Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve In Vitro Experimental Model

Het algemene doel van deze procedure is om een nieuw model van in vitro driedimensionale neuronale netwerken te presenteren die gekoppeld zijn aan micro-elektrodearrays. Dit wordt bereikt door eerst het centrale deel van de MEA te conditioneren met een gemengde oplossing van poly de lysine en laminine en vervolgens de microbeads te coaten met adhesie-eiwitten, laminine en polylysine. De tweede stap is om de suspensie van behandelde microbeads te verdelen op een multi-wellplaat waar ze zichzelf zullen verzamelen en een uniforme laag zullen vormen.

De derde stap van de procedure is om de cellen op het actieve gebied van de MEA te plateren met een dichtheid van 2000 cellen per vierkante millimeter om 2D neuronale netwerken te creëren. Zes tot acht uur na het plateren wordt de suspensie van de multi-wellplaten overgebracht naar de MEA en worden de microbeads toegestaan om zichzelf te verzamelen in een hexagonale compacte structuur. Uiteindelijk wordt confocale microscopie gebruikt om de 3D netwerken te visualiseren, die worden vergeleken met de conventionele 2D neuronale netwerken die over MEA zijn gekweekt.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals in vitro BDI dimensionale celculturen, is dat in een BDI dimensionale model, somata en groeikegels zijn afgeplat, Andon en rise zich niet in alle richtingen kunnen verspreiden. Bovendien domineert burstactiviteit de elektrofysiologische dynamica van BDI dimensionale netwerken, terwijl in een driedimensionale ook een willekeurige speckingactiviteit co-existeert. We hadden eerst het idee voor deze methode toen we het onderzoeksartikel van Sophie Potto las dat in 2008 in Nature Method werd gepubliceerd, waarin ze MICROBITS gebruikte als een schaal om driedimensionale netwerken op te bouwen.

Vervolgens hebben we deze methode aangepast om de eerste driedimensionale in vitro opnames te maken. Om de PDMS elastomeer voor te bereiden, meng je het verhardingsmiddel en een polymeer in een verhouding van één op negen in een petrischaal. Schud vervolgens het mengsel en plaats het in de vacuümkamer gedurende 10 minuten om luchtbellen te elimineren.

Om de PDMS beperking te construeren, steek je het PDMS materiaal in de mal na het model en plaats het gedurende 30 minuten in de oven op 120 graden Celsius. De PDMS beperking moet de vorm hebben van een cilinder met een externe en interne diameter van respectievelijk 22,0 en 3,0 millimeter, en een hoogte van 650 micrometer de dag voor het plateren. Koppel het masker aan het actieve gebied van de MEA onder een stereomicroscoop, steriliseer vervolgens het PDMS masker in de oven op 120 graden Celsius.

Steriliseer vervolgens de glazen microbeads in een conische flacon met 70% ethanol gedurende twee uur, draai om de 30 minuten om alle microbeads te blootstellen. Verwijder de ethanoloplossing uit de flacon en spoel de microbeads twee keer met gesteriliseerd water. Condisioneer vervolgens het centrale deel van het door het PDMS masker afgebakende MEA gebied met 24 microliter gemengde oplossing van polylysine en laminine op 0,05 microgram per milliliter.

Coat de microbeads met adhesie-eiwitten, laminine en polylysine op 0,05 microgram per milliliter. Plaats ze vervolgens in de incubator gedurende een nacht bij 37 graden Celsius om een stabiele en langdurige neuronale netwerk te verkrijgen. Vervolgens verdeel je de suspensie van de behandelde microbeads op de multi-wellplaat met een membraaninzet waar ze zichzelf zullen verzamelen en een uniforme laag zullen vormen.

Vervolgens vul je elk putje van het membraan met 0,5 milliliter medium. Plaats het in de incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide totdat de neuronen klaar zijn om in deze stap te worden geplateerd. Na het opofferen van een drachtige vrouwelijke rat op dag 18, verkrijg je de ratte embryo's en verwijder je de hippocampi van elk ratte embryo.

Plaats ze in ijskoud Hanks evenwichtszout oplossing zonder calcium en magnesium. Vervolgens dissocieer je het weefsel in 0,125% trypsine Hanks oplossing bevattende 0,05% DNAs gedurende 18 tot 20 minuten bij 37 graden Celsius.

Verwijder vervolgens het supernatant met een pepermolenpijp. Stop de enzymatische vertering door medium toe te voegen met 10% FBS gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens het medium met FBS en spoel eenmaal met het groeimedium, het supplement 1% L-glutamine en Gentamycine bij 10 microgram per milliliter.

Vervolgens verwijder je het medium. Vul het opnieuw met 500 microliter groeimedium. Het supplement 1% L-glutamine en Gentamycine bij 10 microgram per milliliter.

Dissocieer het weefsel pellet mechanisch met een smalle PEs pijp tot een melkachtige suspensie van cellen zichtbaar is. Verdun vervolgens een klein volume celsuspensie met het groeimedium om een ​​eindvolume van 2,0 milliliter te verkrijgen. Tel de verkregen celconcentratie met de hemo cytometerkamer.

Verdun vervolgens deze concentratie in een verhouding van één op vijf om de gewenste celconcentratie van 600 tot 700 cellen per microliter te verkrijgen. Plateer de cellen met een dichtheid van 2000 cellen per vierkante millimeter op het actieve gebied van de MEA gedefinieerd door de PDMS beperking om een ​​2D neuronaal netwerk te creëren. Plaats vervolgens het MEA apparaat in de incubator met een 5% bevochtigde koolstofdioxide atmosfeer bij 37 graden Celsius.

Om de voorbereidende stap voor de constructie van 3D cultuur te voltooien, verdeel je 160 microliter van de suspensie met een celconcentratie van 600 tot 700 cellen per microliter op het oppervlak van de monolaag microbeads gepositioneerd in de multi-wellplaten. Plaats vervolgens de multi-wellplaten in de incubator met een 5% bevochtigde koolstofdioxide atmosfeer bij 37 graden Celsius, zes tot acht uur na het plateren breng je 30 tot 40 microliter van de suspensie met microbeads en neuronen over naar het gebied van de MEA beperkt door de PDMS beperking. Na elke overdracht wacht je ongeveer een halve minuut om de microbeads toe te laten zichzelf te verzamelen in een hexagonale structuur.

Zodra alle lagen zijn afgezet en spontaan geassembleerd op 300 microliter medium bovenop het gebied beperkt door de PDMS beperking. Plaats de