Name: Composiet Steigers van Interfacial Polyelectrolyte vezels voor stoffelijk Controlled Release van biomoleculen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Leer hoe je composietsteigers met IPC-vezels maakt voor gecontroleerde afgifte van biomoleculen in weefselengineering. Deze methode bootst de cellulaire niche na met ruimtelijke controle.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Singapore National Research Foundation door een van haar Research Centers of Excellence, de Mechanobiology Institute, Singapore toegediend. MFAC wordt ondersteund door het Agentschap voor Wetenschap, Technologie en Onderzoek (Singapore) en Nationaal Agentschap voor Onderzoek (Frankrijk) gezamenlijk programma onder project nummer 1122703037. BKKT wordt ondersteund door het Mechanobiology Institute. We danken de heer Daniel HC Wong-proof te lezen het manuscript en mevrouw Dawn JH Neo voor het assisteren in de video productie.

1. Voorbereiding van de Polyelectrolyte Solutions <ol><li> Zuiver chitosan, zoals beschreven in Liao et al. Kortom, maak een 1% (w / v) oplossing van chitosan in 2% (v / v) azijnzuur en vacuum filter met rang 93 filtreerpapier. Neutraliseer het filtraat bij gebruik van 5M NaOH tot de pH gestabiliseerd 7. Centrifugeer de geprecipiteerde chitosan bij 1200 xg gedurende 10 min. Decanteer het supernatant en voeg gedeïoniseerd water aan de chitosan wassen. Herhaal de wasstap centrifugeren en twee keer. Bevries de geprecipiteerde chitosan bij -80 ° C en Lyophilize O / N om het gezuiverde vorm te verkrijgen. Bewaar gezuiverd chitosan in een ontvochtigde kast. </li><li> Weeg 1 g gezuiverd chitosan in een steriele weefselkweek schotel. Plaats het chitosan in de weefselkweekplaat zo dicht mogelijk bij de UV-lamp in de bioveiligheidskast en blootstellen aan UV licht gedurende 15 minuten. Met behulp van een steriel pincet, plaatst de gesteriliseerde chitosan in een glazen container. Los chitosan gebruikmaking gefiltreerd 0.15M azijnzuur tot een uiteindelijke concentratie van 0,5% en 1% (w / v). </li><li> Weeg 0,1 g van alginezuur natriumzout en los op in 10 ml gedestilleerd gedeïoniseerd (DDI) water tot een 1% (w / v) oplossing. Meng het alginezuur natriumzout minstens 2 uur op de vortex menger om volledige oplossing te verzekeren. Filter de alginaatoplossing door middel van 0,2 um spuitfilter. Bewaar de alginaat oplossing bij 4 ° C. </li><li> Reconstitueer humaan recombinant groeifactoren zoals vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) of beta - nerve growth factor (NGF), zoals aanbevolen door de fabrikant. </li></ol> 2. Tekening van IPC Fibers <ol><li> Meng eiwitten, groeifactoren of andere biomoleculen in 10-20 pi aliquot van het polyelektrolyt oplossing die een vergelijkbare netto lading heeft. Biologische moleculen met een netto negatieve lading (bijvoorbeeld runderserumalbumine [BSA]) moet worden gemengd met alginaat oplossing. Biologische moleculen met een netto positieve lading (bijvoorbeeld VEGF) moet worden gemengd metchitosan oplossing. </li><li> Plaats kleine hoeveelheden (10-20 pl) van chitosan en alginaat op een stabiele vlakke ondergrond, dat is bedekt met parafilm. De druppels van chitosan en alginaat moet dicht worden geplaatst zonder in contact met elkaar. </li><li> Licht dip elke tip over een pincet in de chitosan en alginaat druppels. Breng de druppels polyelektrolieten elkaar door te knijpen de tang. Wanneer de druppels in contact komen met elkaar, trek de tang verticaal omhoog naar de IPC vezel te trekken uit het grensvlak van de twee druppeltjes (figuur 1A). </li><li> Plaats het einde van de getekende IPC fiber op de tang op een collector, zorgvuldig zoals een platte polymere steiger aangebracht op een roterende doorn (zie hoofdstuk 3 en 4). Draai de doorn met een vaste snelheid van 10 mm / sec tot de vorming van uniforme en beadless IPC vezels mogelijk. Het verhogen van de snelheid van het trekken van de IPC vezels korrels ontstaan ​​die een stootafgifte van geïncorporeerde veroorzakenbiochemische en voortijdige beëindiging vezels. 10 </li><li> Om opnamedoelmatigheid bepalen verzamel alle resterende vloeistof links op de parafilm door verdunning met 500 pi 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Meet het eiwit of groeifactor inhoud van het residu door middel van BCA assay (BSA), ELISA (voor VEGF en NGF) of een geschikte test te detecteren biomolecuul opgenomen. </li></ol> 3. Fabricage van Composite Hydrogel Steiger van Pullulan-Dextran (PD) Polysaccharide en IPC Fibers <ol><li> Fabriceren offer pullulan frame voor IPC fiber collectie <ol><li> Weeg pullulan polysaccharide en meng met gedestilleerd gedeïoniseerd (DDI) water tot een 20% te maken (w / v) waterige oplossing. Meng de pullulanoplossing O / N om homogeniteit te garanderen. </li><li> Cast 15 g pullulan oplossing in een diameter van 10 cm weefselkweek polystyreen (TCPS) schotel. Droog de oplossing pullulan O / N bij 37 ° C. Snijd de pullulan films in 7mm x 7 mm vierkante frames. </li></ol></li><li> Voorbereiding pullulan-dextran polysaccharide oplossing <ol><li> Een 30% (w / v) oplossing van de polysachariden pullulan en dextran (3: 1 verhouding) in DDI water. Mix O / N om de homogeniteit van de polysacharideoplossing waarborgen. Voeg langzaam in natriumbicarbonaat met de polysaccharide oplossing tot een eindconcentratie van 20% te bereiken (gew / v). Mix O / N om de homogeniteit van de oplossing te waarborgen. Bewaar de oplossing polysaccharide bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Verzamelen IPC vezels op pullulan kader <ol><li> Bevestig de opofferende pullulan frame (paragraaf 3.1) met behulp van een alligator clip. Plak de krokodillenklem en pullulan frame op het uiteinde van de roterende doorn met behulp van kunststof bekleed plakband. Draai de doorn met de aangebrachte frame een constante snelheid van 10 mm / sec. Het pullulan frame kan worden bevestigd op de roterende mandrel in de gewenste richtingen. </li></ol></li><li> Teken de IPC vezels met behulp van een pincet (deel 1) en ATTACh het getekende einde van de IPC vezels op de draaiende pullulan frame. Trek de IPC vezels met een constante snelheid. Bij het bereiken van het uiteinde van de IPC vezel, droog de vezels-on-construct O / N bij kamertemperatuur. </li><li> Inbedding IPC vezels in PD hydrogel scaffold </li><li> Voor elke gram van pullulan-dextran oplossing verknopen, voeg 100 pl 11% (w / v) natriumtrimetafosfaat oplossing en 100 ui 10 M natriumhydroxide. 7 Roer de oplossing bij 60 opm met een stirplate gedurende 1 tot 2 minuten. Na toevoeging van natriumtrimetafosfaat en natriumhydroxide, de polysacharideoplossing vrijwel onmiddellijk verknopen. Giet de viskeuze polysaccharide oplossing op de vezels construct-on-frame volledige verankering IPC vezels. Incubeer de gecombineerde pullulan-dextran-IPC vezels (PD-IPC) bij 60 ° C gedurende 30 min een chemisch verknoopte samenstelling scaffolds (figuur 1B) te vormen. </li><li> LET OP: Voer stap 3.3.2 in de zuurkast en het gebruik van de juiste beschermende equipment azijnzuur is een bijtend en brandbaar. </li><li> Om porievorming in de PD-IPC scaffold induceren, onderdompelen gehele steiger 20% (w / v) azijnzuur gedurende 20 min. </li><li> Verwijder ongereageerde reagens door wassen PD-IPC steigers in 1X PBS gedurende 5 minuten onder schudden bij 100 rpm. Herhaal deze stap 2 keer. </li><li> Verwijder de overtollige PBS en de PD-IPC steigers onmiddellijk te bevriezen bij -80 ° CO / N. Lyofiliseren de steigers ten minste 24 uur voor gebruik in een gecontroleerde afgifte of biologische assays. </li></ol> 4. Fabricage van Composite Steiger van PCL en IPC Fibers LET OP: Dichloormethaan is een gevaarlijk materiaal. Gebruik de zuurkast en persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van dichloormethaan. <ol><li> Het creëren van ongerepte en gedessineerde PDMS substraten <ol><li> Maak een ongerepte polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeer substraat met behulp van een stuk TCPS van gewenste afmeting met behulp van zachte lithografie proces. Maak patterned PDMS substraten door standaard zachte lithografische werkwijzen voor poly (methylmethacrylaat) sjablonen met de gewenste topografie. 12 </li></ol></li><li> Fabriceren offer PCL frame voor IPC fiber collectie <ol><li> Weeg PCL en los op in dichloormethaan om 0,9% te maken (w / v) oplossing. Voor elke 1 cm 2 oppervlakte van de PDMS substraat dalen 500 pl 0,9% PCL oplossing. Laat al het dichloormethaan oplosmiddel volledig verdampen in de zuurkast. Herhaal het proces van het gieten van 0,9% PCL de film dikker tot de gewenste dikte. Verwijder de gedroogde film van de PCL PDMS substraat. Maak een gat in de PCL-frame met behulp van een geschikt-sized puncher. 2 </li></ol></li><li> Verzamelen IPC vezels op de PCL kader <ol><li> Bevestig de opofferende PCL frame met gat (van 4.2.1) op een alligator clip. Plak de alligator clip op de draaiende doorn door het gebruik van kunststof gecoate plakband. Bevestig de getekende einde van de IPC vezels op de PCL Frame voordat u de rotatie bij een constante snelheid van 10 mm / sec (deel 2). Na afloop van IPC vezeltrekken, droog de fiber-on-construct O / N bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Inbedding fiber-on frame construct in een patroon PCL substraat <ol><li> Drop 500 pl 0,9% PCL oplossing op het substraat PDMS een ongerept of gepatroneerde PCL base maken, zoals vereist. Gegoten meerdere lagen 0,9% PCL oplossing van een scaffold met de gewenste dikte te verkrijgen. Laat al het dichloormethaan oplosmiddel volledig verdampen in de zuurkast. </li><li> Plaats de fiber-on-construct (sectie 4.3.1) bovenop de PCL base. Voeg 0,9% PCL oplossing op de fiber-on-construct meerdere malen om de gewenste dikte te krijgen en volledige verankering IPC vezels, het vervaardigen van een PCL-IPC composiet scaffold (figuur 1C). </li></ol></li></ol> 5. Meting van het vrijkomen van biologische agentia uit Composite IPC Steigers <ol><li> Plaats composiet PD-IPC ofPCL-IPC steigers en stand-alone IPC vezels afzonderlijk in een 24-wells plaat. </li><li> Dompel het schavot en stand-alone IPC vezels met 500 pi 1X PBS. Incubeer de monsters bij 37 ° C. Verzamel PBS op verschillende tijdstippen (afgiftemedia) en vervangen door 500 pi 1X PBS. </li><li> Meet de hoeveelheid eiwit of groeifactor in afgiftemedia met een BCA assay (BSA), ELISA (VEGF en NGF) of andere geschikte test voor het cumulatieve afgifteprofiel van de opgenomen biomolecuul berekenen. </li></ol> 6. Het zaaien van cellen op Composite IPC Steigers op Test bioactiviteit van Uitgebracht biologische agentia <ol><li> Steriliseer de gevriesdroogde PD-IPC of PCL-IPC composiet scaffolds met UV licht in de biologische veiligheidskast ten minste 20 min. </li><li> Gebruik standaard celkweek technieken om een celsuspensie van 2 x 10 5 cellen te verkrijgen in 200 gl kweekmedium. Seed de geconcentreerde celsuspensie op de composiet steigers. After 20 min, top-up van het volume van de groei media om volledig onderdompelen de steigers. </li><li> Meet cel activiteit door middel van standaard technieken zoals Alamar blauw metabolische activiteit test, PC12 neurietuitgroei assay of immunofluorescentie. </li></ol>

<ol><li>Annabi, N., Tamayol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((25th+Anniversary+Article%3A+Rational+design+and+applications+of+hydrogels+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">25th Anniversary Article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine.</a> Adv. Mater. 26 (1), 85-124 (2014).</li>
<li>Teo, B. K. K., Tan, G. D. S., Yim, E. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synergistic+effect+of+nanotopography+and+sustained+dual+release+of+hydrophobic+and+hydrophilic+neurotrophic+factors+on+human+mesenchymal+stem+cell+neuronal+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">The synergistic effect of nanotopography and sustained dual release of hydrophobic and hydrophilic neurotrophic factors on human mesenchymal stem cell neuronal lineage commitment.</a> Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2151-2161 (2014).</li>
<li>Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+delivery-based+tissue+engineering%3A+general+approaches+and+a+review+of+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments.</a> J. R. Soc. Interface. 8 (55), 153-170 (2011).</li>
<li>Sun, Q., Chen, R. R., Shen, Y., Mooney, D. J., Rajagopalan, S., Grossman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+vascular+endothelial+growth+factor+delivery+enhances+angiogenesis+and+perfusion+in+ischemic+hind+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Sustained vascular endothelial growth factor delivery enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb.</a> Pharm. Res. 22 (7), 1110-1116 (2005).</li>
<li>Rui, J., Dadsetan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+release+of+vascular+endothelial+growth+factor+using+poly-lactic-co-glycolic+acid+microspheres%3A+in+vitro+characterization+and+application+in+polycaprolactone+fumarate+nerve+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits.</a> Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).</li>
<li>King, T. W., Patrick, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+in+vitro+characterization+of+vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF%29-loaded+poly%28DL-lactic-co-glycolic+acid%29%2Fpoly%28ethylene+glycol%29+microspheres+using+a+solid+encapsulation%2Fsingle+emulsion%2Fsolvent+extraction+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Development and in vitro characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF)-loaded poly(DL-lactic-co-glycolic acid)/poly(ethylene glycol) microspheres using a solid encapsulation/single emulsion/solvent extraction technique.</a> J. Biomed. Mater. Res. 51 (3), 383-390 (2000).</li>
<li>Cutiongco, M. F. A., Tan, M. H., Ng, M. Y. K., Le Visage, C., Yim, E. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+pullulan-dextran+polysaccharide+scaffold+with+interfacial+polyelectrolyte+complexation+fibers%3A+A+platform+with+enhanced+cell+interaction+and+spatial+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Composite pullulan-dextran polysaccharide scaffold with interfacial polyelectrolyte complexation fibers: A platform with enhanced cell interaction and spatial distribution.</a> Acta Biomater. 10 (10), 4410-4418 (2014).</li>
<li>Yow, S. Z., Quek, C. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+fibrous+scaffold+for+spatial+organization+of+encapsulated+and+seeded+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Collagen-based fibrous scaffold for spatial organization of encapsulated and seeded human mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (6), 1133-1142 (2009).</li>
<li>Yim, E. K. F., Wan, A. C. A., Le Visage, C., Liao, I. C., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cell+encapsulated+in+polyelectrolyte+complexation+fibrous+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cell encapsulated in polyelectrolyte complexation fibrous scaffold.</a> Biomaterials. 27 (36), 6111-6122 (2006).</li>
<li>Liao, I. C., Wan, A. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+release+from+fibers+of+polyelectrolyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Controlled release from fibers of polyelectrolyte complexes.</a> J. Control. Release. 104 (2), 347-358 (2005).</li>
<li>Wan, A. C. A., Liao, I. C., Yim, E. K. F., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+fiber+formation+by+interfacial+polyelectrolyte+complexation%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanism of fiber formation by interfacial polyelectrolyte complexation.</a> Macromolecules. 37 (18), 7019-7025 (2004).</li>
<li>Yim, E. K. F., Reano, R., Pang, S., Yee, A., Chen, C., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopattern-induced+changes+in+morphology+and+motility+of+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells.</a> Biomaterials. 26 (26), 5405-5413 (2005).</li>
<li>Sun, H., Xu, F., Guo, D., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+evaluation+of+NGF-microsphere+conduits+for+regeneration+of+defective+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation and evaluation of NGF-microsphere conduits for regeneration of defective nerves.</a> Neurol. Res. 34 (5), 491-497 (2012).</li>
<li>Simón-Yarza, T., Formiga, F. R., Tamayo, E., Pelacho, B., Prosper, F., Blanco-Prieto, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated-PLGA+microparticles+containing+VEGF+for+long+term+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">PEGylated-PLGA microparticles containing VEGF for long term drug delivery.</a> Int. J. Pharm. 440 (1), 13-18 (2013).</li>
<li>Patel, Z. S., Ueda, H., Yamamoto, M., Tabata, Y., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+release+of+vascular+endothelial+growth+factor+from+gelatin+microparticles+and+biodegradable+composite+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo release of vascular endothelial growth factor from gelatin microparticles and biodegradable composite scaffolds.</a> Pharm. Res. 25 (10), 2370-2378 (2008).</li>
<li>Sun, H., Xu, F., Guo, D., Liu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+the+effects+of+various+additives+and+polymers+on+nerve+growth+factor+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Int.+Pharm%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of the effects of various additives and polymers on nerve growth factor microspheres.</a> Drug Dev. Int. Pharm. 40 (4), 452-457 (2014).</li>
<li>Lee, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+drug+release+from+hydrogel+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Kinetics of drug release from hydrogel matrices.</a> J. Control. Release. 2, 277-288 (1985).</li>
<li>Cutiongco, M. F. A., Choo, R. K. T., Shen, N. J. X., Chua, B. M. X., Sju, E., Choo, A. W. L., Le Visage, C., Yim, E. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+scaffold+of+poly%28vinyl+alcohol%29+and+interfacial+polyelectrolyte+complexation+fibers+for+controlled+biomolecule+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Bioeng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Composite scaffold of poly(vinyl alcohol) and interfacial polyelectrolyte complexation fibers for controlled biomolecule delivery.</a> Front. Bioeng. Biotechnol. 3 (3), 1-12 (2015).</li>
<li>Yow, S. Z., Lim, T. H., Yim, E. K. F., Lim, C. T., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Electroactive+Polypyrrole-Collagen+Fibrous+Scaffold+for+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">A 3D Electroactive Polypyrrole-Collagen Fibrous Scaffold for Tissue Engineering.</a> Polymers. 3 (1), 527-544 (2011).</li>
<li>Leong, M. F., Toh, J. K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+prevascularised+tissue+constructs+by+assembly+of+polyelectrolyte+hydrogel+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Patterned prevascularised tissue constructs by assembly of polyelectrolyte hydrogel fibres.</a> Nat. Commun. 4, 2353(2013).</li>
<li>Di Benedetto, F., Biasco, A., Pisignano, D., Cingolani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+polyacrylamide+hydrogels+by+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Patterning polyacrylamide hydrogels by soft lithography.</a> Nanotechnology. 16 (5), S165(2005).</li>
<li>Revzin, A., Russell, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogel+microstructures+using+photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Fabrication of poly(ethylene glycol) hydrogel microstructures using photolithography.</a> Langmuir. 17 (18), 5440-5447 (2001).</li>
<li>Yim, E. K. F., Liao, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+compatibility+of+interfacial+polyelectrolyte+complexation+fibrous+scaffold%3A+evaluation+of+blood+compatibility+and+biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Tissue compatibility of interfacial polyelectrolyte complexation fibrous scaffold: evaluation of blood compatibility and biocompatibility.</a> Tissue Eng. Part A. 13 (2), 423-433 (2007).</li>
<li>Chaouat, M., Le Visage, C., Autissier, A., Chaubet, F., Letourneur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+a+small-diameter+polysaccharide-based+arterial+graft+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats.</a> Biomaterials. 27, 5546-5553 (2006).</li>
<li>Eshraghi, S., Das, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+microstructural+properties+of+polycaprolactone+scaffolds+with+one-dimensional%2C+two+dimensional%2C+and+three-dimensional+orthogonally+oriented+porous+architectures+produced+by+selective+laser+sintering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Mechanical and microstructural properties of polycaprolactone scaffolds with one-dimensional, two dimensional, and three-dimensional orthogonally oriented porous architectures produced by selective laser sintering.</a> Acta Biomater. 6, 2467-2476 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

IPC vezels worden gevormd door de wisselwerking van twee tegengesteld geladen polyelektrolyten. De werkwijze maakt gebruik van de extractie van het complex van het grensvlak van de polyelektrolyten, een zelf-assemblageproces voor stabiele vezelvorming vergemakkelijken. Het mechanisme van IPC vezelvorming voor zorgt dat biomolecuul toegevoegd aan een even geladen polyelektrolyt tijdens de complexvorming te kunnen integreren. 10,11 Omgekeerd toevoeging van een biologische molecule in de tegengesteld geladen pol...

De extracellulaire matrix heeft intrinsieke biochemische en biofysische signalen die celgedrag richten. Het nabootsen van deze fysiologische driedimensionale (3D) micro-omgeving is een veel onderzochte strategie voor toepassingen in regeneratieve geneeskunde en weefselengineering. Bijvoorbeeld, zowel natuurlijk afgeleide als synthetische substraten zijn gemodificeerd met topografische signalen als een manier om het biofysische cellulaire milieu na te bootsen.1 Polycaprolacton (PCL) skeletten kunnen bijvoorbeeld gemakkelijk worden gevormd door middel van gieten op gepatroneerde PDMS substraten.2 Echter, de meeste synthetische skeletten herhalen het gecontroleerde biochemische milieu in vivo onvoldoende. Bulk of oppervlaktemodificatie van synthetische materialen presenteert alleen biochemische signalen voor celaanhechting, maar ontbreekt nog steeds een tijdelijke regulering van biochemische levering.3 Dus, er is een behoefte aan optimale skeletten die het tijdelijk gereguleerde biochemische leveringssysteem van de extracellulaire matrix kunnen nabootsen. 
Biochemische leveringssystemen zoals microsferen worden geteisterd door problemen van verlies van bioactiviteit en lage incorporatie-efficiëntie vanwege de ernst en complexiteit van het meervoudige syntheseproces.4-6 Alternatieve methoden die een eenstaps fabricage- en incorporeringmethode gebruiken, bleken uitstekend potentieel te hebben om een gunstige biochemische micro-omgeving te creëren zonder de bijbehorende inefficiëntie in incorporatie en verlies van bioactiviteit. Een haalbare oplossing is het gebruik van interfaciële poly-elektrolyt complexatie (IPC) vezels om biologische agentia te leveren en te beschermen. Wanneer twee tegengesteld geladen poly-elektrolyt waterige oplossingen samengebracht worden, kunnen IPC vezels uit het grensvlak worden getrokken. Vrijwel elk type hydrofiele biomolecuul in waterige oplossing kan worden toegevoegd aan de negatief- of positief-geladen poly-elektrolytoplossing, waardoor de incorporatie van nuttige biomoleculen in de IPC vezel tijdens het complexatieproces wordt vergemakkelijkt. Verder vereist dit proces alleen waterige en omgevingsomstandigheden, waardoor het risico van verlies van bioactiviteit wordt verminderd. Door deze methode te gebruiken, zijn actieve groeifactoren2,7 en zelfs cellen8,9 met succes geleverd. Bovendien, de eenvoudige methode van het vormen van IPC vezels maakt het mogelijk om in elke vorm of oriëntatie te worden gevormd. De stabiliteit van dergelijke vezels is voordelig gebleken bij de incorporatie in zowel hydrofobe2 als hydrofiele polymeren7 om composiet skeletten te creëren. Deze composiet skeletten met IPC vezels zijn voordelig voor het creëren van een fysiologisch relevante biochemische omgeving terwijl ze fysiek anker bieden voor cellen. 
In deze studie tonen we een methode om IPC vezels in een hydrofiele en een hydrofobe skel met topografie te incorporeren voor gecontroleerde afgifte van actieve biomoleculen. Als een proof-of-concept, incorporeren we IPC vezels gemaakt van chitosan en alginaat in het biocompatibele, niet-immuunogene en niet-antigeen pullulaan-dextrose hydrofiele hydrogel of het biocompatibele polycaprolacton hydrofobe skelet.

<table><tbody><tr><td>Pullulan&nbsp;</td><td>Hayashibara Inc Okayama Japan</td><td></td><td>Molecuulgewicht (MW) 200 kDa. Dit materiaal is farmaceutisch kwaliteitspullulan dat wordt gebruikt om pullulan frames en PD-IPC skeletten te maken.</td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1037</td><td>MW 500 kDa. Dit materiaal wordt niet langer geproduceerd door Sigma Aldrich. Voorgestelde alternatief is catalogusnummer 31392 (Sigma Aldrich). Dit materiaal wordt gebruikt om PD-IPC skeletten te maken.</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Natriumbicarbonaat moet langzaam worden toegevoegd aan de pullulan-dextran polysacharideoplossing. Snelle toevoeging van natriumbicarbonaat zal resulteren in precipitatie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumtrimetafosfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5508</td><td>Deze chemische stof is hygroscopisch en moet worden bewaard in de ontvochtigingskast. Waterige oplossing van natriumtrimetafosfaat moet altijd vers worden gemaakt.</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Dit materiaal is gevaarlijk en moet worden behandeld met geschikte beschermende uitrusting zoals nitrilhandschoenen.</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448877</td><td>MW 190-310 kDa. Aceteringsgraad van 75% tot 85%. Zuivering van chitosan is vereist om stabiele IPC-vezels te creëren.</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Merck</td><td></td><td>Dit kan worden vervangen door een ander merk. Dit materiaal is corrosief en ontvlambaar. Beschermende uitrusting zoals gezichtsscherm, nitrilhandschoenen, laboratoriumjas en schoenbedekking moet worden gedragen bij het hanteren van deze chemische stof in de afzuigkap.&nbsp;</td></tr><tr><td>Alginezuur natriumzout uit bruin zeewier, lage viscositeit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2158</td><td>Los op in water gedurende de nacht. Filter door steriele 0,2&nbsp;&micro;m spuitfilter voor gebruik. Bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Rundserumalbumine</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td></td><td>Los op in steriele PBS en filter met behulp van 0,2 &micro;m spuitfilter voor gebruik.&nbsp;</td></tr><tr><td>BCA-analysekit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>Deze kit werd gebruikt om BSA-afgifte uit PD-IPC skeletten te meten.&nbsp;</td></tr><tr><td>Menselijke recombinante vasculaire endotheliale groeifactor</td><td>R&amp;D systems</td><td>293-VE</td><td>Los groeifactor op in 0,2% heparineoplossing tot een eindconcentratie van 5&nbsp;mg/ml.</td></tr><tr><td>Heparine-natriumzout uit varken</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Dit kan worden vervangen door een ander merk. Los heparinezout op in steriel water tot een eindconcentratie van 1% en filter door 0,2 &micro;m spuitfilter voor gebruik.&nbsp;</td></tr><tr><td>Menselijke navelstrengveneuze endotheelcellen (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td>Dit primaire celtype werd gebruikt in de test om VEGF bioactiviteit te bepalen na afgifte uit PD-IPC skeletten.&nbsp;</td></tr><tr><td>Alamar blue</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1025</td><td>Dit wordt gebruikt om celmetabolische activiteit te meten. Incubeer Alamar blue met cellen en bewaar onder standaard celkweekcondities gedurende 2 tot 4 uur. Meet de absorptie bij 570 nm om de Alamar blue procentuele reductie te bepalen, die gecorreleerd is aan de celactiviteit.&nbsp;</td></tr><tr><td>ScanVac Coolsafe Lyofilisaat</td><td>Labogene</td><td>7.001.200.060</td><td>Dit is een niet-programmeerbare vriesdroger die werkt bij -105 tot -110&nbsp;&deg;C. Dit kan worden vervangen door andere standaard laboratorium lyofilisaat.</td></tr><tr><td>Polycaprolacton (PCL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181609</td><td>MW 65 kDa. Dit wordt niet langer geproduceerd door Sigma Aldrich. Dit kan worden vervangen door Sigma Aldrich catalogusnummer 704105.</td></tr><tr><td>Dichloromethaan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V800151</td><td>Dit kan worden vervangen door een ander merk. Dit materiaal is gevaarlijk en moet worden behandeld in de afzuigkap. Beschermende uitrusting moet altijd worden gedragen bij het hanteren van deze chemische stof.</td></tr><tr><td>Polydimetylsiloxaan (PDMS; 184 Siliconen Elastomer Kit)</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>De elastomerenkit wordt geleverd met polymeerbasis en crosslinker. Het mengen van de polymeerbasis en crosslinker in verschillende verhoudingen zal resulteren in verschillende stijfheid van de PDMS.</td></tr><tr><td>Menselijke recombinante Beta-Nerve Growth Factor (NGF)</td><td>R&amp;D systems</td><td>256-GF</td><td>Geconstitueerd in sterieel DI water tot een eindconcentratie van 100&nbsp;&micro;g&#8288;/&#8288;ml. Verdeel in aliquots en bewaar bij -20 &deg;C tot gebruik.</td></tr><tr><td>Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC)</td><td>Cambrex</td><td></td><td>Dit celtype werd gebruikt in de test om het synergistische effect van NGF en nanotopografie te bepalen.</td></tr><tr><td>Ratten PC12 Feochromocytoomcellen&nbsp;</td><td>ATCC</td><td></td><td>Dit celtype werd gebruikt in de neurietuitgroeitest om de bioactiviteit van NGF te bepalen. Meet na blootstelling aan releasemedium met NGF het aantal cellen met neurietuiten en normaliseer naar het totale aantal cellen.</td></tr><tr><td>Grade 93 filterpapier</td><td>Whatman</td><td>Z699675</td><td>Dit wordt gebruikt voor de zuivering van chitosan na zijn precipitatie met natriumhydroxide op pH&nbsp;7.</td></tr><tr><td>Slingeremmercentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Te gebruiken tijdens de zuivering van chitosan met een snelheid van 1.200 x g.</td></tr><tr><td>Motor met mandrel die met constante snelheid draait</td><td>Rhymebus</td><td>RM5E</td><td>De motor wordt gebruikt voor de fabricage van IPC-vezels op pullulan- of PCL-frame.</td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferd zoutoplossing</td><td>FirstBase</td><td></td><td>Steriseren door filtratie (0,2 &micro;m filter) en autoclaven.&nbsp;</td></tr><tr><td>10-mm diameter Tissue Culture Polystyrene Dish (TCPS)</td><td>Greiner</td><td></td><td>De TCPS-schaal wordt gebruikt voor het gieten van pullulan frame.&nbsp;</td></tr><tr><td>Menselijke VEGF ELISA kit</td><td>R&amp;D systems</td><td>DVE00</td><td>De ELISA-kit wordt gebruikt voor detect

composiet steigers van interfacial polyelectrolyte vezels voor stoffelijk controlled release van biomoleculen

Composite Scaffolds of Interfacial Polyelectrolyte Fibers for Temporally Controlled Release of Biomolecules

Verschillende scafolds die worden gebruikt in weefselengineering vereisen een gecontroleerde biochemische omgeving om de fysiologische celniche te imiteren. Interfaciale polyelektrolytcomplexatie (IPC) vezels kunnen worden gebruikt voor gecontroleerde afgifte van verschillende biologische agentia zoals kleine molecuulgeneesmiddelen, cellen, eiwitten en groeifactoren. De eenvoud van de methodologie bij het maken van IPC-vezels geeft flexibiliteit in de toepassing ervan voor gecontroleerde biomolecuul-afgifte. Hier beschrijven we een methode voor het incorporeren van IPC-vezels in twee verschillende polymere scafolds, hydrofiele polysaccharide en hydrofobe polycaprolacton, om een multi-component composiet scaffold te creëren. We toonden aan dat IPC-vezels gemakkelijk in deze polymere structuren kunnen worden ingebed, waardoor de capaciteit voor duurzame afgifte en verbeterde bewaring van biomoleculen wordt vergroot. We creëerden ook een composiet polymeer scaffold met topografische aanwijzingen en duurzame biochemische afgifte die synergistische effecten kunnen hebben op celgedrag. Composiet polymeer scafolds met IPC-vezels vertegenwoordigen een nieuwe en eenvoudige methode om de cellulaire niche te reconstrueren.

In dit artikel hebben we geprobeerd om composiet steigers met IPC vezels voor de langdurige afgifte van verschillende biomoleculen te creëren. Kenmerken van de biomoleculen die in deze studie worden in Tabel 1. IPC vezels werden eerst ingebed in een hydrofiel PD hydrogel een PD-IPC composiet scaffold (Figuur 1B) maken. Model molecule BSA werd eerst getest om de haalbaarheid van het gebruik van een samengestelde matrix voor gecontroleerde afgifte biomolecuul bepalen. BSA werd opgenomen i...

Scaffolds voor weefselengineering moeten het complexe biochemische en biofysische micro-omgeving van de cellulaire niche nabootsen. Hier laten we het gebruik van interfaciale polyelektrolytcomplexatievezels zien als een platform om samengestelde, meercomponenten polymeer scaffolds met aanhoudende biochemische afgifte te creëren.

Composiet Steigers van Interfacial Polyelectrolyte vezels voor stoffelijk Controlled Release van biomoleculen

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial ...

Het algemene doel van deze procedure is om een gecontroleerde afgifte van biomoleculen met ruimtelijke beheersing te bewerkstelligen, om zo de cellulaire niche na te bootsen met behulp van hydrofiele of hydrofobe polymere composietsteigers. Dit wordt bereikt door eerst een opofferingsraamwerk van gewenste polymeren te creëren om de ruimtelijke rangschikking te bepalen van de biomolecuulafgivende vezels, genaamd interfacial poly electrolyte- of IPC-vezels. De tweede stap is het incorporeren van IPC-vezels die het beoogde hydrofiele biomolecuul bevatten op een opofferingsframe.Vervolgens worden de IPC-vezels op frameconstructies ingebed in een groter steunmateriaal met behulp van een micropatroonsubstraat als gietvorm, waarin topografische signalen op het substraat zijn geïntegreerd. De laatste stap is om de volledige assimilatie van de vezels op het frameconstruct en de stolling van de polymeren mogelijk te maken om niet-gepatroneerde of micropatroneerde substraten te creëren. Uiteindelijk kunnen standaardassays worden gebruikt om de afgifteprofielen en bioactiviteit van de doelmoleculen aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande meth

composite-scaffolds-interfacial-polyelectrolyte-fibers-for-temporally

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het proces van electrospinning polymeren voor tissue engineering en cel cultuur wordt behandeld in dit artikel. In het bijzonder, is de electrospinning van fotoreactieve macromers met extra verwerkingsmogelijkheden van photopatterning en multi-polymeer electrospinning beschreven.

Electrospinning Stapel-Polymer Stellingen voor Tissue Engineering en Cell Culture

Electrospun steigers kunnen worden verwerkt post-productie voor tissue engineering toepassingen. Hier beschrijven we methoden voor het spinnen complexe steigers (door opeenvolgende spinnen), voor het maken van dikkere steigers (door meerdere lagen met behulp van warmte of damp gloeien), voor het bereiken van steriliteit (aseptische productie of sterilisatie post-productie) en zorgt voor een juiste biomechanische eigenschappen.

Postproduction Verwerking van electrospun Vezels voor Tissue Engineering

Hier beschrijven we een unieke strategie voor het maken van biocompatibele, gelaagde matrices met continue interfaces tussen verschillende lagen van tissue engineering. Een dergelijke steiger kan een ideale aanpasbare omgeving te moduleren cel gedrag van verschillende biologische, chemische of mechanische...

Dichtheidsgradiënt Meerlaagse polymerisatie (dGMP): een nieuwe techniek voor het maken van meerdere compartimenten, Aanpasbare Steigers for Tissue Engineering

In deze video laten we zien modificatie technieken voor poreuze metalen implantaten om hun functionaliteit te verbeteren en om celmigratie te controleren. Technieken omvatten de ontwikkeling van poriën verlopen naar cel beweging beheersen 3D en productie van basale membraan bootst naar cel beweging beheersen 2-D. Ook is een HPLC-methode voor toezicht integratie implantaten in vivo via analyse bloedeiwitten beschreven.

Multi-Scale modificatie van metalen implantaten Met Pore Verlopen, polyelektrolieten en hun indirecte monitoring<em&gt; In vivo</em

Dit protocol combineert elektrospinnen en microsferen om weefselgeëngineerde scaffolds te ontwikkelen om neuronen te richten. Het zenuwgroeifactor werd ingekapseld in PLGA-microsferen en elektrogespunnen in hyaluronzuur (HA) vezelige scaffolds. De bioactiviteit van het eiwit werd getest door de scaffolds te zaaien met primaire kippendorsaalwortelganglia en 4-6 dagen te kweken.

Elektrospinproces Growth Factor Releasing microsferen in Stapel- Steigers

Hier presenteren we een protocol om elektrogesponnen nanovezel steigers met gradated organisatie van vezels fabriceren en hun toepassingen verkennen in het reguleren van de cel morfologie / oriëntatie. Verlopen met betrekking tot fysische en chemische eigenschappen van de nanovezel scaffolds biedt een grote verscheidenheid aan toepassingen op biomedisch gebied.

Electrospun Nanovezel Steigers met gradaties in Fiber Organisatie

Scaffolds die passen in cranio-maxillofaciale (CMF) botdefecten terwijl ze osteoconductiviteit en bioactiviteit vertonen, zijn interessant. Dit protocol beschrijft de bereiding van een shape memory scaffold op basis van polycaprolacton diacyraat (PCL-DA) met behulp van een solvent-casting particulate-leaching (SCPL) methode, waarbij een gefuseerd zout template wordt gebruikt en toepassing van een bioactieve polydopamine coating.

Fabricage van een biologisch actief, PCL-based &quot;Self-fitting&quot; Shape Memory Polymer Steiger

Twee- en driedimensionale superhydrofobe polymere materialen worden bereid door middel van elektrospinnen of elektrosprayen van biologisch afbreekbare polymeren vermengd met een polymeer met een lagere oppervlakte-energie van vergelijkbare samenstelling.

Fabriceren superhydrophobic polymere materialen voor biomedische toepassingen

In dit werk werden poly(melkzuur)/polyethyleenglycol (PLA/PEG) scaffolds bereid door gebruik te maken van een combinatie van smeltmengen en selectieve uitloging. De hier besproken methode maakte het mogelijk om drie-laags scaffolds te ontwikkelen door zowel de porositeit als de poriëngrootte nauwkeurig te beheersen. De mechanische eigenschappen werden ook geëvalueerd in een fysiologische omgeving.

Een Facile en Eco-vriendelijke Route naar Poly (melkzuur) Steigers met Graded Pore Size Fabriceer

Dit artikel demonstreert de techniek van het uitbreiden van een traditionele, twee-dimensie (2D) electrospun nanofiber mat in een drie-dimensie (3D) steiger door de drukverlaging subkritische CO2 vloeistof. Deze augmented steigers zijn 3D, nauw mimic cellulaire nanotopographic signalen, en het behoud van de functies van biologische moleculen ingekapseld binnen de nanofibers.

Expansie van twee-dimensie Electrospun Nanofiber matten in de steigers van de drie-dimensie

Microgelstaven met complementaire reactieve groepen worden geproduceerd via microfluïdica met het vermogen om in waterige oplossing met elkaar te verbinden. De anisometrische microgels binden en verbinden zich tot stabiele constructies met grotere poriën in vergelijking met op bolvormige systemen gebaseerde systemen. Microgels gemodificeerd met GRGDS-PC vormen macroporeuze 3D-constructies die kunnen worden gebruikt voor celkweek.

Onderling verbonden macroporeuze 3D-steigers van Microgel-staven

Leer hoe je composietsteigers met IPC-vezels maakt voor gecontroleerde afgifte van biomoleculen in weefselengineering. Deze methode bootst de cellulaire niche na met ruimtelijke controle.

Composiet Steigers van Interfacial Polyelectrolyte vezels voor stoffelijk Controlled Release van biomoleculen

Meer video's verkennen