Name: Elektrofysiologie op Geïsoleerde hersenstam ruggenmerg voorbereidingen van pasgeboren knaagdieren Hiermee Neural Network Respiratory Output Opname (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Leer elektrofysiologische opnamen van ademhalingsritmes uit geïsoleerde hersenstam-ruggenmergpreparaten van pasgeboren ratten. Deze methode maakt farmacologisch onderzoek naar neurale ademhalingsregulatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken oprecht de Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 en de Star Foundation for Children's Health Research, samen met de Molly Towell Foundation, voor het ter beschikking stellen van de onderzoeksfaciliteit en de financiële ondersteuning. De auteurs danken ook oprecht Dr. Kinkead Richard voor het correct lezen van het manuscript en het geven van advies.

Deze methode vereist het gebruik van proefdieren, toegestaan ​​door Laval University Dier Ethische Commissie (protocol # 2012-170). 1. Setup en Voorbereiding <ol><li> Oplossingen <ol><li> ACSF Bereid voorraadoplossingen volgens de volgende recepten 7,17. Andere recepten met concentratie variaties zijn in de literatuur. Winkel stock oplossingen bij 4 ° C gedurende maximaal een maand. <ol><li> Zout oplossing: voeg 75,39 g NaCl (129 mM final); 2,5 g KCl (3,35 mM final); 0,81 g NaH2PO4 (0,58 mmol final); 2,33 g MgCl2 (1,15 mmol final); 1,85 g CaCl2 (1,26 mM). Oplossen in 800 ml gedestilleerd water en vervolgens te vullen tot 1 l met gedestilleerd water. </li><li> Bicarbonaat oplossing: voeg 17,65 g NaHCO3 (21 mm definitief). Oplossen in 900 ml gedestilleerd water en vervolgens te vullen tot 1 L met gedestilleerd water. Variaties van de bicarbonaatconcentratie leiden tot schommelingen in de pH. </li><li> Glucose-oplossing: voeg 54,06g glucose (30 mM eind). Oplossen in 400 ml gedestilleerd water vul aan met water tot 500 ml. </li></ol></li><li> Bereid door verdunning aCSF 100 ml zoutoplossing, 100 ml bicarbonaatoplossing en 50 ml glucose-oplossing in 1 liter gedestilleerd water. Bewaar bij 4 ° C tot gebruik. </li><li> Bereid een glazen elektrode door opwarming en stretching een glazen buis tot het breekt. Zand langs de tip voor gebruik. De elektrode kan worden hergebruikt veel tijd zolang het schoon blijft. </li></ol></li><li> Experimentele opstelling Opmerking: De set-up gegevens zijn weergegeven in figuur 2. <ol><li> Zet de versterker, bewegende middelingelement, data-acquisitie systeem, temperatuurregelaar en pomp. Controleer de signaalversterking (winst = 10.000), de filtratie (lage drempel, 10 Hz, hoge drempel, 5 kHz), en de sampling rate van de analoge naar digitale conversie van de ruwe signaal (2,5 kHz). </li><li> Vul een fles met aCSF en bel met carbogen (95% O 2 </sub&gt;, 5% CO 2). Leiden tot een bubbled- en opgewarmde aCSF stroming in de opname kamer (volume 5 ml) en 4 ml / min. Houd de temperatuur van de opname kamer bij 26 (± 1) ° C. pH moet 7,4 in deze algemene voorwaarden. </li><li> Houd 50 ml RT en carbogen geborreld aCSF in een 50 ml spuit in de buurt van de dissectie kamer. </li><li> Zet de computer en start de opname software. </li></ol></li></ol> 2. Dissection <ol><li> Weeg en visueel het geslacht van het dier te bepalen (mannetjes hebben een langere ano-genitale afstand, terwijl de vrouwtjes hebben een korte ano-genitale afstand; mannetjes genitaliën zijn vaak donker terwijl de vrouwelijke genitaliën zijn roze). </li><li> Verdoven pasgeboren knaagdieren door een van de volgende mogelijkheden: cryoanesthesia (het dier ijs volledig onderdompelen gedurende 4 - 5 min 18), injectie (equitensine bij 4 ml / kg) 19 of inhalatie van vluchtige anesthetica (isofluraan 20 of ether 21). Confirm een ​​adequate vlak van anesthesie door de afwezigheid van een poot terugtrekking reflex. </li><li> Leg het dier op de bank, ventrale gezicht naar beneden. Sectie de rostrale deel van het hoofd coronaalwaarts met een scalpel in de bregma niveau (zichtbaar door de huid en de schedel). Voer deze stap onmiddellijk nadat het dier is verdoofd. </li><li> Sectie lichaam coronaalwaarts met een scalpel onder de voorste leden. </li><li> Verwijder de huid, spieren, vetweefsel en viscus met chirurgische en dun schaar en tang. Aangezien botten zijn zacht op deze leeftijd, wees voorzichtig aan het zenuwstelsel niet beschadigen. Voer deze stap op de bank. </li><li> Plaats de voorbereiding in de dissectie kamer. Gebruik de aCSF opgeslagen in de spuit met de bereiding van zuurstof. Vanaf dit punt aan het einde van de opname gebruikt een microscoop. </li><li> Aan de dorsale zijde van de voorbereiding, snijd de schedel en wervels van de rostraal van de caudale deel langs de medium-as met chirurgische en dun schaar en tang. Open de cut schedelen wervels om het zenuwweefsel bloot. Gebruik de aCSF strored in de spuit aan de voorbereiding van zuurstof. </li><li> Met de tang, verwijder de Arachnoid membraan, een dun weefsel dat het oppervlak van het zenuwweefsel. Bewaar de pia mater en bloedvaten tegen het zenuwweefsel. Gebruik de aCSF opgeslagen in de spuit met de bereiding van zuurstof. </li><li> Plaats het preparaat met de dorsale gezicht naar beneden, en zorgvuldig omlaag brengen van de hersenstam en het ruggenmerg door het snijden van de zenuwen en bindweefsel met de schaar terwijl de voorbereiding op zijn plaats. Een dorsale benadering is ook mogelijk. Houd de wortels en zenuwen zo lang mogelijk. Verwijder de botten naar de hersenstam en het ruggenmerg isoleren. Gebruik de aCSF opgeslagen in de spuit met de bereiding van zuurstof. </li><li> Verwijder het cerebellum en de resterende rostrale structuren snijden ze met de scalpel. Gebruik de aCSF opgeslagen in de naald aan de voorbereiding van zuurstof. </li><li> Eventueel afhankelijk ExperimenTal ontwerp, verwijder de pons met de scalpel door een coronale sectie anterior aan de inferieure cerebellaire slagader 22. Merk op dat het houden van de hele pons vertraagt ​​het ritme bij ratten en volledig remt in muizen. Preparaten die alleen het caudale deel van de pons bevatten vertonen een ademhalings-achtige activiteit met een stabiele frequentie van de C4 wortel. </li></ol> 3. Opname <ol><li> Plaats de voorbereiding in de opname kamer, ventrale zijde naar boven. Bevestig het preparaat met pennen in het laagste gedeelte van het ruggenmerg en rostrale-grootste gedeelte van de hersenstam. </li><li> Met behulp van een injectiespuit verbonden met de elektrode van de naald, leiden tot een depressie bij de elektrode (glas tip diameter: 150 - 225 um) door het uittrekken van de spuit zuiger, teneinde gedeeltelijk vullen elektrode met aCSF. </li><li> Met behulp van een micromanipulator voorzichtig plaatst de elektrode nabij een van de vierde ventrale wortels. Andere ventrale wortels zou ook kunnen presenteren een respiratoire-achtige activiteit (e.g., XII hersenzenuw, C1 ventrale root). </li><li> Leiden tot een depressie in de elektrode tank via de spuit door het uittrekken van de zuiger om voorzichtig zuigen de zenuw worteltje. Dan gaan voorzichtig de elektrode toe te passen tegen het ruggenmerg. Opmerking: Idealiter zou de grootte van de worteltje overeenkomt met het formaat van de elektrode opening en creëert zo een afdichting tussen de interne en externe compartimenten van de elektrode. Aangezien verschilversterkers gewoonlijk gebruikt voor dergelijke opnamen openingen tussen de binnenzijde van de elektrode en de opname kamer vermindert de kwaliteit van het signaal en maakt het moeilijk om achtergrondruis te elimineren. </li><li> Start de opname. </li><li> Noteer het ritme door het preparaat onder normoxische omstandigheden (dwz aCSF geborreld carbogen: 95% O2 en 5% CO2) gedurende ten minste 20 min op de basislijn parameters van het preparaat te bepalen. </li><li> Schakel de perfusie van-carbogen geborreld aCSF aanstimulus aCSF (dwz geborreld met 95% N2 en 5% CO2 gedurende hypoxie stimulus) gedurende 15 min. Alter blootstellingsduur, afhankelijk van de experimentele protocol. Noteer de blootstelling duur van de opname en dierlijke datasheet. Gebruik roestvrij stalen buizen tussen de aCSF fles en de kamer zoveel mogelijk te vermijden gasdiffusie naar de buitenzijde van de buis. </li><li> Schakel de perfusie terug naar standaard-carbogen geborreld aCSF gedurende minstens 15 min voor een herstel van de opname. Noteer deze op de opname en dier datasheet. </li><li> Het einde van de opname. </li></ol> 4. Statistische analyse <ol><li> Van het geïntegreerde signaal, berekent de frequentie als het aantal bursts per minuut (uitgedrukt in bursts / min), de amplitude als het verschil tussen de basislijn en de piek van de burst (uitgedrukt in mV), de salvoduur de duur van het begin tot het einde van de burst (uitgedrukt in s), de burst gebied als het gebied onder de curve van de burst op het geïntegreerde signaal (in mV · s) (figuur 3). </li><li> Bereken de frequentie, amplitude, duur en barstte barsten gebied onder normoxische (baseline), hypoxie (stimulus) en posthypoxische (post-stimulus) herstel omstandigheden als het gemiddelde van de laatste 5 minuten van de opnames voor elke conditie. Heeft het eerste gedeelte van elke voorwaarde niet te analyseren omdat er een vertraging tussen het schakelen van de perfusie en aCSF homogenisering in de opname kamer. </li><li> Express dan stimulus (bijvoorbeeld hypoxie) en post-stimulus (dwz posthypoxische) restwaarde als percentage van de basislijn-waarden voor de overeenkomstige opname. Geef de resultaten als gemiddelden ± SD </li></ol>

<ol><li>Feldman, J. L., Del Negro,, A, C., Gray, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+rhythm+of+breathing%3A+so+near%2C+yet+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far.</a> Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).</li>
<li>Taylor, A. C., Kollros, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+in+the+normal+development+of+Rana+pipiens+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Stages in the normal development of Rana pipiens larvae.</a> Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).</li>
<li>Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+potentials+of+bulbar+respiratory+neurons+of+the+turtle%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle.</a> Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).</li>
<li>Bouverot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+breathing+in+birds+compared+with+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Control of breathing in birds compared with mammals.</a> Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).</li>
<li>Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+changes+in+the+isolated+brain+stem+of+the+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish.</a> J Physiol. 71, 121-135 (1931).</li>
<li>Suzue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+rhythm+generation+in+the+in+vitro+brain+stem-spinal+cord+preparation+of+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat.</a> J Physiol. 354, 173-183 (1984).</li>
<li>Fournier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+stress+promotes+pathological+apneas+and+sex-specific+disruption+of+respiratory+control+development+in+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat.</a> J Neurosci. 33, 563-573 (2013).</li>
<li>Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-natal+hypoxic+activity+of+the+central+respiratory+command+is+improved+in+transgenic+mice+overexpressing+Epo+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain.</a> Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).</li>
<li>Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+mechanisms+of+respiratory+rhythm+generation%3A+an+approach+using+in+vitro+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation.</a> Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).</li>
<li>Onimaru, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+respiratory+center+using+isolated+brainstem-spinal+cord+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations.</a> Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).</li>
<li>Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+network+function+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats.</a> Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).</li>
<li>Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+maturation+of+the+mouse+respiratory+rhythm-generator%3A+in+vivo+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies.</a> Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).</li>
<li>Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+and+state-dependent+mechanisms+for+respiratory+rhythm+and+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation.</a> Prog Brain Res. , 165-201 (2007).</li>
<li>Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+respiratory+rhythm+generator+by+the+pontine+noradrenergic+A5+and+A6+groups+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).</li>
<li>Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+pons+in+hypoxic+respiratory+depression+in+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat.</a> Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).</li>
<li>Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diencephalic+and+mesencephalic+influences+on+ponto-medullary+respiratory+control+in+normoxic+and+hypoxic+conditions%3A+an+in+vitro+study+on+central+nervous+system+preparations+from+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat.</a> Neuroscience. 132, 843-854 (2005).</li>
<li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+regulation+in+the+brain%3A+implications+for+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li>
<li>Danneman, P. J., Mandrell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+five+agents%2Fmethods+for+anesthesia+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats.</a> Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).</li>
<li>Formenti, A., Zocchi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error+signals+as+powerful+stimuli+for+the+operant+conditioning-like+process+of+the+fictive+respiratory+output+in+a+brainstem-spinal+cord+preparation+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats.</a> Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).</li>
<li>Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+hyperoxic+exposure+reconfigures+the+central+respiratory+network+contributing+to+intolerance+to+anoxia+in+newborn+rat+pups%5BTitle%5D)+AND+%22J+App+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups.</a> J App Physiol. 116, 47-53 (2014).</li>
<li>Umezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin-B+antagonized+respiratory+depression+induced+by+sevoflurane%2C+propofol%2C+and+remifentanil+in+isolated+brainstem-spinal+cords+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats.</a> Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).</li>
<li>Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+on+extracellular+Ca2%2B%2FK%2B+antagonism+of+inspiratory+centre+rhythms+in+slices+and+en+bloc+preparations+of+newborn+rat+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem.</a> J Physiol. 584, 489-508 (2007).</li>
<li>Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT+acting+on+5-HT%281%2F2%29+receptors+does+not+participate+in+the+in+vitro+hypoxic+respiratory+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression.</a> Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).</li>
<li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+recordings+from+respiratory+neurons+in+the+medulla+of+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+%3A+European+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).</li>
<li>Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+bursting+of+pre-+and+post-inspiratory+neurones+during+central+apnoea+in+mature+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice.</a> J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).</li>
<li>Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+NMDA+receptors+in+the+respiratory+phase+transition+is+different+in+the+adult+guinea+pig+in+vivo+and+in+the+isolated+brain+stem+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation.</a> J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).</li>
<li>Otsuka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+volatile+anesthetics+on+respiratory+activity+and+chemosensitivity+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+the+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hokkaido+Igaku+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat.</a> Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).</li>
<li>Gestreau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Task2+potassium+channels+set+central+respiratory+CO2+and+O2+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity.</a> PNAS. 107, 2325-2330 (2010).</li>
<li>Caravagna, C., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+and+MEK+molecular+pathways+are+involved+in+the+erythropoietin-mediated+regulation+of+the+central+respiratory+command%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command.</a> Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).</li>
<li>Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anandamide+centrally+depresses+the+respiratory+rhythm+generator+of+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice.</a> Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).</li>
<li>Arata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+activity+of+the+neonatal+dorsolateral+pons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro.</a> Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).</li>
<li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+functional+neuron+group+for+respiratory+rhythm+generation+in+the+ventral+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla.</a> J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).</li>
<li>St-John, W. M., Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizations+of+eupnea%2C+apneusis+and+gasping+in+a+perfused+rat+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation.</a> Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of belangenconflicten te melden.

Nauwkeurige kwantificering van respiratoire activiteit kan een uitdaging zijn. Inderdaad, de ademhaling is een functie die zowel automatisch als vrijwillig kan zijn, en dat wordt gemoduleerd volgens het milieu, de behoeften van het lichaam, de emotionele toestand en het gedrag. Het voordeel van deze techniek is het isoleren van neurale elementen bevoegd zijn de opdracht luchtwegen. Aldus elektrofysiologische opnames van de hersenstam ruggenmerg preparaten en plethysmografie complementair technieken om het gehele neurona...

Ademhaling is een complex en levensactiviteit gecontroleerd door de hersenen, waardoor dizuurstof (O 2) opname en kooldioxide (CO 2) verwijdering. De centrale ademhalingsfrequentie wordt gegenereerd door een complex netwerk in de hersenstam beide zoogdieren 1, 2 amfibieën, reptielen 3, 4 vogels en vissen 5. Zelfs als de studie van de ademhaling in vivo kan worden verwerkt, nauwkeurig mechanistische onderzoeken vereisen directe toegang tot de luchtwegen besturingsnet. Hiertoe Adrian en Buytendijk ontwikkelde een verminderde preparaat goud vis, waarbij de hersenstam registratiedrager elektroden gegenereerd ritme geassocieerd met gill ventilatie 5. Deze benadering werd vervolgens Suzue aangepast 1.984 6 voor gebruik bij pasgeboren knaagdieren. De komst van deze voorbereiding heeft geleid tot een significante vooruitgang in de luchtwegen neurobiologie. Aangezien het betrekkelijk eenvoudig is de techniek voorgesteld here vatbaar is voor een breed scala aan fundamentele onderzoek van ritmische motor gedrag en hun oorsprong bij pasgeboren knaagdieren. Het algemene doel van deze methode is het neurale correlaat van inspiratoire activiteit opnemen, respiratoire-achtig ritme genoemd fictieve ademhaling, geproduceerd door de luchtwegen netwerk. Deze methode kan worden gebruikt in een breed scala van onderzoek doelstellingen, gericht op inspiratoire reacties op de luchtwegen variaties of farmacologie zowel wild type 7 en 8 transgene dieren. Aangezien experimenten worden uitgevoerd bij een lage temperatuur, zonder sensorische afferenten en onder omstandigheden waarbij de concentratie van glucose en O2 in de aCSF hoog zijn vragen gerezen over de fysiologische relevantie van het opgenomen signaal. Hoewel er duidelijke verschillen tussen de in vivo en in vitro (bijv., De frequentie van inspiratoire bursts) blijft het een feit dat de aanwezigheid vande kernelementen van de luchtwegen netwerk 6 het mogelijk om een robuuste ritme verbonden met een vitale functie homeostatische 9,10 bestuderen. De grondgedachte achter de ontwikkeling en het gebruik van deze techniek is om directe toegang tot de hersenstam elementen van de luchtwegen netwerk, die moeilijk te bereiken in vivo, in het bijzonder bij pasgeborenen vergemakkelijken. De hersenstam wordt onder strikt gecontroleerde omstandigheden geplaatst: de opgenomen ritme wordt niet gemoduleerd door perifere afferente input van de longen of de halsslagader lichamen, waardoor het onderzoek om zich te concentreren op het centrale respiratoire drive zelf 11. Daarom is deze toegang gebruikt voor stimuli toe te passen en registreer het uitgangssignaal. In tegenstelling tot opnames plethysmografie, wordt de ademritme gemoduleerd door alle componenten in het lichaam (bv., Long- distensie, perifere chemosensors), waardoor het moeilijk nauwkeurige stimuli passen. In eenewborn rat, het protocol bestaat uit het opnemen van de vierde ventrale wortel signaal op een geïsoleerde hersenstam en een afgeknotte ruggenmerg, gehandhaafd in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF). Het ritme die door de hersenstam ruggenmerg preparaten bestaat uit afzonderlijke langzame bursts die verband houden met de inspiratiefase signaal 9. Geïsoleerde hersenstam ruggenmerg voorbereidingen zijn gemakkelijk opneembaar bij ratten van postnatale dag 0-4 (P0 - P4) 7. Deze benadering wordt gewoonlijk gebruikt om de hypoxische respons van de luchtwegen netwerk, en ook de reactie op hypercapnie, acidose of drugs evalueren. Een acute hypoxie-protocol wordt hier gepresenteerd. Deze stimulering wordt verkregen door intrekking van O2 in het aCSF; Deze benadering wordt gewoonlijk gebruikt om de tolerantie en gevoeligheid voor hypoxische beledigingen beoordelen. Het protocol induceert een ritme depressie vanaf de eerste minuut tot het einde van de blootstelling aan hypoxie (figuur 1) 12. Deze depressie wordt omgekeerdtijdens posthypoxische herstel 12. Wat betreft de experimentele opzet, is het belangrijk op te merken dat de pons, bij het ​​rostrale deel van de hersenstam, heeft een remmende werking op de ritmegenerator 8. Zo, de voorbereidingen van de volledige hersenstam en rostrale ruggenmerg weer een lager ritme. Opname van de pons in het geïsoleerde monster voor de opname wordt bepaald afhankelijk van de doelstelling van het experiment 13; de studie van pontine invloed op de medulla oblongata netwerk zou opnames met en zonder pons vereisen de resultaten 14 vergelijken. Bovendien is een van de voordelen van deze techniek is de mogelijkheid om de rostrale deel van het preparaat mesencefalische en / of diencephalic gebieden 15,16 omvatten, waardoor het effect van deze gebieden op het ponto-medullaire respiratoire netwerk beoordelen.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036-5EA</td><td>Gebruik onder kap</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Bioshop</td><td>POC888</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Bioshop</td><td>CCL444</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioshop</td><td>MAG510</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Bioshop</td><td>SPM306</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Bioshop</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Linde</td><td>343-02-0006&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Suction electrode</td><td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td><td>model 573000</td><td></td></tr><tr><td>Differential AC amplifier</td><td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td><td>model 1700</td><td></td></tr><tr><td>Moving averager</td><td>CWE, Ardmore, PA, USA</td><td>model MA-821</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Dataq Instruments, Akron, OH, USA</td><td>model DI-720</td><td></td></tr><tr><td>LabChart software</td><td>ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism sofware</td><td>Graphpad, La Jolla, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection chamber</td><td>Plastic box (e.g. petri box) zal het doen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recording chamber</td><td>Zelf gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base</td><td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td><td>MB</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA</td><td>KITE-R</td><td></td></tr><tr><td>Base</td><td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td><td>MB</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>MINIPULS 3</td><td></td></tr><tr><td>Faraday Cage</td><td>Zelf gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

elektrofysiologie op geïsoleerde hersenstam ruggenmerg voorbereidingen van pasgeboren knaagdieren hiermee neural network respiratory output opname

Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

Hoewel het algemeen bekend is dat de centrale ademhalingsdrijfveer zich in de hersenstam bevindt, zijn er nog steeds verschillende aspecten van zijn basisfunctie, ontwikkeling en respons op stimuli die volledig moeten worden begrepen. Om de moeilijkheid om toegang te krijgen tot de hersenstam bij het hele dier te overwinnen, wordt isolatie van de hersenstam en een deel van het ruggenmerg uitgevoerd. Deze voorbereiding wordt onderhouden in kunstmatige hersen- en ruggenmergvloeistof waar gassen, concentraties en temperatuur worden gecontroleerd en gemonitord. Het uitgangssignaal van het ademhalingsnetwerk wordt opgenomen door een zuigelektrode die op de vierde ventrale wortel is geplaatst. Op deze manier kunnen stimuli direct op de hersenstam worden toegepast en het effect kan direct worden opgenomen. Het opgenomen signaal is gekoppeld aan het inspiratiesignaal dat via de nervus phrenicus naar het middenrif wordt gestuurd en kan worden beschreven als bursts (ongeveer 8 bursts per minuut). Analyse van deze bursts (frequentie, amplitude, lengte en oppervlakte onder de curve) maakt een nauwkeurige karakterisering van het stimuluseffect op het ademhalingsnetwerk mogelijk. De belangrijkste beperking van deze methode is de levensvatbaarheid van de voorbereiding voorbij de vroege post-natale stadia. Daarom richt deze methode zich grotendeels op de studie van het hele netwerk zonder de perifere input bij de pasgeboren rat.

Zoals vermeld in de inleiding, een van de belangrijkste voordelen van deze techniek is de directe toegang tot de hersenstam op verschillende stimuli passen. Als voorbeeld werd hypoxie hier toegepast. Figuur 1. AB toont een volledig protocol opname, zowel normoxische en hypoxische omstandigheden. Figuur 1.CE toont het ritme opgenomen in normoxische omstandigheden (dwz aCSF geborreld met 95% O2 en 5% CO 2 bij 26 ° C). Zoals eerder aangetoond in deze exacte p...

De centrale ademhalingsaandrijfmechanisme bevindt zich in de hersenstam. Spontane ademhalingsmotorische output van een geïsoleerde hersenstam-ruggenmerg wordt geregistreerd door het plaatsen van een elektrode op de vierde ventrale wortel. Deze experimentele aanpak is waardevol voor farmacologische onderzoeken of de beoordeling van ademhalingsproblemen en genetische manipulaties op ritmisch motoriek gedrag.

Elektrofysiologie op Geïsoleerde hersenstam ruggenmerg voorbereidingen van pasgeboren knaagdieren Hiermee Neural Network Respiratory Output Opname

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to ...

Het algemene doel van deze procedure is om het ritme vast te leggen dat wordt gegenereerd door de respiratoire kernen van de hersenstam in afwezigheid van perifere E onder verschillende condities. Dit wordt bereikt door eerst de nek en de bovenrug van de rat te verwijderen, waar de hersenstam zich bevindt. De tweede stap is het isoleren van het zenuwstelsel en het verwijderen van de schedel- en wervelbeenderen.Plaats vervolgens de elektrode op de vierde ventrale wortel en start de registratie. Uiteindelijk worden elektrofysiologische registraties uitgevoerd op de geïsoleerde hersenstam en het ruggenmerg. Preparaten worden gebruikt om het door de hersenstam gegenereerde ritme in reactie op verschillende stimuli aan te tonen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een cruciale vraag binnen het respiratoire veld, zoals wellat een molecuul betrokken is bij het ritme. Generatie R-controles zijn wat het medische uiteinde gebruikt op de respiratoire kern. Begin deze procedure door een geanestheseerde pasgeboren rat op een schaal te plaatsen.Verwijder onmiddellijk de rostrale zijde van de kop op het niveau van de bgma, coronale doorsnede, met een scalpel. Verwijder vervolgens het lichaam onder de voorste ledematen corona. Verwijder daarna de huidspieren en het vetweefsel over de schedel.Verwijder daarna het viskeuze materiaal en wees voorzichtig om het zenuwstelsel niet te beschadigen. Breng vervolgens de preparaat over naar de dissectiekamer. Plaats de dissectiekamer onder de microscoop.Breng vervolgens de geoxygeneerde A CSF aan met een spuit om het preparaat aan de dorsale zijde te oxygeneren. Snijd de schedel langs de mediaal-as door en open deze om het zenuwweefsel bloot te leggen. Voer dezelfde procedure uit voor de wervels.Breng vervolgens het gezuursde A CSF aan om het preparaat te oxygeneren. Positioneer het preparaat daarna met de dorsale zijde naar beneden. Isoleer voorzichtig de hersenen, hersenstam en het ruggenmerg door de zenuwen en het bindweefsel door te snijden terwijl het preparaat op zijn plaats wordt gehouden.Verwijder vervolgens het cerebellum en de overige rostrale structuren. Breng de zuurstofrijke A CSF aan op het preparaat. Plaats bij deze procedure het zenuwweefsel in de registratiekamer met de ventrale zijde naar boven. Fixeer het met pinnen in het laagste deel van het ruggenmerg en het meest rostrale deel van de hersenstam.Verwijder daarna het arachnoïdale membraan, een dun weefsel dat het oppervlak van het zenuwweefsel bedekt. Let erop dat de pia mater en de bloedvaten van het zenuwweefsel niet worden verwijderd. Vul vervolgens de elektrode met A CSF.Plaats de elektrode met behulp van een micromanipulator voorzichtig dicht bij de vierde ventrale wortel. Aspireer de zenuwwortel voorzichtig met de spuit. Plaats vervolgens de elektrode samen met de zenuwwortel tegen het ruggenmerg.Registreer vervolgens gedurende ten minste 20 minuten de elektrofysiologische activiteiten die door het zenuwweefsel onder normoxische omstandigheden worden gegenereerd. Om de basisparameters van het preparaat te bepalen, wordt de perfusie-oplossing gewisseld van met carbogeen beluchte A CSF naar hypoxia-stimulus A CSF, waarna gedurende 15 minuten wordt geregistreerd. Schakel daarna de perfusie-oplossing terug naar standaard carbogeen.Belucht het CSF en neem gedurende ten minste nog eens 15 minuten op voordat de getoonde opname wordt beëindigd. Hier zijn de respiratoire outputs geregistreerd vanuit de C4 ventrale wortel van de hersenstam-ruggenmergpreparatie van een P4 rat onder normoxische, hypoxische en post-hypoxische herstelcondities. Dit is het geïntegreerde signaal en dit is het ruwe signaal.En hier zijn de vergrote opnames en de enkelvoudige bursts voor elke conditie na ontwikkeling. Deze methode biedt onderzoekers op het gebied van respiratie de mogelijkheid om de neuronale groepen en moleculaire mechanismen te verkennen die betrokken zijn bij de ademhalingscontrole en -generatie bij pasgeborenen.

electrophysiology-on-isolated-brainstem-spinal-cord-preparations-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een demonstratie van de isolatie van neonatale muis ruggenmerg voor elektrofysiologische studies.

Spinal Cord Elektrofysiologie

Een demonstratie van de fabricage en het gebruik van een extracellulair zuigkracht elektrode gebruikt om de elektrofysiologische opnamen van neonatale knaagdieren ruggenmerg te...

Spinal Cord Elektrofysiologie II: Extracellulaire Suction Elektrode Fabrication

This video demonstrates electrophysiological recordings of isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents. The preparation is placed in a recording chamber, and the inspiratory bursts from the brainstem are recorded under oxygenated and oxygen-deprived conditions using the fourth ventral nerve root in the spinal cord.

Electrophysiological Recordings of Brainstem-Spinal Cord Preparations from a Newborn Rodent

Een chirurgische methode wordt beschreven om de ventrale schedel aan pasgeboren ratten bloot. Met deze benadering is het mogelijk om een ​​craniotomie acute elektrofysiologie en twee-foton microscopie experimenten in de hersenstam van verdoofde pups openen.

Een methode om een ​​Craniotomie aan de ventrale Schedel van pasgeboren knaagdieren maken

Deze procedure voert langdurige in vivo intracellulaire recordings uit één neuronen in fysiologisch relevante cerebrale staten en na volledige afschaffing van lopende elektrische activiteiten, waardoor een isoelektrisch hersentoestand. De fysiologische constanten van het dier worden zorgvuldig gecontroleerd tijdens de overgang naar de kunstmatige comateuze toestand.

Inductie van een iso-elektrisch Brain staat om de impact van endogene synaptische activiteit op neuronale Exciteerbaarheid Onderzoek<em&gt; In Vivo</em

We laten zien hoe we schuine plakjes van het ruggenmerg in jonge muizen bereiden. Deze voorbereiding maakt de stimulatie van de ventrale wortels mogelijk.

De Voorbereiding van de Oblique Spinal Cord Slices voor Ventral Root Stimulation

Hier introduceren we een nieuwe techniek die is ontworpen om elektroencefalografie (EEG) op te nemen bij vrij bewegende neonatale epileptische pups en omschrijft haar procedures, eigenschappen en toepassingen. Met deze methode kan men gedurende meer dan 1 week EEG opnemen.

EEG opnemen bij vrij bewegende neonatale ratten met behulp van een nieuwe methode

In deze studie wordt de methode gepresenteerd over het uitvoeren van multi-site in vivo elektrofysiologische opnamen van de hyperdirecte weg onder urethaananesthesie.

acuut<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektrofysiologische opnamen van lokale veldpotentialen en multi-unit activiteit van de Hyperdirect Pathway in verdoofde ratten

Deze studie introduceert een methode voor het gelijktijdig opnemen van lokale veld potentieel in de hersenen, elektrocardiogrammen, electromyograms en signalen voor een vrij bewegend rat te ademen. Deze techniek, die experimentele kosten vermindert en vereenvoudigt gegevensanalyse, zal bijdragen aan het begrip van de interacties tussen de hersenen en perifere organen.

Gelijktijdige opnamen van corticale lokale veld Potentials, elektrocardiogram Electromyogram en ademhaling ritme van een vrij bewegende Rat

Dit protocol zowel visueel communiceert de hersenstam-ruggenmerg voorbereiding en de voorbereiding van de hersenstam dwarse segmenten verduidelijkt in een uitgebreide stapsgewijze manier. Het werd ontworpen om de reproduceerbaarheid verhogen en de kans voor het verkrijgen van levensvatbare, langdurig, ritmisch-actieve segmenten voor het opnemen van neurale uitvoer uit de luchtwegen gebieden van de hersenstam te verbeteren.

Voorbereiding van ritmisch-actief In Vitro neonatale knaagdier hersenstam-ruggenmerg en dun plakje

Dit protocol beschrijft een methode om in vivo opnames van één neuron met hoge dichtheid te verkrijgen van de hersenstam van muizen met een hoofdfixatie. Deze benadering wordt gebruikt om het afvuren van het actiepotentiaal van neuronen in het ventrolaterale periaqueductale grijs te meten - een hersenstamgebied dat inactief is tijdens de Rapid Eye Movement (REM)-slaap - voor en tijdens algemene anesthesie.

Acute single-unit multi-elektrode-opnames van de hersenstam van muizen met een hoofdfixatie

Leer elektrofysiologische opnamen van ademhalingsritmes uit geïsoleerde hersenstam-ruggenmergpreparaten van pasgeboren ratten. Deze methode maakt farmacologisch onderzoek naar neurale ademhalingsregulatie mogelijk.

Elektrofysiologie op Geïsoleerde hersenstam ruggenmerg voorbereidingen van pasgeboren knaagdieren Hiermee Neural Network Respiratory Output Opname (Video) | JoVE Journal

Elektrofysiologie op Geïsoleerde hersenstam ruggenmerg voorbereidingen van pasgeboren knaagdieren Hiermee Neural Network Respiratory Output Opname

Meer video's verkennen