Name: Met behulp van Caco-2 cellen te Lipid Transport studie van de Darm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Leer lipidentransport in de darm bestuderen met behulp van Caco-2 cellen en dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. Deze methode isoleert lipoproteïnen voor analyse van deeltjesgrootte en transportmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Seed Grant Award van California Northstate University College of Pharmacy (aan AMN). De auteurs willen California Northstate University College of Pharmacy bedanken voor het dekken van de publicatiekosten van dit artikel, en George Talbott voor zijn hulp bij het redigeren van dit manuscript.

1. Onderhoud van de Caco-2 cellen <ol><li> Met behulp van reguliere weefselkweekschaaltjes <ol><li> Ontdooi de Caco-2-cellen uit een bevroren flacon door het plaatsen van de flacon in een 37 ° C waterbad en direct toevoegen aan een 10 cm weefsel kweekplaat met 10 ml voorverwarmde groeimedium (15% foetaal runderserum (FBS ) in Dulbecco&#39;s Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)). <ol><li> Wanneer de Caco-2-cellen 50-70% confluentie hebben bereikt, splitsen 1: 6 door incuberen van de cellen met 3 ml 0,05% trypsine / 0,53 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) bij 37 ° C totdat zij buiten (15 min) . Om cel klonteren voorkomen, meng de cellen meerdere malen door zachte pipetteren. Voeg 0,5 ml van de cellen met trypsine behandeld met een 10 cm weefsel kweekplaat met 10 ml voorverwarmde groeimedium. </li></ol></li><li> Schud de gerechten meerdere malen in een voorwaartse en achterwaartse richting, gevolgd door een naar links en naar rechts richting. Vermijd wervelende de gerechtenaangezien het kan resulteren in een ongelijke cel dispersie. </li><li> De schaaltjes worden op een vlak oppervlak in een met 5% CO 2 toegevoerd 37 ° C incubator. Schuine vlakken kunnen ook resulteren in een ongelijke cel dispersie. </li><li> Wijzig de groeimedia dag na aanvang van de incubatie. </li><li> Bewaken van de cellen en noteer de dag dat ze samenvloeiing bereiken. Het duurt ongeveer 1 week duren voordat de cellen samenvloeiing bereiken vanaf de dag dat ze worden gesplitst. </li><li> Wijzig de groei media twee keer per week voor de cellen te bereiken samenvloeiing. Zodra de cellen samenvloeiing bereikt hebben, veranderen de groei media om de andere dag. Nadat de cellen zijn 7-dagen na de samenvloeiing, veranderen de groei media dagelijks. Opmerking: De cellen zijn klaar voor experimenten wanneer zij 13 dagen na confluente (figuur 1). Omdat de cellen uiteindelijk minder effectief in het produceren van lipoproteïnen wordt, gebruiken cellen die 13 tot 17 dagen na confluent 8. Ga naar stap 3 over hoe om het experiment uit te voeren.</li></ol></li><li> De permeabele membraansysteem <ol><li> Zaad van de Caco-2-cellen in het permeabele membraan insert zoals beschreven in stap 1.1.1.1. hierboven. Vermijd het gebruik van cellen van een bevroren flesje omdat hun celgroei is normaal gesproken langzamer (herstelperiode). In het kort, voeg 0,5 ml van de cellen met trypsine behandeld om de apicale kamer (bovenste compartiment) die 10 ml van voorverwarmd groeimedium bevat. Ook, voeg 10 ml van voorverwarmd groeimedium aan de basolaterale kamer (onderste magazijn). Opmerking: Voor de beste praktijken, voeg de groei media om de apicale kamer en vervolgens naar de basolaterale kamer. Bij het verwijderen van de oude media, verwijder de basolaterale media voordat de apicale media. Vermijd porren het polycarbonaat membraan als het kan het membraan scheuren. </li><li> Door de slechte cel zicht door het polycarbonaat membraan, zaad de Caco-2-cellen in een regelmatig weefselkweekplaat met gelijke dichtheid, en deze schotel naar de celconfluentie beoordelen. </li><li> Volg sTEPs 1.1.2-1.1.6 boven. </li></ol></li></ol> 2. Gene Overexpressie <ol><li> Met behulp van de reguliere transfectie aanpak <ol><li> Zaad van de Caco-2-cellen op een weefselkweek schotel, zoals beschreven in 1.1.1.1.-1.1.4. Opmerking: Wanneer de cellen zijn ongeveer 40-50% confluent, zijn ze klaar om te worden getransfecteerd. </li><li> Voeg 67 ul van het transfectie reagens om 472 ui van de verminderde serum media in een microcentrifugebuis. Vermijd contact van het onverdunde transfectiereagens met de buiswand. </li><li> Voeg 23 ug pLL3.7 versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) 9 in het transfectiereagens / verlaagde serum medium mengsel. </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 20 min bij kamertemperatuur. </li><li> Vervang de Caco-2 cellen groeimedia met 8 ml 10% FBS in DMEM. </li><li> Voeg de DNA / transfectiereagens / verminderd serum media mengsel druppelsgewijs aan het gerecht. </li><li> Schud de gerechten meerdere malen in een voorwaartse en backward richting gevolgd door een naar links en naar rechts richting. </li><li> Zet de schaal in de 37 ° C incubator. </li><li> Vervang het medium in de schaal met 10 ml groeimedium dag na aanvang van de incubatie. </li><li> Controleer de genexpressie. <ol><li> Monitor genexpressie zonder 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) kleuring. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop, bepaalt het percentage cellen die groen zijn. Het percentage is de transfectie-efficiëntie. </li><li> Controleer de genexpressie met DAPI kleuring. <ol><li> Was de cellen met met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) driemaal. </li><li> Fixeer de cellen door toevoeging van 10 ml van 4% formaldehyde in PBS (10 min incubatie bij kamertemperatuur). </li><li> Was de cellen met PBS driemaal. </li><li> Incubeer de cellen in het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met 8 ml PBS dat 1: 500 DAPI, 1% BSA, 0,01% digitonine. </li><li> Was de cellen met PBS driemaal. </li><li> Uzing een fluorescentiemicroscoop Bepaal het aantal cellen die groen / blauw ten opzichte van die die blauw (figuur 2 bovenste paneel). Het berekende percentage geeft de transfectie-efficiëntie. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> De lentivirus overexpressie systeem 10 <ol><li> Seed humane embryonale nier (HEK) 293T-cellen in een 15 cm weefsel kweekplaat (10% FBS in DMEM hun groeimedium). Opmerking: Wanneer de cellen zijn ongeveer 60-70% confluent, zijn ze klaar om te worden getransfecteerd. </li><li> Voeg 162 ul van het transfectie reagens 1133 pl van het verminderde serum media in een microcentrifugebuis 11. Vermijd contact van het onverdunde transfectiereagens met de buiswand. </li><li> Voeg 24 ug pLL3.7 eGFP (of een andere constructie), 15,6 ug Rev response-element (RRE), 6,0 ug REV, en 8,4 ug vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSVG) in de transfectiereagens / reduced serum media mengsel. </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 20 min bij kamertemperatuur. </li><li> Vervang de groeimedia met 16 ml 10% FBS in DMEM. </li><li> Voeg de DNA / transfectiereagens / verminderd serum media mengsel druppelsgewijs aan het gerecht. </li><li> Schud de gerechten meerdere malen in een voorwaartse en achterwaartse richting, gevolgd door een naar links en naar rechts richting. Het is normaal om een ​​aantal van de HEK293T cellen losgemaakt op dit punt te zien. </li><li> Zet de schaal in de incubator. </li><li> Na 24 uur incubatie, de plaats van de media in de schaal met 25 ml van de groei media. </li><li> Op de volgende dag, het verzamelen van de groei media met de lentivirus (eerste collectie). </li><li> Herhaal stap 2.2.10 meer lentivirus (de tweede collectie) te verzamelen. </li><li> Verzamel de eerste en de tweede verzamelhouder en verwijder celresten door centrifugeren (2500 x g gedurende 5 minuten). </li><li> Filter de collectie met een wegwerp fles-top filter (0,45 pm porie), enconcentreren van het virus door centrifugeren de collectie van 31.400 xg gedurende 2 uur bij RT (JA-20 rotor). Merk de bodem van de centrifugebuis wanneer de pellet is gelegen. Giet het supernatant en laat de buis omgekeerd bij KT gedurende 15 min. </li><li> Resuspendeer de virus-bevattende pellet met 100 pi 1X PBS. Vermijd bubbels. </li><li> Bewaar de geconcentreerde virus bij -80 ° C. Vermijd vries-dooi cycli. </li><li> Bepaal de optimale hoeveelheid virus die nodig is om de Caco-2-cellen te transduceren door middel van titratie. Om kosten te besparen, gebruikt een 24-well plaat (0,3 ml groeimedium / putje) in plaats van een 10 cm weefselkweekschaal titratie. <ol><li> Voeg toenemende hoeveelheden van het geconcentreerde virus (0, 1, 2, 5, 10, 25, en 50 gl / putje) aangevuld met polybreen (eindconcentratie = 5 ug / ml) aan de 40-70% confluent Caco-2-cellen. Schud de 24-well plaat voorzichtig zoals beschreven in 1.1.2. </li><li> Toezicht op hun genexpressie (stap 2.1.10.) (Figuur 2 bottom4 panelen). </li></ol></li><li> Omdat de expressie van transgene algemeen wordt volgehouden, handhaven van de getransduceerde cellen voor toekomstige experimenten en voortdurend hun genexpressie controleren (stap 2.1.10.). </li></ol></li></ol> 3. Het stimuleren van de Lipoprotein Afscheiding <ol><li> De reguliere weefselkweekplaat <ol><li> Bereid een 100X lipide mengsel door mengen van 50 mg oliezuur, 40 mg lecithine en 48 mg natrium taurocholaat. Breng het volume tot 900 ul met PBS (genoeg voor 8 gerechten). Vortex de lipidemengsel krachtig. </li><li> Voeg 900 ul van de 100X lipide mengsel in 89,1 ml groeimedium. Meng en filteren de lipide bevattende media. De eindconcentraties (1X) oliezuur, lécithine, en natriumtaurocholaat zijn 2,0 mM, 1,36 mM en 1,0 mM, respectievelijk. </li><li> Voeg 10 ml van het lipide bevattende media op de cellen. </li><li> Incubeer de cellen met de lipiden bevattende media voor 4 uur in een 37° C incubator. </li><li> Was de cellen met PBS driemaal. </li><li> Voeg 10 ml van het kweekmedium om de cellen aan het lipoproteïne secretie verzamelen. </li><li> Incubeer 2 uur in een 37 ° C incubator. </li><li> Verzamel de lipoproteïne-bevattende media. </li></ol></li><li> De permeabele membraansysteem <ol><li> Volg de stappen 3.1.1-3.1.2 aan de lipide mengsel te bereiden. </li><li> Voeg 10 ml van het lipide bevattende media om de apicale kamer en 10 ml van het kweekmedium aan de basolaterale kamer. </li><li> Incubeer gedurende 4 uur in een 37 ° C incubator. Verzamel de lipoproteïne-bevattende media in de basolaterale kamer. </li></ol></li></ol> 4. Lipoproteïne afzonderlijk (figuur 3) <ol><li> Verwijder de celresten van het lipoproteïne bevattende medium door centrifugeren (2000 x g gedurende 5 minuten). </li><li> Giet het medium in een 50 ml buis. </li><li> Voeg 5,95 g natriumchloride aan de media. </li><li> Als de sample worden geanalyseerd door TEM, voeg 1 proteaseremmer cocktail tabletten de integriteit van de lipoproteïnen handhaven. </li><li> Breng het volume op 23 ml met water (1,2 g / ml NaCl-density oplossing). </li><li> Los het volledig opgeloste stoffen. </li><li> Giet alle oplossing in een polycarbonaat ultracentrifuge buis. </li><li> Overlay voorzichtig de 1,2 g / ml oplossing dichtheid met 0,5 ml water (1,0 g / ml dichtheid). </li><li> De balans van de buis van het gewicht en niet door volume. </li><li> Voorzichtig laden van de buizen in de T865 rotor. </li><li> Spin de monsters in de ultracentrifuge bij 429.460 xg gedurende 24 uur bij 4 ° C. </li><li> Onmiddellijk isoleren van de top 0,5 ml oplossing door zachte pipetteren. Houd de buis zo stil mogelijk. </li></ol> 5. TEM Analyse <ol><li> Bereid 5 ml 2% fosfowolfraamzuur (w / v) en breng de pH op 6,0. </li><li> Filter de 2% fosfowolfraamzuur met een spuitfilter (poriegrootte: 0,2 urn). </li><li> Drop 20 ui van het lipoproteïne monster op een steriele schaal. </li><li> Drop 20 ul van de gefiltreerde 2% fosfowolfraamzuur naast het monster op dezelfde schaal. </li><li> Zachtjes laten vallen een EM rooster met de saaie kant rust op het monster. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min. </li><li> Tik zachtjes tegen de zijkant van de EM rooster op een filter papier om het monster uit het rooster te verwijderen. </li><li> Voorzichtig laat de EM rooster met de saaie kant rust op de 2% fosfowolfraamzuur. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min. </li><li> Tik zachtjes tegen de zijkant van de EM rooster op een filter papier om de fosfowolfraamzuur uit het rooster te verwijderen. </li><li> Met een TEM, vangen de beelden van de lipoproteïnen (figuur 4). </li></ol>

<ol><li>Drover, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+deficiency+impairs+intestinal+lipid+secretion+and+clearance+of+chylomicrons+from+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood.</a> J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).</li>
<li>Nauli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+is+important+for+chylomicron+formation+and+secretion+and+may+mediate+cholesterol+uptake+in+the+proximal+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).</li>
<li>Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase+release+is+not+associated+with+chylomicron+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).</li>
<li>Lo, C. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+the+gut+choose+apolipoprotein+B48+but+not+B100+for+chylomicron+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).</li>
<li>Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+noninvasive+method+for+the+measurement+of+intestinal+fat+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption.</a> Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).</li>
<li>Nauli, A. M., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+transport+as+a+potential+determinant+of+drug+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability.</a> Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).</li>
<li>Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterocyte+fatty+acid+uptake+and+intestinal+fatty+acid-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein.</a> Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).</li>
<li>Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chylomicrons+produced+by+Caco-2+cells+contained+ApoB-48+with+diameter+of+80-200+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm.</a> Physiol Rep. 2 (6), (2014).</li>
<li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Pottekat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+biosynthetic+interaction+network+component%2C+TMEM24%2C+facilitates+insulin+reserve+pool+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release.</a> Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).</li>
<li>Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+saturated%2C+mono-%2C+and+polyunsaturated+fatty+acids+on+the+secretion+of+apo+B+containing+lipoproteins+by+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells.</a> Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).</li>
<li>Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cells+and+human+fetal+colon%3A+a+comparative+analysis+of+their+lipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport.</a> Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).</li>
<li>Luchoomun, J., Hussain, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+secretion+of+chylomicrons+by+differentiated+Caco-2+cells.+Nascent+triglycerides+and+preformed+phospholipids+are+preferentially+used+for+lipoprotein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly.</a> J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).</li>
</ol>

De auteur heeft niets te onthullen.

In dit document kunnen de twee systemen die kunnen worden gebruikt voor het onderhoud Caco-2 cellen zijn beschreven, namelijk de normale weefselkweek schaal en de permeabele membraan. De voordelen van het permeabele membraan systeem omvatten de scheiding van de apicale en basolaterale compartimenten en de mogelijkheid om het lipide mengsel incubeer en laat het lipoproteïne secretie tegelijk. De permeabele membraan inserts zijn duur en hun polycarbonaatmembraan laat geen goede mobiele zicht. Een van de voordelen van deze...

Studies van intestinale absorptie van dieetvet en vetoplosbare geneesmiddelen en vitaminen kunnen in vivo worden uitgevoerd door toepassing van een model lymfe fistel 1-4. De chirurgische technieken noodzakelijk zijn niet alleen moeilijk maar ook duur. Hoewel in vivo benade- fecal analyse kan worden toegepast, worden zij vooral gebruikt om het percentage opname bepaald door het maagdarmkanaal 2,5. De in vitro beschreven in dit document model is meer kosteneffectief, en de betrokken technieken zijn misschien wel minder uitdagend. Genetische modificatie studies ook economischer en minder tijdrovend wanneer ze worden uitgevoerd in deze in vitro model. Aangezien vetoplosbare stoffen die door enterocyten genomen worden verpakt in lipoproteïnen 6,7, de doeltreffendheid van deze in vitro model lipoproteïnen produceren cruciaal. De twee belangrijkste intestinal lipoproteïnen zijn chylomicronen en lipoproteïnen zeer lage dichtheid (VLDL). Chylomicronen, gedefinieerd als lipoproteïnen met 80 nm of meer in diameter, strikt door de dunne darm wanneer lipiden zijn overvloedig aanwezig in de maag lumen. Omdat ze de grootste lipoproteïnen, chylomicronen zijn denkbaar de meest efficiënte lipide transporteurs. Deze in vitro model dat kan produceren chylomicronen 8, kan worden gebruikt om voeding vetabsorptie, vet-oplosbare vitamine absorptie door de darm en orale biologische beschikbaarheid lipofiele geneesmiddelen te bestuderen. De aanwezigheid van lipide oplosbare moleculen, vitamines of drugs in de lipoproteïne fractie is een indicator van de absorptie door de dunne darm. Zoals eerder besproken, kan dit model worden gebruikt om orale biobeschikbaarheid lipofiel geneesmiddel 6 verbeteren. Dit artikel beschrijft hoe Caco-2 cellen permeabel membraan of vaste weefselkweekplaten, hoe de lipide mi te handhavenxture voor het stimuleren lipoproteïne produktie moet worden voorbereid, hoe lentivirus expressiesysteem kan worden toegepast om effectief overexpressie halen en hoe de lipoproteïnen die moeten worden geanalyseerd.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>16750-112</td><td>Verwarm het groeimedium in individuele weefselkweekschalen voor het toevoegen van cellen</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>3600511</td><td>We inactiveren ons serum niet door verhitting</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>Cellen kunnen worden gewassen met PBS voorafgaand aan trypsinebehandeling</td></tr><tr><td>Permeabel membraansysteem</td><td>Fisher</td><td>7200173</td><td>10-cm schaal, 3-mm poriëngrootte, polycarbonaatmembraan</td></tr><tr><td>10 cm schaal</td><td>Fisher</td><td>08-772-E</td><td>Weefselkweekschaal</td></tr><tr><td>15 cm schaal</td><td>Fisher</td><td>08-772-24</td><td>Weefselkweekschaal</td></tr><tr><td>24 wel plaat</td><td>Fisher</td><td>12565163</td><td>Weefselkweekplaat</td></tr><tr><td>Lipid-gebaseerde transfectiereagens</td><td>Fisher</td><td>PRE2691</td><td>Kan worden vervangen door een ander transfectiereagens</td></tr><tr><td>Gereduceerd serummedium</td><td>Invitrogen</td><td>11058021</td><td>Voor transfectie</td></tr><tr><td>pLL3.7 eGFP</td><td>Addgene</td><td>11795</td><td><a href="https://www.addgene.org/11795/">https://www.addgene.org/11795/</a></td></tr><tr><td>Fles-top filter</td><td>Fisher</td><td>9761120</td><td>0,45 mm poriën</td></tr><tr><td>Polybreen</td><td>Fisher</td><td>NC9840454</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Oleinzuur</td><td>Sigma</td><td>01383-5G</td><td>Bevries-ontdooicyclus voorkomen</td></tr><tr><td>Lecithine&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>IC10214625</td><td>Eierlecithine&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumtaurocholaat</td><td>Fisher</td><td>NC9620276</td><td>Product niet meer leverbaar; alternatief catalogusnummer: 50-121-7956</td></tr><tr><td>Protease-remmercocktailtablet (EDTA-vrij)</td><td>Fisher</td><td>5892791001</td><td>Wordt voornamelijk gebruikt voor monsters die TEM-analyse nodig hebben</td></tr><tr><td>Polycarbonaat ultracentrifugebuis</td><td>Fisher</td><td>NC9696153</td><td>Meerdere keren hergebruiken zal de buis doen instorten</td></tr><tr><td>Deksel voor ultracentrifugebuis</td><td>Fisher</td><td>NC9796914</td><td>Er is een gereedschap nodig om de buis/deksel uit de rotor te verwijderen</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>Fisher</td><td>50-949-261</td><td>Wegwerp</td></tr><tr><td>Spuitfilter</td><td>Fisher</td><td>09-719C</td><td>Poriëngrootte = 0,2 mm; nylon</td></tr><tr><td>Fosfowolfraamzuur</td><td>Fisher</td><td>AC208310250</td><td>Voor het bereiden van 2% fosfowolfraamzuur, pH 6,0</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fisher</td><td>50-238-62</td><td>Extra fijne en sterke uiteinden</td></tr><tr><td>Formvar/koolstof raster</td><td>Fisher</td><td>50-260-34</td><td>Formvar/koolstoffilm vierkant raster 400 Koper</td></tr></tbody></table>

met behulp van caco-2 cellen te lipid transport studie van de darm

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies van de absorptie van dieetvetten worden over het algemeen uitgevoerd met behulp van een diermodel dat is uitgerust met een lymfekatheter. Hoewel dit diermodel algemeen wordt geaccepteerd als het in vivo model van absorptie van dieetvetten, zijn de chirurgische technieken die hierbij betrokken zijn uitdagend en duur. Genetische manipulatie van het diermodel is ook kostbaar en tijdrovend. Het alternatieve in vitro model is misschien wel betaalbaarder, tijdbesparend en minder uitdagend. Belangrijk is dat het in vitro model onderzoekers in staat stelt de enterocyten als een geïsoleerd systeem te onderzoeken, waardoor de complexiteit die inherent is aan het model van het hele organisme wordt verminderd. Dit artikel beschrijft hoe humane coloncarcinoomcellen (Caco-2) kunnen dienen als een in vitro model om de transport van lipiden door enterocyten te bestuderen, evenals van lipofielen geneesmiddelen en vitaminen. Het legt de juiste onderhoud van Caco-2 cellen en de voorbereiding van hun lipidenmengsel uit; en het bespreekt verder de waardevolle optie om het permeabele membraansysteem te gebruiken. Omdat gedifferentieerde Caco-2 cellen gepolariseerd zijn, is het belangrijkste voordeel van het gebruik van het permeabele membraansysteem dat het het apicale van het basolaterale compartiment scheidt. Bijgevolg kan het lipidenmengsel aan het apicale compartiment worden toegevoegd, terwijl de lipoproteïnen uit het basolaterale compartiment kunnen worden verzameld. Bovendien wordt de effectiviteit van het lentivirusexpressiesysteem bij het reguleren van genexpressie in Caco-2 cellen besproken. Ten slotte beschrijft dit artikel hoe de succesvolle isolatie van intestinale lipoproteïnen kan worden bevestigd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).

Figuur 1 toont de normale 13-dagen na de samenvloeiing Caco-2-cellen. Het uiterlijk van de koepelvormige constructies en intracellulaire vetdruppels zijn kenmerkend gedifferentieerde Caco-2-cellen. Wanneer de Caco-2 cellen niet gelijk tijdens het zaaien worden gedispergeerd, ze klonteren en overgroei in bepaalde gebieden van de schaal; en er een aantal gebieden in de schotel hiervoor geen enkele cellen. Het wervelen en het plaatsen van de schotel op een hellend oppervlak moet worden vermeden. Het is ook...

Caco-2 cellen kunnen dienen als een in vitro model om het enterocyt transport van lipiden, en in vet oplosbare geneesmiddelen/vitaminen te bestuderen. Het permeabele membraansysteem scheidt het apicale van het basolaterale compartiment, terwijl het lentivirusuitdrukkingssysteem een effectieve genoverexpressiemethode biedt. De isolatie van lipoproteïnen wordt bevestigd door TEM.

Met behulp van Caco-2 cellen te Lipid Transport studie van de Darm

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van het transport van lipide-oplosbare moleculen door de darm. Dit wordt bereikt door eerst gedifferentieerde Caco 2-cellen in de permeabele membraan-insert te plaatsen. Vervolgens worden de Caco 2-cellen geïncubeerd met een lipidemengsel en wordt de secretie van lipoproteïnen gestimuleerd.Vervolgens worden de lipoproteïnen geïsoleerd middels ultracentrifugatie met een natriumchloride-dichtheidsgradiënt. Tot slot worden de geïsoleerde lipoproteïnen negatief gekleurd met fosfotungstinezuur. Ten slotte wordt deeltjesgrootteanalyse gebruikt om de relatieve overvloed van chylomicronen ten opzichte van very low density lipoproteins aan te tonen.Hoewel deze methode inzicht kan geven in het transport van voedingslipiden door de darm, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals het bepalen van de biobeschikbaarheid van orale lipide geneesmiddelen. Na het implementeren van gen-overexpressie en monitoring volgens het tekstprotocol, moeten de KCO twee cellen die de gen-overexpressie in stand houden, worden onderhouden. Gebruik cellen die 50 tot 70% confluentie hebben bereikt, splits de cellen één op zes door drie milliliters 0,05%trypsine en 0,53 millimol EDTA toe te voegen, en incubeer bij 37 °C tot de cellen zijn losgelaten; pipetteer de cellen vervolgens voorzichtig enkele keren om klontering te voorkomen.Overdracht vervolgens 0,5 milliliters van de cellen naar de apicale of bovenste kamer van een doorlaatbaar membraan, dat 10 milliliters voorverwarmd groeimedium bevat. Voeg 10 milliliters warm groeimedium toe aan de onderste of laterale kamer. Schud de schaaltjes voorzichtig enkele keren in een voor- en achterwaartse beweging.Vermijd het ronddraaien van de schalen, omdat dit kan leiden tot een ongelijkmatige celverdeling. Plaats de schalen op een vlak oppervlak in een incubator op 37 °C en 5% CO2. Vers xlabel de groeimedia een dag later en blijf het medium vervangen volgens het tekstprotocol.Bereid een 100 x lipidmengsel door 900 µL PBS toe te voegen aan 50 mg oliezuur. Vortex het mengsel krachtig. Draag het gehele oliezuurmengsel over naar een buis met 40 mg Han en 48 mg natriumtarotaat. Los het lipidmengsel op door krachtig te vortexen.Voeg de 900 µL lipidenmengsel toe aan 89,1 mL groeimedium en meng de gefilterde oplossing voor de hier getoonde uiteindelijke concentraties in het medium. Gebruik Caco-2-cellen die 13 dagen na confluentie op permeabele membraaninserts zijn gekweekt. Voeg 10 mL van het lipidehoudende medium toe aan de apicale kamer en 10 mL van het groeimedium aan de basolaterale kamer.Incubeer gedurende vier uur bij 37 °C voordat het lipoproteïnebevattende medium in de basolaterale kamer wordt opgevangen. Om de lipoproteïnen te isoleren, worden de celresten uit het lipoproteïnebevattende medium verwijderd door te centrifugeren bij 2000 ×g gedurende vijf minuten. Giet het medium over in een buis van 50 mL en voeg vervolgens 5,95 gram natriumchloride toe; indien er analyse plaatsvindt via transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), voeg dan één protease-inhibitortablet toe.Vul aan met water tot een volume van 23 milliliters en los de opgeloste stoffen volledig op. Giet de oplossing vervolgens over in een polycarbonaat ultracentrifugebuis. Gebruik 0,5 milliliters water om de oplossing met een dichtheid van 1,2 gram per milliliter voorzichtig te overlagen.Balanceer de buizen vervolgens op gewicht. Plaats de buizen in een T 8 65 rotor en voer ultracentrifugatie uit bij 429.460 ×g en 4 °C gedurende 24 uur. Isoleer vervolgens onmiddellijk de bovenste 0,5 milliliter van de oplossing, terwijl u de buis zo stil mogelijk houdt.Bereid voor de TEM-analyse vijf milliliter 2% fosforzuur en stel de pH in op 6,0. Filtreer de oplossing met een spuitfilter met een poriegrootte van 0,2 micrometers. Breng 20 microliters van het lipoproteïnemonster aan op een steriele schaal.Breng vervolgens 20 µL van het gefilterde fosfotungstisch zuur aan naast het monster op dezelfde schaal, met de matte zijde richting het monster. Plaats voorzichtig een EM-grid op de lipoproteïnedruppel en laat dit één minuut incuberen bij kamertemperatuur. Tik vervolgens voorzichtig met de zijkant van het grid op filterpapier om overtollig monster van het grid te verwijderen.Laat vervolgens het raster voorzichtig zakken met dezelfde zijde rustend op de fosfotong-zuurdruppel en incubeer gedurende één minuut voordat het raster voorzichtig op filterpapier wordt getikt om het overtollige oplosmiddel te verwijderen. Voer ten slotte TEM uit om beelden van lipoproteïnen vast te leggen. Hier worden normale Caco 2-cellen getoond, 13 dagen na confluentie, die koepelvormige structuren en intracellulaire lipiddruppels vertonen die kenmerkend zijn voor gedifferentieerde Caco 2-cellen.Op dit punt moet nieuw medium voorzichtig worden toegevoegd, omdat de cellen vatbaarder zijn voor loslating. Met de natriumchloride-dichtheidsgradiënt-ultracentrifugatiemethode werden de door de Caco 2-cellen uitgescheiden lipoproteïnen geïsoleerd en geanalyseerd via TEM. Enkele van de chylomicronen, lipoproteïnen met een diameter groter dan 80 nanometers, zijn hier afgebeeld.Kleine v LDL's zijn ebenfalls aanwezig. Een hoog percentage chylomicrondeeltjes ten opzichte van het totale aantal lipoproteïnedeeltjes duidt op een efficiënt lipidentransport na de vorming ervan. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers in de farmaceutische wetenschappen om de biologische beschikbaarheid van orale lipofiele geneesmiddelen uitgebreider te onderzoeken.

using-caco-2-cells-to-study-lipid-transport-by-the-intestine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates an in vitro technique to assess iron bioavailability in complex food sources. The technique combines the simulation of human digestion along with iron uptake by differentiated Caco-2 cells. Intracellular ferritin formation acts as a marker for cellular iron uptake.

Caco-2 Cell Bioassay: An In Vitro Method for Measuring Iron Bioavailability in Complex Food Sources

Vele therapeutische toepassingen vereisen een veilig en efficiënt transport van drugs vervoerders en hun lading over cellulaire barrières in het lichaam. Dit artikel beschrijft een aanpassing van bestaande methoden om de snelheid en het mechanisme van het vervoer van drugs nanocarriers (NC's) over cellulaire barrières, zoals de gastro-intestinale (GI) epitheel evalueren.

Modellen en methoden om vervoer van Drug Delivery Systems Across Cellular Barrières Evalueer

We beschrijven een in vitro protocol co-cultuur darm microbioom en darmvlokken voor een langere periode met een menselijke darm-on-a-chip microphysiological systeem.

Co-cultuur van de levens- Microbiome met Microengineered Human darmvlokken in een Gut-on-a-Chip microfluïdische apparaat

We beschrijven eenvoudige methoden de regulering van intestinale serotonine transporter (SERT) functie en expressie onder toepassing van een in vitro celkweek model van Caco-2-cellen gekweekt in 3D en een ex vivo model van muis darmen bestuderen. Deze methoden zijn geschikt voor de studie van andere epitheliale transporters.

Methoden om te studeren epitheliale Transport Protein functie en de expressie in Inheemse darm en Caco-2-cellen gekweekt in 3D

Dit protocol beschrijft de isolatie en kweek van gemengde muis kleine darmcellen. Deze primaire kweken intestinale maken het onderzoek signaalroutes onderliggende darm peptidesecretie behulp van een aantal technieken.

Gemengde Primaire culturen van Muizen dunne darm Bestemd voor de Studie van Gut hormoon en live cell imaging van entero-Cells

We presenteren een protocol om te onderzoeken de Overspraak tussen Caco-2 X-Vleug-bestraalde en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC). Het protocol start met Caco-2 bestraling en opzet van de co cultuur met PBMC; trans-epitheliale elektrische weerstand is vervolgens regelmatig gedurende 48 h en westelijke vlek uitgevoerd in zowel Caco-2 en PBMC gemeten.

Een co cultuur methode te onderzoeken de Overspraak tussen X-ray bestraald Caco-2 cellen en PBMC

Twee methoden worden hier voorgesteld om te bepalen van intestinale barrièrefunctie. Een epitheliale meter (volt/ohm) wordt gebruikt voor metingen van de elektrische weerstand van de transepithelial van gekweekte epithelen rechtstreeks in weefselkweek wells. Bij muizen, wordt de FITC-dextran maagsonde methode gebruikt om te bepalen de intestinale permeabiliteit in vivo.

In Vitro en In Vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit

Dit protocol beschrijft een assay voor de karakterisering van lipide druppel (LD) vorming in humane intestinale organoïden bij stimulatie met vetzuren. We bespreken hoe deze assay wordt gebruikt voor de kwantificering van LD-vorming, en hoe het kan worden gebruikt voor screening met hoge doorvoer voor geneesmiddelen die de LD-vorming beïnvloeden.

Een op fluorescentie gebaseerde assay voor de karakterisering en kwantificering van de vorming van lipiden druppeltjes in humane intestinale Organoïden

We stelden een microfysiologisch systeem (MPS) met darm- en leverorganoïden bloot aan paracetamol (APAP). Dit artikel beschrijft de methoden voor organoïde productie en APAP farmacokinetische en toxicologische eigendomsbeoordelingen in de MPS. Het beschrijft ook de weefselfunctionaliteitsanalyses die nodig zijn om de resultaten te valideren.

Een darm/levermicrofysiologisch systeem voor farmacokinetische en toxicologische beoordeling

De Caco-2 cel bioassay voor ijzer (Fe) biologische beschikbaarheid vertegenwoordigt een kosteneffectieve en veelzijdige aanpak om fe biologische beschikbaarheid te beoordelen van voedingsmiddelen, voedingsproducten, supplementen, maaltijden en zelfs dieetregimes. Grondig gevalideerd voor menselijke studies, vertegenwoordigt het de state-of-the-art voor studies van fe biologische beschikbaarheid.

De Caco-2 Cell Bioassay voor het meten van de biologische beschikbaarheid van ijzer in levensmiddelen

Leer lipidentransport in de darm bestuderen met behulp van Caco-2 cellen en dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. Deze methode isoleert lipoproteïnen voor analyse van deeltjesgrootte en transportmechanismen.

Met behulp van Caco-2 cellen te Lipid Transport studie van de Darm

Meer video's verkennen