Name: Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve In Vitro Experimental Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Leer hoe je 3D neuronale netwerken koppelt aan micro-elektrode arrays met glazen microbolletjes als steiger. Deze methode verbetert elektrofysiologische opnames voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Giorgio Carlini voor de technische ondersteuning bij de ontwikkeling van de opsluiting structuur en Dott. Ornella LoBrutto voor de grondige herziening van het manuscript. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering van 7e kaderprogramma van de Europese Unie ontvangen (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET Young Explorers regeling) onder subsidieovereenkomst 284.772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).

Het experimentele protocol werd door de Europese Animal Care wetgeving (2010/63 / EU), door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid goedgekeurd in overeenstemming met de DL 116/1992 en door de richtlijnen van de Universiteit van Genua (Prot. N. 13.130, mei 2011). Alle inspanningen werden gedaan om het aantal dieren dat voor het project te verminderen en hun lijden te minimaliseren. 1. Voorbereiding van Materialen en Supports <ol><li> Construct de mal om de PDMS (Poly-dimethyl-siloxaan) constraint te bouwen door middel van een CNC (Computer Numerical Control) freesmachine. Een dergelijke vorm wordt gerealiseerd in polycarbonaat met de centrale cilinder polytetrafluorethyleen (PTFE). Dit materiaal maakt eenvoudiger extractie van het masker nadat het PDMS is uitgehard. NB: Het ontwerp van de mal is uitgevoerd door Computer-Aided Design (CAD) en vervolgens geleverd aan de CNC-freesmachine. </li><li> Bereid de PDMS elastomeer. PDMS is een organisch polymeer. Het bestaat uit twee elementenEen hardingsmiddel en een polymeer. Vermengen door een volumeverhouding van 1:10, een deel hardingsmiddel en negen delen polymeer. Leg de twee componenten in een petrischaal, schud en plaats het mengsel in de vacuümkamer gedurende 10 min om luchtbellen te elimineren. 3 g PDMS is voldoende voor een beperking. </li><li> De bouw van het PDMS beperking. Plaats de PDMS materiaal in de boetseerder en zet het in de oven gedurende 30 min bij 120 ° C. De PDMS beperking heeft de vorm van een ideale cilinder met een uitwendige en inwendige diameter van 22,0 en 3,0 mm respectievelijk en een hoogte van 650 urn. </li><li> De dag voor de beplating, stel het masker op het actieve gebied van de micro-elektrode arrays (MEA) met behulp van een pincet onder een stereomicroscoop en steriliseer de PDMS masker in de oven op 120 ° C. </li><li> Steriliseer de glasmicrokralen (nominale diameter van 40 ± 2 urn; gecertificeerd gemiddelde diameter van 42,3 ± 1,1 pm) in 70% ethanol gedurende 2 uur in een konische flesje en draai every 30 min om alle microbolletjes bloot. </li><li> Verwijder de ethanol-oplossing uit het flesje en spoel de microbolletjes twee keer met gesteriliseerd water. </li><li> Conditioneer het centrale deel van het MEA afgebakend door PDMS masker (diameter gelijk aan 3,0 mm) met 24 gl gemengde oplossing van Poly-D-Lysine en laminine bij 0,05 ug / ml. </li><li> Coat de microkorrels met adhesie-eiwitten, laminine en poly-D-lysine op 0,05 ug / ml en laat ze een nacht in de incubator bij 37 ° C, een stabiele en langdurige neurale netwerk te verkrijgen. </li><li> Verwijder de adhesiefactoren zowel het glazen oppervlak van de MEA en de microbolletjes van glas. Zuig ongeveer 95% van de bekledingsoplossing met een pipet en breng een kleine volume- 24μl- steriel water op het oppervlak MEA. Zuig weer meer dan 95% van het water en laat het MEA drogen onder laminaire kap 1 uur vóór het uitplaten van de cellen. OPMERKING: Bij microkorrels plaats, zuig het coatingoplossing en een eerste wassen met gesteriliseerd water en een tweede met het basismedium en de aanvulling zoals B27, teneinde het glasoppervlak waarin neuronen wordt uitgeplaat conditie. Laat de microbolletjes droog. Laat ze in suspensie in het kweekmedium in de flacon. </li><li> Verdeel met behulp van een pipet -200 μl-, de suspensie van microbolletjes behandelde (ongeveer 32.000) op een plaat met meerdere putjes met insert membraan (poriediameter 0,4 urn) wanneer zij zelfassemblage vorming van een uniforme laag. </li><li> Vul elk putje van het membraan met 0,5 ml medium en zet het in de incubator (T = 37,0 o C, CO 2 = 5%) tot de neuronen zijn klaar om te worden verzilverd (3.2). </li></ol> 2. Dissectie van embryo&#39;s en dissociatie van Tissue <ol><li> Vrouwelijke ratten huis volwassen (200-250 g) bij een constante temperatuur (22 ± 1 ° C) en luchtvochtigheid (50%) onder normale licht-donker schema (light-on 7 AM-PM 7) in dedier faciliteit. Zorg ervoor dat voedsel en water zijn vrij beschikbaar. </li><li> Verdoven een zwangere vrouwelijke ratten na 18 dagen van ontwikkeling (E18) met 3% isofluraan. Vervolgens offeren het dier door cervicale dislocatie. </li><li> Hippocampus verwijderd uit elk embryo rat en plaats ze in ijskoude Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg2 +. Op dag 18 van de ontwikkeling hippocampus en cortex weefsels zeer zacht en hoeven niet in kleine stukjes te snijden. Nadere details vindt u 18,19. </li><li> Distantiëren het weefsel in 0,125% trypsine / Hank&#39;s oplossing bevattende 0,05% DNAse gedurende 18-20 min bij 37 ° C. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof met een Pasteur pipet en stopt de enzymatische digestie door het toevoegen van medium met 10% foetaal runderserum (FBS) gedurende 5 min. </li><li> Verwijder het medium met FBS en eenmaal wassen met het medium met supplement, 1% L-glutamine, gentamicine 10 ug / ml. Verwijder opnieuw het medium met een Pasteur pipette en vult deze opnieuw met een kleine hoeveelheid (500 ui) van het groeimedium met supplement, 1% L-glutamine, gentamicine 10 ug / ml. </li><li> Distantiëren van het weefsel pellet mechanisch met een smalle Pasteur pipet tot er een melkachtige suspensie van cellen is duidelijk. Het is niet nodig de celsuspensie centrifuge. </li><li> Verdun het kleine volume celsuspensie met het groeimedium tot een eindvolume van 2,0 ml. Tel de verkregen cellulaire concentratie met een hemocytometer kamer. Verdun deze concentratie 1: 5 om het gewenste celconcentratie van 600-700 cellen / ul te verkrijgen. </li></ol> 3. Cell Plating <ol><li> Plate cellen bij een dichtheid van ongeveer 2000 cellen / mm 2 op het actieve gebied van de MEA, gedefinieerd door de PDMS beperking voor een 2D neuronaal netwerk. OPMERKING: Elke hippocampus bevat ongeveer 5 x 10 5 cellen (1 x 10 6 voor een enkele embryo). Ontleden 6 embryo&#39;s tot een totaal bedrag van 6 x 10 krijgen6 cellen in 2 ml en een geschatte concentratie van 3000 cellen / ul. Verdun deze concentratie 1: 5 om het gewenste celconcentratie te verkrijgen en de plaat ongeveer 600-700 cellen / ul. Als het MEA afgebakend door PDMS constraint ongeveer 7,065 mm 2, en het totale aantal cellen uitgeplaat 600 cellen / ul x 24 gl = 14.400 cellen de uiteindelijke dichtheid van 2038 cellen / mm2. </li><li> Plaats de MEA inrichtingen in de incubator met bevochtigde CO2 atmosfeer (5%) bij 37 ° C. </li><li> Verdeel 160 pi van de suspensie met een celconcentratie van 600-700 cellen / pl (ongeveer 100,000 cellen) op het oppervlak van de microbolletjes monolaag gepositioneerd binnen de multiwell platen om de eerste stap bij de constructie van driedimensionale cultuur voltooien. Zet de multiwell platen in de incubator met bevochtigde CO2 atmosfeer (5%) bij 37 ° C. </li></ol> 4. 3D Neuronal Netwerk Bouw <ol><li> 6-8 uur na het plateren, breng de suspensie (microkorrels met neuronen) vanaf het multiwell platen voorzichtig binnen het gebied begrensd door de PDMS beperking met behulp van een pipet instellen voor een volume van ongeveer 30-40 pl. Na elke overdracht, wacht ongeveer een halve minuut, om de microbolletjes om zichzelf assembleren in een hexagonale compacte structuur mogelijk te maken. </li><li> Zodra alle lagen worden afgezet en spontaan geassembleerd, vullen met een grote daling van ongeveer 300 ul medium boven het gebied begrensd door de PDMS constraint. </li><li> Zet de 3D ​​structuur gekoppeld met de MEA in incubator (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) gedurende 48 uur voordat een eindvolume (ongeveer 1 ml) groeimedium kweek met supplement. OPMERKING: Beschouw het totale aantal kralen op de multiwell platen met membraan insert (30000) en het aantal kralen op een enkele laag op de MEA inrichting (6000). Het resulterende 3D-structuur bestaat uit 5 lagen microbeads en cellen. Aangezien de 3D neurale netwerk niet geometrisch perfect kan het resulterende 3D-structuur bestaat uit 5-8 lagen. </li><li> De dag na plating, zorgvuldig het uiteindelijke volume van het medium (ongeveer 900 pl) in de MEA ring toe te voegen. Handhaaf de 3D ​​kweken in een bevochtigde CO2 atmosfeer (5%) bij 37 ° C gedurende 4-5 weken. Vervang de helft van het medium eenmaal per week. </li></ol> 5. confocale microscopie Acquisition <ol><li> Bevestig de biologische monsters tot het stadium van de microscoop in een houder. Stel de laser (Argon, 496-555 nm), de scansnelheid (400 Hz), waarbij aan het beeld, de versterking en offset (-0,3%) van de PMT te verwerven voor elk beeld om de juiste bandbreedte emissie-filter en om vast te leggen verzadiging voorkomen en de signaal-ruisverhouding te verhogen. De resultaten afdeling rapporteert de waarden die worden gebruikt om de beelden van figuur 4 te verwerven. </li><li> Voor de verwerving van de z -stack volgorde, sparst selecteren, de waarde van de Z-positie van de bovenste en de onderste laag van het monster, en selecteer vervolgens de stap grootte om de overname te maken. </li></ol>

<ol><li>Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stability+and+developmental+changes+in+spontaneous+network+burst+firing+patterns+in+dissociated+rat+cerebral+cortex+cell+cultures+on+multi-electrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays.</a> Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).</li>
<li>Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precisely+timed+spatiotemporal+patterns+of+neural+activity+in+dissociated+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures.</a> Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).</li>
<li>Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectronic+system+for+high-resolution+mapping+of+extracellular+electric+fields+applied+to+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).</li>
<li>Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+microdrop+delivery+system+for+neuronal+network+patterning+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays.</a> J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).</li>
<li>Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+compartment+neurofluidic+system+for+electrophysiological+measurements+in+physically+segregated+and+functionally+connected+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroeng%22%5BJournal%5D)">Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture.</a> Front. Neuroeng. 4, (2011).</li>
<li>Kanagasabapathi, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+and+dynamics+of+cortical-thalamic+networks+co-cultured+in+a+dual+compartment+device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Eng%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device.</a> J. Neural. Eng. 9, (2012).</li>
<li>Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering+and+biohybridized+microsystems+for+neurobiological+investigation+in+vitro+%28Part+1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1).</a> Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Bursting+in+Cortical+Cultures+with+Closed-Loop+Multi-Electrode+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation.</a> J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).</li>
<li>Shany, B., Vago, R., Baranes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+primary+hippocampal+neuronal+tissue+on+an+aragonite+crystalline+biomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss.+Eng%22%5BJournal%5D)">Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix.</a> Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).</li>
<li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering%3A+strategies+for+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).</li>
<li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+stem+and+progenitor+cell+differentiation+into+functional+neuronal+circuits+in+three-dimensional+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels.</a> Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).</li>
<li>Baranes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interconnected+network+of+ganglion-like+neural+cell+spheres+formed+on+hydrozoan+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+En%22%5BJournal%5D)">Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton.</a> Tissue En. 13, 473-482 (2007).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+B%2C+Review%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.</a> Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).</li>
<li>Schuz, A., Palm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+of+neurons+and+synapses+in+the+cerebral+cortex+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).</li>
<li>Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloid-guided+assembly+of+oriented+3D+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Method%22%5BJournal%5D)">Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks.</a> Nat. Method. 5, 735-740 (2008).</li>
<li>Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+dynamics+of+3D+engineered+neuronal+cultures%3A+a+new+experimental+model+for+in-vitro+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology.</a> Sci. Rep. 4, (2014).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+functional+brain-like+cortical+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S%22%5BJournal%5D)">Bioengineered functional brain-like cortical tissue.</a> Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cell%22">Culturing Nerve Cell</a>. , 2nd edition, MIT Press. (1998).</li>
<li>Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+culture%2C+record+and+stimulate+neuronal+networks+on+Micro-electrode+arrays+%28MEAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs).</a> J. Vis. Exp. (39), (2010).</li>
<li>Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chitin+and+chitosan+nanofibers+in+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Adv%22%5BJournal%5D)">Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications.</a> Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).</li>
<li>Crompton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polylysine-functionalised+thermoresponsive+chitosan+hydrogel+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterial%22%5BJournal%5D)">Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering.</a> Biomaterial. 28, 441-449 (2007).</li>
<li>3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

In dit werk, een nieuw experimenteel in vitro platform opgebouwd uit 3D-engineered neuronale culturen gekoppeld aan MMO&#39;s voor netwerk-elektrofysiologie is gepresenteerd. Het gebruik van microbolletjes als scaffold de neuritische uitgroei langs de z-as toe is afgestemd worden geïntegreerd met de vlakke MEA. Op deze wijze verkregen micro-systeem resulteert in een valide en betrouwbare in vitro 3D model voor de opkomende elektrofysiologische dynamiek 16 bestuderen. <p class="j...

In vitro tweedimensionale (2D) neurale netwerken gekoppeld aan micro-elektrode arrays (MEA) arethe gouden standaard aangenomen om de wisselwerking tussen neuronale dynamiek en de onderliggende connectiviteit bestuderen experimenteel model. Tijdens de ontwikkeling, de neuronen recreëren complexe netwerken die goed weergegeven definedspatio-temporalpatternsof activiteit 1,2 (dat wil zeggen, uitbarstingen, netwerk uitbarstingen, willekeurige spiking activiteit). MEA registreren de elektrofysiologische activiteit van vele sites (van tientallen tot duizenden micro-electroden), waardoor een grondig onderzoek van de expressie dynamiek op netwerkniveau. Bovendien, het gebruik van gedissocieerde kweken maakt possibile engineered-netwerken te ontwerpen. Het is gemakkelijker te begrijpen op deze wijze de functionele verbanden tussen de opgenomen elektrofysiologische activiteit en de parameters van het netwerk organisatie als celdichtheid 3, modulariteit 4,5, aanwezigheid van heterogene neuronale populations 6, etc. Echter, alle in vitro naar gescheiden gekweekte cellen op basis van 2D-neuronale netwerken. Deze benadering leidt tot vereenvoudigingen ten opzichte van de in vivo (intrinsiek 3-dimensionale, 3D) systeem: (i) in een 2D-model, somata en groei kegels afgevlakt en de axonen-dendrieten uitgroei kan verspreiden in alle richtingen 7. (ii) 2D in vitro netwerken vertonen stereotiep elektrofysiologische dynamiek gedomineerd door barsten activiteit die het grootste deel van de neuronen van het netwerk 8. Recentelijk zijn verschillende oplossingen ontwikkeld om de constructie van in vitro 3D gedissocieerde neuronale netwerken mogelijk maken. Het gemeenschappelijke idee bestaat in het creëren van een steiger waar de neuronen kunnen groeien in een 3D-mode. Een dergelijke steiger kan worden gerealiseerd met polymeer gels en vaste poreuze matrices 9-13. Door het benutten van de mechanische eigenschappen van de polymeren, is het mogelijk om cellen in te bedden these structuren door het definiëren van een uniform blok 3D culturen van neurosferen 11. Het belangrijkste kenmerk van deze aanpak is de starre mechanische eigenschap van de neurosferen 9,12. Echter, deze materialen beperkt porositeit, en dat doen ze niet garanderen celmigratie in de matrix. Om dit nadeel te ondervangen, een mogelijke oplossing bestaat uit het doorsnijden van de matrix in &quot;eenheid&quot; modules. Helaas, kunnen de grootte en vorm diversiteit van de deeltjes de pakking in reguliere gelaagde structuren belemmeren. In 7, Cullen en medewerkers ontworpen 3D neuronale construct uit neuronen en / of astrocyten binnen een bioactief extracellulair matrix-gebaseerde scaffold. Een dergelijke gemanipuleerde zenuwweefsel toegestaan ​​in vitro onderzoek te bestuderen en te manipuleren neurobiologische reacties binnen 3D micro-omgevingen. Dit model bestaat uit neuronen en glia gedistribueerd door de extracellulaire matrix (ECM) en / of hydrogel scaffolds (500-600 micrometer dik). In dit condition een optimale cellevensvatbaarheid (meer dan 90%) werd gevonden door uitplaten cellen bij een uiteindelijke dichtheid van ongeveer 3750 - 5000 cellen / mm3. Opgemerkt zij dat een dergelijke dichtheidswaarde veel lager dan in de in vivo toestand, wanneer de celdichtheid van muizenhersenen cortex ongeveer 90.000 cellen / mm 3 14. Om deze beperking te overwinnen Pautot en medewerkers 15 realiseerde een 3D in vitro systeem waarbij de celdichtheid en netwerkconnectiviteit gecontroleerd te lijken in vivo omstandigheden tegelijk een real-time weergave van het netwerk. Praktisch is deze methode gebaseerd op het concept dat gedissocieerde gekweekte neuronen kunnen groeien op silica microkorrels. Deze kralen te groeioppervlak groot genoeg voor neuronale cellichamen te houden en hun arborizations groeien, rijpen, uitbreiden en definiëren synaptische contacten met andere neuronen. Deze methode maakt het spontane samenstel eigenschappen van mono-gedispergeerde kralen FOrm 3D gelaagde zeshoekige arrays met verschillende subsets van neuronen op verschillende lagen met constrained verbinding tussen neuronen van verschillende kralen. De bereikte celdichtheid met deze methode ongeveer 75.000 cellen / mm3. Onlangs hebben we methode Pautot&#39;s aangepast MEA 16: de verkregen resultaten blijkt dat de 3D ​​elektrofysiologische activiteit presenteert een breder repertoire activiteiten dan het door 2D maken zich. 3D volwassen culturen vertonen een verbeterde dynamiek waarin zowel het netwerk burst en willekeurige spike activiteit naast elkaar bestaan. Evenzo Tang-Schomer en 17 medewerkers realiseerde een zijde eiwit-gebaseerde poreuze scaffold die een primaire corticale kweken handhaaft in vitro enkele maanden, en nam de elektrofysiologische activiteit middels een wolfraamelektrode. In dit werk, de experimentele procedures 3D neuronale netwerken gekoppeld aan MEA bouwen wordt beschreven.

<table><tbody><tr><td>Laminine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>0,05 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>0,05 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>25050-014</td><td>0,125% verdund 1:2 in HBSS zonder CA++, MG++</td></tr><tr><td>DNAase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>0,05% verdund  in Hanks oplossing</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21103049</td><td>kweekmedium</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>17504044</td><td>2% mediumsupplement</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2442</td><td>10%</td></tr><tr><td>Glutamax-I </td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>0,5 mM</td></tr><tr><td>gentamicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G.1272</td><td>5 mg/L</td></tr><tr><td>Poly-Dimethyl-Siloxaan (PDMS)</td><td>Corning Sigma</td><td>481939</td><td>hardingsmiddel en de polymeer</td></tr><tr><td>Micro-Elektrode Arrays</td><td>Multi Channel Systems (MCS)</td><td>60MEA200/30-Ti-pr</td><td>MEA met: Elektrodenrooster 8x8; Elektrodeafstand en diameter 200 en 30 &micro;m, respectievelijk; plastic ring zonder schroefdraad</td></tr><tr><td>Microkraal</td><td>Distrilab-Duke Scientific</td><td>9040</td><td>&nbsp;1 gr Glas Deel. Grootte Stds 40 &micro;m</td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Costar Sigma</td><td>CLS 3413</td><td>multiwell platen met membraaninzet (6,5 mm diameter poreus 0,4 &micro;m)</td></tr><tr><td>HBSS zonder Ca++,Mg++&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14175-052</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Buffer Oplossing </td><td>Sigma </td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Teflon</td><td>Sigma</td><td>430935-5G</td><td>polytetrafluorethyleen</td></tr><tr><td>Ratten</td><td>Sprague Dawley</td><td>Wistar Rat</td><td></td></tr><tr><td>Confocale Microscopie Rechtopstaand</td><td>Leica</td><td>TCS SP5 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>20,0x0,50 WATER objectief</td><td>Leica</td><td>Leica HCX APO L U-V-I </td><td></td></tr><tr><td>40,0x0,80 WATER objectief</td><td>Leica</td><td>Leica HCX APO L U-V-I </td><td></td></tr><tr><td>25,0x0,95 WATER objectief</td><td>Leica</td><td>HCX IRAPO L</td><td></td></tr></tbody></table>

interfacing 3d engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve<em&gt; in vitro</em&gt; experimental model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Momenteel zijn grootschalige netwerken afgeleid van gedissocieerde neuronen die in vitro groeien en zich ontwikkelen op extracellulaire micro-transducer apparaten de gouden standaard experimenteel model om fundamentele neurofysiologische mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij de vorming en het onderhoud van neuronale celassemblages. Echter, in vitro studies zijn beperkt gebleven tot het registreren van de elektrofysiologische activiteit gegenereerd door bi-dimensionele (2D) neurale netwerken. Niettemin, gezien de ingewikkelde relatie tussen structuur en dynamica, is een aanzienlijke verbetering noodzakelijk om de vorming en de ontwikkelingsdynamica van driedimensionale (3D) netwerken te onderzoeken. In dit werk wordt een nieuw experimenteel platform gepresenteerd waarin 3D hippocampale of corticale netwerken gekoppeld zijn aan vlakke Micro-Electrode Arrays (MEAs). 3D netwerken worden gerealiseerd door neuronen te zaaien in een schaal van glazen microbeads (30-40 µm in diameter) waarop neuronen kunnen groeien en complexe onderling verbonden 3D assemblages vormen. Op deze manier is het mogelijk om geconstrueerde 3D netwerken te ontwerpen bestaande uit 5-8 lagen met een verwachte uiteindelijke celdichtheid. De toenemende complexiteit in de morfologische organisatie van de 3D assemblage induceert een verbetering van de elektrofysiologische patronen die door dit type netwerken worden weergegeven. In vergelijking met de standaard 2D netwerken, waar zeer stereotiepe burstactiviteit ontstaat, verandert de 3D structuur de burstactiviteit in termen van duur en frequentie, en stelt het ook de observatie van meer willekeurige spiking activiteit mogelijk. In die zin lijkt het ontwikkelde 3D model dichter op in vivo neurale netwerken.

. In deze experimentele procedure wordt een belangrijke rol gespeeld door de microkorrels dat de mechanische scaffold de groei van de 3D ​​neurale netwerk te definiëren figuren 1A en B tonen de opstelling van de microkorrels (nominale diameter van 40 ± 2 urn; gecertificeerd gemiddelde diameter 42,3 ± 1,1 micrometer) in het vliegtuig. De bijzonderheid van dergelijke structuren is dat microkorrels spontaan zelfassemblage die een compact hexagonale geometrie (Figuur 1B en C). De zo gegener...

In dit werk wordt een nieuw experimenteel model gepresenteerd waarin 3D neuronale culturen gekoppeld zijn aan vlakke Micro-Elektrode Array's (MEA's). 3D netwerken worden gebouwd door neuronen te zaaien in een schaal gemaakt van glazen microbeads waarop neuronen groeien en onderling verbonden 3D structuren vormen.

Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Het algemene doel van deze procedure is het presenteren van een nieuw model van in vitro driedimensionale neuronale netwerken gekoppeld aan micro-elektrode-arrays. Dit wordt bereikt door eerst het centrale deel van de MEA te conditioneren met een mengoplossing van poly-D-lysine en laminine, en vervolgens de microbeads te coaten met adhesie-eiwitten, laminine en polylysine. De tweede stap is het distribueren van de suspensie van behandelde microbeads op een multi-well plaat, waar ze zullen zelf-assembleren en een uniforme laag zullen vormen.De derde stap van de procedure is het uitplaten van de cellen op het actieve gebied van de MEA met een dichtheid van 2000 cellen per vierkante millimeter om 2D-neuronaal netwerken te creëren. Zes tot acht uur na het uitplaten wordt de suspensie overgebracht van de multi-well platen naar de MEA en krijgen de microbeads de kans om zichzelf te assembleren in een compacte hexagonale structuur. Ten slotte wordt confocale microscopie gebruikt om de 3D-netwerken te visualiseren, welke worden vergeleken met de conventionele 2D-neuronaal netwerken die op de MEA zijn gegroeid.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals in vitro 2D-celculturen, is dat in een 2D-model de somata en groeikegels worden afgeplat, waardoor axonen en dendrieten zich niet in alle richtingen kunnen verspreiden. Daarnaast domineert burst-activiteit de elektrofysiologische dynamiek van 2D-netwerken, terwijl in een driedimensionaal netwerk ook een willekeurige spiking-activiteit coexisteert. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we het onderzoekspaper van Sophie Potto lazen, gepubliceerd in Nature Methods in 2008, waarin zij microbeads gebruikte als steiger om driedimensionale neurale netwerken te bouwen.Vervolgens hebben we deze methode aangepast om de eerste driedimensionale in vitro opnamen te maken. Meng voor de bereiding van het PDMS-elastomeer het hardingsmiddel en een polymeer in een volumeverhouding van één op negen in een Petrischaal. Schud het mengsel daarna en plaats het gedurende 10 minuten in de vacuümkamer om luchtbellen te verwijderen.Om de PDMS-beperking te vervaardigen, brengt u het PDMS-materiaal aan in de mal en plaatst u deze vervolgens 30 minuten in de oven bij 120 °C. De PDMS-beperking moet de vorm hebben van een cilinder met een externe en interne diameter van respectievelijk 22,0 en 3,0 mm, en een hoogte van 650 µm, vervaardigd op de dag vóór het uitplaten. Bevestig het masker onder een stereomicroscoop aan het actieve gebied van de MEA en steriliseer het PDMS-masker vervolgens in de oven bij 120 °C.Steriliseer vervolgens de glazen microbeads in een conisch buisje met 70% ethanol gedurende twee uur, waarbij het buisje elke 30 minuten wordt gedraaid om alle microbeads bloot te stellen. Verwijder de ethanoloplossing uit het buisje en spoel de microbeads twee keer af met steriel water. Conditioneer vervolgens het centrale deel van het MEA-gebied, begrensd door het PDMS-masker, met 24 µL van een mengsel van polylysine en laminine in een concentratie van 0,05 µg/mL.Coat de microbeads met adhesie-eiwitten, laminine en polylysine in een concentratie van 0,05 µg/mL. Plaats ze vervolgens gedurende de nacht in de incubator bij 37 °C om een stabiel en duurzaam neuraal netwerk te verkrijgen. Verdeel daarna de suspensie van de behandelde microbeads over de multi-wellplaat met een membraaninsert, waar ze zullen zelf-assembleren en een uniforme laag zullen vormen.Vul vervolgens elke put van het membraan met 0,5 milliliters medium. Plaats dit in de incubator bij 37 degree Celsius en 5%carbon dioxide totdat de neuronen klaar zijn om in deze stap te worden geplaatst. Na het opofferen van een zwangere vrouwelijke rat van E 18, worden de rattenembryo's verkregen, waarna de hippo campi uit elk rattenembryo worden verwijderd.Plaats deze in ijskoude Hanks gebalanceerde zoutoplossing zonder calcium en magnesium. Dissocieer vervolgens het weefsel in een Hanks-oplossing met 0,125% trypsine en 0,05% DNase gedurende 18 tot 20 minuten bij 37 °C.Verwijder daarna de supernatant met een Pasteurpipet. Stop de enzymatische digestie door gedurende vijf minuten medium met 10% FBS toe te voegen. Verwijder vervolgens het medium met FBS en was één keer met het groeimedium, aangevuld met 1% L-glutamine en Gentamycine bij 10 micrograms per milliliter.Verwijder vervolgens het medium. Vul het opnieuw aan met 500 µL groeimedium. Dit is aangevuld met 1% L-glutamine en Gentamycine bij 10 µg/mL.Dissocieer het weefselpellet mechanisch met een smalle PE-pipet totdat een melkachtige suspensie van cellen zichtbaar is. Verdun daarna een klein volume van de celsuspensie met het groeimedium om een eindvolume van 2,0 milliliters te verkrijgen. Tel de verkregen cellulaire concentratie met de hemocytometerkamer.Verdun vervolgens deze concentratie in een verhouding van één op vijf om de gewenste celconcentratie van 600 tot 700 cellen per µL te verkrijgen. Zaai de cellen uit met een dichtheid van 2000 cellen per mm² op het actieve gebied van de MEA, dat is gedefinieerd door de PDMS-beperking, om een 2D-neuronaal netwerk te creëren. Plaats het MEA-apparaat vervolgens in de incubator met een bevochtigde atmosfeer van 5% koolstofdioxide bij 37 °C.Om de voorbereidende stap voor de constructie van de 3D-cultuur te voltooien, verdeelt u 160 µL van de suspensie met een celconcentratie van 600 tot 700 cellen per µL over het oppervlak van de monolaag microbeads in de multi-well platen. Plaats de multi-well platen vervolgens in de incubator met een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 °C. Zes tot acht uur na het uitplaten brengt u 30 tot 40 µL van de suspensie met microbeads en neuronen over naar het gebied van de MEA dat is begrensd door de PDMS-restrictie. Wacht na elke overdracht ongeveer een halve minuut om de microbeads de kans te geven zichzelf te organiseren in een hexagonale structuur.Zodra alle lagen zijn gedeponeerd en spontaan zijn geassembleerd bij 300 µL medium bovenop het gebied dat is afgebakend door de PDMS-beperking. Plaats de 3D-structuur gekoppeld aan de MEA in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 48 uur. Voeg daarna 1 mL groeimedium met supplement toe; na drie weken in vitro is de 3D-structuur ook stabiel zonder de getoonde PDMS-beperking.Hier is een DIC-afbeelding van een enkele laag kralen die gekoppeld zijn aan het MEA-oppervlak. De positie van de zwarte stippen geeft de ruimtelijke indeling van de elektroden weer. Immunofluorescente kleuring voor kaart twee, wat wordt weergegeven door het rode signaal, toont de distributie van dendritische arborisatie en ADA van de neuronen rond de microbeads die direct gekoppeld zijn aan het elektrodevlak van de MEA.Deze afbeelding toont de maximale projectie van een Z-stapel van een 3D-kweek, die een sterk onderling verbonden netwerk vertoont waarbij neuronen zijn gelabeld voor neuN, dat tot expressie komt in volwassen postmitotische neuronen, en voor GABA. Hier is de representatieve elektrofysiologische registratie van de hippocampale netwerken in 3D-configuratie. En hier is de representatieve elektrofysiologische registratie van de hippocampale netwerken in 2D-configuratie.Zodra deze procedure onder de knie is, kan deze in zeven uur worden uitgevoerd. Het is echter vermeldenswaardig dat, aangezien de procedure verschillende stappen bevat die op verschillende dagen zijn uitgevoerd, de tijdsschatting voor het realiseren van de volledige procedure slechts een indicatie is. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken eerst een 2D-laag neuron diuretic op de elektrode van de mea te plaatsen, en vervolgens de suspensie van microbits en neuronen zeer voorzichtig van de multi-well plaat naar de mea over te brengen om na de ontwikkeling de 3D-structuur te realiseren.Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de computationele neurowetenschappen om te onderzoeken hoe netwerkconnectiviteit de opkomende netwerkdynamiek kan vormgeven. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een in vitro driedimensionaal neuronaal netwerk bouwt dat gekoppeld is aan micro-elektrodearrays.

interfacing-3d-engineered-neuronal-cultures-to-micro-electrode-arrays

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol biedt de nodige informatie voor het opzetten, zorg voor, opname van en elektrisch stimuleren van culturen op MMO's.

Hoe te Cultuur, Record en het stimuleren van neuronale netwerken op de Micro-elektrode arrays (MEA&#39;s)

This video demonstrates the development of a 3D neuronal culture coupled to a planar microelectrode array with hippocampal neurons. The isolated neurons form a 2D network on the microelectrode array's active area and adhere to glass microbeads in a multi-well plate with a membrane insert. Upon transferring these neuron-coated microbeads to the electrode, they organize into an interconnected 3D neural network.

Building Three-Dimensional Neuronal Networks Coupled to Micro-Electrode Arrays

This video demonstrates the procedure of using the multielectrode array (MEA) to measure synaptic physiology in 3D coculture spheres. This method allows to understand the neural network dynamics and synaptic network burst activity within the 3D spheres.

Utilizing Multielectrode Arrays to Measure Synaptic Physiology in 3D Coculture Spheres

Dit manuscript beschrijft een protocol om te groeien in vitro modulaire netwerken bestaande uit ruimtelijk beperkt, functioneel met elkaar verbonden neuronale circuits. Een polymere masker wordt gebruikt voor het patroon van een eiwit laag om cellulaire adhesie op het kweken substraat te bevorderen. Plated neuronen groeien op gecoat gebieden oprichting spontane verbindingen en vertonen elektrofysiologische activiteit.

Ontwerp, oppervlaktebehandeling, Cellular Plating, en het kweken van Modulair neuronale netwerken Samengesteld uit Functioneel Inter-verbonden Circuits

We presenteren een protocol om primaire murine spiraalvormige ganglion neuron explantaten te kweken op multi-elektrode arrays om neuronale responsprofielen te bestuderen en stimulatieparameters te optimaliseren. Dergelijke studies zijn gericht op het verbeteren van de neuron-elektrode interface van cochleaire implantaten om het gehoor bij patiënten te verbeteren evenals het energieverbruik van het apparaat.

Spiraal Ganglion Neuron Explantatie Cultuur en elektrofysiologie op Multi Electrode Arrays

We wijzigen en implementeren van een eerder gepubliceerd protocol beschrijft de snelle, reproduceerbare en efficiënte differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) in prikkelende corticale neuronen 12. Specifiek onze modificatie maakt regeling van neuronale celdichtheid en gebruik op micro-electrode arrays elektrofysiologische eigenschappen op netwerkniveau meten.

Rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays

In dit protocol, wij streven ernaar om te beschrijven een reproduceerbare methode voor combineren losgekoppeld menselijke pluripotente stamcel afgeleid neuronen en astrocyten samen in 3D bol cocultures, behoud van deze gebieden vrij zwevende voorwaarden, en daarna het meten van synaptic circuit activiteit van de bollen met immunoanalysis en multielectrode serie opnamen.

Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol heeft tot doel om aan te tonen hoe te in vitro micro-elektrode-arrays combineren met microfluidic apparaten voor het bestuderen van de actiepotentiaal transmissie in neuronale culturen. Data-analyse, namelijk de opsporing en karakterisering van teeltmateriaal van de actie potentieel, is uitgevoerd met behulp van een nieuwe geavanceerde, nog gebruikersvriendelijk en vrij beschikbaar zijn, computationele gereedschap.

Interfacing Microfluidics met micro-elektrode Arrays voor het bestuderen van de neuronale communicatie- en axonale signaal vermeerdering

3D-printen op micrometerschaal maakt snelle prototyping mogelijk van polymere apparaten voor neuronale celculturen. Als proof-of-principle werden structurele verbindingen tussen neuronen beperkt door barrières en kanalen te creëren die de uitgroei van neurieten beïnvloedden, terwijl de functionele gevolgen van dergelijke manipulatie werden waargenomen door extracellulaire elektrofysiologie.

Twee-foton polymerisatie 3D-printen van neuronale celkweekapparaten op microschaal

Hier gebruiken we HD-MEA om ons te verdiepen in de computationele dynamica van grootschalige neuronale ensembles, met name in hippocampussen, olfactoriusbolcircuits en menselijke neuronale netwerken. Het vastleggen van spatiotemporele activiteit, gecombineerd met computationele tools, geeft inzicht in de complexiteit van neuronale ensembles. De methode verbetert het begrip van hersenfuncties en identificeert mogelijk biomarkers en behandelingen voor neurologische aandoeningen.

Vastleggen en analyseren van multimodale grootschalige neuronale ensembledynamiek op CMOS-geïntegreerde micro-elektrode-array met hoge dichtheid

Dit protocol heeft tot doel dorsaal-ventrale gefuseerde assembloids stabiel te plaatsen op multi-elektrode-arrays voor het modelleren van epilepsie in vitro.

Een multi-elektrode array platform voor het modelleren van epilepsie met behulp van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide hersenassemboïden

Leer hoe je 3D neuronale netwerken koppelt aan micro-elektrode arrays met glazen microbolletjes als steiger. Deze methode verbetert elektrofysiologische opnames voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve

Meer video's verkennen