Plasmide afkomstig DNA Strand Displacement Gates Uitvoeringsbesluit Chemical Reaction Networks
25 november 2015
Dit protocol beschrijft een methode voor het afleiden van DNA-strengverplaatsingspoorten vanuit plasmiden en het testen ervan met behulp van fluorescentie-kinetische metingen. De poorten kunnen modulair worden samengesteld tot meercomponentensystemen om het gedrag van formele chemische reactienetwerken (CRN) te benaderen, wat een nieuw gebruik van CRN's als moleculaire programmeertaal aantoont.
Het algemene doel van deze procedure is om DNA-strandverplaatsingspoorten af te leiden van bacteriële plasmiden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een bacterieel plasmide gebruikt als een zeer zuivere bron om robuuste DNA-poorten te genereren. Het demonstreren van deze procedure zal mijn collega's Sam Dip en ik zijn Om te beginnen massaal te produceren en vervolgens DNA-poorten te isoleren door DNA-isolatiekits te gebruiken zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol en in overeenstemming met de instructies van de fabrikant volgens ellucian.
Meet de concentratie van plasmide-DNA met behulp van standaardtechnieken. Bewerk vervolgens het DNA door vier eenheden van het restrictie-enzym PV U2 HF toe te voegen voor elke milligram van het plasmide. Voeg vervolgens twee equivalenten volumes ijskoud absoluut ethanol toe aan het monster.
Incubeer het mengsel gedurende minimaal één uur bij min 80 graden Celsius om het DNA te laten bezinken. Pel het bezonken DNA vervolgens door het monster gedurende 30 minuten te centrifugeren bij 10.000 tot 14.000 keer G en nul graden Celsius. Verwijder de SNAT en voeg 1000 microliter van 95% ethanol op kamertemperatuur toe aan het monster.
Keer vervolgens het monster 10 tot 15 keer om, centrifugeer vervolgens het monster gedurende 10 minuten bij 10.000 tot 14.000 keer G en vier graden Celsius. Wanneer u klaar bent, verwijdert u het supernatant en laat u het DNA 10 tot 20 minuten op een werkbank drogen. Wees voorzichtig bij het verwijderen van het supernatant van het bezonken DNA om het pellet niet te verstoren, anders zal de opbrengst aanzienlijk verminderen.
Eenmaal droog, suspendeert u het DNA-pellet in maximaal 200 microliter nuclease-vrij water en mengt u door middel van een vortex. Het toevoegen van meer dan 200 microliter water zal het monster over het algemeen verdunnen voor gebruik. Bij kinetische experimenten meet u het opnieuw gesuspendeerde DNA met behulp van een spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant.
Voeg vervolgens vier eenheden van het knippenzym M-B-B-S-R-D toe per één microgram plasmide en voeg het bijbehorende enzymbuffer toe. Incubeer het monster gedurende één uur bij 65 graden Celsius om de gewrichten te verteren. Bewerk vervolgens de vorkgaten door acht eenheden van het knippenzym NT BST mb toe te voegen per één microgram plasmide en de bijbehorende enzymbuffer.
Incubeer het monster gedurende één uur bij 55 graden Celsius. Om de fluorescerende reporters eerst Resus te bereiden, schorsen en kwantificeren de monsters zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Meng vervolgens 10 microliter van de reporters'bodemstreng met 13 microliter van de topquecher-streng in tris-acetaat EDTA-buffer met 12,5 millimolair magnesium.
Om ervoor te zorgen dat alle flora, vier gelabelde strengen worden gekwantificeerd, moet een 30% overschot van de quencher-gelabelde streng worden toegevoegd. Bewerk vervolgens het reporter C-complex met behulp van een thermische cycler. Koel het monster van 95 graden Celsius tot 20 graden Celsius af met een snelheid van één graad Celsius per minuut.
Wanneer u klaar bent, bewaart u het monster bij vier graden Celsius na kalibratie. Begin met de fluorescentiemetingen door de temperatuurregelaar eerst in te stellen op 25 graden Celsius terwijl de temperatuur stabiliseert. Stel de juiste parameters in voor kinetische metingen in de data-acquisitiesoftware.
Nadat u de software voor de spectrale fluorimeter hebt geopend, stelt u de gleufbreedte in op 2,73 nanometer voor zowel de excitatie- als emissiemonochroom. Stel vervolgens de integratietijd in op 10 seconden voor elke 62e tijdstip en stel de totale meettijd in op 24 uur. Stel tot slot de excitatie- en emissiegolflengten in om overeen te komen met de flora-bos die in het experiment wordt gebruikt.
Voeg vervolgens 410,2 microliter nuclease-vrij water en 52,8 microliter 10 extra's acetaat EDTA-buffer met 125 millimolair magnesium toe aan een synthetische kwartscel. Voeg ook twee microliter van 300 millimolair poly T-strengen toe en schud vervolgens de synthetische kwartscel gedurende 10 tot 15 seconden. Voeg vervolgens negen microliter van de reporterstringen toe bij 10 micromolair en zes microliter van elke hulpstring bij 10 micromolair.
Voeg vervolgens 45 microliter van zowel de gewrichten als de vorkgaten toe bij één micromolair en meng de oplossing voorzichtig door het minstens 20 keer op en neer te pipetten. Voeg tenslotte negen microliter 10% natriumdoductalsulfaat toe om een eindconcentratie van 0,15% SDS te bereiken, meng de reactie voorzichtig door het minstens 20 keer op en neer te pipetten en plaats onmiddellijk de synthetische kwartcellen in de kamer van de spectra-fluter en start de kinetische meting. Voeg na vijf minuten meting drie microliter van de inputstrengen toe.
Voeg 10 micromolair toe aan de synthetische kwartscel. Terwijl het data-acquisitieprogramma is onderbroken, meng de reactie voorzichtig door het minstens 20 keer op en neer te pipetten en sluit vervolgens het lichtdeksel en ga door met het opnemen van de reactiekinetiek totdat deze stabiel is. De kinetiekgegevens voor de plasma-afgeleide poorten en de gesynthetiseerde poorten worden hier in de experimenten weergegeven.
De concentratie van signaalstreng A is vast terwijl de hoeveelheid van het katalytische signaal B wordt gevarieerd. Signaal C wordt gebruikt om de voortgang van de reactie af te lezen zonder onderbreking. De katalytische cyclus-omzet wordt gedefinieerd als de hoeveelheid signaal C die voor elke katalysator B wordt geproduceerd op een bepaald tijdstip.
Voor een ideaal katalytisch systeem zou dit omzetgetal lineair met de tijd moeten toenemen en onafhankelijk zijn van de hoeveelheid katalysator, zolang het substraat niet beperkend is. Hier wordt waargenomen dat het gesynthetiseerde systeem veel eerder afwijkt van de ideale lineaire toename van de omzet dan het plasma-afgeleide systeem, wat wijst op sequestratie van de katalysator door een ongewenste nevenreactie. De
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het afleiden van DNA-strandverplaatsingspoorten uit bacteriële plasmiden en het testen hiervan via fluorescentiekinetiekmetingen. De benadering maakt een modulaire samenstelling van poorten tot systemen met meerdere componenten mogelijk, waarmee het gedrag van formele chemische reactienetwerken wordt gesimuleerd.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Biotechnologie
- Moleculaire biologie
- Systeembiologie
Achtergrond
- DNA-strandverplaatsingspoorten zijn essentieel voor moleculaire programmering.
- Bacteriële plasmiden dienen als een zuivere bron voor het genereren van robuuste DNA-poorten.
- Fluorescentiekinetiekmetingen bieden inzicht in de prestaties van de poorten.
- Het begrijpen van het gedrag van deze poorten kan het ontwerp van moleculaire circuits verbeteren.
Doel van de studie
- Om DNA-strengverplaatsingspoorten af te leiden uit bacteriële plasmiden.
- Om het gebruik van fluorescentiekinetiek bij het testen van deze poorten aan te tonen.
- Om de prestaties van plasmide-afgeleide poorten te vergelijken met gesynthetiseerde poorten.
Gebruikte methoden
- Isolatie en kwantificering van plasmide-DNA.
- Digestie van DNA met restrictie-enzymen.
- Bereiding van fluorescente reporters en hun complexen.
- Fluorescentie-kinetiekmetingen om de prestaties van de poort te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Plasmid-afgeleide poorten vertoonden een lagere lekstroom van het circuit in vergelijking met gesynthetiseerde poorten.
- De omzetsnelheid van de katalytische cyclus was stabieler in plasmid-afgeleide systemen.
- Fluorescentiemetingen wezen op verschillen in prestaties tussen de poorttypes.
- De robuustheid van de DNA-poorten werd bevestigd door middel van herhaalde tests.
Conclusies
- Het protocol genereert en test met succes DNA-gates vanuit plasmiden.
- Uit plasmiden afgeleide gates vertonen superieure prestatiekenmerken.
- Deze methode kan het vakgebied van moleculaire programmering en synthetische biologie verder bevorderen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Poorten voor DNA-strengverplaatsing afgeleid van plasmiden maken schaalbare productie met een hoge getrouwheid mogelijk van programmeerbare DNA-componenten voor moleculaire computatie en synthetische biologie. Deze benadering beantwoordt aan de behoefte aan robuuste, reproduceerbare DNA-materialen bij de constructie van chemische reactienetwerken (CRN's) en moleculaire apparaten. De methode verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid en operationele stabiliteit op het snijvlak van ontdekkingsbiologie en moleculaire engineering.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Faciliteert het onderzoeken van moleculaire logica en reactiepaden met behulp van programmeerbare DNA-poorten.
- Maakt biologische risicoreductie mogelijk door het leveren van DNA-componenten met een hoge zuiverheid en consistentie voor mechanistische studies.
- Ondersteunt voorspellende betrouwbaarheid bij het ontwerp van moleculaire netwerken en functionele validatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde DNA-gate-systemen voor voor downstream kinetische en functionele assays.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van assays door het gebruik van plasmide-gebaseerde DNA-bronnen.
- Maakt kwantitatieve fluorescentie-gebaseerde read-outs mogelijk voor betrouwbare benchmarking van de prestaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij initiatieven voor synthetische biologie voor programmeerbare moleculaire therapieën en diagnostiek.
- Biedt continuïteit van moleculair ontwerp tot preklinische validatie van DNA-gebaseerde systemen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang van programmeerbare moleculaire platforms.
Integratie van pipeline en workflow
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking naar prekliniek door robuuste DNA-gates te leveren voor hypothesetoetsing, assayontwikkeling en moleculaire netwerkengineering.
- Discovery Biology: Maakt hypothesegestuurde tests van chemische reactienetwerken en moleculaire logische schakelingen mogelijk.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve fluorescentie-outputs voor vergelijkende analyse van de prestaties van DNA-gates.
- Analytics: Biedt kinetische metingen en lekkwantificatie om ontwerpbeslissingen te onderbouwen.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt de ontwikkeling van programmeerbare DNA-systemen met potentiële translationele toepassingen.
- Bedrijfsmatige Hergebruik: Vestigt een schaalbare, plasmid-gebaseerde workflow voor herhaaldelijke productie van DNA-gates over verschillende projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de constructie van moleculaire netwerken.
- Operationele waarde: Standaardiseert de productie van DNA-gates voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie in R&D binnen de synthetische biologie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van programmeerbare moleculaire platforms mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biologie, enzymatische verwerking en fluorescentiekinetiek.
- Toegang tot plasmidepreparatiekits, restrictie- en nicking-enzymen en infrastructuur voor fluorescentiespectrometrie is noodzakelijk.
- Vereist cross-team standaardisatie van de preparatie van DNA-gates en de protocollen voor kinetische metingen.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende DNA-sequenties of ontwerpen van reactienetwerken.
- Potentiële beperkingen omvatten enzymspecificiteit en optimalisatie van reactieomstandigheden voor diverse toepassingen.
