Layer-by-layer Collageen depositie in Microfluïdische Inrichtingen voor Microtissue Stabilization
29 september 2015
De creatie van functionele microweefsels binnen microfluïdische apparaten vereist de stabilisatie van celfenotypen door traditionele celkweektechnieken aan te passen aan de beperkte ruimtelijke dimensies in microapparaten. Aanpassing van collageen maakt de laag-voor-laag afzetting van ultradunne collageenstructuren mogelijk die primaire cellen, zoals hepatocyten, kunnen stabiliseren als microfluïdische weefselmodellen.
Het algemene doel van deze procedure is om een dunne collageensamenstelling op cellen in een microfluïdisch apparaat af te zetten. Dit wordt bereikt door eerst aangezuurd natieve collageen aan te passen door methylering om collageenmoleculen met een netto positieve lading te creëren. De tweede stap is om aangezuurd natieve collageen aan te passen door ation om collageenmoleculen met een netto negatieve lading te creëren.
Vervolgens worden de microfluïdische apparaten voorbereid en gezaaid met hepatocyten, die overnacht mogen hechten en zich verspreiden. De laatste stap is om de collageensamenstelling af te zetten door de cellen afwisselend bloot te stellen aan de positief en negatief geladen collageenoplossingen om 10 bilaagse collageenlagen bovenop de cellagen te creëren. Uiteindelijk worden fase- en immunofluorescentiemicroscopie en albumine- en ureumtests gebruikt om de ontwikkeling en het behoud van celpolariteit en secretoire functie te laten zien.
De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het hepatocytencultuur in microapparaten mogelijk maakt met behulp van vergelijkbare technieken als die welke al meer dan 20 jaar in plaatculturen worden toegepast. Het vereist geen complexe apparaatdesigns en de afgezet matrix is zeer dun in de orde van 100 nanometer. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode tijdens een brainstorm over hoe we celcultuurtechnieken van Capy in klassen van platen naar microfluïdische apparaten konden vertalen.
De collageensandwichmethoden werkt in open top microscopische systemen, maar de gebruikte hydrogels zijn niet compatibel met gesloten microapparaten met beperkte kanaalhoogten. Verdun 100 milligram van een natieve aangezuurde collageenoplossing tot een concentratie van 0,5 milligram per milliliter met ijs, koud, steriel water en plaats de oplossing op ijs om alation te voorkomen. Pas vervolgens de pH van de collageenoplossing aan tot tussen negen en 10 met een paar druppels een normale natriumhydroxide en roer de oplossing zachtjes gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
Naarmate het collageen precipiteert, zal de oplossing troebel beginnen te worden, centrifugeer de geprecipiteerde collageenoplossing 3000 keer G gedurende 25 minuten. Daarna zou een heldere gelachtige precipitaat zichtbaar moeten zijn in de bodem van de buizen, aspireer de snat en suspendeer vervolgens het geprecipiteerde collageen in 200 milliliter methanol met 0,1 normaal zoutzuur, laat de methyleringsreactie gedurende vier dagen op kamertemperatuur plaatsvinden terwijl je roert. Na de methylering centrifugeer de oplossing op 3000 keer G gedurende 25 minuten om het gemethyleerde collageen te pellen, aspireer en verwijder vervolgens de aangezuurde methanolsnat. Los vervolgens het gemethyleerde collageen op in 25 milliliter steriel PBS en filter de oplossing door een 60 micron celzeven.
Pas de pH van de oplossing aan tot 7,3 tot 7,4 met incrementen van 20 microliter van een normale natriumhydroxide. Bepaal de concentratie van de collageenoplossing met behulp van een commercieel rattencollageen ELIZA-kit of hydroxyproline-assaykit. Verdun vervolgens de oplossing tot drie milligram per milliliter met steriel PBS.
Steriliseer de gemethyleerde collageenoplossing door deze over te brengen naar een glazen fles met een schroefdop. Laag voor laag 3 milliliter chloroform op de bodem van de fles en laat de fles een nacht bij vier graden Celsius staan. De volgende ochtend.
Verwijder aseptisch de bovenste gemethyleerde collageenlaag. Bewaar het gemethyleerde collageen bij vier graden Celsius en gebruik het binnen een maand. Verdun nog eens 100 milligram natieve aangezuurde collageenoplossing tot een concentratie van 0,5 milligram per milliliter met ijs, koud, steriel water en plaats de oplossing op ijs om dation te voorkomen zoals eerder getoond, pas de pH van de collageenoplossing aan met natriumhydroxide en roer de oplossing op kamertemperatuur om het collageen te precipiteren.
Los vervolgens 40 milligram zes cynic anhydride op in 10 milliliter aceton. Voeg dit mengsel langzaam toe aan de collageenoplossing in incrementen van 0,5 milliliter terwijl je roert en continu de pH van de oplossing controleert. Houd de pH boven 9,0 door een of twee druppels een normale natriumhydroxide toe te voegen terwijl de pH 9,0 nadert, roer continu gedurende 120 minuten op kamertemperatuur.
Na het toevoegen van alle zes cynic anhydrideoplossing, observeer dat het mengsel helder wordt terwijl het succinaatcollageen oplost, blijf de pH periodiek controleren om ervoor te zorgen dat deze boven 9,0 blijft. Wanneer al het succinaatcollageen is opgelost, pas de pH van de oplossing aan tot 4,0 met incrementen van 20 microliter van een normale zoutzuur. Observeer dat de oplossing opnieuw troebel wordt terwijl het succinaatcollageen precipiteert.
Centrifugeer vervolgens de oplossing gedurende 25 minuten bij 3000 keer G. Om het succinaatcollageen te pellen, aspireer en verwijder de aangezuurde snat met niet-reactieve snic anhydride, los het succinaatcollageen op door herhaaldelijk te pipetten in 25 milliliter steriel PBS tot een eindconcentratie van ongeveer drie milligram per milliliter. Filter vervolgens de oplossing door een 60 micron celzeven en pas vervolgens de pH van de oplossing aan tot tussen 7,3 en 7,4.
Gebruik incrementen van 20 microliter van een normale natriumhydroxide om de concentratie van de oplossing te bepalen met behulp van een commercieel collageenratten ELIZA-kit of hydroxyproline-assaykit. Verdun vervolgens de oplossing tot drie milligram per milliliter. Gebruik steriel PBS om deze gemethyleerde collageenoplossing te steriliseren op dezelfde manier als de gemethyleerde collageenoplossing.
Begin met het fabriceren van een microfluïdisch apparaat met standaardtechnieken die kweekkamers met kanalen van 100 micron hoog, 0,4 tot 1,5 millimeter breed en een tot 10 millimeter lang voor celgroei bevatten. Gebruik een plasmareiniger om de oppervlakken van het apparaat en een glazen plaat te oxideren. Druk vervolgens de twee samen om een binding te vormen.
Na het steriliseren van het apparaat door blootstelling aan UV-licht gedurende minimaal
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het afzetten van een dunne collageensamenstelling op cellen binnen een microfluïdisch apparaat om celfenotypen te stabiliseren. De methode omvat het modificeren van collageen om positief en negatief geladen moleculen te creëren, die afwisselend worden afgezet om een multilaagstructuur te vormen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Microfluidica
- Celcultuur
- Weefsel engineering
Achtergrond
- Microweefsels zijn essentieel voor het nabootsen van orgaanfuncties.
- Stabilisatie van celfenotypen is cruciaal in microfluïdische toepassingen.
- Collageen is een sleutelcomponent in weefsel engineering.
- Laag-voor-laag afzettingstechnieken verbeteren celfunctionaliteit.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor collageensamenstellingsafzetting in microfluïdische apparaten.
- Om primaire cellen zoals hepatocyten te stabiliseren voor weefselmodellering.
- Om celpolariteit en secretoire functies na afzetting te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Modificatie van natieve collageen door methylering en ation.
- Bereiding van microfluïdische apparaten en zaaien met hepatocyten.
- Laag-voor-laag afzetting van collageen door cellen afwisselend bloot te stellen aan geladen oplossingen.
- Gebruik van fase- en immunofluorescentiemicroscopie, samen met albumine- en ureumtests.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle afzetting van 10 bilayers van collageen op hepatocyten.
- Bewezen behoud van celpolariteit.
- Bevestigde secretoire functie van hepatocyten door middel van assays.
- Visuele weergave van structurele integriteit met behulp van microscopietechnieken.
Conclusies
- De methode stabiliseert effectief celfenotypen in microapparaten.
- Laag-voor-laag collageenafzettingen verbeteren de functionaliteit van weefselmodellen.
- Deze aanpak kan worden toegepast op andere celtypen voor verschillende toepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Stabilizing primary hepatocyte morphology and function in microfluidic devices remains a critical challenge for liver tissue modeling and drug metabolism studies. This layer-by-layer collagen deposition technique enables long-term culture of microtissues by creating ultrathin, biocompatible matrices that recapitulate key aspects of the native extracellular matrix. By supporting differentiated phenotypes for over 14 days, the method improves predictive confidence in preclinical hepatocyte-based assays, reducing biological variability that can compromise lead identification and safety screening outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of hepatocyte-specific pathways by maintaining polarized morphology and secretory function essential for target validation in liver disease models.
- Operational Value: Reduces phenotypic drift during culture, increasing reproducibility of functional readouts used to de-risk mechanistic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized collagen-coated microfluidic platforms that support quantitative albumin and urea assays for consistent compound screening.
- Operational Value: Compatible with existing microfluidic fabrication workflows, allowing scalable integration into automated screening systems without complex device redesign.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains hepatocyte differentiation and function over two weeks, supporting preclinical continuity from discovery to toxicology studies.
- Operational Value: Extends the usable window for longitudinal assessment of drug-induced liver injury (DILI) biomarkers in microfluidic tissue models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by enabling stable hepatocyte cultures that support early-stage assay development and preclinical validation of liver-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by preserving hepatocyte polarity and function, which are critical for assessing target engagement in metabolic pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts via albumin and urea secretion, facilitating reliable compound evaluation in microtissue formats.
- Analytics: Generates functional endpoints that allow cross-condition comparison of hepatocyte health and metabolic activity.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by stabilizing phenotypes needed for disease-relevant modeling.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable surface modification technique applicable across multiple microfluidic platforms and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through maintenance of differentiated hepatocyte phenotype and function over extended culture periods.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via ultrathin, precisely deposited collagen layers that minimize batch variability.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing false negatives from dedifferentiated cells in liver toxicity screening.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of candidates based on stable, long-term functional readouts from microfluidic liver models.
Implementation Considerations
- Expertise in collagen chemistry and microfluidic device preparation is required for methylation and succination steps.
- Access to centrifugation, pH control, and sterile filtration infrastructure is necessary for collagen modification.
- Standardization across teams depends on consistent layering timing and solution handling to ensure uniform thin-film deposition.
- Adaptation to other cell types requires validation of collagen compatibility and impact on phenotype stability.
- Practical limitations include the incompatibility of hydrogels with closed microfluidic devices having limited channel heights, as noted in the source.
