemie tijden door het vervoer en de behandeling van de lever weefselmonster op ijs tot perfusie. </li><li> Neem het weefselgewicht onder steriele omstandigheden en plaats het leverweefsel monster in een petrischaal in de laminaire luchtstroom. Reinig het oppervlak van het weefselmonster met een steriel kompres uit remaining bloed en spoel de canule set met behulp van 1x perfusie-oplossing Ik ervoor te zorgen dat alle canule waren permeabel. </li><li> Gebruik weefsel lijm op de olijven van de canules in enkele grotere bloedvaten te repareren. Afhankelijk van de grootte van de lever weefsel monster en het aantal vaartuigen op het oppervlak, gebruik van een canule set met 3-8 canules. Test de perfusie en te controleren op lekkages. Sluit alle bloedvaten, die duidelijke 1x perfusie-oplossing I, met weefsel lijm lekken. </li><li> Plaats de canule leverweefsel monster in een Büchner trechter zijn geperforeerde filterschijf (Figuur 1A). </li><li> Stel het debiet van de peristaltische pomp van 7,5 ml / min en 14,6 ml / min, afhankelijk van het aantal canules gebruikt en de weerstand van het leverweefsel. Stel het debiet telkens om ervoor te zorgen dat er een stroom maar langzaam perfusie. Perfuseren het weefsel totdat het bloed wordt uitgespoeld, maar ten minste 20 min. Let op het weefsel helderder worden in gebieden met een goede perfusiop. Opmerking: In sommige gevallen kan het nodig zijn één van de canules met plastic klem of klemmen aan de binnendruk van een gebied te vergroten door zacht drukken met een spatel tegen de lever capsule, de doorbloeding te optimaliseren. Een volledige kleurverandering tot een lichtgele tot lichtbruin kleur geeft een goede perfusie. </li><li> Verander de perfusievloeistof om de spijsvertering-oplossing bevattende collagenase P (tabel 1). </li><li> De volgorde van de installatie (Figuur 1A) voor de vertering stap. Speelt daarom een kringloop van spijsvertering-oplossing volgens figuur 1B tot 15 minuten. Opmerking: Het is van cruciaal belang voor de perfusie onmiddellijk te stoppen wanneer de lever weefselmonster voldoende verteerd. Een goede vertering kan worden waargenomen, wanneer het weefsel komt geen elasticiteit bepaald door handhaving capsule vervormingen, wanneer deze wordt ingedrukt met een spatel. </li></ol> 4. Isolatie van hepatocyten (1 uur) <ol><li> Turn de peristaltische pomp uit en zet het leverweefsel monster in een glazen schaal. Spoel de buitenkant van het weefselmonster met ijskoude stop-oplossing (Tabel 1). Verwijder de canules uit de lever weefselmonster. Gebruik een scalpel om de lever weefselmonster geopend door incisie in het midden van het gebied waar de canules werden vastgemaakt. Houd zorg dat de Glisson&#39;s capsule blijft intact. </li><li> Spoel de binnenkant van het weefselmonster en het gehele weefselmonster met ijskoude stop-oplossing. Schud het weefsel voorzichtig aan de cellen uit het weefsel los te maken. </li><li> Verzamel de celsuspensie en filteren door middel van een blik trechter (plastic trechter gevoerd met gaas kompres) in 50 ml plastic buizen. Voeg meer Stop-oplossing voor de lever weefselmonster tot een eindvolume van 500 ml wordt verbruikt. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 50 x g, 5 min, 4 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof later niet-parenchymale cel isolatie. Was de celpellet met PBS (Figuur 2A). </li><li> Centrifugeer de celsuspensie opnieuw bij 50 xg, 5 min, 4 ° C. Verzamel de supernatant en resuspendeer de pellet in Hepatocyte Incubation medium (tabel 2, figuur 2B). </li><li> Bepaal het aantal cellen en de levensvatbaarheid van de verkregen celsuspensie met behulp van trypan blauw kleuring. Tel het aantal levende en dode cellen in een Neubauer telkamer. Bereken het aantal cellen, levensvatbaarheid en opbrengst van PHH via de formule. opbrengst (getelde cellen) = geteld cellen x verdunningsfactor x volume van de cel suspensie (ml) x 10.000 opbrengst (hepatocyten / (g leverweefsel monster)) = (opbrengst (hepatocyten / (ml media)) x Volume celsuspensie (ml)) / (gewicht van leverweefsel monster (g)) levensvatbaarheid (%) = 100% x (aantal levende cellen) / (totaal aantal cellen) </li></ol> 5. Zuivering van hepatocyten (1 uur) Opmerking: Deze zuiveringsstap wordt aanbevolen, wanneer de levensvatbaarheidlager dan 70%. <ol><li> Voer alle stappen op het ijs. Bereid een 25% dichtheidsgradiënt door 5 ml dichtheidsgradiënt oplossing en 15 ml PBS dichtheidsgradiënt centrifugatie. </li><li> Zet maximaal 50 miljoen cellen in totaal uit de hepatocyten rijke celsuspensie voorzichtig en langzaam bovenop de 25% dichtheidsgradiënt laag zodat een duidelijke scheiding van de beide lagen wordt verkregen (Figuur 2C). Zet de buizen voorzichtig in de centrifuge en centrifugeer bij 1250 xg, 20 min, 4 ° C zonder rem (figuur 2D). </li><li> Zuig de resterende celsuspensie en de dode cellen in de interfase. Afhankelijk van het vetgehalte men zou ook zuig het dichtheidsgradiënt oplossing. Opmerking: PHH met een laag vetgehalte vormen een dichte pellet en de dichtheidsgradiënt kan volledig worden opgezogen. PHH met een hoog lipidegehalte vormen een diffuse pellet en veel van levensvatbare cellen in de dichtheidsgradiënt oplossing boven de pellet overblijven. </li><li>Resuspendeer de hepatocyte pellets met PBS en centrifugeer opnieuw bij 50 xg, 5 min, 4 ° C. de pellets zwembad, opnieuw wassen met PBS en resuspendeer gezuiverd PHH in Hepatocyte Incubation medium. Voer cel tellen zoals beschreven in stap 4.6. </li></ol> 6. Teelt van hepatocyten <ol><li> Bereid de celkweek gerechten voor het zaaien van PHH door ze te coaten met een extracellulaire matrix, bijvoorbeeld rattenstaart collageen (collageen type I). Bereid de rattenstaart collageen volgens de door Rajan et al protocol. 17 </li><li> Verdun de rattenstaart collageen voorraad oplossing 1: 200 in PBS. Transfer 100 ul / cm2 rattenstaart collageen oplossing in de cultuur gerechten, zorg dat het hele oppervlak is bedekt. Incubeer de celkweek kunststoffen voor 20 min bij kamertemperatuur. Zuig de resterende rattenstaart collageen oplossing. </li><li> Seed 15 x 10 4 levercellen / cm2 in Hepatocyte incubatiemedium over cultuur disheS gecoat met rattenstaart collageen. Cultiveren van de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende ten minste 4 uur. Na 4 uur de hepatocyten gehecht en het medium kan worden veranderd. </li><li> Voeren onderzoeken afhankelijk van de experimentele opstelling. Een cultuur van 48 uur is aanbevolen om de cellen te herstellen van de isolatiewerkwijze. </li></ol> 7. Isolatie van niet-parenchymale levercellen (1,5-2 uur) <ol><li> Centrifugeer de verzamelde supernatant (stap 4,5 en 4,6) bij 72 xg, 5 min, 4 ° C om de resterende erythrocyten en hepatocyten elimineren. Verzamel de supernatanten en centrifugeer ze twee keer twee celpellets kwamen: 300 xg, 5 min, 4 ° C voor de sedimentatie van HSC, LEC deels KC en 650 x g, 7 min, 4 ° C gedurende sedimentatie van de resterende KC. </li><li> Pool zowel pellets en resuspendeer ze in HBSS. Bereid een 25% en 50% dichtheidsgradiënten door mengen dichtheidsgradiënt oplossing en PBS dichtheidsgradiënt CENTRIFugation (25% dichtheidsgradiënt oplossing: 5 ml dichtheidsgradiënt oplossing en 15 ml PBS, 50% dichtheidsgradiënt oplossing: 10 ml dichtheidsgradiënt oplossing en 10 ml PBS, zie figuur 2). Plaats de 25% dichtheidsgradiënt oplossing voorzichtig bovenop de 50% dichtheidsgradiënt oplossing laag. </li><li> Zet de NPC suspensie langzaam en voorzichtig bovenop de 25% dichtheidsgradiënt oplossing laag op een manier die een duidelijke scheiding van de beide lagen wordt verkregen. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie op de dichtheidsgradiënt bij 1800 x g, 20 min, 4 ° C zonder rem (figuur 2,2). </li><li> Aspireren dode cellen en celresten uit de bovenste laag. De NPC liggen in de interfase tussen 25% en 50% dichtheidsgradiënt laag (figuur 2). Verzamel NPC, was ze met HBSS en centrifugeer de celsuspensie het toepassen van de hierboven beschreven dual centrifugeren (stap 7.2.). </li></ol> 8. Scheiding van Kupffer cellen (AdherenceScheidingsstap) (1 uur) <ol><li> Voer een celgetal van de KC in de NPC fractie zoals beschreven in stap 4.6. (Voor de verschijning van KC in suspensie zie figuur 3B). Centrifugeer de NPC fractie de bovenbeschreven tweevoudige centrifugatie (stap 7,2) en resuspendeer de NPC in Kupffer cel enten medium (tabel 2). </li><li> Het zaad van de KC-houdende fractie op plastic celkweek schepen bij een dichtheid van 5 x 10 5 KC / cm2. Incubeer de KC kweken gedurende 20 min in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% CO2. Primaire KC zich op celcultuur plastic binnen een korte tijd (Figuur 2.3). </li><li> Verzamel de supernatant dat niet gehandeld NPC, voornamelijk bestaande uit LEC en HSC. de supernatanten voor latere scheiding van LEC Pool (zie paragraaf 9) en HSC (zie paragraaf 10). Was de hechtende KC met HBSS en te kweken in Kupffer celkweekmedium (Tabel 2) bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator. </li></ol> 9. Scheiding van endotheelcellen (1,5 uur) <ol><li> Centrifugeer de verzamelde supernatant (stap 8,5.) Bij 300 xg, 5 min, 4 ° C. Was de pellet met PBS. Na centrifugatie bij 300 xg, 5 min, 4 ° C resuspendeer de cellen in stellaatcel / endotheelcellen scheidingsmedium en voer een celgetal van alle resterende cellen zoals beschreven in stap 4.6. </li><li> Resuspendeer 1 x 10 7 miljoen cellen in 1 ml stellaatcel / endotheelcellen scheidingsmedium, voeg 20 pl blokkeeroplossing van de MACS-KIT en 20 pl van de CD31 microparels voor immunokleuring en incubeer de resulterende suspensie gedurende 15 minuten bij 4 ° C temperatuur (figuur 2,4). </li><li> LEC gescheiden van HSC zoals beschreven in het merk gebruikt protocol voor de magnetisch geactiveerde celsortering systeem MACS (figuur 2,5). Elueer magnetisch behield CD31-positieve LEC en op te schorten ze in Stellaatcellen Cell / endotheelcellen kweekmedium (tabel 2). </li><li> Voer cel tellen voor LEC zoals beschreven in stap 4.6. Zaad LEC in een dichtheid van 1,25 x 10 5 cellen / cm2 in celkweek schepen gecoat met rattenstaart collageen (zie stap 6.1). Cultiveren van de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator. </li></ol> 10. Scheiding van stellaatcellen (0,5 uur) <ol><li> Ongelabelde HSC passeren de scheidingskolom in de MACS procedure. Verzamel de HSC-fractie (zie stap 9.5, Figuur 2.5). Voer cel tellen zoals beschreven in stap 4.6. </li><li> Zaad HSC met een dichtheid van 5 x 10 4 cellen / cm2 in cel kweekvaten gecoat met rattenstaart collageen (zie stap 6,1) in stellaatcel / endotheelcellen cultuurmedium (Tabel 2) en te kweken bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator. </li></ol><img alt= &quot;Tabel 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53069 / 53069table1.jpg&quot; /&gt; Tabel 1: perfusie en isolatieoplossing. <img alt="tabel 2" src="/files/ftp_upload/53069/53069table2.jpg" /> Tabel 2: Cultuur en isolatie media.

<ol><li>Pfeiffer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+cultivation+of+human+hepatocytes+and+non-parenchymal+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells.</a> Exp Biol Med. , Maywood. (2014).</li>
<li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+and+development+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Organogenesis and development of the liver.</a> Dev Cell. 18 (2), 175-189 (2010).</li>
<li>Alpini, G., Phillips, J. O., Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+isolation+of+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the isolation of liver cells.</a> Hepatology. 20 (2), 494-514 (1994).</li>
<li>Godoy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+2D+and+3D+in+vitro+systems+using+primary+hepatocytes%2C+alternative+hepatocyte+sources+and+non-parenchymal+liver+cells+and+their+use+in+investigating+mechanisms+of+hepatotoxicity%2C+cell+signaling+and+ADME%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1315-1530 (2013).</li>
<li>Gómez-Lechón, M. J., Castell, J. V., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes--the+choice+to+investigate+drug+metabolism+and+toxicity+in+man%3A+in+vitro+variability+as+a+reflection+of+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes--the choice to investigate drug metabolism and toxicity in man: in vitro variability as a reflection of in vivo.</a> Chem Biol Interact. 168 (1), 30-50 (2007).</li>
<li>Ginai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+bioreactors+as+in+vitro+models+in+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">The use of bioreactors as in vitro models in pharmaceutical research.</a> Drug Discov Today. 18 (19-20), 922-935 (2013).</li>
<li>Schyschka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+3D+cultures+but+not+2D+cultures+preserve+specific+transporter+activity+for+acetaminophen-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hepatic 3D cultures but not 2D cultures preserve specific transporter activity for acetaminophen-induced hepatotoxicity.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1581-1593 (2013).</li>
<li>Kostadinova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-term+three+dimensional+liver+co-culture+system+for+improved+prediction+of+clinically+relevant+drug-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A long-term three dimensional liver co-culture system for improved prediction of clinically relevant drug-induced hepatotoxicity.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 268 (1), 1-16 (2013).</li>
<li>Messner, S., Agarkova, I., Moritz, W., Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-cell+type+human+liver+microtissues+for+hepatotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Multi-cell type human liver microtissues for hepatotoxicity testing.</a> Arch Toxicol. 87 (1), 209-213 (2013).</li>
<li>Nussler, A. K., Nussler, N. C., Merk, V., Brulport, M., Schormann, W., Yao, P., Hengstler, J. G. The Holy Grail of Hepatocyte Culturing and Therapeutic Use. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNussler%2C+AK+%22Strategies+in+Regenerative+Medicine%22">Strategies in Regenerative Medicine</a>. Santin, M. , Springer. New York. 1-38 (2009).</li>
<li>Friedman, S. L., Roll, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hepatic+lipocytes%2C+Kupffer+cells%2C+and+sinusoidal+endothelial+cells+by+density+gradient+centrifugation+with+Stractan%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hepatic lipocytes, Kupffer cells, and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with Stractan.</a> Anal Biochem. 161 (1), 207-218 (1987).</li>
<li>Knook, D. L., Blansjaar, N., Sleyster, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+Kupffer+and+endothelial+cells+from+the+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of Kupffer and endothelial cells from the rat liver.</a> Exp Cell Res. 109 (2), 317-329 (1977).</li>
<li>Alabraba, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+isolation+and+culture+of+human+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to isolation and culture of human Kupffer cells.</a> J Immunol Methods. 326 (1-2), 139-144 (2007).</li>
<li>Friedman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+hepatic+lipocytes+and+Kupffer+cells+from+normal+human+liver%3A+morphological+and+functional+characteristics+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver: morphological and functional characteristics in primary culture.</a> Hepatology. 15 (2), 234-243 (1992).</li>
<li>Lalor, P. F., Lai, W. K., Curbishley, S. M., Shetty, S., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+can+be+distinguished+by+expression+of+phenotypic+markers+related+to+their+specialised+functions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Human hepatic sinusoidal endothelial cells can be distinguished by expression of phenotypic markers related to their specialised functions in vivo.</a> World J Gastroenterol. 12 (34), 5429-5439 (2006).</li>
<li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
<li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hepatic+stellate+cells+from+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hepatic stellate cells from mouse liver.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 46 (4), 291-298 (2014).</li>
<li>Zeng, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+to+isolate+and+culture+rat+kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new method to isolate and culture rat kupffer cells.</a> PLoS One. 8 (8), e70832(2013).</li>
<li>Tokairin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+specific+isolation+of+rat+sinusoidal+endothelial+cells+by+the+immunomagnetic+bead+method+using+SE-1+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A highly specific isolation of rat sinusoidal endothelial cells by the immunomagnetic bead method using SE-1 monoclonal antibody.</a> J Hepatol. 36 (6), 725-733 (2002).</li>
<li>Damm, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+parenchymal+and+non-parenchymal+liver+cell+isolation%2C+culture+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+International%22%5BJournal%5D)">Human parenchymal and non-parenchymal liver cell isolation, culture and characterization.</a> Hepatology International. 7, 915-958 (2013).</li>
<li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+hepatocytes+from+livers+rejected+for+liver+transplantation+on+a+national+basis%3A+results+of+a+2-year+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transpl%22%5BJournal%5D)">Isolation of human hepatocytes from livers rejected for liver transplantation on a national basis: results of a 2-year experience.</a> Liver Transpl. 9 (5), 506-512 (2003).</li>
<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Gerlach, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+isolation+of+sinusoidal+endothelial+cells+from+pig+and+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale isolation of sinusoidal endothelial cells from pig and human liver.</a> J Surg Res. 100 (1), 39-45 (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrentieel belang hebben.

De gepubliceerde protocol beschrijft een techniek om pure PHH en NPC, namelijk KC, HSC en LEC isoleren, tegelijkertijd in hoge kwaliteit en zuiverheid van hetzelfde monster van het menselijk leverweefsel. De meerderheid van de publicaties over levercel isolaties bestrijkt slechts één van die celpopulaties 18-20 en isolatie procedures uitgevoerd met menselijk weefsel zijn zeldzaam (beoordeeld door Damm et al.) 21. Aanpassing van gelegd met dierlijk weefsel (bijvoorbeeld rat lever) ...

Menselijk leverweefsel is zeer complex en bestaat uit twee verschillende mobiele eenheden, parenchymcellen en niet-parenchymale cellen (NPC). Parenchymale levercellen bevatten hepatocyten en cholangiocyten. Hepatocyten vertegenwoordigen 60 tot 70% van de totale levercellen en zijn goed voor het grootste deel van de metabolische leverfuncties, bijvoorbeeld galzuur en een aanvulling factor synthese, de biologische omzetting en de energiestofwisseling 2,3. De kleinere NPC fractie vormt 30-40% van de levercellen. NPC onder andere cel populaties, namelijk Kupffer cellen (KC), lever endotheelcellen (LEC) en de leverstellaatcellen (HSC). Deze heterogene celfractie speelt een centrale rol in fysiologische processen in de lever. Bovendien NPC deelnemen bij het ​​veroorzaken acute leverbeschadiging, bijvoorbeeld drugs geïnduceerde leverschade (DILI) en in chronische lever verwondingen, zoals cirrose 4. In de afgelopen jaren, human levercellen zijn er meer en meer van essentieel belang in onderzoek en ontwikkeling van de drug het testen, de ontwikkeling van geneesmiddelen en de identificatie van nieuwe biochemische pathways in leverziekten geworden. Voor in vitro testen PHH monoculturen worden nog steeds beschouwd als de &quot;gouden standaard&quot; 5. De belangrijkste beperking van de huidige homotypische levermodellen is dedifferentiatie en verlies van functie van de levercellen binnen een paar dagen 4. De oprichting van 3-dimensionale (3D) kweektechnieken is gebleken dat deze beperkingen kunnen worden gecompenseerd 4,6. Maar zelfs de moderne 3D-cultuur technieken zijn niet in staat om al hepatotoxische werkingsmechanismen 7 weer te geven. Ontbrekende NPC populaties in de bestaande in vitro modellen besproken als een mogelijke reden voor deze discrepantie met de in vivo situatie. Aangetoond is dat de communicatie cel-cel tussen de verschillende celpopulaties lever speelt een centrale rol in fysiologische homeostase, maar ook in pathophysiologic 8 verwerkt. Daarom is de wetenschappelijke aandacht richt zich meer en meer op NPC en hun cel-cel interacties. Het doelgericht gebruik in co-cultuur tissue engineered systemen zou een oplossing voor de grote vraag in vitro levermodellen 8,9 die zo dicht mogelijk bij de in vivo situatie mogelijke zijn. Momenteel is de belangrijkste uitdaging is de ontwikkeling van een gestandaardiseerde menselijke lever co-cultuur model, dat duidelijk omschreven delen van PHH en NPC bevat. Bijgevolg worden isolatietechnieken voor de heterogene levercellen nodig en die moeten worden geoptimaliseerd om zuivere celpopulaties krijgen. Hoewel gestandaardiseerde protocollen voor isolatie PHH bestaan ​​10, de gestandaardiseerde isolatie van humane NPC nog in ontwikkeling. Meeste gepubliceerde NPC isolatie protocollen gebaseerd op experimenten met niet-menselijke cellen 11,12. Slechts een paar publicaties beschrijven de isolatie proces van menselijke NPC en de meeste hebben alleen betrekking opwerkwijzen voor de isolatie van een enkele celtype 11-16. De belangrijkste celeigenschappen die zijn aangewend voor celscheiding zijn grootte, dichtheid, hechtingsgedrag, en de expressie van oppervlakte-eiwitten. Op basis van deze kenmerken hebben we een vereenvoudigde protocol te isoleren PHH, KC, LEC en HSC, die voorheen in Experimental Biology and Medicine 1 werd gepubliceerd. Vanwege de grote belangstelling voor deze techniek was het doel van dit artikel om een ​​gedetailleerd protocol voor de levercel isolatiewerkwijze zoals een video, waardoor het reproduceren van de techniek makkelijker te verschaffen. Het protocol omvat ook werkwijzen voor kwaliteitscontrole evaluatie van opbrengst en levensvatbaarheid en voor identificatie en zuiverheid beoordelingsproces met specifieke immunokleuring.

<table><tbody><tr><td>Algemein Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipetten</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-incubator</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamin Air</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Varifuge 3.0R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urinbeker</td><td>Sarstedt</td><td>2041101</td><td></td></tr><tr><td>perfusor spuit 50 ml</td><td>B.Braun</td><td>12F0482022</td><td></td></tr><tr><td>fles stopfilter</td><td>Nalgene</td><td>1058787</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml polypropyleen conische buis</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml polypropyleen conische buis</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>weefselkweek plaat</td><td>BD Biosciences</td><td>533047</td><td>24 well</td></tr><tr><td>serologische pipetten</td><td>BD Biosciences</td><td>357525, 357551, 357543</td><td>25 ml, 10 ml, 5 ml</td></tr><tr><td>pipet tips</td><td>SARSTEDT</td><td>0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011</td><td>100 &micro;l, 200 &micro;l, 1.000 &micro;l</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Isolatieapparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>waterbad</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>peristaltische pomp</td><td>Carl Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>circulatiethermostaat</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Schott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fijne schalen</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stand</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml;chner trechter</td><td>Haldenwanger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastic trechter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>siliconen buis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kanules met olijfpunten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glasbakje</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tang</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>scalpel</td><td>Feather</td><td>12068760</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer telkamer</td><td>Optic Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellifter</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische drape</td><td>Charit&eacute; Universitätsmedizin Berlin</td><td>A2013027</td><td></td></tr><tr><td>kompres</td><td>Fuhrmann</td><td>40013331</td><td></td></tr><tr><td>steriele chirurgische handschoenen</td><td>Gammex PF</td><td>1203441104</td><td></td></tr><tr><td>weefsel lijm</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>glas fles</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche</td><td>13349524</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Scheidingsoplossing</td><td>Biochrom</td><td>L6145</td><td>Dichtheid 1.124 g/ml</td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s BSS</td><td>PAA</td><td>H00911-3938</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s PBS</td><td>PAA</td><td>H15 - 002</td><td>zonder Mg/Ca</td></tr><tr><td>Ampuwa</td><td>Plastipur&nbsp;</td><td>13CKP151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1.064.041.000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>49.361.000</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Pufferan&nbsp;</td><td>Roth</td><td>133196836</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Mediaapparatuur&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAA</td><td>E15-005</td><td>Laag Glucose (1 g/L) (zonder L-Glutamine)</td></tr><tr><td>HEPES Bufferoplossing 1&nbsp;M</td><td>GIBCO</td><td>1135546</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GIBCO</td><td>25030-024</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>penicilline/streptomycine</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15 - 039</td><td>zonder L-Glutamine</td></tr><tr><td>Natrium Pyruvaat</td><td>GIBCO</td><td>1137663</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Trypan Blauw Oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0,4%</td></tr><tr><td>William&rsquo;s E&nbsp;&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>32551-020</td><td></td></tr><tr><td>met GlutaMAX&trade;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03780-50G</td><td></td></tr><tr><td>Fortecortin</td><td>Merck</td><td>49367</td><td>8 mg/2 ml</td></tr><tr><td>Humaan-Insuline</td><td>Lilly</td><td>HI0210</td><td>100 I.E./ml</td></tr><tr><td>N-Acetyl cysteïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal kalfs serum (FCS)</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur voor Immunokleuringen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD 68</td><td>R&amp;D Systems, USA</td><td></td><td>monoklonaal</td></tr><tr><td>CK 19</td><td>Santa Cruz</td><td>D2309</td><td>polyklonaal</td></tr><tr><td>CK18</td><td>Santa Cruz</td><td>K2105</td><td>monoklonaal</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>monoklonaal</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>monoklonaal</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23.472-9</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-Muis IgG1-PE</td><td>Santa Cruz</td><td>C0712</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-konijn IgG-FITC</td><td>Santa Cruz</td><td>L0412</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T.Baker</td><td>1104509006</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 4%</td><td>Herbeta Arzneimittel</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (

protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en overeenkomstige major populaties van niet-parenchymale liver cells

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Naast parenchymale hepatocyten, de lever bestaat uit niet-parenchymcellen (NPC), te weten Kupffer cellen (KC), lever endotheelcellen (LEC) en leverstellaatcellen (HSC). Tweedimensionale (2D) kweek van primaire humane hepatocyten (PHH) wordt nog steeds beschouwd als de &quot;gouden standaard&quot; voor in vitro testen van geneesmiddelmetabolisme en hepatotoxiciteit. Het is bekend dat de 2D-monocultuur van PHH lijdt aan dedifferentiatie en functieverlies. Recent werd aangetoond dat hepatische NPC een centrale rol in de lever (patho-) fysiologie en het behoud van PHH functies spelen. Lopend onderzoek houdt de reconstructie van in vivo weefselarchitectuur van 3D- en co-kweekmodellen de beperkingen van 2D monoculturen te overwinnen. Eerder gepubliceerde we een methode om humane levercellen isoleren en onderzocht de geschiktheid van deze cellen voor het gebruik in celkweken in Experimental Biology and Medicine 1. Op basis van de brede belangstelling voor deze technique het doel van dit artikel is een meer gedetailleerd protocol voor de levercel isolatiewerkwijze zoals een video, die een gemakkelijke weergave van deze techniek zal verschaffen. Menselijke lever cellen werden uit menselijk leverweefsel monsters van chirurgische ingrepen geïsoleerd door een twee-staps EGTA / collagenase P perfusie techniek. PHH werden gescheiden van de NPC door een eerste centrifugatie bij 50 x g. Dichtheidsgradiënt centrifugatie stappen werden gebruikt voor het verwijderen van dode cellen. Individuele levercel populaties werden geïsoleerd van de verrijkte NPC fractie met behulp van specifieke cel eigenschappen en celsortering procedures. Naast het PHH isolatie waren we in staat om te scheiden KC, LEC en HSC voor verdere teelt. Tezamen de gepresenteerde protocol maakt de isolatie van PHH en NPC in hoge kwaliteit en kwantiteit van één donor weefselmonster. De toegang tot het gezuiverde levercel populaties kan het ontstaan ​​van in vivo als menselijke li toestaanver modellen.

De scheiding in een parenchymale en niet-parenchymale fractie via dichtheidsgradiënt centrifugering zoals een reinigingsprocedure combinatie met het gebruik van hechtingseigenschappen en MACS leidt tot succesvolle PHH en NPC isolatie. PHH en NPC kan worden geïsoleerd in hoge kwaliteit en kwantiteit. Figuur 1 toont de representatieve instellingen van het apparaat voor de lever perfusie en de spijsvertering. 10% FCS werd aan de collagenase P met Perfusion toegevoegd - oplo...

Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van hepatologie en toxicologie en biedt ons de mogelijkheid voor de ontwikkeling van nieuwe in vitro co-culture- en tissue-engineered levermodellen. Het voordeel van deze nieuwe techniek is dat alle levercelpopulaties kunnen worden geïsoleerd uit dezelfde donor en hetzelfde kleine stukje leverweefsel. Om deze procedure te starten, weegt u het vers gedissecteerde leverweefsel onder steriele omstandigheden en plaatst u het leverweefselmonster in de laminaire airflow-kast.Maak vervolgens het bloed van het oppervlak van het weefselmonster schoon. Spoel daarna de canules door met 1X perfusie-oplossing één. Gebruik de weefsellijm om de olives van de canules in de grotere bloedvaten te fixeren.Test vervolgens de perfusie en controleer de canules op lekken. Sluit daarna alle bloedvaten die heldere 1X perfusie-oplossing lekken af met weefsellijm. Plaats daarna het gecannuleerde leverweefselmonster in de Büchner-trechter.Stel vervolgens de stroomsnelheid van de peristaltische pomp in tussen 7,5 en 14,6 milliliters per minuut, afhankelijk van het aantal gebruikte canules en de weerstand van het leverweefsel. Perfuseer het weefsel totdat het volledige bloed is weggespoeld, gedurende minimaal 20 minuten en maximaal 30 minuten. In sommige gevallen kan het nodig zijn om een van de canules met plastic klemmen af te sluiten of om de interne druk van een gebied te verhogen door met een spatel zachtjes tegen het leverkapsel te drukken om de perfusie te optimaliseren.Een volledige kleurverandering van bruinrood naar lichtbruin of lichtgeel duidt op een goede perfusie. Vervang daarna de perfusievloeistof door een digestiesolution die collagenase P bevat. Richt vervolgens de opstelling opnieuw in voor de digestiestap. Voer aansluitend een circulaire stroom van de digestiesolution uit gedurende maximaal 15 minuten.Stop de perfusie periodiek en controleer de mate van digestie. Het is essentieel dat de perfusie met de digestie-oplossing onmiddellijk wordt gestopt zodra het leverweefselmonster voldoende is gedigesteerd. Haal de lever uit het apparaat wanneer deze klaar is en plaats deze in een glazen schaal.Spoel de buitenkant van het weefselmonster af met ijskoud Stop Solution. Verwijder de canules uit het leverweefselmonster. Gebruik vervolgens een scalpel om het leverweefselmonster te openen door een incisie te maken in het midden van het gebied waar de canules waren bevestigd; zorg ervoor dat het kapsel van Glisson intact blijft.Spoel de binnenkant van het weefselmonster om en bedek vervolgens het gehele weefselmonster met de Stop Solution. Schud daarna het weefsel voorzichtig om de cellen ervan los te maken. Verzamel vervolgens de celsuspensie en filter deze via een gaasfilter in 10 plastic buisjes van 50 milliliter.Voeg meer stopoplossing toe aan het leverweefselmonster totdat een eindvolume van 500 milliliters is bereikt. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie, verzamel het supernatant voor latere NPC-isolatie en voeg de celpellets samen in plastic buizen van 250-milliliters. Was vervolgens de celpellets met PBS.Centrifugeer hiervoor de celsuspensie. Verzamel het supernatant, voeg de pellets samen en resuspendeer de pellet in hepatocyt-incubatiemedium. Bepaal vervolgens het celgetal en de levensvatbaarheid in de resulterende celsuspensie met behulp van Trypaanblauw-kleuring.Om de niet-parenchymale levercellen te isoleren, centrifugeert u het verzamelde supernatant om de resterende erytrocyten en hepatocyten te verwijderen. Verzamel de supernatanten en centrifugeer deze tweemaal om de celpellets te verkrijgen voor de sedimentatie van HCS, LEC, gedeeltelijk KC, en de resterende KC. Suspendeer vervolgens de pellets opnieuw in HBSS. Bereid daarna een dichtheidsgradiënt van 25% en 50% voor door de dichtheidsgradiëntoplossing en PBS te mengen voor dichtheidsgradiëntcentrifugatie.Plaats de 25% dichtheidsgradiëntoplossing voorzichtig bovenop de laag van de 50% dichtheidsgradiëntoplossing. Plaats vervolgens de NPC-suspensie voorzichtig en langzaam bovenop de laag van de 25% dichtheidsgradiëntoplossing om een duidelijke scheiding van beide lagen te verkrijgen. Centrifugeer de celsuspensie op de dichtheidsgradiënt zonder rem (without break).De NPC bevinden zich in de interface tussen de lagen van het dichtheidsgradiënt van 25% en 50%. Aspireer de dode cellen en het celdebris uit de bovenste laag en verzamel de interface zorgvuldig. Voer na de dubbele centrifugatie een cel telling uit voor de KC en de MPC-fractie.Centrifugeer vervolgens de NPC-fractie met de eerder beschreven dubbele centrifugatiestap en resuspendeer de NPC in Kupffer-celzaaimedium. Zaai de KC-bevattende fractie op de plastic celkweekvaten met een dichtheid van vijf keer 10⁵ KC per vierkante centimeter. Incubeer de KC-culturen gedurende 20 minuten in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% koolstofdioxide.Primaire KC moeten binnen een korte tijd hechten aan de plastics voor celkweek. Verzamel vervolgens het supernatant dat de niet-gehechte NPC bevat, bestaande uit hoofdzakelijk LEC en HSC. Om LEC van HSC te scheiden, begint men met een centrifugatie van het supernatant.Was vervolgens de pellet met PBS. Na de tweede centrifugatie worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in scheidingsmedium voor stellaire endotheelcellen en wordt een celtelling uitgevoerd voor alle resterende cellen. Suspendeer daarna 10 miljoen cellen opnieuw in één milliliter scheidingsmedium voor stellaire endotheelcellen.Voeg vervolgens 20 µL blokkeeroplossing uit de MAX-kit en 20 µL CD31-microbeads voor immunolabeling toe en incubeer de resulterende suspensie gedurende 15 minuten bij een temperatuur van 4 °C. Scheid daarna de LEC van de HSC zoals beschreven in het protocol van de fabrikant voor het magnetisch geactiveerde cel sorteersysteem MAX en verzamel de HSC-fractie. Elueer de magnetisch vastgehouden CD31-positieve LEC en suspendeer deze in stellate cell endotheliale celkweekmedium.Hier tonen deze afbeeldingen de verschillende geïsoleerde populaties levercellen direct na het isolatieproces in fasecontrastmicroscopie. Deze set afbeeldingen presenteert de geïsoleerde en gecultiveerde cellen na 24 uur cultivatie. De op immunofluorescentie gebaseerde karakterisering van verschillende cellfracties wordt hier getoond.PHH vertoonden positieve signalen voor de hepatocytmarker CK18 24 uur na isolatie, KC waren positief voor de marker CD68 24 uur na isolatie, LEC vertoonden positieve signalen voor vimentine 72 uur na isolatie, en HSC waren positief voor GFAP 72 uur na isolatie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een succesvolle isolatie afhankelijk is van een optimale digestie van het leverweefselmonster. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de digestie beheerst en hoe u de scheiding via dichtheidsgradiënt uitvoert, wat de kritieke stappen van deze procedure zijn.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van medisch onderzoek om hepatische functies en ziekten te bestuderen in nieuw gecreëerde in vitro celculturen en weefseltechnische levermodellen.

protocol-for-isolation-primary-human-hepatocytes-corresponding-major

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Primaire hepatocyten een waardevol hulpmiddel om biochemische, moleculaire en metabolische functies in een fysiologisch relevante experimentele systeem te evalueren. We beschrijven een betrouwbaar protocol voor rat in situ leverperfusie, die consequent levensvatbare hepatocyten genereert tot to1.0 ×...

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Een gewijzigde tweefasige collagenase perfusie procedure voor isolatie van humane hepatocyten is beschreven. Deze methode kan ook worden toegepast op andere zoogdieren levers. De geïsoleerde hepatocyten zijn beschikbaar in hoge opbrengst en haalbaarheid, waardoor ze een geschikt model voor wetenschappelijk onderzoek op gebieden zoals lever regeneratie, farmacokinetiek en toxicologie.

Isolatie van humane hepatocyten door een twee-stap Collagenase Perfusie Procedure

Lever verwondingen worden begeleid door voorlopercellen cel expansie die een heterogene populatie cellen vertegenwoordigt. Nieuwe indeling van deze cellulaire compartiment zorgt voor de onderscheidende meerdere subsets. De hier beschreven methode laat de flowcytometrieanalyse en hoge zuiverheid isoleren van diverse subsets die kunnen worden gebruikt voor verdere tests.

Isolatie en Verrijking van Liver Progenitor subsets geïdentificeerd door een Novel Surface Marker Combinatie

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van gezonde en functionele primaire muisknop hepatocyten. Instructies voor het opsporen van hepatische ontluikende eiwitsynthese door niet-radioactieve labeling substraat werden verstrekt om te helpen begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de eiwitsynthese in het kader van de homeostase van de energie-metabolisme in de lever.

Isolatie van primaire muisknop hepatocyten door niet-radioactieve L-azidohomoalanine Labeling methode p.a. ontluikende eiwit synthese

Het doel van dit protocol is bedoeld als een stapsgewijze handleiding om uit te voeren van de experimenten van de 3-D "lever-on-a-chip" infectie met het hepatitis B-virus.

"Lever-on-a-Chip" culturen van primaire hepatocyten en Kupffer cellen voor Hepatitis B-virusinfectie

Primaire hepatocyten zijn een waardevol hulpmiddel om leverrespons en metabolisme in vitro te bestuderen. Met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia werd een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen ontwikkeld.

Een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen

Dit protocol beschrijft het gebruik van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslangen, temperatuurregeling aangevuld met real-time monitoring en een alarmsysteem voor tweestaps collagenaseperfusieprocedure om de consistentie in de levensvatbaarheid, opbrengst en functionaliteit van geïsoleerde primaire rathepatocyten te verbeteren.

Isolatie van primaire rattenhepatocyten met multiparameterperfusiecontrole

Met lipiden beladen hepatocyten zijn inherent aan leverregeneratie, maar gaan meestal verloren bij centrifugatie van dichtheidsgradiënt. Hier presenteren we een geoptimaliseerd celisolatieprotocol dat steatotische hepatocyten behoudt, wat representatieve populaties van regenererende hepatocyten oplevert na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen.

Isolatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen

Hier presenteren we een niet-genetische methode om menselijke autologe leversferoïden te genereren met behulp van mononucleaire cellen geïsoleerd uit steady-state perifeer bloed.

Humane leversferoïden uit perifeer bloed voor leverziektestudies

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde tweestaps collagenase-leverperfusietechniek in een rattenmodel en toont het gebruik van geïsoleerde hepatocyten voor in vitro langdurige kweek van 3D-organoïden.

Perfusie van rattenlever en isolatie van primaire hepatocyten: een oude procedure die cruciaal is voor geavanceerde 3D-organoïdencultuur

Leer een protocol voor de isolatie van primaire menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van één donor. Deze methode biedt hoge opbrengst en viabiliteit voor in vitro levermodellen.

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells (Video) | JoVE Journal

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

Meer video's verkennen