Name: Biomembraan Fabrication door de Solvent-geassisteerde lipidedubbellaag (SALB) Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer biomembraanfabricatie via de solvent-geassisteerde lipidedubbellaagmethode op vaste substraten. Deze techniek vereenvoudigt het onderzoek naar membraaneigenschappen en membraaneiwitten voor toepassingen in therapie en diagnostiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen erkennen steun van de National Research Foundation (NRF -NRFF2011-01 en NRF2015NRF-POC0001-19), de National Medical Research Council (NMRC / CBRG / 0005/2012), en de Nanyang Technological University te NJC

1. Vorming van Ondersteunde lipidebilaag op een Hydrofiel Solid Ondersteuning <ol><li> Bereid lipide-voorraadoplossingen van 10 mg / ml 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) en 1 mg / ml 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - (lissamine rhodamine B sulfonyl) (Rh-PE) door het oplossen van de respectievelijke lipide poeders (adequaat vooraf gewogen met een analytische massabalans) in isopropanol oplossing. </li><li> Verdun en meng de voorraadoplossingen in isopropanol om het gewenste lipide mengsel te bereiden op de eindconcentratie. Voor fluorescentie microscopie en FRAP experimenten dient 0,5 gew% Rh-PE worden opgenomen in het lipidemengsel. </li><li> Injecteer het lipide mengsel in isopropanol in het microfluïdische kanaal totdat deze gevuld is. </li><li> Incubeer het lipide mengsel op het glas gedurende 10 min. </li><li> Geleidelijk vervangen lipideoplossing met water of bufferoplossing met behulp van een peristaltische pomp bij een zeer lage stroomsnelheid(10-50 pl / min). Als alternatief, vervang de lipidemengsel door herhaalde pipetteren. </li><li> Spoel het kanaal grondig met overmaat buffer om het residuele isopropanol te verwijderen. </li></ol> 2. Vorming van-cholesterol verrijkt Ondersteunde Membranen Opmerking: de stevige ondergrond (SiO 2) ondersteunt blaasje fusie, maar het membraan samenstelling (hoge cholesterol) remt blaasje fusie omdat cholesterol verrijkt blaasjes hebben hoge buigstijfheid 30. <ol><li> Bereid een voorraadoplossing van 10 mg / ml lipide DOPC, 10 mg / ml cholesterol en 1 mg / ml Rh-PE door eerst de respectieve poeders in isopropanol. </li><li> Herhaal stap 1,2-1,6 met behulp van de voorraad oplossingen bereid in stap 2.1. </li></ol> 3. Membraan Fluidity Assay <ol><li> Dompel het glaasje in natriumdodecylsulfaat (SDS) oplossing (1%) gedurende 10 min. </li><li> Was de dia&#39;s grondig met gedemineraliseerd water en spoel with ethanol. </li><li> Föhn dia&#39;s met behulp van een zachte stroom van stikstof. </li><li> Maak de objectglaasjes zuurstofplasma gedurende 30 seconden bij maximum vermogen in radiofrequentie zuurstof plasmakamer. </li><li> Verwijder de beschermende film coating van de bodemloze commerciële microfluïdische kamer (figuur 1A) met behulp van een pincet en bevestig het glaasje op de kleverige kant van de kamer (Figuur 1B). </li><li> Monteer de connectoren en slangen in de inlaat en uitlaat posities van de kamer en plaats de microfluïdische kanaal op de microscooptafel (figuur 1C). </li><li> Vorm een fluorescent-gelabelde ondersteunde lipide dubbellaag in de microfluïdische kanalen [herhaal stap 1 met de gewenste lipidensamenstelling (bijvoorbeeld 0,5 mg / ml DOPC) met 0,5 wt% Rh-PE in organisch oplosmiddel]. </li><li> Zoek de bilaag vliegtuig met een 60X olie-immersie objectief (NA 1,49) om beelden vast te leggen. </li><li> Neem twee pre-bleekmiddel afbeeldingen, dan foto-bleken 301; m breed ronde plek met een 532 nm, 100 mW laserstraal. Voordat photobleaching, warmen de laser totdat de intensiteit stabiel is geworden. Direct na fotobleken, Een reeks beelden elke 1 sec gedurende 2 min teneinde het herstel van de fluorescentie-intensiteit zich ter gebleekte vlek. </li></ol> 4. Cholesterol kwantificering Assay <ol><li> Expose siliciumdioxide beklede kwartskristal sensorchip met zuurstofplasma gedurende 30 seconden bij maximum vermogen in radiofrequentie zuurstof plasmakamer. Verwijder de chip uit de kamer en onmiddellijk monteer de chip in de meetkamer. </li><li> Voordat experiment, eerst de frequentie en de afvoer van de sensor chip in de lucht om een ​​goede montage zorgen te verwerven. <ol><li> Voor de commerciële Q-Sense E1 of E4 QCM-D instrument, voert u de Q-Soft programma en klik op &quot;Acquisition&quot; en selecteer &quot;Setup Measurement&quot;. </li><li> In het nieuwe venster dat verschijnt, controleer dan de 3, 5, 7, 9, 11 en 13 boventonen en klik op zoeken en uitvoeren om de resonantiespectra controleren. Stel de temperatuur op 24 ° C. Indien één of meer resonantie frequenties niet eens met de verwachte waarden, check de chip montage en opnieuw uitvoeren van deze stap totdat een akkoord is bereikt. </li></ol></li><li> Start de peristaltische pomp en stroming bufferoplossing (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) in de meetkamer met een stroomsnelheid van 100 pl / min. </li><li> In het programma, klik op &quot;Acquisition&quot; en selecteer &quot;Restart Measurement&quot; om de resonantiefrequentie en energie dissipatie signalen opnemen. Herhaal deze stap tot een stabiele basislijn wordt verkregen voor de frequentie en de dissipatie verschuivingen. Opmerking: voor de stappen hierna, maar aanvullende frequentie en dissipatie verschuivingen die kunnen worden geregistreerd als functie van de tijd. </li><li> Injecteer isopropanol (zonder lipiden) gedurende 10 min. </li><li> Injecteer het mengsel van DOPC lipiden / cholesterol in hetgewenste molverhouding met een totale lipide concentratie van 0,5 mg / ml in isopropanol gedurende 10 min. </li><li> Injecteer buffer gedurende 20 min bij een stroomsnelheid van 100 pl / min. </li><li> Injecteer 1 mM oplossing van methyl-β-cyclodextrine (MβCD) bereid in buffer (debiet 100 ul / min) totdat het signaal een stabiele waarde bereikt. </li><li> Meet de relatieve positieve frequentieverschuivingen die wordt veroorzaakt door de MβCD behandelingsstap en bereken de massa van cholesterol en DOPC lipiden door omzetting van de Af cho en Af DOPC waarden massawaarden met de Sauerbrey vergelijking [Δm = - (C / N) x Af, waarbij C = 17,7 ng / cm2, n: ondertoon]. </li><li> Bereken de molfractie van cholesterol in de SLB, rekening houdend met de molecuulgewichten van DOPC lipide (786,1 g / mol) en cholesterol (386,6 g / mol). </li></ol>

<ol><li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membranes%3A+Scientific+and+practical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supported membranes: Scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li>
<li>Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+of+lipid+membranes+analyzed+with+high-resolution+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phase separation of lipid membranes analyzed with high-resolution secondary ion mass spectrometry.</a> Science. 313, 1948-1951 (2006).</li>
<li>Kalb, E., Engel, J., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+proteins+to+specific+target+sites+in+membranes+measured+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of proteins to specific target sites in membranes measured by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biochemistry. 29, 1607-1613 (1990).</li>
<li>Bally, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+GII.+4+Virus-like+Particles+Recognize+Galactosylceramides+in+Domains+of+Planar+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Norovirus GII. 4 Virus-like Particles Recognize Galactosylceramides in Domains of Planar Supported Lipid Bilayers.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 12020-12024 (2012).</li>
<li>Bally, M., Graule, M., Parra, F., Larson, G., Höök, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virus+biosensor+with+single+virus-particle+sensitivity+based+on+fluorescent+vesicle+labels+and+equilibrium+fluctuation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">A virus biosensor with single virus-particle sensitivity based on fluorescent vesicle labels and equilibrium fluctuation analysis.</a> Biointerphases. 8, 10-1186 (2013).</li>
<li>Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+in+studies+on+immune+cell+adhesion+and+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers in studies on immune cell adhesion and communication.</a> Journal of Immunological Methods. 278, 10-1016 Forthcoming.</li>
<li>Mager, M. D., Melosh, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Bilayer+Deposition+and+Patterning+via+Air+Bubble+Collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Lipid Bilayer Deposition and Patterning via Air Bubble Collapse.</a> Langmuir. 23, 9369-9377 (2007).</li>
<li>Lenhert, S., Sun, P., Wang, Y., Fuchs, H., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Dip-Pen+Nanolithography+of+Heterogeneous+Supported+Phospholipid+Multilayer+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography of Heterogeneous Supported Phospholipid Multilayer Patterns.</a> Small. 3, 71-75 (2007).</li>
<li>Mennicke, U., Salditt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+solid-supported+lipid+bilayers+by+spin-coating%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating.</a> Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).</li>
<li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 47, 105-113 (1985).</li>
<li>Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+supported+planar+bilayers+by+fusion+of+vesicles+to+supported+phospholipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Formation of supported planar bilayers by fusion of vesicles to supported phospholipid monolayers.</a> Biochim Biophys Acta. 1103, 307-316 (1992).</li>
<li>Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+vesicle+adsorption+and+supported+biomembrane+formation+from+vesicles+in+solution%3A+influence+of+surface+chemistry%2C+vesicle+size%2C+temperature%2C+and+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure.</a> Langmuir. 19, 1681-1691 (2003).</li>
<li>Cho, N. -J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-Driven+assembly+of+various+supported+lipid+platforms%3A+A+comparative+study+on+silicon+oxide+and+titanium+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: A comparative study on silicon oxide and titanium oxide.</a> Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).</li>
<li>Boudard, S., Seantier, B., Breffa, C., Decher, G., Felix, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+pathway+of+formation+of+supported+lipid+bilayers+of+DMPC+by+varying+the+sodium+chloride+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Thin+Solid+Films%22%5BJournal%5D)">Controlling the pathway of formation of supported lipid bilayers of DMPC by varying the sodium chloride concentration.</a> Thin Solid Films. , 495-4246 (2006).</li>
<li>Stanglmaier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+anionic+phospholipids+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of anionic phospholipids in supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 28, 10818-10821 (2012).</li>
<li>Jackman, J. A., Choi, J. -H., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+osmotic+pressure+on+adhesion+of+lipid+vesicles+to+solid+supports%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Influence of osmotic pressure on adhesion of lipid vesicles to solid supports.</a> Langmuir. 29, 11375-11384 (2013).</li>
<li>Rossetti, F. F., Bally, M., Michel, R., Textor, M., Reviakine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+titanium+dioxide+and+phosphatidyl+serine-containing+liposomes%3A+formation+and+patterning+of+supported+phospholipid+bilayers+on+the+surface+of+a+medically+relevant+material%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Interactions between titanium dioxide and phosphatidyl serine-containing liposomes: formation and patterning of supported phospholipid bilayers on the surface of a medically relevant material.</a> Langmuir. 21, 6443-6450 (1021).</li>
<li>Cho, N. -J., Cho, S. -J., Cheong, K. H., Glenn, J. S., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Employing+an+amphipathic+viral+peptide+to+create+a+lipid+bilayer+on+Au+and+TiO2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Employing an amphipathic viral peptide to create a lipid bilayer on Au and TiO2.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 10050-10051 (2007).</li>
<li>Hardy, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+supported+lipid+bilayers+with+high+cholesterol+content+formed+by+%5Bsmall+alpha%5D-helical+peptide-induced+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by [small alpha]-helical peptide-induced vesicle fusion.</a> Journal of Materials Chemistry. 22, 19506-19513 (2012).</li>
<li>Wallin, M., Choi, J. -H., Kim, S. O., Cho, N. -J., Andersson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-induced+formation+of+a+tethered+lipid+bilayer+membrane+on+mesoporous+silica%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Peptide-induced formation of a tethered lipid bilayer membrane on mesoporous silica.</a> European Biophysics Journal. , 1-10 (2014).</li>
<li>Coutable, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+tethered-lipid+bilayers+on+gold+surfaces+for+the+incorporation+of+integral+membrane+proteins+synthesized+by+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of tethered-lipid bilayers on gold surfaces for the incorporation of integral membrane proteins synthesized by cell-free expression.</a> Langmuir. 30, 3132-3141 (2014).</li>
<li>Zan, G. H., Jackman, J. A., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AH+peptide-mediated+formation+of+charged+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">AH peptide-mediated formation of charged planar lipid bilayers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 118, 3616-3621 (2014).</li>
<li>Jackman, J. A., Zhao, Z., Zhdanov, V. P., Frank, C. W., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+adhesion+and+rupture+on+silicon+oxide%3A+Influence+of+freeze%E2%80%93thaw+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Vesicle adhesion and rupture on silicon oxide: Influence of freeze–thaw pretreatment.</a> Langmuir. 30, 2152-2160 (2014).</li>
<li>Tabaei, S. R., Choi, J. -H., Haw Zan,, Zhdanov, G., P, V., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-Assisted+Lipid+Bilayer+Formation+on+Silicon+Dioxide+and+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Solvent-Assisted Lipid Bilayer Formation on Silicon Dioxide and Gold.</a> Langmuir. 30, 10363-10373 (2014).</li>
<li>Hohner, A., David, M., Rädlera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+solvent-exchange+deposition+of+phospholipid+membranes+onto+solid+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Controlled solvent-exchange deposition of phospholipid membranes onto solid surfaces.</a> Biointerphases. 5, 1-8 (2010).</li>
<li>Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, S. -O., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-Assisted+Lipid+Self-Assembly+at+Hydrophilic+Surfaces%3A+Factors+Influencing+the+Formation+of+Supported+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly at Hydrophilic Surfaces: Factors Influencing the Formation of Supported Membranes.</a> Langmuir. 31, 3125-3134 (2015).</li>
<li>Tabaei, S. R., Vafaei, S., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Charged+Membranes+by+the+Solvent-Assisted+Lipid+Bilayer+%28SALB%29+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Method+on+SiO2+and+Al2O3.+Physical+Chemistry+Chemical+Physics.%2C+doi%3A10.1039%2FC5CP01428J%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Charged Membranes by the Solvent-Assisted Lipid Bilayer (SALB) Formation.</a> Method on SiO2 and Al2O3. Physical Chemistry Chemical Physics., doi:10.1039/C5CP01428J. , (2015).</li>
<li>Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembly+Formation+of+Lipid+Bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Coatings+on+Bare+Aluminum+Oxide%3A+Overcoming+the+Force+of+Interfacial+Water.+ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Self-Assembly Formation of Lipid Bilayer.</a> Coatings on Bare Aluminum Oxide: Overcoming the Force of Interfacial Water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).</li>
<li>Keller, C., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+specific+kinetics+of+lipid+vesicle+adsorption+measured+with+a+quartz+crystal+microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance.</a> Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).</li>
<li>Sundh, M., Svedhem, S., Sutherland, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+phase+separating+lipids+on+supported+lipid+bilayer+formation+at+SiO2+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Influence of phase separating lipids on supported lipid bilayer formation at SiO2 surfaces.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 453-460 (2010).</li>
<li>Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz+crystal+microbalance+with+dissipation+monitoring+of+supported+lipid+bilayers+on+various+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates.</a> Nature Protocols. 5, 1096-1106 (2010).</li>
<li>Beseničar, M. P., Bavdek, A., Kladnik, A., Maček, P., Anderluh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+cholesterol+extraction+from+lipid+membranes+by+methyl-%CE%B2-cyclodextrin%E2%80%94A+surface+plasmon+resonance+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Kinetics of cholesterol extraction from lipid membranes by methyl-β-cyclodextrin—A surface plasmon resonance approach.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1778, 175-184 (2008).</li>
<li>Pedersen, S., Jørgensen, K., Baekmark, T. R., Mouritsen, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+evidence+for+lipid-domain+formation+in+the+transition+region+of+phospholipid+bilayers+by+two-probe+fluorescence+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Indirect evidence for lipid-domain formation in the transition region of phospholipid bilayers by two-probe fluorescence energy transfer.</a> Biophysical journal. 71, 554-560 (1996).</li>
<li>Okonogi, T., McConnell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast+inversion+in+the+epifluorescence+of+cholesterol-phospholipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Contrast inversion in the epifluorescence of cholesterol-phospholipid monolayers.</a> Biophysical Journal. 86, 880-890 (2004).</li>
<li>McConnell, H. M., Radhakrishnan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensed+complexes+of+cholesterol+and+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Condensed complexes of cholesterol and phospholipids.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1610, 159-173 (2003).</li>
<li>Tabaei, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Cholesterol-Rich+Supported+Membranes+Using+Solvent-Assisted+Lipid+Self-Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of Cholesterol-Rich Supported Membranes Using Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly.</a> Langmuir. 30, 13345-13352 (2014).</li>
<li>Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Liedberg, B., Parikh, A. N., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+Stripe+Superstructure+in+the+%CE%B2-Two-Phase+Coexistence+Region+of+Cholesterol%E2%80%93Phospholipid+Mixtures+in+Supported+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Observation of Stripe Superstructure in the β-Two-Phase Coexistence Region of Cholesterol–Phospholipid Mixtures in Supported Membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136, 16962-16965 (2014).</li>
<li>Salamon, Z., Wang, Y., Tollin, G., Macleod, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+molecular+organization+of+self-assembled+lipid+bilayers+on+solid+substrates+monitored+by+surface+plasmon+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Assembly and molecular organization of self-assembled lipid bilayers on solid substrates monitored by surface plasmon resonance spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. , 1195-11267 (1994).</li>
<li>Yuan, C., Johnston, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+evolution+in+cholesterol%2FDPPC+monolayers%3A+atomic+force+microscopy+and+near+field+scanning+optical+microscopy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Phase evolution in cholesterol/DPPC monolayers: atomic force microscopy and near field scanning optical microscopy studies.</a> Journal of microscopy. 205, 136-146 (2002).</li>
<li>Schneider, J., Dufrêne, Y. F., Barger, W. R. Jr, Lee, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscope+image+contrast+mechanisms+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscope image contrast mechanisms on supported lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 79, 1107-1118 (2000).</li>
<li>Tamm, L. K., Tatulian, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+spectroscopy+of+proteins+and+peptides+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+reviews+of+biophysics%22%5BJournal%5D)">Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers.</a> Quarterly reviews of biophysics. 30, 365-429 (1997).</li>
<li>Miller, C. E., Majewski, J., Gog, T., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+biological+thin+films+at+the+solid-liquid+interface+by+X-ray+reflectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Characterization of biological thin films at the solid-liquid interface by X-ray reflectivity.</a> Physical Review Letters. 94, 238104(2005).</li>
<li>Koenig, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+reflectivity+and+atomic+force+microscopy+studies+of+a+lipid+bilayer+in+water+adsorbed+to+the+surface+of+a+silicon+single+crystal%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal.</a> Langmuir. 12, 1343-1350 (1996).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te onthullen.

In dit werk, wordt een oplosmiddel-uitwisseling protocol voorgesteld waarin lipiden alcohol (isopropanol, ethanol of n-propanol) worden geïncubeerd met een vaste drager en daarna de alcohol geleidelijk vervangen door een waterige bufferoplossing teneinde een reeks drijven van faseovergangen uiteindelijk produceren lamellaire fase lipidendubbellagen 24. Er wordt aangetoond dat de methode kan vervaardigen ondersteunde lipide dubbellagen op oppervlakken zoals goud, die hardnekkig het blaasje fusiemethode. Een optimale lipide concentratiebereik (0,1-0,5 mg / ml) werd bepaald voor complete vorming dubbellaag in standaard experimentele formats dusver getest. Bij lipide concentraties onder 0,1 mg / ml, discrete microscopische stukken bilagen gevormd. Anderzijds, bij concentraties boven 0,1 mg / ml en lager dan 0,5 mg / ml, is een volledige en gelijkmatige bilaag gevormd. Op lipide concentraties boven deze range, werd een vloeistof bilayer nog gevormd als verificatieed door FRAP analyse echter fluorescentiemicroscopie onthult de aanwezigheid van extra lipidestructuren bovenop de bilaag. Opvallend is dat de morfologie van deze bijkomende lipidestructuren, zoals bepaald met QCM-D analyse, afhankelijk van de alcohol die gebruikt werd tijdens de incubatiestap. In het geval van ethanol, de relatief hoge Δ f en Δ D verschuivingen lijken op de QCM-D signature verkregen voor een geadsorbeerde laag vesicle. Wanneer isopropanol of n-propanol werd gebruikt in de Δ f iets hoger dan de waarde verwacht voor een dubbellaag (laatste Δ f tussen -30 tot -40 Hz), terwijl Δ D was aanmerkelijk hoger. Dergelijke QCM-D reacties te verwachten voor uitgebreide lipidestructuren (bijv wormachtige micellen) buitenwaarts uitsteekt uit het membraanoppervlak (zoals zichtbaar door fluorescentiemicroscopie in sommige gevallen). De snelheid van de oplosmiddel uitwisseling is een andere belangrijke parameter die kritisch kan zijn, especially bij lagere lipide concentraties (bijvoorbeeld 0,1 mg / ml) gebruikt. Snelle omwisseling oplosmiddel bij lage lipide concentratie kan leiden tot de vorming van incomplete bilagen. In de standaard meetkamer gebruikt voor QCM-D metingen in dit document (Q-Sense E4 meetkamer), debiet van ongeveer 100 ui / min, waren geschikt voor zeer reproduceerbare volledige dubbellaagsformatie. Voor stroom cellen met andere geometrieën en volume, kan de optimale stroomsnelheid variëren en moet empirisch worden bepaald op basis van de hierin voorgestelde maatregelen. Naast ondersteunde lipide dubbellagen vormen op oppervlakken die hardnekkig vesikel fusie zijn, kan de SALB worden toegepast om de noodzaak van lipide vesicles die kunnen scheuren, waardoor de deur naar de vervaardiging van ondersteunde membranen met complexe samenstellingen omzeilen. Als illustratief voorbeeld samenstelling werden lipidemengsels met een grote fractie van cholesterol onderzocht. Cholesterol is een belangrijke component van Mammalian celmembranen, en zijn fractie kan benaderen 45-50 mol% van het membraan lipide samenstelling (bijvoorbeeld in erytrocyten). Derhalve moet ook een eenvoudig model van een lipide bilaag die een menselijke celmembraan omvatten cholesterol. Terwijl vesikel fusie kan worden om vloeibare lipide dubbellagen die slechts 10-15% cholesterol fabriceren, kan de werkwijze SALB vorming van vloeibare lipide dubbellagen met een hoog fracties cholesterol (tot 57 mol%, zoals gekwantificeerd door QCM-D metingen) 36. Wanneer echter het cholesterolgehalte verder werd verhoogd (tot 63 mol%) werden domeinen streep-vorm 37 waargenomen. De co-bestaande domeinen vloeistof denken aan die waargenomen in de β regio in het fasediagram van de cholesterol / fosfolipiden monolaag aan het lucht-water grensvlak. Over het algemeen wordt de SALB methode getoond om een ​​eenvoudige en efficiënte aanpak op ondersteunde lipide bilagen te vormen, met name in gevallen buiten het bereik van de conventionele vesikel fusie methode. Tot nu toe werden de QCM-D techniek en fluorescentiemicroscopie voornamelijk gebruikt om de ondersteunde lipide bilagen gevormd door SALB wijze karakteriseren. Kijken, een breed scala van oppervlakte-gevoelige analytische meettechnieken, zoals oppervlakte plasmon resonantie (SPR) 38, atomic force microscopie (AFM) 39,40, Fourier-transformatie infrarood spectroscopie 41, X-ray 42 en neutronen reflectiviteit 43 kan, worden gebruikt voor het verder karakteriseren en studie eenvoudige en complexe configuraties dubbellaag Bereid middels de werkwijze SALB. Deze nieuwe mogelijkheden opent de deur naar een groter aantal wetenschappers die kunstmatige celmembranen kunnen verkennen door gebruik te maken van een eenvoudige en robuuste experimentele protocol.

De vaste drager lipide bilaag 1 (SLB) is een veelzijdig platform dat de basiskenmerken van biomembranen behoudt zoals de dubbellaag dikte, tweedimensionale lipide diffusievermogen, en de mogelijkheid om membraangebonden biomoleculen gastheer. Vanwege de complexiteit van natuurlijke celmembranen, heeft deze eenvoudige platform getoond gefunctioneerd als efficiënt platform in vitro studies membraan processen zoals raft vorming 2, eiwitbinding 3, virussen en virusachtige deeltje bindende 4,5 en cell signaling 6. Gevormd in de nabijheid van een vaste drager, de SLB platform is compatibel met een reeks oppervlak-gevoelige meettechnieken als totale interne reflectie microscopie (TIRF), kwartskristalmicrobalans-dissipatie (QCM-D) en impedantiespectroscopie. Verschillende werkwijzen zijn ontwikkeld om verschillende soorten SLBs, waaronder luchtbel producereninstorting 7 en dip-pen nanolithografie 8 voor submicron-sized lipide vlekken, spin-coating 9 voor tweelaags stacks en Langmuir-Blodgett (LB) 10 en blaasje fusion (VF) 11 voor full-spanning, enkel lipidedubbellaag coatings. De VF werkwijze omvat de adsorptie van kleine unilamellaire vesicles een vaste drager en daaropvolgende spontane breuk en fusie met een continu lipide dubbellaag vormen. Echter, onder fysiologische omstandigheden, spontane breuk vesikel is voornamelijk bedoeld silicium gebaseerde materialen zoals siliciumdioxide, glas en mica. Bovendien is vesicle breuk niet spontaan blaasjes voor complexe lipide samenstellingen zoals die met hoge fracties van cholesterol of negatief geladen lipiden. Afhankelijk van het systeem kan vesicles scheuren worden geïnduceerd door verdere afstemming van de experimentele condities zoals temperatuur 12, 13 oplossing pH en zoutgehalte 14, osmotische shock 15 </sup&gt; of druk 16 of toevoeging van bivalente ionen, zoals Ca2 + 17. Alternatief kan het membraan-actieve peptide AH worden ingevoerd om een laag geadsorbeerd blaasjes destabiliseren, waardoor scheuren en vesikel bilaag vorming op een reeks oppervlakken 18-22. Bovendien vereist een succesvolle dubbellaagsformatie bereiding van een goed gecontroleerde populatie van kleine unilamellaire vesicles die tijdrovend en moeilijk te bereiken voor bepaalde membraan preparaten kunnen worden. Daarom, ondanks het hoge rendement optimaal gevallen (bijvoorbeeld na uitgebreide vries-dooi voorbehandeling van vesicles 23), de algemene toepassing van vesikel fusie wordt beperkt door de reikwijdte van geschikte substraten en membraan preparaten. Werkwijze 24-28-oplosmiddel ondersteunde lipide dubbellaag (SALB) is een alternatieve fabricagetechniek die lipide vesicles niet vereist. De werkwijze berust op de afzetting of lipide moleculen aan een vast oppervlak in aanwezigheid van een water mengbaar organisch oplosmiddel, gevolgd door geleidelijke uitwisseling van deze oplosmiddelen met een waterige bufferoplossing teneinde SLB vorming veroorzaken. Tijdens het oplosmiddel-uitwisselingsstap, het ternaire mengsel van lipiden, organisch oplosmiddel en water ondergaat een serie faseovergangen met toenemende water fractie, wat leidt tot de vorming van lamellaire fase structuren in de bulk oplossing en een SLB op het vaste substraat. Belangrijk is dat deze zelfassemblage route omzeilt de noodzaak van vesicles scheuren, gewoonlijk de beperkende stap voor de transformatie van geadsorbeerde vesicles in een SLB. Het protocol is toepasbaar op diverse oppervlakken zoals siliciumdioxide, aluminiumoxide, chroom, indium tinoxide, en goud. In dit document en de bijbehorende video, wordt de vergelijking van lipideafzetting de SALB en vesicle fusiemethoden gepresenteerd. Met name de invloed van de experimentele criteria zoals lipideconcentratie, Stroomsnelheid, en de keuze van water mengbaar organisch oplosmiddel, de kwaliteit van de bilaag gevormd door de SALB methode besproken. Analytische karakterisering van de vervaardigde SLBs wordt uitgevoerd door de QCM-D, fluorescentiemicroscopie en fluorescentieherstel na fotobleken (FRAP) technieken. QCM-D bewaking is een oppervlakte-gevoelige massa meettechniek die sinds het pionierswerk uitgevoerd door Keller en Kasemo 29, is uitgebreid gebruikt om kwantitatief onderzoek dubbellaagsformatie. Fluorescentie microscopie maakt controle van membraan homogeniteit en de visualisatie van membraandomeinen. De FRAP techniek is een standaard hulpmiddel om de laterale beweeglijkheid van lipide moleculen in een SLB, hetgeen een essentiële eigenschap van vloeibare membranen te bepalen. Het eerste deel van deze studie omvat QCM-D analyse van de SALB en vesikel fusie methoden toegepast dubbellaagsformatie op siliciumdioxide en goud proberen. In het tweede deel,de bereiding en karakterisering van ondersteunde membranen met verschillende soorten cholesterol concentraties met SALB methode gedemonstreerd en de resultaten vergeleken met die verkregen door het blaasje fusie methode.

<table><tbody><tr><td>QCM-D siliciumdioxide-gecoate substraten</td><td>QSense AB,&nbsp; Zweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QCM-D goud-gecoate substraten</td><td>QSense AB,&nbsp; Zweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Sense E4 module</td><td>QSense AB,&nbsp; Zweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaner, PDC-32G</td><td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td><td>PDC-001 (115V)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(lissamine rodamine B sulfonyl) (ammoniumzout) (Rh-PE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810150P</td><td></td></tr><tr><td>cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&beta;-cyclodextrine</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>673773</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>n-propanol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>279544</td><td></td></tr><tr><td>Sticky-Slide I 0.1 Luer</td><td>IBIDI</td><td>81128</td><td></td></tr><tr><td>Mannelijke elleboog 1/8&rdquo;</td><td>Cole-Parmer</td><td>30505-70</td><td></td></tr><tr><td>Siliconen slang 1,6&#160;mm ID</td><td>IBIDI</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Glazen dekglas No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Reglo Digital M2-2/12 Peristaltische pomp</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>71725</td><td></td></tr></tbody></table>

biomembraan fabrication door de solvent-geassisteerde lipidedubbellaag (salb) methode

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Om celmembranen na te bootsen, de ondersteunde lipidedubbellaag (SLB) is een aantrekkelijk platform waarmee in vitro onderzoek van membraan-gerelateerde processen, terwijl het verlenen van biocompatibiliteit en biofunctionality aan vaste substraten. De spontane adsorptie en breuk van fosfolipide vesicula is de meest gebruikte methode om SLBs vormen. Echter, onder fysiologische omstandigheden, vesicle fusie (VF) is beperkt tot slechts een deel van lipidesamenstellingen en vaste dragers. We beschrijven hier een eenstaps algemene procedure genaamd de oplosmiddelvrije ondersteunde lipide dubbellaag (SALB) de vorming methode om SLBs die geen vesicles vormen vereist. De SALB werkwijze omvat de afzetting van lipide moleculen aan een vast oppervlak in de aanwezigheid van met water mengbare organische oplosmiddelen (bijvoorbeeld isopropanol) en daaropvolgende solvent-uitwisseling met waterige bufferoplossing teneinde SLB vorming veroorzaken. De continue oplosmiddel stap uitwisseling maakt de toepassing van deWerkwijze in een doorstroom configuratie geschikt voor bewaking dubbellaagsformatie en daaropvolgende wijzigingen via uiteenlopende oppervlakte-gevoelige biosensoren. De SALB werkwijze kan worden gebruikt om SLBs fabriceren op uiteenlopende hydrofiele vaste oppervlakken, zoals die welke hardnekkig vesikel fusie zijn. Bovendien maakt fabricage van SLBs samengesteld lipidesamenstellingen die niet kunnen worden bereid met de vesicle fusiemethode. Hierin vergelijken we de resultaten verkregen met de SALB en conventionele blaasjes fusiemethoden twee illustratieve hydrofiele oppervlakken, siliciumdioxide en goud. Om de experimentele omstandigheden voor de bereiding van hoogwaardige bilagen bereid via de SALB werkwijze te optimaliseren, is het effect van verschillende parameters, waaronder het type organisch oplosmiddel in de depositiestap de snelheid van uitwisseling van oplosmiddel en de lipide concentratie besproken met probleemoplossingstips . Vorming van ondersteunde membranen die hoge fracties van cholesterol is ook demonencentreerde de SALB methode, aandacht voor de technische mogelijkheden van de SALB techniek voor een breed scala van membraan configuraties.

We presenteren een experimenteel protocol naar een ondersteunde lipidebilaag op vaste substraten te vormen zonder gebruik van lipide blaasjes. We tonen een eenstaps werkwijze op een lipide dubbellaag op siliciumdioxide en goud en ondersteunde membranen met cholesterol verrijkte domein voor verschillende biologische toepassingen te vormen.

Biomembraan Fabrication door de Solvent-geassisteerde lipidedubbellaag (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Het algemene doel van deze procedure is het vervaardigen van ondersteunde membranen via de solvent-geassisteerde lipidendubbellaagmethode. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de membraanbiologie, zoals het begrijpen van de fundamentele eigenschappen van lipiden en membraaneiwitten, en maakt toepassingen mogelijk zoals geneesmiddelenontwikkeling en moleculaire diagnostiek. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het in veel gevallen mogelijk maakt om ondersteuningslipiden laag voor laag op te bouwen, wat met de conventionele methode niet mogelijk is.De procedure is bovendien eenvoudig in gebruik en vereist minimale monstervoorbereidingen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot onze therapie en diagnostiek, omdat het de bestudering van belangrijke drugtargets, zoals membraaneiwitten, mogelijk maakt. De methode kan ook worden gebruikt voor het vervaardigen van biocompatibele substraten voor toepassingen in de materiaalkunde.We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we spraken over de moeilijkheidsgraad van conventionele methoden voor membraanfabricage; het aantonen van de procedure zal toegankelijk en begrijpelijk zijn voor promovendi uit ons laboratorium. Bereid een lipidenstockoplossing van 10 mg/mL DOPC-lipiden door het lipidenpoeder op te lossen in een isopropanoloplossing. Los vervolgens rhodamine-gelabeld DOPE-lipidenpoeder op in een isopropanoloplossing om een lipidenstockoplossing van 1 mg/mL te verkrijgen.Verdun en meng de stockoplossingen in isopropanol om het gewenste lipidenmengsel te bereiden in de eindconcentratie voor fluorescentie, microscopie en experimenten voor fluorescentieherstel na fotobleken of frap; 0,5 gewichtsprocent R domine gelabelde DOPE moet in het lipidenmengsel worden opgenomen. Injecteer het lipidenmengsel in isopropanol in het microfluïdische kanaal totdat dit gevuld is. Incubeer het lipidenmengsel op het glasoppervlak gedurende ongeveer 10 minuten.De zoutuitwisseling moet met een zeer lage stroomsnelheid worden uitgevoerd, anders zal de kwaliteit van de dubbellaag laag zijn. Vervang de lipidoplossing geleidelijk door water of een bufferoplossing met behulp van een peristaltische pomp bij een zeer lage stroomsnelheid. Spoel het kanaal vervolgens grondig met een overmaat aan buffer om het resterende isopropanol te verwijderen voor de vorming van cholesterol-verrijkte ondersteunde membranen.Bereid een stokoplossing bestaande uit DOPC, lipide cholesterol en rho domine, gelabeld DOPE-lipide, door de betreffende poeders eerst op te lossen in isopropanol en vervolgens hetzelfde protocol als voorheen te herhalen om de membraanvloeibaarheidsanalyse uit te voeren. Dompel het glazen objectglas eerst gedurende 10 minuten onder in een 1% natrium-ESAL-sulfaatoplossing. Was de objectglazen daarna grondig met gedeïoniseerd water en spoel ze af met ethanol.Droog de objectglazen met een zachte stroom stikstof. Stel de objectglazen vervolgens 30 seconden lang bloot aan zuurstofplasma bij maximaal radiofrequent vermogen in de zuurstofplasmakamer. Verwijder daarna met een pincet de beschermende foliecoating van de bodemloze commerciële microfluïdische kamer en bevestig het glazen objectglas op de plakzijde van de kamer.Monteer de connectoren en slangetjes in de inlaat- en uitlaatposities van de kamer en plaats het microfluïdische kanaal op de microscooptafel. Vorm, zoals voorheen, een fluorescent gelabelde ondersteunde lipiden-dubbellaag in het microfluïdische kanaal met de gewenste lipidensamenstelling, inclusief 0,5 gewichtsprocent rho domine, gelabelde DOPE Lipid Inorganic solvent. Lokaliseer vervolgens het vlak van de dubbellaag met een 60 x olie-immersieobjectief. Om beelden vast te leggen, moeten er eerst twee preble-beelden worden genomen vóór het fotobleken.Warm de laser op totdat de intensiteit stabiel is geworden. Fotobleach vervolgens een cirkelvormige spot van 30 micron breed met een 532 nanometer 100 milliwatt laserstraal. Direct na het fotobleachen.Leg elke seconde een reeks beelden vast gedurende twee minuten om het herstel en de fluorescentie-intensiteit op de bleach-spot te volgen voor de cholesterolkwantificering. Stel eerst de met siliciumdioxide gecoate kwartskristalsensorchip gedurende 30 seconden bloot aan zuurstofplasma bij maximaal radiofrequentievermogen in de zuurstofplasmakamer. Verwijder de chip uit de kamer en monteer deze onmiddellijk in de meetkamer; hierbij wordt vóór het experiment een Q Sense E four A vierkanaals kwartskristalmicrobalans gebruikt.Stel de frequentie en dissipatie van de sensor en lucht vast om een correcte montage te garanderen. Gebruik hiervoor het qof-softwareprogramma. Klik op acquisition en selecteer setup measurement in het nieuwe venster dat verschijnt; vink de 3 5 7 9 11 en 13 boventonen aan.Klik vervolgens op find en run. Om de resonantiespectra te controleren, stelt u de temperatuur in op 24 °C. Zodra de juiste montage is bereikt, start u de peristaltische pomp en laat u bufferoplossing in de meetkamer stromen met een stroomsnelheid van 100 µL per minuut; klik in het softwareprogramma op acquisition en selecteer restart measurement om de resonantiefrequentie en de energiedissipatiesignalen te registreren.Herhaal deze stap tot een stabiele basislijn is verkregen voor de frequentie- en dissipatieverschuivingen. Injecteer de isopropanol zonder lipide gedurende 10 minuten.Volg dit met de injectie van het DOPC-lipide- en cholesterolmengsel in de gewenste molaire verhouding, met een totale lipideconcentratie van 0,5 mg/mL in isopropanol gedurende 10 minuten. Injecteer vervolgens gedurende 20 minuten buffer met een stroomsnelheid van 100 µL/min. Injecteer daarna een oplossing van 1 mM methyl-beta-cyclodextrine bereid in buffer totdat het frequentiesignaal een stabiele waarde bereikt.Meet de relatieve positieve frequentieverschuivingen die worden veroorzaakt door de behandelingsstap met methyl-bèta-cyclodextrine en bereken de massa aan cholesterol en DOPC-lipiden zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereken vervolgens de molaire fractie cholesterol in de ondersteunde lipide dubbellaag, rekening houdend met de molecuulgewichten van het DOPC-lipide en cholesterol. Hier wordt een representatieve fluorescentiemicroscopie-afbeelding getoond van een DOPC-lipide dubbellaag met 0,5 gewichtsprocent rhodamine-gelabeld DOPE-lipide, gevormd op glasoppervlakken via de SAL-methode.Het experiment voor fluorescentieherstel na fotobleken toonde bijna volledig herstel van de fluorescentie aan, wat wijst op de laterale vloeibaarheid van de lipidendubbellaag. Hier zijn representatieve QCMD-curven van frequentie- en dissipatieverschuivingen voor de vorming van een ondersteunde dubbellaag weergegeven. Met gebruik van de SAL-methode werden uiteindelijke resonantiefrequentieverschuivingen en dissipatieverschuivingen bereikt, die overeenkomen met de vorming van een vlakke dubbellaag zodra deze beheerst wordt.Deze techniek kan in 30 minuten worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het fabriceren van ondersteunde biomembranen met behulp van de solvent-geassisteerde lipide-bilayer-methode. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat verse lipide-oplossingen vóór het experiment moeten worden bereid en dat de solvent-uitwisselingsflux moet worden geoptimaliseerd op basis van uw experimentele opstelling. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals Atomic force microscopy, worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de vorming van membraandomainen.

biomembrane-fabrication-solvent-assisted-lipid-bilayer-salb

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In this video, we demonstrate a procedure to investigate septin organization on a glass-supported lipid bilayer in vitro using total internal reflection fluorescence microscopy.

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: A Microscopy-Based In Vitro Technique to Investigate Septin Assembly on Biological Membrane Mimics

This video describes the technique of studying the septin protein assembly on microspheres coated with lipid bilayers. This technique helps in understanding the curvature-dependent assemblies of protein on curved surfaces.

Spherical Supported Lipid Bilayer Assay: A Technique to Observe the Septin Assembly on Microspheres

Ondersteunde lipide dubbellagen en natuurlijke membraan deeltjes zijn handig systemen die de eigenschappen van celmembranen kunnen benaderen en diverse analytische strategieën worden opgenomen. Hier laten we een werkwijze voor het bereiden microarrays samengesteld ondersteunde lipide-bilaag beklede SiO2 parels, fosfolipide vesicula of natuurlijke membraan deeltjes.

Vorming van biomembraan Microarrays met een zuigmond-gebaseerde Vergadering Methode

Hier wordt de bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde planaire glas-ondersteunde lipide bilayers, de bepaling van eiwitmobiliteit binnen en de meting van eiwitdichtheden getoond. Een routekaart voor het bouwen van een ruisonderdrukte Total Internal Reflection microscoop wordt geschetst, die het mogelijk maakt om enkele bilayer-residente fluorochromen met hoge ruimtelijk-temporele resolutie te visualiseren.

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

We tonen een opgeslagen of vervoerd lipidedubbellaag formatie systeem. Een lipide dubbellaag membraan kan worden gevormd binnen 1 uur meer dan 80% succes als een bevroren membraan precursor tot omgevingstemperatuur wordt gebracht. Dit systeem tijdrovend proces en deskundigheid geassocieerd met ionkanalen verminderen.

Geautomatiseerde lipidebilaagmembraan Vorming Met behulp van een Polydimethylsiloxane Thin Film

Hier presenteren we twee ultrasnelle protocollen voor reconstructie van membraaneiwitten in fusogenic proteoliposomes, en de fusie van dergelijke proteoliposomes met doel lipide bilayers voor wasmiddel-gratis bezorging van deze membraaneiwitten binnen de postfusion dubbelgelaagde. De combinatie van deze benaderingen kan snel en gemakkelijk-gecontroleerde vergadering van complexe multi-component membraan systemen.

Wasmiddel-vrije ultrasnelle reconstitutie van membraaneiwitten in lipide-Bilayers met behulp van Fusogenic aanvullende geladen Proteoliposomes.

Mitochondriale fusie is een belangrijke homeostatische reactie die ten grondslag ligt aan mitochondriale dynamiek. Hier beschreven is een in vitro reconstitution systeem om mitochondriale binnenmembraan fusie die membraan tethering, docking, hemifusion, en porie opening kan oplossen. De veelzijdigheid van deze aanpak bij het verkennen van celmembraansystemen wordt besproken.

Een modelmembraanplatform voor het reconstrueren van mitochondriale membraandynamica

Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.

Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties

Celvrije reconstitutie is een belangrijk hulpmiddel geweest om de cytoskeletassemblage te begrijpen, en het werk in het afgelopen decennium heeft benaderingen vastgesteld om septinedynamica in minimale systemen te bestuderen. Hier worden drie complementaire methoden gepresenteerd om septineassemblage in verschillende membraancontexten te observeren: vlakke bilayers, sferische steunen en staafsteunen.

Reconstitutie van septineassemblage bij membranen om biofysische eigenschappen en functies te bestuderen

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de binding, mobiliteit en assemblage van afzonderlijke moleculen op kunstmatige overvolle lipidemembranen uit te voeren en te analyseren met behulp van single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopie.

Single-Molecule Diffusie en assemblage op polymeer-crowded lipide membranen

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe monsters te maken voor single-eiwittracking in solid-supported lipid bilayers. Het verklaart ook een eenvoudige fluorescentiemicroscoop met enkelvoudige moleculegevoeligheid en een hoge framerate. Tot slot beschrijven we de procedure voor het extraheren van single-protein trajecten.

Tracking van enkele eiwitten in lipide-dubbellagen met behulp van fluorescentiemicroscopie

Leer biomembraanfabricatie via de solvent-geassisteerde lipidedubbellaagmethode op vaste substraten. Deze techniek vereenvoudigt het onderzoek naar membraaneigenschappen en membraaneiwitten voor toepassingen in therapie en diagnostiek.

Biomembraan Fabrication door de Solvent-geassisteerde lipidedubbellaag (SALB) Methode

Meer video's verkennen