Name: Layer-by-layer Collageen depositie in Microfluïdische Inrichtingen voor Microtissue Stabilization (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Leer laag-voor-laag collageendepositie in microfluïdische apparaten met gemodificeerd collageen om hepatocyten te stabiliseren. Deze methode behoudt celpolariteit en secretorische functie voor weefselmodellering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health, inclusief een microfysiologisch systemen consortium subsidie van het National Center for Advancing Translational Sciences (UH2TR000503), een Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Postdoctoral Fellowship (F32DK098905 voor WJM) en pathway naar onafhankelijkheid award (DK095984 voor AB) van het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.

1. Voorbereiding van de Native Oplosbare Collageen Solution <ol><li> Bereid of aankoop 200 mg aangezuurd oplosbaar type I collageen van staarten rat op 1-3 mg / ml middels standaard isolatietechnieken protocollen zoals beschreven door Piez et al. 15 </li><li> Schaal de hoeveelheid uitgangsmateriaal op basis van het gewenste eindvolume van gemodificeerd collageen oplossingen. Ongeveer maken 25-30 ml methylalcohol en 25-30 ml gesuccinyleerd collageen oplossingen, elk met 3 mg / ml, 200 mg oplosbaar natief collageen. </li></ol> 2. Collageen Methylering <ol><li> Verdun 100 mg van de natieve, aangezuurd (pH 2-3) collageenoplossing tot een concentratie van 0,5 mg / met ijskoud steriel water ml en houd de oplossing op ijs gelering te voorkomen. </li><li> Stel de pH van het collageen oplossing 9-10 met een paar druppels 1 N NaOH en roer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Let op de collageen neerslag, waardoor de oplossing troebel. </li&gt; <li> Spin down de neergeslagen collageen oplossing bij 3000 x g gedurende 25 min. Een heldere, gelachtige precipitaat moet zichtbaar op de bodem van de buisjes. Aspireren en correct afvoeren van de bovenstaande vloeistof. </li><li> Resuspendeer het neergeslagen collageen in 200 ml methanol met 0,1 N HCl en laat de methyleringsreactie optreden onder roeren bij kamertemperatuur gedurende 4 dagen. Het collageen lost niet op, maar moet apart breken in zeer kleine stukjes zichtbaar dat de oplossing troebel maken. </li><li> Na methylatie Centrifugeer de oplossing bij 3000 xg gedurende 25 min naar het gemethyleerde collageen pellet. Aspireren en afvoeren van de aangezuurde methanol supernatant. </li><li> Los het gemethyleerde collageen in 25 ml steriel PBS, waardoor een concentratie van ongeveer 3 mg / ml, met herhaalde pipetteren, en filtreer de oplossing door een 60 urn zeef cel. Stel de pH van de oplossing 7,3-7,4 via 20 gl stappen van 1 N NaOH. </li><li> Beoordeel de concentration van de oplossing met behulp van een commercieel rat collageen ELISA-kit of hydroxyproline testkit. Verdun de oplossing 3 mg / ml met steriele PBS. </li><li> Steriliseer de gemethyleerde collageenoplossing door deze naar een glazen flesje met een schroefdop, zorgvuldig lagen 3 ml chloroform op de bodem van de fles, zodat de fles O / N ingesteld op 4 ° C, en vervolgens aseptisch verwijderen en de toplaag, welke de gemethyleerd collageen. </li><li> Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor gebruik binnen 1 maand. </li></ol> 3. Collageen succinileringsgraad <ol><li> Verdun de andere 100 mg van de natieve, aangezuurd (pH 2-3) collageenoplossing tot een concentratie van 0,5 mg / met ijskoud steriel water ml en houd de oplossing op ijs gelering te voorkomen. </li><li> Stel de pH van het collageen oplossing 9-10 met een paar druppels 1 N NaOH en roer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Het collageen moet neerslaan, waardoor de oplossing troebel. </li><li> Los op 40 mg succinic anhydride (0,4 mg per mg collageen) in 10 ml aceton (1/20 ste het volume van de collageenoplossing). Langzaam (ongeveer 0,5 ml stappen) voeg dit mengsel aan de collageenoplossing onder roeren terwijl continu de pH. Handhaving van de pH boven 9,0 door toevoeging van 1 of 2 druppels 1 N NaOH de pH 9,0 bereikt. </li><li> Blijf roeren bij kamertemperatuur 120 min na het toevoegen van alle barnsteenzuuranhydride in aceton. Neem de oplossing duidelijk worden als de gesuccinyleerde collageen oplost. Controleer regelmatig de pH-waarde om ervoor te zorgen dat boven 9,0 blijft. </li><li> Stel de pH van de oplossing tot 4,0 met 20 gl stappen van 1 N HCl. Neem de oplossing bewolkt weer, omdat de gesuccinyleerde collageen neerslaat. </li><li> Na succinileringsgraad Centrifugeer de oplossing bij 3000 xg gedurende 25 min naar het gesuccinyleerde collageen pellet. Aspireren en afvoeren van de bovenstaande aangezuurd met gereageerde barnsteenzuuranhydride. </li><li> Los de gesuccinyleerd collageenin 25 ml steriel PBS, waardoor een concentratie van ongeveer 3 mg / ml, met herhaalde pipetteren, en filtreer de oplossing door een 60 urn zeef cel. Stel de pH van de oplossing 7,3-7,4 via 20 gl stappen van 1 N NaOH. </li><li> Beoordeel de concentratie van de oplossing met behulp van een commercieel collageen rat ELISA-kit of hydroxyproline testkit. Verdun de oplossing 3 mg / ml met steriele PBS. </li><li> Steriliseer de gesuccinyleerde collageenoplossing door deze naar een glazen flesje met een schroefdop, zorgvuldig lagen 3 ml chloroform op de bodem van de fles, zodat de fles O / N ingesteld op 4 ° C, en vervolgens aseptisch verwijderen en de toplaag, welke de gesuccinyleerde collageen. </li><li> Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor gebruik binnen 1 maand. </li></ol> 4. Verificatie van de Collagen Wijzigingen <ol><li> Bereid 1 ml monsters van elk van de natieve, gemethyleerd en gesuccinyleerd collageen oplossingen en verdun tot een concentration van 0,1 mg / met steriel zuiver water waterstofionen titratie ml. Verdun de buffer tenminste 1000-voudig door dialyse tegen water door een 10 kDa cutoff membraneusing 3 oplossing verandert gedurende ten minste 4 uur elk. </li><li> Stel de pH van de oplossingen tot 7,3 met kleine hoeveelheden NaOH en HCl. Gebruik van pH 7,3 als een willekeurige referentie voeren waterstofionen titratie op elk van de monsters zoals beschreven door Tanford 16 titratie curven voor de natieve, gemethyleerd en gesuccinyleerd collageen oplossingen. </li><li> Plot de pH verandering per volume zuur versus het aantal gebonden H + -ionen per molecuul toegevoegd. De hoge pH &quot;amino&quot; bereik zou een verschuiving in de gesuccinyleerde collageen aan het sterpunt (verlies van aminegroepen) vertonen, en de lage pH &quot;carboxyl&quot; bereik zou een verschuiving naar links in de gemethyleerde collageen (een verlies van carboxylgroepen blijkt ) en een verschuiving naar rechts in de gesuccinyleerde collageen (een winst in carboxylgroeps), vergeleken met het natief collageen. </li><li> Beoordelen van de werkzaamheid van de succinilerings- reactie door bepaling van het% van de aminogroepen in de natieve collageen vervangen door succinyleren met de 2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuur (TNBA) colorimetrische methode volgens standaard protocollen 17,18. </li></ol> 5. Fabricage van microfluïdische apparaten en Cell zaaien <ol><li> Fabriceren microfluïdische apparaten met behulp van standaard methoden 9. Gebruik replica gieten van PDMS van de SU-8 masters op silicium gedefinieerd met behulp van fotolithografie om microfluïdische celkweek kamers te creëren met 100 micrometer lang, 0,4-1,5 mm breed, en 1-10 mm lange kanalen voor celgroei. </li><li> Gebruik een plasma cleaner om de oppervlakken van het apparaat en een glasplaatje oxideren en druk samen om obligatie. Na het steriliseren van de inrichting door blootstelling aan UV licht gedurende ten minste 30 min, vult de kamer met 50 ug / ml fibronectine in steriele PBS en incubeer bij 37 ° C gedurende 45 min. </li&gt; <li> Zaad van de inrichting met cellen, zoals primaire rat en humane hepatocyten, waarbij een collageengel voor het stabiliseren van fenotype of differentiatie toestand vereist. We maken gebruik van 20 ul van vers geïsoleerde primaire rat hepatocyten 7,19 of in de handel verkrijgbaar gecryopreserveerde primaire humane hepatocyten gezaaid met 14 x 10 6 cellen / ml per apparaat. </li><li> Laat de cellen te hechten voor 4-6 uur, en daarna wassen uit losse cellen en vervang de beplating media met een groei media. Incubeer O / N op volledige cellen waarborgen spreiding en een confluente monolaag van cellen. </li></ol> 6. Laag-voor-laag collageenafzetting <ol><li> In een laminaire stroming weefselkweek kap Bereid voldoende hoeveelheden gemethyleerd en gesuccinyleerd collageen oplossingen voor 10 toepassingen van elke oplossing per apparaat, evenals een paar ml media. Houd de oplossingen op ijs. We maken gebruik van 20 ul (10-15 keer het totale volume van het apparaat) van collageen per laag per apparaat. </li><li> Zijnstrikken met de gemethyleerd (polykationische) oplossing, alternatieve spoelen van de apparaten met 20 ul van gemethyleerd en vervolgens gesuccinyleerd collageen oplossingen, wacht 1 minuut tussen iedere toepassing. Spoel de inrichting in totaal 10 keer per oplossing, die ongeveer 20 minuten moet nemen. Werk snel de tijd de cellen zonder media te minimaliseren. </li><li> Observeren collageen langzaam ophopen aan de ingang / uitgang afhankelijk van de grootte. Als de weerstand tegen stroming toeneemt, spoelt het apparaat een of twee keer met de media, en dan verder gelaagdheid. </li><li> Na het aanbrengen van alle lagen, de inrichting spoel tweemaal met vers medium en terug naar de incubator. Afhankelijk van het celtype, de extracellulaire matrix geïnduceerde morfologische veranderingen, zoals verhoogde polarisatie in hepatocyten, zichtbaar binnen enkele uren moet zijn. </li><li> Bereid representatieve inrichtingen voor transmissie elektronenmicroscopie middels standaardwerkwijzen 9 om de aanwezigheid van een collageen matrix verifiërenmontage bovenop de gekweekte cellen. </li></ol> 7. Stabilisatie van celfenotype en functie <ol><li> Afbeelding de celmorfologie, levensvatbaarheid en polariteit toepassing van standaardmethoden voor het celtype. Voor hepatocyten, beelden verzamelen van meer dan 14 dagen met behulp van fase microscopie, Live / DEAD kleuring voor levensvatbaarheid en CMFDA kleurstof voor apicale polarisatie om de effecten van de collageen afzetting tonen. </li><li> Voor celmorfologie, spoelt het apparaat via de inlaat met een pipet met 20 ul van PBS te spoelen, injecteren 20 pi PBS, en het beeld van het apparaat met behulp van fasecontrastmicroscopie. </li><li> Voor Live / DEAD kleuring, spoelt de inrichting door de inlaat met een pipet met 20 pl PBS te spoelen, injecteren 20 ul van LIVE / DEAD kleuroplossing met DAPI bereid volgens de instructies van de fabrikant, incubeer 30 min bij 37 ° C, spoelen weer apparaat met 20 ul van PBS, en het beeld van het apparaat met behulp van fluorescentie microscopie. </li><li> Voor gal canaliCuli kleuring, spoelt de inrichting door de inlaat met een pipet met 20 pl PBS te spoelen, injecteer 20 gl 2 pM CMFDA kleuroplossing met DAPI bereid volgens de instructies van de fabrikant, incubeer 30 min bij 37 ° C, spoel het apparaat opnieuw met 20 ul van PBS, en het beeld van het apparaat met behulp van fluorescentie microscopie. </li><li> Het verzamelen van de uitgegeven media en meet cellulaire metabolische producten op de juiste tijdstippen over de duur cultuur aan de celfunctie te bepalen. Voor hepatocyten, meet de hoeveelheid albumine en ureum in de media bracht. </li><li> Voer eindpunt functionele analyses van de cellen zelf, zoals het beoordelen enzymactiviteit niveaus antilichaamkleuring of RNA analyse. Voor hepatocyten induceren en het meten van cytochroom P450 enzym activiteiten of fase II vervoeging enzym glutathion S-transferase. </li></ol>

<ol><li>Pedersen, J. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+in+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology in the third dimension.</a> Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).</li>
<li>Glowacki, J., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Collagen scaffolds for tissue engineering.</a> Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).</li>
<li>Vescio, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-like+drug+responses+of+human+tumors+growing+in+three-dimensional+gel-supported+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture.</a> PNAS. 84, 5029-5033 (1987).</li>
<li>Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-adhesive+and+chemotactic+activities+of+thrombospondin-1+for+breast+carcinoma+cells+are+mediated+by+%CE%B13%CE%B21+integrin+and+regulated+by+insulin-like+growth+factor-1+and+CD98%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98.</a> J Biol Chem. 274 (16), 11408-11416 (1999).</li>
<li>Chen, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+differentiation+of+rhesus+monkey+embryonic+stem+cells+in+three%E2%80%90dimensional+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems.</a> Stem Cells. 21 (3), 281-295 (2003).</li>
<li>Whelan, M. C., Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+I+initiates+endothelial+cell+morphogenesis+by+inducing+actin+polymerization+through+suppression+of+cyclic+AMP+and+protein+kinase+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A.</a> J Biol Chem. 278 (1), 327-334 (2003).</li>
<li>Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+function+of+adult+hepatocytes+in+a+collagen+sandwich+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration.</a> Biotechnol Prog. 7 (3), 237-245 (1991).</li>
<li>Decher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fuzzy+Nanoassemblies%3A+Toward+Layered+Polymeric+Multicomposites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites.</a> Science. 277, 1232-1237 (1997).</li>
<li>McCarty, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ultrathin+collagen+nanolayer+assembly+for+3-D+microtissue+engineering%3A+Layer-by-layer+collagen+deposition+for+long-term+stable+microfluidic+hepatocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22TECHNOLOGY%22%5BJournal%5D)">A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture.</a> TECHNOLOGY. 2 (01), 67-74 (2014).</li>
<li>Swierczewska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+nanoscale+elastin-like+polypeptide+polyelectrolyte+multilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers.</a> Acta Biomater. 4 (4), 827-837 (2008).</li>
<li>Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+in+vitro+liver+sinusoid+mimics+using+chitosan-hyaluronic+acid+polyelectrolyte+multilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Pt+A%22%5BJournal%5D)">The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers.</a> Tissue Eng Pt A. 16 (9), 2731-2741 (2010).</li>
<li>Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+Multicellular+Organotypic+3D+Liver+Model+with+a+Detachable%2C+Nanoscale+Polymeric+Space+of+Disse%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Pt+C%22%5BJournal%5D)">Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse.</a> Tissue Eng Pt C. 19 (11), 875-884 (2013).</li>
<li>Kidambi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Co%E2%80%90Culture+of+Primary+Hepatocytes+and+Fibroblasts+Using+Polyelectrolyte+Multilayer+Templates%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates.</a> Macromol Biosci. 7 (3), 344-353 (2007).</li>
<li>Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+elastin-like+polypeptide-polyelectrolyte+complexes+to+control+hepatocyte+morphology+and+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro.</a> Biomaterials. 29 (6), 625-632 (2008).</li>
<li>Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chromatographic+Separation+and+Amino+Acid+Composition+of+the+Subunits+of+Several+Collagens%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*.</a> Biochemistry. 2 (1), 58-66 (1963).</li>
<li>Tanford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interpretation+of+hydrogen+ion+titration+curves+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins.</a> Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).</li>
<li>Cayot, P., Tainturier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantification+of+protein+amino+groups+by+the+trinitrobenzenesulfonic+acid+method%3A+a+reexamination%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination.</a> Anal Biochem. 249 (2), 184-200 (1997).</li>
<li>Kakade, M. L., Liener, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+available+lysine+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of available lysine in proteins.</a> Anal Biochem. 27 (2), 273-280 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Ultradunne pure collageen samenstellingen kunnen worden gestort op rekening gebracht cellen of materiaal oppervlakken met behulp van laag-voor-layer deposition van gemodificeerde collageen. De resultaten van deze studie tonen aan dat methylatie en succinylatie van natief collageen maken polykation en polyanion collageen oplossingen (figuur 1) die kan worden gebruikt met de laag-voor-laag techniek om ultradunne collageen matrix samenstellingen afzetten op cellen (figuur 2) of andere gela...

Hoewel microfluïdica de mogelijkheid biedt om het cellulaire micro-omgeving nauwkeurig te controleren, kan het cultiveren van cellen, met name primaire cellen, in microfluïdische apparaten een uitdaging zijn. Veel traditionele celkweektechnieken zijn ontwikkeld om de celfunctie te ondersteunen en te stabiliseren wanneer ze in weefselkweekplaten worden gekweekt, maar het is vaak moeilijk om die technieken te vertalen naar microfluïdische apparaten.
Een van die technieken is het kweken van cellen op of ertussen in collageengels als een model van de fysiologische 3D-celomgeving.1 Type I collageen is een van de meest gebruikte eiwitten voor biomateriaaltoepassingen vanwege zijn alomtegenwoordigheid in de extracellulaire matrix, natuurlijke overvloed, robuuste celanhechtende sites en biocompatibiliteit.2 Veel cellen profiteren van 3D-kweek met collageen, waaronder kankercellen3,45, microvasculaire endotheelcellen6 en hepatocyten7, onder anderen. Hoewel het gebruik van collageengels gemakkelijk is in open formaten, zoals weefselkweekplaten, maken de beperkte kanaalafmetingen en de gesloten aard van microfluïdische apparaten het gebruik van vloeistoffen die geleren onpraktisch zonder het hele kanaal te blokkeren.
Om dit probleem te overwinnen, hebben we de laag-voor-laag depositietechniek8 gecombineerd met chemische modificaties van natuurlijke collageenoplossing om ultradunne collageenassemblages bovenop cellen te creëren die in microfluïdische apparaten zijn gekweekt. Deze lagen kunnen de celmorfologie en functie stabiliseren, vergelijkbaar met collageengels, en kunnen op cellen in microfluïdische apparaten worden gedeponeerd zonder de kanalen te blokkeren met gepolymeriseerde matrix. Het doel van deze methode is om natuurlijk collageen aan te passen om polycationische en polyanionische collageenoplossing te creëren en cellen in microfluïdische kweek te stabiliseren door dunne collageenmatrixassemblages op de cellen te deponeren. Deze techniek is gebruikt om de morfologie en functie van primaire hepatocyten in microfluïdische apparaten te stabiliseren.9
Hoewel laag-voor-laag depositie eerder is gerapporteerd met natuurlijke en synthetische polyelektrolyten10 om hepatocyten in plaatkweek11,12 te bedekken en als een zaailaag voor hepatocyten in microfluïdische apparaten13,14, beschrijft deze methode de depositie van een zuivere collageenlaag bovenop hepatocyten, die de 3D-collageenkweektechnieken nabootst. In dit protocol gebruiken we hepatocyten als voorbeeldcellen die kunnen worden onderhouden met 3D-collageenlagen. De vele andere soorten cellen die profiteren van 3D-kweek in collageen kunnen op vergelijkbare wijze profiteren van kweek na laag-voor-laag depositie van een ultradunne collageenmatrixassemblage.

<table><tbody><tr><td>collageen type I, rattenstaart</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301</td><td>optie voor geconcentreerd rattenstaart collageen</td></tr><tr><td>collageen type I, rattenstaart</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>optie voor geconcentreerd rattenstaart collageen</td></tr><tr><td>collageen type I, rattenstaart</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115</td><td>optie voor geconcentreerd rattenstaart collageen</td></tr><tr><td>collageen type I, rattenstaart</td><td>R%D Systems</td><td>3440-100-01</td><td>optie voor geconcentreerd rattenstaart collageen</td></tr><tr><td>succinezuuranhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239690-50G</td><td>succinyleringsreagens</td></tr><tr><td>watervrij methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-100ML</td><td>methyleringsreagens</td></tr><tr><td>natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>pH-precipitatiereagens</td></tr><tr><td>zoutezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td>pH-precipitatiereagens</td></tr><tr><td>ratten collageen type I ELISA</td><td>Chondrex</td><td>6013</td><td>optie voor het detecteren van collageengehalte</td></tr><tr><td>hydroxyproline assay kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK008-1KT</td><td>optie voor het detecteren van collageengehalte</td></tr><tr><td>hydroxyproline assay kit</td><td>Quickzyme Biosciences</td><td>QZBtotcol1</td><td>optie voor het detecteren van collageengehalte</td></tr></tbody></table>

layer-by-layer collageen depositie in microfluïdische inrichtingen voor microtissue stabilization

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Hoewel microfluidische systemen een uitstekende controle over de cellulaire micro-omgeving bieden, kan het cultiveren van cellen in microfluïdische apparaten uitdagend zijn. 3D-kweek van cellen in collageen type I-gels helpt om de celmorfologie en functie te stabiliseren, wat noodzakelijk is voor het creëren van microfluïdische weefselmodellen in micro-apparaten. Het vertalen van traditionele 3D-kweektechnieken voor weefselkweekplaten naar microfluïdische apparaten is vaak moeilijk vanwege de beperkte afmetingen van de kanalen. In deze methode beschrijven we een techniek voor het aanpassen van natuurlijk type I collageen om polycationische en polyanionische collageenoplossing te genereren die kunnen worden gebruikt met laag-voor-laag afzetting om ultradunne collageensamenstellingen op cellen te creëren die in microfluïdische apparaten zijn gekweekt. Deze dunne collageenlagen stabiliseren de celmorfologie en functie, zoals getoond met primaire hepatocyten als voorbeeldcel, waardoor de lange termijn kweek van microweefsels in microfluïdische apparaten mogelijk wordt.

Natief collageen kan worden gewijzigd met behulp van methylering en succinileringsgraad te polykation en polyanion collageen oplossingen voor gebruik in laag-voor-laag depositie creëren. Succinileringsgraad wijzigt de ε-aminogroepen van natief collageen met succinyl groepen en methylering wijzigt de carboxylgroepen van natief collageen met een methylgroep (Figuur 1A). Deze modificaties aan het collageen eiwit aminozuurzijketens weg pH titratie krommen voor oplossingen. Succinileringsgraad vermindert het...

De creatie van functionele microweefsels binnen microfluïdische apparaten vereist de stabilisatie van celfenotypen door traditionele celkweektechnieken aan te passen aan de beperkte ruimtelijke dimensies in microapparaten. Aanpassing van collageen maakt de laag-voor-laag afzetting van ultradunne collageenstructuren mogelijk die primaire cellen, zoals hepatocyten, kunnen stabiliseren als microfluïdische weefselmodellen.

Layer-by-layer Collageen depositie in Microfluïdische Inrichtingen voor Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Het algemene doel van deze procedure is om een dunne collageenassemblage op cellen in een microfluïdisch apparaat te deposeren. Dit wordt bereikt door eerst gezuurd natief collageen te modificeren via methylering om netto positief geladen collageenmoleculen te creëren. De tweede stap is om gezuurd natief collageen te modificeren via ation om netto negatief geladen collageenmoleculen te creëren.Vervolgens worden de microfluïdische apparaten voorbereid en gezaaid met hepatocyten, waarna deze een nacht de tijd krijgen om aan te hechten en uit te spreiden. De laatste stap is het aanbrengen van de collageensamenstelling door de cellen afwisselend bloot te stellen aan positief en negatief geladen collageenoplossingen om 10 billagen collageen bovenop de cellaag te creëren. Ten slotte worden fasecontrast- en immunofluorescentiemicroscopie en albuminen- en ureumassays gebruikt om de ontwikkeling en het behoud van de celpolariteit en de secretorische functie aan te tonen.De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het hepatocytenkweek in micro-apparaten mogelijk maakt met behulp van technieken die vergelijkbaar zijn met die welke al meer dan 20 jaar in plaatkweken worden toegepast. Het vereist geen complexe ontwerpmodellen van apparaten en de neergeslagen matrix is zeer dun, in de orde van 100 nanometers. We kregen oorspronkelijk het idee voor deze methode tijdens een brainstormsessie over hoe we kweektechnieken voor Capy-cellen van platen naar microfluïdische apparaten konden vertalen.De collageenzandwichmethode werkt in microscopische systemen met een open bovenkant, maar de gebruikte hydrogelen zijn incompatibel met gesloten micro-apparaten met beperkte kanaalhoogtes. Verdun 100 milligram van een native aangezuurde collageenoplossing tot een concentratie van 0,5 milligram per milliliter met ijskoud, steriel water, en plaats de oplossing op ijs om aggregatie te voorkomen. Pas vervolgens de pH van de collageenoplossing aan naar een waarde tussen 9 en 10 met een paar druppels 1 N natriumhydroxide en roer de oplossing voorzichtig 30 minuten lang bij kamertemperatuur.Wanneer het collageen neerslaat, zal de oplossing troebel worden; centrifugeer de neerslag van de collageenoplossing bij 3000 ×g gedurende 25 minuten. Daarna zou een helder, gelachtig neerslag zichtbaar moeten zijn onderin de buisjes; aspireer het supernatant en resuspendeer het neergeslagen collageen vervolgens in 200 milliliters methanol met 0,1 normaal zoutzuur. Laat de methyleringsreactie plaatsvinden onder roering bij kamertemperatuur gedurende vier dagen. Centrifugeer na de methylering de oplossing bij 3000 ×g gedurende 25 minuten om het gemethyleerde collageen te pelletteren, aspireer vervolgens de verzuurde methanol-supernatant en gooi deze weg. Los daarna het gemethyleerde collageen op in 25 milliliters steriele PBS en filter de oplossing door een cellstrainer van 60 micron.Stel de pH van de oplossing in op 7,3 tot 7,4 met stappen van 20 µL 1 N natriumhydroxide. Bepaal de concentratie van de collageenoplossing met behulp van een commerciële rat-collageen ELISA-kit of een hydroxyproline-assaykit. Verdun vervolgens de oplossing tot 3 mg/mL met steriele PBS.Steriliseer de gemethyleerde collageenoplossing door deze over te brengen naar een glazen fles met een schroefdop. Breng voorzichtig drie milliliter chloroform aan als laag onderin de fles en laat de fles een nacht staan bij vier graden Celsius. De volgende ochtend.Verwijder aseptisch de bovenste gemichelateerde collagenlaag. Bewaar het gemichelateerde collageen bij vier graden Celsius en gebruik het binnen één maand. Verdun opnieuw 100 milligram van de natuurlijke verzuurde collageenoplossing tot een concentratie van 0,5 milligram per milliliter met ijskoud, steriel water en plaats de oplossing op ijs om degradatie te voorkomen; stel, zoals eerder getoond, de pH van de collageenoplossing bij met natriumhydroxide en roer de oplossing bij kamertemperatuur om het collageen te laten neerslaan.Los vervolgens 40 milligram six cynic anhydride op in 10 milliliter aceton. Voeg dit mengsel langzaam toe aan de collageenoplossing in stappen van 0,5 milliliter onder roeren en met continue controle van de pH van de oplossing. Houd de pH boven 9,0 door één of twee druppels één normaal natriumhydroxide toe te voegen wanneer de pH 9,0 nadert; blijf 120 minuten continu roeren bij kamertemperatuur.Nadat alle zes de cynide- en hydride-oplossingen zijn toegevoegd, observeer dan dat het mengsel helder wordt naarmate het succinaatcollageen oplost; controleer periodiek de pH om te garanderen dat deze boven de 9,0 blijft. Wanneer al het succinaatcollageen is opgelost, stelt u de pH van de oplossing in op 4,0 met stappen van 20 µL van één normaal zoutzuur. Observeer dat de oplossing opnieuw troebel wordt doordat het succinaatcollageen neerslaat.Centrifugeer vervolgens de oplossing bij 3000 ×g gedurende 25 minuten. Om het succinaatcollageen te pelletteren en de verzuurde supernatant met niet-reactief succinic anhydride te verwijderen, wordt het succinaatcollageen opgelost door herhaaldelijk pipetteren in 25 ml steriele PBS, wat resulteert in een uiteindelijke concentratie van ongeveer 3 mg/ml. Filtreer de oplossing vervolgens door een cellstrainer van 60 µm en stel daarna de pH van de oplossing in op een waarde tussen 7,3 en 7,4.Beoordeel de concentratie van de oplossing met behulp van een commerciële rattencollageen-ELISA-kit of een hydroxyproline-assaykit, waarbij toenames van 20 µL normale natriumhydroxide worden gebruikt. Verdun vervolgens de oplossing tot 3 mg/mL. Steriliseer deze behandelde collageenoplossing met steriele PBS op dezelfde wijze als de gemethyleerde collageenoplossing.Begin met het vervaardigen van een microfluïdisch apparaat met behulp van standaardtechnieken, voorzien van celkweekkamers met kanalen van 100 microns hoog, 0,4 tot 1,5 millimeters breed en één tot 10 millimeters lang voor celgroei. Gebruik een plasmareiniger om de oppervlakken van het apparaat en een glazen objectglas te oxideren. Pers vervolgens de twee tegen elkaar om een verbinding te vormen.Steriliseer het apparaat door het gedurende ten minste 30 minuten aan UV-licht bloot te stellen. Vul de kamer met 15 µg/mL fibronectine in steriele PBS en incubeer dit 45 minuten bij 37 °C. Zaai vervolgens de cellen in het apparaat zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Bereid in een laminaire flow-kast voor weefselkweek voldoende volumes gemethyleerde en niet-gemethyleerde collageenoplossingen voor 10 toepassingen van elke oplossing per apparaat, evenals enkele extra milliliters medium. Bewaar de oplossingen op ijs. Spoel de apparaten afwisselend met 20 µL gemethyleerde en vervolgens niet-gemethyleerde collageenoplossingen.Wacht één minuut tussen elke toepassing. Spoel het apparaat in totaal 10 keer per oplossing. Werk snel om de tijd dat de cellen zonder medium zijn te minimaliseren terwijl de collageenlagen groeien; het is mogelijk om te observeren dat collageen zich langzaam ophoopt bij de inlaat en uitlaat van het microfluïdische apparaat.Als de weerstand tegen de vloeistofstroom toeneemt, spoel het apparaat dan één of twee keer door met medium en ga vervolgens verder met het aanbrengen van de lagen. Nadat alle lagen zijn aangebracht, spoel het apparaat twee keer met vers medium en plaats het terug in de incubator. Methylering en acetylering veranderen de ladingseigenschappen van de collageenmoleculen.Acetylering verwijdert positief geladen groepen en vervangt deze door negatief geladen groepen, en methylering verwijdert negatief geladen groepen, waardoor netto positief geladen moleculen ontstaan; dit maakt laag-voor-laag depositie van de twee collageenvarianten op geladen oppervlakken, zoals cellen, mogelijk. Primaire hepatocyten die zijn gezaaid op met fibronectine gecoate glazen plaatjes binnen een microfluïdisch apparaat, kunnen met deze laag-voor-laag techniek worden gecoat. Bij de assemblage van de collageenmatrix zorgt de depositie van 10 dubbellagen op cellen voor een collageenlaagdikte van ongeveer 140 nanometer bij hepatocyten zonder een bovenliggende laag-voor-laag collageenlaag.Matrices verliezen na verloop van tijd hun gedifferentieerde fenotype, trekken samen en laten los van het oppervlak van microfluïdische apparaten. In contrast hiermee behouden hepatocyten die bedekt zijn met een ultradunne collageenassemblage hun gedifferentieerde morfologie, een levensvatbaarheid van meer dan 90% en hun polarisatie gedurende 14 dagen. Naast de cellevensvatbaarheid, morfologie en polarisatie herstelt en stabiliseert de layer-by-layer-collageentechniek ook de functie van primaire hepatocyten, zoals hier wordt aangetoond. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u collageen moet methyleren en succineren om netto positief en negatief geladen collageenoplossingen te creëren, en hoe u deze kunt gebruiken bij layer-by-layer-depositie om dunne collageenassemblages bovenop cellen in microfluïdische apparaten aan te brengen.

layer-layer-collagen-deposition-microfluidic-devices-for-microtissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Beschrijven we een protocol voor de fabricage van microfluïdische apparaten die cel te vangen en cultuur kunnen inschakelen. In deze benadering patroon microstructuren, zoals groeven in microfluïdische kanalen worden gebruikt om lage shear stress regio's waarbinnen de cel kan dock te creëren.

Een microfluïdische apparaat met Groove patronen voor het bestuderen van Cellular Gedrag

Oprichting van micro-weefsels met behulp van cilindrische collageen gels, genaamd modules, die ingesloten cellen en dat het oppervlak bevatten, is bekleed met endotheelcellen.

Fabricatie van Micro-weefsels met behulp van modules van Collageen gel met cellen

Dit model systeem gaat uit van een myofibroblast-bevolkte fibrine gel die kan worden gebruikt om endogene collageen (her) inrichting real-time op een niet-destructieve manier te bestuderen. Het modelsysteem is zeer instelbaar, als het kan worden gebruikt met verschillende bronnen van cellen, medium additieven, en kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke behoeften.

Techniek Fibrine-based Tissue constructen van myofibroblasten en Application of Constraints en Zeef to Cell en collageen (Re) organisatie Induce

In dit werk presenteren we een techniek voor de snelle fabricage van levend vasculair weefsel door directe cultivatie van collageen, gladde spiercellen en endotheelcellen. Daarnaast wordt een nieuw protocol beschreven voor de mechanische karakterisering van gefabriceerd vasculair weefsel.

Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

We presenteren een methode voor microfluïdische depositie van genipine en fibronectine met een patroon op PDMS-substraten, waardoor een langere levensvatbaarheid van weefsels met een hoge dichtheid aan vasculaire gladde spiercellen mogelijk wordt. Deze weefselfabricagemethode wordt gecombineerd met eerdere technologie voor dunne vaatwandfilms om de vasculaire contractiliteit te meten gedurende tijdsverlopen die relevant zijn voor ziekten.

Microfluïdische Genipin Deposition Techniek voor Extended Cultuur van micropatterned Vascular Gespierd Thin Films

Collageen is een essentieel onderdeel van de ECM en biedt essentiële signalen verscheidene cellulaire processen gaande van migratie differentiatie en proliferatie. Er wordt hier een protocol voor het inbedden van cellen in 3D collageen hydrogels, en een meer geavanceerde techniek voor het genereren van gerandomiseerde of uitgelijnd collageen matrices gebruikt PDMS microkanalen.

Voorbereiding van de 3D Collageen Gels en Microkanalen voor de Studie van 3D-Interacties<em&gt; In Vivo</em

Dit manuscript bevat een spuitgiet methode om microvaten dat fysiologische eigenschappen van endotheel recapituleren ingenieur. De microfluïdische-based proces creëert patent 3D vasculaire netwerken met tailorable omstandigheden, zoals stroom, cellulaire samenstelling, geometrie, en biochemische hellingen. Het fabricageproces en voorbeelden van mogelijke toepassingen worden beschreven.

Micropatterning en montage van 3D microvaten

Dit artikel biedt gedetailleerde methoden voor het vervaardigen en karakteriseren van een pneumatisch bedienend microfluïdisch apparaat voor chondrocyten compressie.

Een Microfluïdisch platform voor het stimuleren van chondrocyten met dynamische compressie

Het doel van dit protocol is om de ontwikkeling van een driedimensionaal (3D) microfluïdisch model van sterk uitgelijnd menselijk hartweefsel, samengesteld uit stamcel-afgeleide cardiomyocyten, samen met hartfibblasten (CFs) in een biomimetische, op collageen gebaseerde hydrogel, uit te leggen en aan te tonen, voor toepassingen in hartweefseltechniek, geneesmiddelenscreening en ziektemodellering.

Het ontwikkelen van 3D georganiseerd menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch platform

Dit protocol demonstreert het gebruik van een microfluïdisch kanaal met veranderende geometrie langs de vloeistofstroomrichting om extensieve spanning (stretching) te genereren om vezels uit te lijnen in een 3D-collageenhydrogel (&lt; 250 μm dik). De resulterende uitlijning strekt zich uit over enkele millimeters en wordt beïnvloed door de extensieve reksnelheid.

Micro-engineering 3D collageen hydrogels met lange-afstand vezeluitlijning

Hier presenteren we een protocol om een uniek tweelaags microfluïdisch apparaat te fabriceren om de elektromechanische regulatie van de homeostase van epitheelweefsel te bestuderen. Het apparaat past statische fysiologische elektrische stromen toe die loodrecht op het weefselvlak staan, wat van invloed is op de adhesie, proliferatie en extrusie van cellen tot cel. Beeldvorming van levende cellen en mechanische stressmetingen onthullen mechanismen van deze processen.

Onthullende elektromechanische controle van weefselhomeostase met behulp van een tweelaags microfluïdisch apparaat

Leer laag-voor-laag collageendepositie in microfluïdische apparaten met gemodificeerd collageen om hepatocyten te stabiliseren. Deze methode behoudt celpolariteit en secretorische functie voor weefselmodellering.

Layer-by-layer Collageen depositie in Microfluïdische Inrichtingen voor Microtissue Stabilization

Meer video's verkennen