Een Screenbare In Vivo Test voor Mitochondriale Modulators gebruik van Transgene Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Het algemene doel van het volgende experiment is om mitochondriale toxiciteit of gunstige effecten van geneesmiddelen te identificeren met behulp van het modelorganisme. C elegant. Dit wordt bereikt door de in vivo kwantificering van TP-niveaus in transgene zee-elgan-stammen die het vuurvlieg-kruisbloemengeen fuseren met het groen fluorescerende eiwit.

Het fusiegeen verleent twee verschillende eigenschappen aan nematoden. De eerste is dat wanneer het substraat Lucifer wordt gegeven, de nematoden licht uitzenden in het zichtbare bereik in verhouding tot hun cellulaire ATP-reserves. En de tweede is dat wanneer ze worden belicht met de juiste golflengte, ze sterke groene fluorescentie vertonen.

Fluorescentie is onafhankelijk van de ATP-niveaus van de nematoden en is evenredig aan hun massa of aantal. Daarom kan het worden gebruikt om de bioluminescentiemetingen te normaliseren. Tijdens een typisch assay wordt een populatie van ontwikkelingssynchrone wormen gekweekt tot het L vierde larvale stadium.

De nematoden worden vervolgens behandeld met de te testen geneesmiddelverbindingen gedurende een bepaalde periode vóór de meting van zowel fluorescentie als bioluminescentie. Resultaten tonen potentiële geneesmiddeltoxiciteit. Wanneer bioluminescentie wordt verminderd, geeft een versterkt signaal een hit aan voor verdere testen op gunstige effecten op mitochondriale functie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals geneesmiddelscreening op gekweekte cellen, is dat het screenen wordt uitgevoerd in de fysiologische context van een volledig levend meercellig organisme met bijna 50% genetische oogheelkunde bij mensen. En net als mensen, heeft de elegantie eigenlijk een mitochondriale oxidatieve fosforylering nodig om zich tot volwassenheid te ontwikkelen en zijn zijn mitochondriën ook veel kenmerken gemeen met zoogdiermitochondriën in termen van hun structuur, hun functie, hun bio-energetica. Kritische parameters binnen het protocol omvatten het ontwikkelingsstadium waarin de blootstellingen worden gestart, de duur van de blootstelling aan de nematode, aan het geneesmiddel van belang en het zaaien van een vergelijkbaar aantal nematoden in elk van de putjes, en natuurlijk, vermijding van besmetting Op dag één. Onder steriele omstandigheden breng nematoden over van één zes centimeter nematodegroeimediumplaat in twee milliliters S compleet medium in een fles met 30 gram per liter e coli.

OP 50 in S compleet medium, bebroed vervolgens de fles met schudden op dag vier, bleek de cultuur van GR nematoden om de eieren te oogsten en om de wormpopulatie te synchroniseren. Bebroed vervolgens de eieren een nacht in een glazen fles met 15 milliliter S compleet medium met schudden de volgende dag, dag vijf, de nematoden zullen zich in hetzelfde groeistadium bevinden. Om het aantal uitgekomen wormen te bepalen, gebruik elk keer een schone tip, breng drie 100 microliter aliquots van nematoden over in afzonderlijke microbuisjes die 900 microliter medium bevatten, aangevuld met 0,01% tween 20, pipet omhoog en omlaag een paar keer om eventuele wormen los te maken die aan de tip hechten.

Tel vervolgens de nematoden in vier afzonderlijke druppels van 10 microliter uit elk van de drievoudige verdunningsbuisjes, en bereken het volume van de nematodensuspensie dat nodig is om twee 20 milliliter culturen op te zetten met 10 nematoden per 10 microliter, decanteer geschatte volumes in twee vooraf gewogen 15 milliliter kegelvormige buisjes. Weeg de buisjes om het werkelijke volume te bepalen. Bepaal vervolgens het gewenste volume en meng voorzichtig en verwijder overtollig volume.

Was nu de nematoden in een totaal van 14 milliliter vers S compleet medium per buis en suspendeer de pellets in vijf milliliter S compleet medium met 30 gram per liter equali. OP 50. Breng de nematoden over naar kegelvormige glazen flessen die 15 milliliter S compleet bevatten met 30 gram per liter equali.

OP 50 tot een totaal volume van 20 milliliter per fles en noteer het tijdstip van voeding. Bereken het gemiddelde aantal nematoden in negen 10 microliter druppels om te bevestigen dat de culturen zijn verdund tot 10 nematoden per 10 microliter. Plaats de culturen in de incubator gedurende 42 tot 44 uur.

Op dag zeven trekt u de nematodeculturen in een enkele fles met continu zacht schudden. Breng vervolgens drie tot vier milliliter aliquots van nematoden over in een enkele 60 milliliter steriele trog. Gebruik een achtkanaals pipette om 25 microliters gesuspendeerde nematoden per putje in 96 te brengen.

Zwarte microtiterplaten met platte, transparante bodems. Breng vervolgens de deksels terug naar de platen en zet de platen opzij. Elke keer dat twee platen zijn gezaaid, brengt u nog eens twee, 2,5 milliliter aliquots van nematoden over in de trog om het verloren volume te vervangen.

Na het zaaien van 13 tot 14 platen met nematoden, voegt u 74 microliter S compleet medium toe aan elke put en brengt u de platen over naar een vochtige kamer en een schuddende incubator tot de geneesmiddeltoediening, terwijl de platen schudden. Ontdooi 2 96 welplaten voor geneesmiddelen voor testen. Gebruik vervolgens een multikanaals pipette en verwissel de tips elke keer.

Breng een microliter van de eerste kolom van de eerste geneesmiddelplaat over naar kolommen één tot vijf van een nematodeplaat. Breng een ander microliter over van de tweede kolom van de geneesmiddelplaat naar kolommen acht tot twaalf van de nematodeplaat. Voeg vervolgens één microliter voertuig toe aan kolommen zes en zeven van de nematodeplaat.

Gebruik de resterende kolommen in de geneesmiddelplaat om de rest van de nematodeplaten op dezelfde manier te behandelen, zorg ervoor dat u ook twee volledig met voertuigen behandelde platen opneemt. Breng vervolgens alle platen terug naar de vochtige kamers in de schuddende incubator voor nog eens 20 tot 22 uur op dag acht. Om een achtergrondcontroleplak voor fluorescentiemetingen voor te bereiden, combineer de inhoud van de putjes van een volledig met voertuigen behandelde nematodeplaat en laat de nematoden gedurende twee tot drie minuten bezinken.

Verzamel vervolgens de bacteriën die snat bev