Name: 3D Hydrogel Stellingen voor Articulaire Chondrocyte Cultuur en Kraakbeen Generation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Leer een 3D-biomimetische hydrogelcultuur voor het kweken van menselijke articulaire chondrocyten en het genereren van kraakbeen. Deze methode ondersteunt groei en rijping voor regeneratief onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag het Stanford Department of Orthopaedic Surgery en Stanford Coulter Translational Seed Grant bedanken voor de financiering. J.H.L. wil de National Science Foundation Graduate Fellowship en DARE Doctoral Fellowship bedanken voor de ondersteuning.

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Stanford University Human proefpersonen en Institutional Review Board protocol goedgekeurd. 1. Articulaire Chondrocyte Isolatie <ol><li> Verkrijgen kraakbeen weefsel tijdens de totale knieprothese weggegooid en ontleden zoals eerder 8 beschreven. </li><li> Selecteer visueel het mediale of laterale femurcondylen kraakbeen monsters voor gladde oppervlakken en maak snede in het oppervlak van het kraakbeen door een scalpel om 4-5 mm kraakbeen biopsieën verwijderen zonder dat de subchondrale bot. </li><li> Isoleer chondrocyten van de extracellulaire matrix door enzymatische dissociatie van het weefsel met O / N behandeling met gezuiverd collagenase. Met 1: 1 verhouding van collagenase II (125 U / ml) en collagenase IV (160 U / ml) in chondrocyten groei media bij 37 ° C. </li><li> De volgende dag, filteren het gedigereerde weefsel dat de gedissocieerde cellen door een 70mm poriegrootte Nylon mesh. Was tweemaal met 20 ml DMEM / F12 en centrifugeer bij 600 g gedurende 5 min. </li><li> Plaat de geïsoleerde chondrocyten met een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / 60 mm kweekschaal na resuspensie in DMEM / F12 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 25 ug / ml ascorbaat, 2 mM L-glutamine, antibiotica (100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 0,25 ug / ml fungizon). Laat de platen bij 37 ° C en de primaire chondrocyten kweken als een high-density monolaag houden vóór inkapseling in biomimetische hydrogels. </li></ol> 2. Biomimetic Hydrogel Fabrication Opmerking: deze methode kan de synthese van een biomimetische hydrogel bevattende poly (ethyleen glycol diacrylaat) (PEGDA, MW 5000 g / mol), chondroïtinesulfaat-methacrylaat (CS-MA) in DPBS. De toevoeging van foto-initiator maakt licht geactiveerde verknoping. De uiteindelijke hydrogelsamenstelling bevat 7% wegent / volume (w / v) van PEGDA, 3% w / v van CS-MA en 0,05% w / v van fotoinitiator. <ol><li> Synthetiseren CS-MA door functionaliseren CS polymeer met methacrylaatgroepen. <ol><li> Bereid gebufferde oplossing van 50 mM 2-morfolinoethaansulfonzuur (MES) en 0,5 M natriumchloride (NaCl) door het oplossen van 1,952 g MES en 5,84 g NaCl in 200 ml gedeïoniseerd water (DIH 2 O). Los in de gebufferde oplossing 5 g chondroïtinesulfaat natriumzout. </li><li> Voeg 0,532 g (4,62 mmol) N-hydroxysuccinimide (NHS) en 1,771 g (9,24 mmol) 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) (molaire verhouding NHS: EDC = 1: 2) om de oplossing en roer gedurende 5 min. </li><li> Voeg 0,765 g (4,62 mmol) 2-aminoethyl methacrylaat (AEMA) (molaire verhouding NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) aan de oplossing en de reactie bij kamertemperatuur gedurende 24 uur te handhaven. </li><li> Zuiver het mengsel door dialyse tegen gedeïoniseerd water (DIH 2 O) gedurende 4 dagen via dialysebuizen (12-14 kDa MWCO). </li><li> Filter de purified oplossing door een 0,22 urn filter en plaats de open buizen met de oplossing in de exsiccator en vacuum O / N. Zorg ervoor dat alle buizen worden beschermd tegen het licht. Bewaar het opgelost polymeer bij -20 ° C beschermd tegen licht en vocht. </li></ol></li></ol> 3. Cell Encapsulation <ol><li> Autoclaaf de PCR-film en cilindrische staven (voor het ponsen van de cel-beladen 3D hydrogels) en steriliseer de op maat gemaakte cilindrische gel schimmel door onderdompeling in 0,2 urn gefilterde 70% ethanol in weefselkweek kap onder UV-licht. </li><li> Dicht de onderkant van de gel vorm met geautoclaveerd PCR film zonder luchtbellen of spleten om lekkage te voorkomen. Hou het in een steriele 150 mm plaat. </li><li> De dag voor celinkapselende in biomimetische hydrogel, dissociëren de high-density chondrocyten monolaag met O / N behandeling Collagenase II en IV Collagenase oplossing. Gebruik 125 U / ml voor Collagenase II en 160 U / ml collagenase VI voor elk in chondrocyten groeimediumbij 37 ° C. </li><li> Neem een ​​50 ml buis en voeg 5% gewicht / volume (w / v) poly (ethyleen glycol diacrylaat) (PEGDA, MW = 5000 g / mol), 3% w / v chondroïtinesulfaat-methacrylaat (CS-MA), en 0,05% w / v fotoinitiator in DPBS. Vortex de buis om de oplossing te mengen en apart houden. Bescherm de buis van licht. </li><li> Verzamel de gedissocieerde cellen in een 50 ml Falcon buis, tellen en centrifugeer bij 460 xg gedurende 5 min. Zuig alle media uit de cellen buis en voeg de bovenstaande gemengde gel materiaal resuspendeer cellen bij een dichtheid van 15 x 10 6 cellen / ml. Meng het 30 keer grondig terwijl het vermijden van de vorming van luchtbellen. </li><li> Pipetteer 72 ul van de cel-suspensie hydrogel of hydrogel alleen in de op maat gemaakte gel cilindrische vorm en gelering te induceren door middel van blootstelling aan UV-licht (365 nm golflengte) van 3 mW / m 2 gedurende 5 min. Bereid sommige hydrogel oplossing met geen mobiele content. Met deze constructen als negatieve controles voor de toekomstige biochemische en mechanische testen. Measuopnieuw de intensiteit van het UV licht met een UV intensiteit meter. Om de intensiteit aan te passen, wijzigt u de afstand tussen de UV-lichtbron en de hydrogel schavot tijdens geleren. OPMERKING: Omdat de hydrogel bevat CS, wordt de acellulaire bijdrage afgetrokken van de biochemische GAG ​​inhoud van de cel beladen hydrogels alleen de cellulaire GAG ​​vertegenwoordigen. </li><li> Gebruik een scalpel om de film voor een eenvoudige schil af te snijden en verwijder deze voorzichtig. Met de hulp van de cilindrische staven, duwen de gel in een 6-wells plaat met 5 ml steriel DPBS te wassen gepolymeriseerde gel en losse cellen. </li><li> De cultuur van de cel-beladen hydrogels in 24 well platen met 1,5 ml chondrocyten groei media in elk putje. Gebruik een wegwerp spatel om de gewassen hydrogels zetten in de put. </li><li> Beoordelen levensvatbaarheid van de cellen door levend dood kleuring 24 uur na inkapseling met een levensvatbaarheid / cytotoxity kit. De cultuur van de cel-beladen hydrogels en de lege hydrogels voor 3-6 weken veranderen frisse chondrocyten growth media om de 2 dagen voor de oogst voor de analyses. </li></ol> 4. RNA-extractie en genexpressie analyses <ol><li> Zorgvuldig aspireren de media en zet steriele 1X PBS aan de cellen beladen en de lege controle hydrogels. </li><li> Met behulp van een steriele spatel, breng elke hydrogel een schone 1,5 ml eppendorfbuisje en voeg 250 ul van Tri-reagens aan elke buis. Volg de instructies van de fabrikant om RNA te isoleren. </li><li> Na RNA isolatie en kwantificering gebruik 1 ug van het van elk monster en het uitvoeren van een omgekeerde transcriptie in cDNA met behulp van de High Capacity cDNA reverse transcriptie Kit. </li><li> Voor kwantitatieve PCR gebruiken TaqMan Gene Expression Arrays voor het onderzoek van de expressie van de genen van belang. Normaliseren van de genexpressie niveaus intern GAPDH. </li><li> Voor de PCR-omstandigheden omvatten een 2 minuten incubatie bij 50 ° C eerdere amplicons met uracil-DNA glycosylase inactiveren, gevolgd door een 1060; min incubatie bij 95 ° C om het Taq polymerase te activeren. Voer veertig PCR-cycli bestaande uit 15 sec bij 95 ° C en 1 min bij 60 ° C. </li></ol> 5. Biochemische Analyses <ol><li> Voor elke cel-hydrogel constructen kwantificeren DNA en gesulfateerd glycosaminoglycaan (sGAG) produceren als volgt. </li><li> Zorgvuldig aspireren de media en zet steriele 1X PBS aan de cellen beladen en de lege controle hydrogels. Weeg een lege tube en zet de hydrogel binnenkant na deppen het op zijdepapier en registreer het gewicht of natte gewicht van de hydrogels. </li><li> Bevries elk hydrogel bij -20 ° C in een afzonderlijke 1,5 ml eppendorfbuisje voor enzymatische digestie en later gebruik van een aliquot van het verteerde product Picogreen-test (DNA) en dimethyl-methyleenblauw assay (voor GAG) in werking. </li><li> Bereid de papainase oplossing enzymatische digestie van de hydrogels. <ol><li> Maak eerst de PBE buffer door weging uit 7,1 g natrium Phosphate dibasisch (Na 2 HPO 4) en 1,6 g ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout (EDTA-Na 2). Oplossen in 500 ml dH 2 O, de pH op 6,5 en filtreer de gezuiverde oplossing door een 0,22 mm filter. </li><li> Oplossen in 20 ml PBE buffer 0,035 g L-cysteïne. Filtreer de oplossing en 100 ui steriel enzym papaïne. </li></ol></li><li> Als direct de assays, neemt de buizen van -20 ° C en voeg 300 ul van het gereed papaïne oplossing van het bevroren hydrogels. Plet de gel met een vijzel en stamper en meng het goed met de motor stamper. </li><li> Breng het volume tot 500 ul met extra papaïne oplossing. Voer dezelfde procedure voor de controle gels. Incubeer bij 60 ° C gedurende 16 uur 3,9. De oplossing die het gedigereerde hydrogel kan daarom gebruikt voor DNA kwantificatie en GAG. De DNA-inhoud met de Picogreen test met Lambda faag DNA als standaard volgende pr fabrikant metenotocol. </li><li> Kwantificeren van de gesulfateerde GAG-inhoud met behulp van de 1,9-dimethylmethyleen blauw (DMMB) kleurstof bindingstest met haai chondroïtinesulfaat standaard 10. Bepaal het GAG gehalte in de hoeveelheid GAG delen voor de overeenkomstige natgewicht. </li></ol> 6. Mechanische Testen <ol><li> Voeren onbeperkte compressie testen met behulp van een Instron 5944 testsysteem uitgerust met een 10 N load cell. <ol><li> Nadat de gewenste dagen in vitro cultuur, voert u de compressie-test op de mobiele-hydrogel schavot en de acellulaire controle hydrogels. </li><li> Dompel de monsters in PBS bad bij kamertemperatuur en te comprimeren met een snelheid van 1% rek / sec tot een maximale rek van 15% 11,12 omdat de lichamelijke belasting ervaren door kraakbeenweefsel onder belastingstoestand is gerapporteerd 10-20% te zijn 13,14. </li></ol></li><li> Maak spanning vs. rek bochten en curve fit met behulp van een derde orde veeltermvergelijking. Bepaal de compressive tangent modulus van de kromme passende vergelijking ten rekwaarden van 15%. </li></ol>

<ol><li>Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+study+of+collagen+types+I+and+II+and+procollagen+IIA+in+human+cartilage+repair+tissue+following+autologous+chondrocyte+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Knee%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation.</a> Knee. 16, 398-404 (2009).</li>
<li>Smeriglio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Potential+of+Juvenile+and+Adult+Human+Articular+Chondrocytes+for+Cartilage+Tissue+Formation+in+Three-Dimensional+Biomimetic+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li>
<li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Scientific reports. 3, 3553(2013).</li>
<li>Taipale, J., Keski-Oja, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+in+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Growth factors in the extracellular matrix.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).</li>
<li>Varghese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+based+niches+for+chondrogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).</li>
<li>Park, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+matrix+stiffness+on+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+in+response+to+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta.</a> Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).</li>
<li>Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stromal+Cells+in+Combinatorial+Hydrogels+Containing+Cartilage+Matrix+Proteins+with+Decoupled+Mechanical+Stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li>
<li>Smith, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intermittent+hydrostatic+pressure+and+BMP-2+on+osteoarthritic+human+chondrocyte+metabolism+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro.</a> J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).</li>
<li>Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocytes+in+agarose+culture+synthesize+a+mechanically+functional+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix.</a> J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).</li>
<li>Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+quantitation+and+discrimination+of+sulphated+glycosaminoglycans+by+use+of+dimethylmethylene+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue.</a> Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).</li>
<li>Lai, J. H., Levenston, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meniscus+and+cartilage+exhibit+distinct+intra-tissue+strain+distributions+under+unconfined+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+cartilage+%2F+OARS%2C+Osteoarthritis+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).</li>
<li>Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-rate+dependent+stiffness+of+articular+cartilage+in+unconfined+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression.</a> Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).</li>
<li>Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+measurement+of+articular+cartilage+deformations+in+the+intact+human+hip+joint+under+load%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+bone+and+joint+surgery.+American%22%5BJournal%5D)">In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load.</a> The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).</li>
<li>Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+stresses+in+the+human+hip+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">Cartilage stresses in the human hip joint.</a> Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).</li>
<li>Benya, P. D., Shaffer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiated+chondrocytes+reexpress+the+differentiated+collagen+phenotype+when+cultured+in+agarose+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels.</a> Cell. 30, 215-224 (1982).</li>
<li>Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Articular+cartilage%3A+tissue+design+and+chondrocyte-matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Instructional+course+lectures%22%5BJournal%5D)">Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions.</a> Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).</li>
<li>Wang, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+chondroitin+sulphate+for+cartilage+tissue-biomaterial+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration.</a> Nat Mater. 6, 385-392 (2007).</li>
<li>Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bonding+and+fusion+of+meniscus+fibrocartilage+using+a+novel+chondroitin+sulfate+bone+marrow+tissue+adhesive%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive.</a> Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Zoals gemeld in dit protocol, 3D hydrogels kunnen chondrocyte fenotype te behouden in de cultuur, het vermijden van het proces van cel dedifferentiation in fibrocartilage cellen meestal ondervonden met monolaagkweken 15. Bovendien langdurige kweken van de chondrocytes- hydrogel construct bleek een gunstige omgeving die de intrinsieke cel functies die samenhangen met de leeftijd en ziekte handhaaft. Het gebruik van een 3D biomimetische hydrogel heeft verschillende voordelen. Ten eerste, het opnemen van chondroïtinesulfaat (CS), een belangrijke component in gewrichtskraakbeen staat cellen aan de hydrogel matrix afbreken secreteren chondroitinase en bepaalt nieuw gesynthetiseerde kraakbeen extracellulaire matrix 5, 16. Bovendien is CS aangetoond anti-inflammatoire eigenschappen in het gewrichtsontsteking hebben. De biomimetische hydrogel kan ook worden gebruikt als een stellage materiaal voor cellulaire levering kraakbeenherstel, en kunnen chemisch gemodificeerdbeter weefsel-biomateriaal integratie 17,18 vergemakkelijken. Het gebruik van PEG-hydrogelen CS maakt langdurige kweken van chondrocyten en de evaluatie van de biochemische en mechanische eigenschappen. Hier laten we zien hoe dit platform nuttig kan zijn voor de vergelijkende analyse van de verschillende bronnen van gedifferentieerde chondrocyten om de optimale celtype kraakbeen techniek definiëren. Interessant chondrocyten ingekapseld in hydrogels levensvatbaar blijft en prolifereren op basis van hun intrinsieke capaciteiten. De hydrogelsamenstelling dragers, namelijk de groei van gezonde jeugdige en volwassen chondrocyten zoals getoond in figuur 2. De samenstelling en de structuur van de beschreven hydrogelen bevordert ook de vorming van kraakbeenweefsel zoals aangegeven door de afzetting van een functionele extracellulaire matrix bepaald door glycosaminoglycaan (GAG ) kwantificering. Bijkomend voordeel is dat de chondrocyten-hydrogel constructenkan worden beoordeeld op de mechanische eigenschappen van het nieuw gevormde kraakbeenweefsel. Merk op dat het onbeperkte compressietest worden uitgevoerd op de acellulaire hydrogel ter vergelijking. De hydrogels, in feite, een intrinsieke stijfheid als gevolg van de stijfheid van het CS resten. Onbeperkte compressie stam van 5-20% (bij een vervormingssnelheid 1% / s) kunnen worden toegepast voor het mechanisch testen van kraakbeenweefsel 11,12 omdat de lichamelijke belasting ervaren door kraakbeenweefsel onder belastingstoestand werd gemeld dat 10-20 13,14%. De reactie van zowel cel-beladen en acellulair hydrogels mechanische testen werd geëvalueerd aan de cultuur eindpunt. In het beschreven voorbeeld hierboven zagen we een vergelijkbare stijfheid van de constructen bevattende volwassen en jonge chondrocyten in tegenstelling tot de lagere stijfheid van de constructen die OA chondrocyten. Dergelijke mechanische eigenschappen van de cel-hydrogel construct kan de beoordeling van de functionele eigenschappen van devormden weefsel geven van een grondige analyse van de cel rijping vermogen. Concluderend kan het gebruik van de 3D biomimetische hydrogels het potentieel van verschillende chondrocyte populatie studeren om kraakbeenweefsel te genereren schaal worden toegepast. Naast de in vitro studies beschreven, kunnen in vivo transplantatie van de cellen beladen constructen worden beoogd om celrijping en regeneratieve mogelijkheden bestuderen van de fysiologische context. Verdere modificaties van de hydrogel platform bijkomende biomimetische kunnen eveneens worden beoogd om chondrocyte proliferatie en maturatie optimaliseren.

Met zijn beperkte potentieel voor zelfherstel ondergaat menselijk gewrichtskraakbeen frequent onomkeerbare schade. Momenteel zijn uitgebreide inspanningen gericht op de ontwikkeling van efficiënte cel-gebaseerde benaderingen voor de behandeling van gewrichtskraakbeenletsels. Het succes van deze cel-gebaseerde therapieën is sterk afhankelijk van de selectie van een optimale celbron en het behoud van het regeneratieve potentieel. Chondrocyten zijn een veelvoorkomende celbron voor kraakbeenherstel, maar ze zijn beperkt in aanvoer en kunnen gedurende in vitro expansie in 2D monolaagcultuur dedifferentiëren, waardoor hun generatie van hyalien kraakbeen wordt beperkt 1. 
Het doel van dit protocol is om een 3-dimensionaal hydrogelplatform te vestigen voor een in vitro vergelijkende studie van menselijke chondrocyten van verschillende leeftijden en ziektetoestand. In tegenstelling tot conventionele tweedimensionale (2D) cultuur, laten driedimensionale (3D) hydrogels chondrocyten toe om hun morfologie en fenotype te behouden en biedt het een fysiologisch relevante omgeving waardoor chondrocyten kraakbeenweefsel kunnen produceren 2,3. Naast het bieden van een 3D fysieke structuur voor chondrocytencultuur, bootsen hydrogels de functie van de natuurlijke kraakbeenextracellulaire matrix (ECM) na. Specifiek, de opname van chondroïtinesulfaatmethacrylaat biedt een potentieel reservoir voor uitgescheiden paracriene factoren 4 en maakt celgemedieerde degradatie en matrix-turnover mogelijk 5. Hoewel veel 3D hydrogelcultuursystemen breed zijn gebruikt in verschillende studies, waaronder agarose- en alginaatgels, hebben we een biomimetisch 3D-cultuursysteem gebruikt dat enkele duidelijke voordelen heeft voor chondrocytencultuur. Chondroïtinesulfaat (CS) is een overvloedig component in gewrichtskraakbeen en PEG-CS hydrogels hebben aangetoond dat ze het chondrogene fenotype kunnen behouden en zelfs verbeteren en celgemedieerde matrixdegradatie en -turnover kunnen faciliteren 2,5. Bovendien kunnen de mechanische eigenschappen van het hydrogelscaffold gemakkelijk worden gemoduleerd door de concentratie van PEG te veranderen en daarom kunnen ze worden gebruikt om het regeneratiepotentieel van chondrocyten of een verwante celtype verder te verbeteren 6,7. PEG/CSMA is ook biocompatibel en heeft dus het potentieel voor directe klinische toepassing in kraakbeendefecten, bijvoorbeeld. De beperking voor dit systeem is de complexiteit en het gebruik van fotopolymerisatie dat mogelijk de celviabiliteit kan beïnvloeden in vergelijking met eenvoudigere systemen zoals agarose, echter wegen de voordelen voor de chondrocytencultuur de potentiële beperkingen op.
De 3D hydrogelcultuur is compatibel met conventionele testen voor evaluatie van celfenotype (genexpressie, eiwitimmunostaining) en functioneel resultaat (kwantificering van kraakbeenmatrixproductie, mechanische testen). Deze gunstige 3D-omgeving werd getest om het weefselregeneratiepotentieel van menselijke chondrocyten uit drie verschillende leeftijdspopulaties in lange termijn 3D-culturen te vergelijken.
De resultaten werden geëvalueerd via zowel fenotypische als functionele assays. Juveniele, volwassen en OA-chondrocyten vertoonden differentiële reacties in de 3D biomimetische hydrogelcultuur. Na 3 en 6 weken werd de chondrogene genexpressie opgereguleerd in juveniele en volwassen chondrocyten, maar werd gedownreguleerd in OA-chondrocyten. De depositie van kraakbeenweefselcomponenten, inclusief aggrecaan, type II collageen en glycosaminoglycaan (GAG), was hoog voor juveniele en volwassen chondrocyten, maar niet voor OA-chondrocyten. De compressieve moduli van de resulterende kraakbeenconstructen vertoonden ook vergelijkbare trends. Kortom, zowel juveniele als volwassen chondrocyten vertoonden chondrogene en kraakbeenmatrixdispositie tot 6 weken van 3D-cultuur in hydrogels. In contrast, osteoartritise chondrocyten vertoonden een verlies van kraakbeenfenotype en minimale capaciteit om robuust kraakbeen te genereren.

<table><tbody><tr><td>juvenile chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System )</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>adult chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>poly(ethylene glycol diacrylate)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-1000-1g</td><td></td></tr><tr><td>2-morpholinoethanesulfonic acid</td><td>Sigma</td><td>M5287</td><td></td></tr><tr><td>photoinitiator</td><td>Irgacure&nbsp;</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>chondroitin sulfate sodium salt&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C9819</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>2-aminoethyl methacrylate</td><td>Sigma</td><td>516155</td><td></td></tr><tr><td>dialysis tubing</td><td>Spectrum Laboratories&nbsp;</td><td>132700</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 2</td><td>Worthington Biochemical&nbsp;</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 4</td><td>Worthington Biochemical&nbsp;</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 media</td><td>HyClone, Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SH3002301&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>live/dead assay</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L3224">L3224</a></td><td></td></tr><tr><td>Tri reagent</td><td>Life Technologies</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P11496">P11496</a></td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>1,9-dimethylmethylene blue&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV light equipment - XX-15LW Bench Lamp, 365 nm</td><td>UVP</td><td>95-0042-07</td><td></td></tr><tr><td>Instron 5944 testing system&nbsp;</td><td>Instron Corporation</td><td>E5940</td><td></td></tr></tbody></table>

3d hydrogel stellingen voor articulaire chondrocyte cultuur en kraakbeen generation

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Menselijk gewrichtskraakbeen is zeer gevoelig voor schade en heeft een beperkt potentieel voor zelfherstel en regeneratie. Celgebaseerde strategieën om kraakbeenweefsel te ontwikkelen bieden een veelbelovende oplossing voor het repareren van gewrichtskraakbeen. Om de optimale celbron voor weefselherstel te selecteren, is het belangrijk om een geschikt kweekplatform te ontwikkelen om de biologische en biomechanische verschillen in het door weefseltechniek ontwikkelde kraakbeen door verschillende celbronnen systematisch te onderzoeken. Hier hebben we een driedimensionale (3D) biomimische hydrogelkweekplatform toegepast om systematisch het regeneratiepotentieel van kraakbeen van juveniele, volwassen en osteoartritis (OA) chondrocyten te onderzoeken. De 3D biomimische hydrogel bestond uit synthetische component poly(ethyleenglycol) en bioactieve component chondroïtinesulfaat, die een fysiologisch relevante micro-omgeving biedt voor in vitro kweek van chondrocyten. Bovendien kan het scaffold mogelijk worden gebruikt voor celbezorging voor kraakbeenreparatie in vivo. Gewrichtsweefsel dat in het scaffold is ontwikkeld, kan worden geëvalueerd met behulp van kwantitatieve genexpressie, immunofluorescentiekleuring, biochemische analyses en mechanische testen. Door gebruik te maken van deze resultaten, waren we in staat om het differentiële regeneratiepotentieel van chondrocyten van verschillende leeftijden te karakteriseren, zowel op het niveau van genexpressie als in de biochemische en biomechanische eigenschappen van het ontwikkelde kraakbeenweefsel. Het 3D-kweekmodel zou kunnen worden toegepast om de moleculaire en functionele verschillen tussen chondrocyten en stamcellen van verschillende stadia van normale of abnormale ontwikkeling te onderzoeken.

Bioactieve hydrogels die PEG en CS groepen (figuur 1) vormen een ideaal platform voor de cultuur en de rijping van de menselijke articulaire chondrocyten 2,3,5,7. Chondrocyten van verschillende leeftijden en ziektetoestanden kunnen worden gekweekt bij de beschreven werkwijze en hun fenotype, genexpressie en biochemische en mechanische eigenschappen van het kraakbeenweefsel gegenereerde geanalyseerd. Drie chondrocyt monsters, juvenile- 6 maanden, volwassenheid 34 jaar en osteoarthritic- 74 jaar, werden geoogst na 3 weken van de cultuur in 3D biomimetische hydrogels. Genexpressie analyses van normale chondrocyten, zowel juveniele en volwassen, vertoonden een toename in de expressie van de genen chondrocyte COL2A1 en Col6a1. Integendeel, zieke chondrocyten toonden een dramatische verlaging van COL2A1 terwijl de expressie van Col6a1 (figuur 2) toont een verlies van chondrogene fenotype ondanks gekweekt in een gunstige biomimetische omgeving. De CS-PEG hydrogels ook dienen als een dynamische omgeving voor chondrocyten te laten groeien, verteren de bestaande matrix van PEG en CS en deponeren hun pericellulaire en extracellulaire matrix, de hoofdcomponenten van de volwassen kraakbeenweefsel. Gezien deze vermogens, chondrocyte expansie na 3 weken in vitro kweek kan worden geschat door kwantificering van DNA met de Picogreen kleurstof. Vergelijkende analyse van de drie groepen cellen blijkt dat de celdichtheid van jeugdige en volwassen populatie was onveranderd terwijl OA chondrocyten vertoonden een dramatische afname vergeleken met dag 1 van de kweek. Een verlies van DNA-gehalte werd waargenomen voor OA maar geen andere chondrocyten waarin mogelijke celdood tijdens de langdurige kweek (Figuur 3). Het uitgescheiden matrix werd gekwantificeerd als gesulfateerde GAG-gehalte DMMB-kleurstof bindingstest aan het eindpunt fase na 3 weken kweken. GAG inhoud wordt genormaliseerd door het natte gewicht van de hydrogel als Recorded voordat de enzymatische spijsvertering en de acellulaire bijdrage wordt afgetrokken. Zoals getoond in figuur 4, chondrocyten neergeslagen eenzelfde aanzienlijke hoeveelheid GAG gedurende 3 weken kweken in 3D hydrogels. De aanwezigheid van een scaffold fysieke maakt de evaluatie van de biomechanische eigenschappen van de monsters door middel onbeperkte compressietests 2,3. Terwijl acellulair hydrogels ondergaat een afname van de samendrukkende moduli, cellen beladen constructen handhaafde de samendrukkende moduli na 3 weken in kweek (Figuur 4). De fenotypische, biochemische en biomechanische analyse beschreven zijn daarom bruikbaar voor het evalueren en begrijpen van de potentie van verschillende chondrocyte populaties voor engineering van kraakbeen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig1.jpg" /> Figuur 1. PEG-CS biomimetische hydrogels voor 3D chondrocyte cultuur. chondrocyten opnieuw gesuspendeerd in een mengsel met poly (ethyleen glycol diacrylaat) (PEGDA) en chondroïtinesulfaat-methacrylaat (CS-MA) en gegoten in de maat cilindervormige gel vorm. Na blootstelling aan UV, gestolde gels worden verzameld uit de mallen en levensvatbaarheid van de cellen wordt bepaald door levend dood kleuring 24 uur na inkapseling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig2.jpg" /> Figuur 2. Expressie van chondrogene genen in menselijke chondrocyten gekweekt in 3D biomimetische hydrogels. Kwantitatieve genexpressie van kraakbeenmarkers COL2A1 en Col6a1 met juveniele, volwassenen en OA chondrocyten na 3 weken kweken in 3D biomimetische hydrogels. Waarden worden genormaliseerd om genexpressie niveau op dag 1. Fout bars vertegenwoordigen gemiddelde ± SD. * p &lt;0,05 zoals bepaald door een tweezijdige Student t-test. Gewijzigd van Smeriglio et al. 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig3.jpg" /> Figuur 3. DNA-gehalte in menselijke chondrocyten gekweekt in 3D biomimetische hydrogels. DNA kwantificering van Picogreen assay bij jonge, volwassen en OA chondrocyten na 3 weken van de cultuur in 3D biomimetische hydrogels. Waarden worden genormaliseerd om DNA-niveau op dag 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig4.jpg" /> &lt;br /&gt; Figuur 4. GAG gehalte meten en onbeperkte compressie test van de menselijke chondrocyten op dag 1 en na 3 weken van de cultuur in 3D biomimetische hydrogels. (A) GAG kwantificering van DMMB test in chondrocyten op dag 1 en na 3 weken van de cultuur in 3D biomimetische hydrogels. Waarden zijn genormaliseerd naar gewicht (ww) nat en uitgedrukt als ug / g. (B) compressiemodulus (kPa) van acellulaire en cel-beladen hydrogels op dag 1 en na 3 weken van de cultuur in 3D biomimetische hydrogels. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.</a>

Kraakbeenherstel vormt een onopgeloste medische uitdaging en cel-gebaseerde benaderingen om menselijk articulair kraakbeen te ontwikkelen zijn een veelbelovende oplossing. Hier beschrijven we driedimensionale (3D) biomimetische hydrogels als een ideaal hulpmiddel voor de uitbreiding en rijping van menselijke articulaire kraakbeencellen.

3D Hydrogel Stellingen voor Articulaire Chondrocyte Cultuur en Kraakbeen Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van een 3D biomimetische hydrogelcultuur om articulaire chondrocyten uit te breiden en menselijk gewrichtskraakbeen te genereren. Dit wordt bereikt door eerst de femurale condylen te dissecteren die zijn verkregen via een totale knieprothese, het kraakbeenweefsel uit het subchondrale bot te verwijderen en chondrocyten uit de extracellulaire matrix te isoleren door enzymatische dissociatie. De tweede stap is het synthetiseren van chondroïtinsulfaat-methacrylaatpolymeer voor de fabricage van een biomimetische hydrogel.Vervolgens worden de chondrocyten ingekapseld in de 3D biomimetische hydrogels en worden de constructen gedurende drie tot zes weken in vitro gekweekt. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die de groei en rijping van gewrichtschondrocyten aantonen aan de hand van zowel biochemische als mechanische testen. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van een 3D biometric hydrogen-platform voor het kweken van chondrocyten is dat het een fysiologisch relevante micro-omgeving biedt, omdat het de natuurlijke componenten van kraakbeen bevat.Dit is het voordeel dat chondrocyten hun fysiologie en fenotype gedurende een langere periode kunnen behouden. De opname van een bioactief polymeer, het chondroïtine-oppervlak, in de driedimensionale matrix-hydrogel maakt chondrocyten-gemedieerde metrics en degradatie-omzetting mogelijk. Daarnaast kunnen de mechanische en biochemische eigenschappen van de hydrogelmatrix eenvoudig worden aangepast.Deze techniek is compatibel met conventionele assays om het cel-fenotype en de functionele uitkomst te evalueren. Het kan worden gebruikt om intrinsieke kenmerken van chondrocyten te bestuderen die geassocieerd zijn met een gevorderd ziektestadium en om de celrijping en het regeneratieve potentieel in een fysiologische context te evalueren. Begin met het bereiden van het dissociatiemedium door één deel collagenase twee bij 125 units per milliliter te mengen met één deel collagenase vier bij 160 units per milliliter in choy-groeimedium, waarbij gebruik wordt gemaakt van vers kraakbeenweefsel dat doorgaans wordt weggegooid tijdens een totale knieprothese.Neem een steriele scalpel en neem een biopsie van het gladde oppervlak van een van de femorale condylen. Schaaf de biopsie vervolgens in dunne plakjes. Voeg de kraakbeenplakjes in een volumeverhouding van één op drie toe aan het gecombineerde dissociatiemedium en plaats de schaal gedurende de nacht bij 37 °C om de chondrocyten de volgende dag uit de extracellulaire matrix vrij te maken.Filter het gedigesteerde weefsel met de gedissocieerde cellen door een nylon gaas met een poriegrootte van 70 micron. Was de cellen vervolgens twee keer met 20 milliliters voorverwarmd D-M-E-M-F 12-medium en pelletteer de cellen gedurende vijf minuten bij 600 G. Tel daarna de geïsoleerde chondrocyten op een hemocytometerplaat.1 miljoen cellen op een kweekschaal van 60 millimeter plaatsen en bedekken met aangevuld D-M-E-M-F 12 medium. Houd de primaire choy-culturen in stand als een hoog-densiteitsmonolaag door standaard kweektechnieken te volgen. Synthetiseer chondroïtinesulfaatmethacrylaat door 1,952 gram van twee morph eth ethane sul acid en 5,84 gram natriumchloride aan 200 milliliters gedeïoniseerd water toe te voegen en de oplossing te roeren tot deze volledig is opgelost.Los vervolgens vijf gram chondroïtinesulfaatnatriumzout op in de gebufferde oplossing. Voeg daarna 0,532 gram N-hydroxy CIN-amide en 1,771 gram 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride toe aan de oplossing en roer gedurende vijf minuten. Zodra dit is opgelost, voegt u 0,765 gram 2-aminoethylmethacrylaat toe aan de oplossing en laat u de reactie 24 uur lang op kamertemperatuur staan, afgedekt met aluminiumfolie.Purificeer het uiteindelijke mengsel door vier dagen dialyse tegen gedeïoniseerd water, met behulp van dialysebuizen met een molecular weight cutoff van 12 tot 14 kilodalton. Filtreer vervolgens de gezuiverde oplossing door een 0,22 micron filter en vries deze in bij minus 20 graden Celsius. Plaats de open buisjes met de oplossing in een exsiccator.Bescherm ze tegen licht door ze af te dekken met aluminiumfolie en pas gedurende de nacht een vacuüm toe. Bewaar het opgeloste polymeer op min 20 graden Celsius in Falcon-buisjes, gewikkeld in parafilm en folie om het de dag vóór de celinkapseling te beschermen tegen licht en vocht. Verwijder het medium van de gecultiveerde cellen en bedek de cellen met dissociatiemedium.Incubeer de cellen overnight bij 37 °C in de collagenase-oplossing. Autoclaveer de PCR-folie en cilindrische staven, en steriliseer vervolgens de op maat gemaakte cilindrische gelmatrijs door deze overnight onder UV-licht in een weefselkweekkap te onderdompelen in met 0,2 µm gefilterde 70% ethanol. Verwijder de volgende dag de matrijzen uit de ethanol en laat ze drogen in de weefselkweekkap. Plaats de matrijs vervolgens in een steriele plaat van 150 mm. Zodra ze droog zijn, wordt de onderzijde van de matrijzen afgesloten met autoclaveerbare PCR-folie.Vermijd luchtbellen of openingen om lekken te voorkomen. Neem vervolgens een buis van 50 milliliter en voeg 10% van het bereide chondroïtinesulfaat-methacrylaat, 10% polyethyleenglycol-diacrylaat en 5% gewicht per volume foto-initiator in DPBS toe tot een uiteindelijke concentratie van respectievelijk 3%, 5% en 0,05%.Bescherm de buis tegen licht en vortex het mengsel kort. Verzamel de gedissocieerde cellen in een falcon-buis van 50 milliliter en tel ze vervolgens met een hemocytometer. Pelleteer de cellen bij 460 ×g gedurende vijf minuten en resuspendeer ze in het gemengde gelmateriaal bij een dichtheid van 15 miljoen cellen per milliliter.Meng de oplossing 30 keer, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen bellen worden gevormd. Pipetteer vervolgens 72 µL van de cel-hydrogelsuspensie of de hydrogel alleen in de op maat gemaakte cilindrische gelmal. Induceer de gelering door de gels vijf minuten lang bloot te stellen aan 365 nm UV-licht bij drie mW/cm².Zodra de gel is gestold, gebruik dan een scalpel om de film door te snijden en deze voorzichtig te verwijderen. Duw met behulp van de cilindrische staafjes de gel in een six-well plaat met vijf milliliter steriel DPBS om resterende niet-gepolymeriseerde gel en losse cellen weg te wassen. Verplaats vervolgens de gewassen hydrogels naar de wells van een 24-well plaat die elk 1,5 milliliter Chondra site groeimedium bevatten.Incubeer de hydrogels bij 37 °C en ververs het medium elke twee dagen. Beoordeel de cellevensvatbaarheid 24 uur na inkapseling via een live/dead-kleuring met behulp van standaardtechnieken. Cultureer de celgeladen hydrogels en de lege hydrogels gedurende drie tot zes weken vóór oogst en analyse. Haal de monsters na het gewenste aantal dagen in vitro-cultuur uit de incubator om de compressietest uit te voeren op de cel-hydrogelscaffold en de acellulaire controlehydrogels.Plaats de monsters één voor één bij kamertemperatuur in het PBS-bad dat is bevestigd aan een mechanisch testsysteem uitgerust met een krachtsensor van 10 Newton; comprimeer met een snelheid van 1% rek per seconde tot een maximale rek van 15%. Om de mechanische tests te analyseren, worden voor elk monster spannings-rekcurves gemaakt en wordt er een curvefitting uitgevoerd. Bepaal aan de hand van een polynoomvergelijking van de derde graad de compressie-tangensmodulus uit de curvefitting-vergelijking bij rekwaarden van 15%. Na drie weken kweek in 3D biomimetische hydrogels toonde de genexpressieanalyse van normale chondrocyten, zowel juveniel als adult, een toename in de expressie van de chondrocytgenen collagen two A one en collagen six A one. Daarentegen vertoonden zieke chondrocyten een drastische afname van collagen two A one, terwijl de expressie van collagen six A one behouden bleef, wat duidt op een verlies van het chondrogene fenotype ondanks kweek in een gunstige biomimetische omgeving.De expansie van chondrocyten na drie weken kweken kan worden geschat door kwantificering van DNA met de pico green-kleurstof. Een vergelijkende analyse van de drie celgroepen laat zien dat de celdichtheid van de juveniele en volwassen populaties ongewijzigd bleef, terwijl osteoartritische chondrocyten een drastische afname vertoonden vergeleken met dag één van de kweek. De uitgescheiden chondrocytenmatrix werd gekwantificeerd als gesulfateerd GAG-gehalte na drie weken kweken.Zoals hier getoond, deponeerden de chondrocyten gedurende drie weken kweek een aanzienlijke hoeveelheid gag, wat mogelijk heeft bijgedragen aan de verbeterde mechanische eigenschappen van celgeladen hydrogels in vergelijking met controles. Naast de toepassing van deze procedure voor individuele studies, kan het 3D biomimetische hydrogelkweektmodel eenvoudig worden vertaald naar een model voor volledige dikte kraakbeendefecten om de functionele en biochemische resultaten bij langdurige regeneratie van gewrichtskraakbeen te karakteriseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe menselijke chondrocyten uit gewrichtsspecimens van de knie kunnen worden geïsoleerd en hoe een driedimensionale hydrogel-scaffold kan worden geproduceerd voor langdurige kweek en kraakbeenvorming. Het gebruik van de 3D OME-hydrogels stelt ons en andere onderzoekers in staat om het chondrogene potentieel van verschillende populaties rijpe chondrocyten, alsofmede nieuwe populaties stam- en progenitorcellen, te vergelijken.In de toekomst kunnen deze technieken worden uitgebreid om aanvullende mimetische factoren op te nemen, om zo een optimaal steunstructuur te formuleren die kan worden gebruikt voor kraakbeenregeneratie en -herstel.

3d-hydrogel-scaffolds-for-articular-chondrocyte-culture-cartilage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een 3D-systeem van het kweken van menselijke articulaire chondrocyten in hoge mate van gewrichtsvocht wordt beschreven. Gewrichtsvocht geeft de meest natuurlijke micro-omgeving voor het kraakbeen, en kan gemakkelijk worden verkregen en opgeslagen. Dit systeem kan dus gebruikt worden voor het bestuderen van het herstel van kraakbeen en voor het screenen van geneesmiddelen voor de behandeling van artritis.

Een 3D-systeem voor het kweken van menselijke articulaire chondrocyten in gewrichtsvloeistof

De biosynthese van kraakbeenachtige extracellulaire matrix door chondrocyten kan worden beïnvloed door toepassing van mechanische stimuli. Deze methode beschrijft de technische uitvoering van dynamische druk-stammen chondrocyten ingekapseld in 3D constructen en de evaluatie van geïnduceerde veranderingen in chondrocyte metabolisme.

Mechanische stimulatie van Chondrocyten-agarose Hydrogelen

Een bioprinter werd gebruikt om gevormde hydrogelen gebaseerd op een offer mal maken. De poloxamer mal werd opgevuld met een tweede hydrogel en vervolgens geëlueerd, waardoor holtes die gevuld waren met een derde hydrogel. Deze methode maakt gebruik van snelle elutie en goede bedrukbaarheid van poloxameer om complexe architecturen uit biopolymeren genereren.

Afdrukken warmteresponsieve Reverse Mallen voor de schepping van Patterned Hydrogelen Twee-component voor 3D Cell Culture

De in dit document beschreven methoden zien hoe je een commerciële inkjet printer omzetten in een bioprinter met gelijktijdige UV-polymerisatie. De printer is geschikt voor het construeren van 3D-weefselstructuur met cellen en biomaterialen. De studie hier toonde construeerde een 3D neocartilage.

Human kraakbeenweefsel Fabrication behulp van drie-dimensionale Inkjet Printing Technology

Engineering en analyse van dragende weefsels met heterogene celpopulaties is nog steeds een uitdaging. Hier beschrijven we een methode voor het maken van bi-gelaagde alginaat-hydrogelschijven als platform voor co-cultuur van diverse celpopulaties binnen één constructie.

Gelaagde Alginaat Constructen: Een platform voor Co-cultuur van heterogene celpopulaties

Chondrogenese uit stamcellen vereist fine tuning van de kweekomstandigheden. Hier presenteren we een magnetische aanpak voor het condenseren van cellen, een essentiële stap om chondrogenese te initiëren. Bovendien tonen wij aan dat dynamische rijping in een bioreactor zijn mechanische stimulatie van de cellulaire constructen en verbetert kraakbeenachtige extracellulaire matrix productie.

3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Hier beschrijven we een facile voorbereiding van chitosan gebaseerde injecteerbare hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. Methoden om aan te passen van de hydrogel mechanische sterkte en de toepassing ervan in de 3D-celkweek worden gepresenteerd.

Voorbereiding van injecteerbare Hydrogels Chitosan gebaseerde en de toepassing ervan in de 3D-celkweek

Hier presenteren we een protocol voor 3D-cultuur systemen bij het zelf monteren van peptide steigers ter bevordering van de differentiatie van dedifferentiated menselijke articulaire chondrocyten in kraakbeen-achtig weefsel.

Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers

We bieden gedetailleerde methoden voor het genereren van vier soorten weefsels uit menselijke mesenchymale stamcellen, die worden gebruikt om het kraakbeen, bot, vetkussen en synovium in het menselijke kniegewricht samen te vatten. Deze vier weefsels zijn geïntegreerd in een aangepaste bioreactor en verbonden via microfluïdica, waardoor een kniegewricht-op-een-chip wordt gegenereerd.

Creatie van een kniegewricht-op-een-chip voor het modelleren van gewrichtsaandoeningen en het testen van medicijnen

Bottherapie via endochondrale ossificatie door het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel geproduceerd uit mesenchymale stamcellen heeft het potentieel om de nadelen van conventionele therapieën te omzeilen. Hyaluronzuurhydrogels zijn effectief bij het opschalen van uniform gedifferentieerde kraakbeentransplantaten en bij het creëren van geïntegreerd bot met vascularisatie tussen gefuseerde transplantaten in vivo.

Geïntegreerde botvorming door in vivo endochondrale ossificatie met behulp van mesenchymale stamcellen

Deze studie beschrijft een methode voor het produceren van chondrocytische sferoïden door cellen samen te voegen tot sferoïden onder omstandigheden met een lage adhesie met behulp van zwaartekracht, gevolgd door het kweken van de resulterende sferoïden in mini-bioreactoren.

Het genereren van sferoïden uit verschillende chondrocyten met behulp van weinig klevende omstandigheden onder zwaartekracht en zelfgemaakte mini-bioreactoren

Leer een 3D-biomimetische hydrogelcultuur voor het kweken van menselijke articulaire chondrocyten en het genereren van kraakbeen. Deze methode ondersteunt groei en rijping voor regeneratief onderzoek.

3D Hydrogel Stellingen voor Articulaire Chondrocyte Cultuur en Kraakbeen Generation

Meer video's verkennen