Name: Plasmide afkomstig DNA Strand Displacement Gates Uitvoeringsbesluit Chemical Reaction Networks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Leer DNA-strandverplaatsingspoorten afleiden uit bacteriële plasmiden en testen met fluorescentiekinetiek. Deze methode genereert robuuste poorten met minder circuitlek dan gesynthetiseerde alternatieven.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Figuren 1, 2, 3, 4, 6, 8 en de tabellen 2, 3, 10, 15, 16 worden gewijzigd van 29 Ref. Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (NSF verlenen-CCF 1.117.143 en NSF-CCF 1.162.141 GS). Y.-JC werd ondersteund door de Taiwanese regering beurzen. SDR werd gesteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP).

<ol><li>Zhang, D. Y., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+nanotechnology+using+strand-displacement+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions.</a> Nat. Chem. 3, 103-113 (2011).</li>
<li>Krishnan, Y., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+based+molecular+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid based molecular devices.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50, 3124-3156 (2011).</li>
<li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+DNA+strand+displacement+kinetics+using+toehold+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Control of DNA strand displacement kinetics using toehold exchange.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 17303-17314 (2009).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475, 368-372 (2011).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+digital+circuit+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scaling up digital circuit computation with DNA strand displacement cascades.</a> Science. 332, 1196-1201 (2011).</li>
<li>Zadegan, R. M., Jepsen, M. D., Hildebrandt, L. L., Birkedal, V., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+fuzzy+and+boolean+logic+gates+based+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Construction of a fuzzy and boolean logic gates based on DNA.</a> Small. 11, 1811-1817 (2015).</li>
<li>Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+nucleic+acid+logic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free nucleic acid logic circuits.</a> Science. 314, 1585-1588 (2006).</li>
<li>Zadegan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+4+zeptoliters+switchable+3D+DNA+box+origami%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Construction of a 4 zeptoliters switchable 3D DNA box origami.</a> ACS Nano. 6, 10050-10053 (2012).</li>
<li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459, 73-76 (2009).</li>
<li>Zhang, D. Y., Hariadi, R. F., Choi, H. M., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+DNA+strand-displacement+circuitry+with+DNA+tile+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Integrating DNA strand-displacement circuitry with DNA tile self-assembly.</a> Nat. Commun. 4, (1965).</li>
<li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406, 605-608 (2000).</li>
<li>Green, S. J., Lubrich, D., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+hairpins%3A+fuel+for+autonomous+DNA+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">DNA hairpins: fuel for autonomous DNA devices.</a> Biophys. J. 91, 2966-2975 (2006).</li>
<li>Venkataraman, S., Dirks, R. M., Rothemund, P. W., Winfree, E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autonomous+polymerization+motor+powered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">An autonomous polymerization motor powered by DNA hybridization.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 490-494 (2007).</li>
<li>Green, S. J., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+chemomechanical+cycles%3A+a+mechanism+for+autonomous+molecular+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Coordinated chemomechanical cycles: a mechanism for autonomous molecular motion.</a> Phys. Rev. Lett. 101, 238101(2008).</li>
<li>Omabegho, T., Sha, R., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bipedal+DNA+Brownian+motor+with+coordinated+legs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bipedal DNA Brownian motor with coordinated legs.</a> Science. 324, 67-71 (2009).</li>
<li>Turberfield, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fuel+for+free-running+nanomachines%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">DNA fuel for free-running nanomachines.</a> Phys. Rev. Lett. 90, 118102(2003).</li>
<li>Dirks, R. M., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+amplification+by+hybridization+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Triggered amplification by hybridization chain reaction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 15275-15278 (2004).</li>
<li>Seelig, G., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalyzed+relaxation+of+a+metastable+DNA+fuel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalyzed relaxation of a metastable DNA fuel.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 12211-12220 (2006).</li>
<li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318, 1121-1125 (2007).</li>
<li>Yin, P., Choi, H. M., Calvert, C. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+biomolecular+self-assembly+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming biomolecular self-assembly pathways.</a> Nature. 451, 318-322 (2008).</li>
<li>Chen, X., Briggs, N., McLain, J. R., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stacking+nonenzymatic+circuits+for+high+signal+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Stacking nonenzymatic circuits for high signal gain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 5386-5391 (2013).</li>
<li>Phillips, A., Cardelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programming+language+for+composable+DNA+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">A programming language for composable DNA circuits.</a> J. R. Soc. Interface. 6, Suppl 4. S419-S436 (2009).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Polo, F., Emmott, S., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+DSD%3A+a+design+and+analysis+tool+for+DNA+strand+displacement+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Visual DSD: a design and analysis tool for DNA strand displacement systems.</a> Bioinformatics. 27, 3211-3213 (2011).</li>
<li>Lakin, M. R., Youssef, S., Cardelli, L., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abstractions+for+DNA+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Abstractions for DNA circuit design.</a> J. R. Soc. Interface. 9, 470-486 (2012).</li>
<li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+and+modularity+properties+of+a+non-covalent+DNA+catalytic+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Robustness and modularity properties of a non-covalent DNA catalytic reaction.</a> Nucleic Acids Res. 38, 4182-4197 (2010).</li>
<li>Ducani, C., Kaul, C., Moche, M., Shih, W. M., Hogberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+production+of+%27monoclonal+stoichiometric%27+single-stranded+DNA+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic production of 'monoclonal stoichiometric' single-stranded DNA oligonucleotides.</a> Nat. Methods. 10, 647-652 (2013).</li>
<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cloning+of+artificial+DNA+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo cloning of artificial DNA nanostructures.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 17626-17631 (2008).</li>
<li>Bhatia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icosahedral+DNA+nanocapsules+by+modular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Icosahedral DNA nanocapsules by modular assembly.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 4134-4137 (2009).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nat. Nanotechnol. 8, 755-762 (2013).</li>
<li>Arkin, A., Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+functions+in+biochemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Computational functions in biochemical reaction networks.</a> Biophys. J. 67, 560-578 (1994).</li>
<li>Érdi, P., Tóth, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3a%C3%89rdi%2C+P+%22Mathematical+models+of+chemical+reactions%3A+theory+and+applications+of+deterministic+and+stochastic+models%22">Mathematical models of chemical reactions: theory and applications of deterministic and stochastic models</a>. , Manchester University Press. (1989).</li>
<li>Magnasco, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+kinetics+is+Turing+universal%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Chemical kinetics is Turing universal.</a> Phys. Rev. Lett. 78, 1190(1997).</li>
<li>Oishi, K., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+implementation+of+linear+I%2FO+systems%5BTitle%5D)+AND+%22IET+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biomolecular implementation of linear I/O systems.</a> IET Syst. Biol. 5, 252-260 (2011).</li>
<li>Senum, P., Riedel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate-independent+constructs+for+chemical+computation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rate-independent constructs for chemical computation.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Soloveichik, D., Cook, M., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computation+with+finite+stochastic+chemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Computing%22%5BJournal%5D)">Computation with finite stochastic chemical reaction networks.</a> Natural Computing. 7, 615-633 (2008).</li>
<li>Soloveichik, D., Seelig, G., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+as+a+universal+substrate+for+chemical+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DNA as a universal substrate for chemical kinetics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 5393-5398 (2010).</li>
<li>Tyson, J. J., Chen, K. C., Novak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sniffers%2C+buzzers%2C+toggles+and+blinkers%3A+dynamics+of+regulatory+and+signaling+pathways+in+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sniffers, buzzers, toggles and blinkers: dynamics of regulatory and signaling pathways in the cell.</a> Curr. Opin. Cell. Biol. 15, 221-231 (2003).</li>
<li>Cardelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-domain+DNA+strand+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22Math.+Struct.+Comput.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-domain DNA strand displacement.</a> Math. Struct. Comput. Sci. 23, 247-271 (2013).</li>
<li>Angluin, D., Aspnes, J., Eisenstat, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+population+protocol+for+fast+robust+approximate+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Distrib.+Comput%22%5BJournal%5D)">A simple population protocol for fast robust approximate majority.</a> Distrib. Comput. 21, 87-102 (2008).</li>
<li>Cardelli, L., Csikasz-Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+switch+computes+approximate+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">The cell cycle switch computes approximate majority.</a> Sci. Rep. 2, 656(2012).</li>
<li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUPACK%3A+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Chem%22%5BJournal%5D)">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> J. Comput. Chem. 32, 170-173 (2011).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J. Vis. Exp. , e253(2007).</li>
<li>Lessard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+E.+coli+via+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of E. coli via electroporation.</a> Methods Enzymol. 529, 321-327 (2013).</li>
<li>Nasri, M., Thomas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+the+specificity+of+PvuII+restriction+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Alteration of the specificity of PvuII restriction endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 15, 7677-7687 (1987).</li>
<li>Dalchau, N., Seelig, G., Phillips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+design+of+reaction-diffusion+patterns+using+DNA-based+chemical+reaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Computing+and+Molecular+Programming%22%5BJournal%5D)">Computational design of reaction-diffusion patterns using DNA-based chemical reaction networks.</a> DNA Computing and Molecular Programming. , 84-99 (2014).</li>
<li>Scalise, D., Schulman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+modular+reaction-diffusion+programs+for+complex+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Designing modular reaction-diffusion programs for complex pattern formation.</a> Technology. 2, 55-66 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dit document beschrijft een werkwijze voor het afleiden ndsDNA gates van zeer zuiver plasmide-DNA. Bovendien wordt een protocol voorgesteld voor het karakteriseren gate prestaties met fluorescentie kinetiek-assay. Experimentele gegevens tonen aan dat het plasmide afgeleide systeem overtreft de synthetische tegenhanger zelfs indien het synthetische systeem is samengesteld uit strengen gezuiverd via polyacrylamidegelelektroforese (PAGE). Waarschijnlijk de verbeterde prestaties van plasmide afgeleide poorten voornamelijk vanwege de hoge zuiverheid van het biologische DNA. Synthetisch DNA bevat een aantal fouten, met name deleties die resulteren in oligonucleotiden met lengte n-1, en ​​dergelijke bijproducten worden meestal niet volledig verwijderd PAGE of High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) zuiveringsprocedures. Ook werden soortgelijke verbeteringen aan de hier gerapporteerde waargenomen in een eerdere studie van een gekatalyseerd haarspeld versterker dat DNA afkomstig van biologische bronnen 21 gebruikt. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Zelfs het gebruik van plasmide afgeleide poorten niet volledig fouten in de uitvoering poort, waarvan er ten minste twee redenen elimineren: eerste over-digestie of gebrek aan snede nauwkeurig kan leiden tot poorten met teveel nicks of inkepingen in de verkeerde posities. In beide gevallen poorten vaker deelnemen ongewenste reacties. Dergelijke problemen kunnen worden verlicht door het optimaliseren van de hoeveelheid enzym (zie figuur 4). Ten tweede, in deze experimenten, aantal ingangen en ondersteunende strengen werden synthetisch DNA en bevatte aldus deleties en mutaties. In principe kunnen alle enkelstrengs ingang en ondersteunende strengen worden via faagmide DNA door een inkerving enzymdigestie van de vooraf gecodeerde m13 virale genoom 26. Misschien het circuit uitvoering kan verder worden verbeterd middels ssDNA afkomstig van het bacteriële genoom. Hoewel het gebruik van plasmide afgeleide poorten bleek circuit te verbeteren, een analysede kosten en doorlooptijden gebleken dat terwijl de productie van plasmide afgeleide poorten is iets goedkoper (tabel 15), het duurt 2-3 keer langere verwerkingstijd in vergelijking met de montage en zuivering van poorten van commercieel gesynthetiseerde oligo (Tabel 16). De primaire kosten van plasmide afgeleide poorten gen synthese en het gebruik van restrictie-enzymen. Voor 300 pmol gates (genoeg voor 15 reacties bij 30 nM), de geschatte kosten van uzelf poorten ongeveer 170 $ en 200 $ voor vork poorten, het kostenverschil alvorens het gebruik van verschillende enzymen inkeping. In tegenstelling, de chemische synthese van de strengen voor dezelfde poort kost ongeveer $ 260 inclusief PAGE zuivering vergoeding. De primaire tijd kosten voor plasmide afgeleide poorten in het klonen procedure, die, net als DNA-synthese, kunnen worden uitbesteed aan een gensynthese bedrijf. Echter, eenmaal samengesteld, plasmide afgeleide gates hebben het voordeel dat de host plasmiden gemakkelijk kan worden gerepliceerd eennd kunnen worden opgeslagen in de vorm van bacteriële glycerol voorraden. Dit maakt het mogelijk de poorten, opnieuw vaak. Vooruitblikkend, zou de verbeterde prestaties van plasmide afgeleid poorten een veel groter scala aan dynamiek gedrag dan zijn experimenteel dusver met DNA CRNs aangetoond schakelen. Bijvoorbeeld recente theoretische werk 47,48 gesuggereerd dat zelf-georganiseerde ruimtelijke patronen op macro-schaal kan worden gerealiseerd met DNA CRNs via een reactie diffusie mechanisme. De hier gepresenteerde methode verschaft een levensvatbaar pad voor het construeren van de onderliggende moleculaire componenten van dergelijke zelfstandige patroneren DNA materialen. Hoewel uitdagend, het ontwikkelen van macro-schaal morfologie in een programmeerbare manier zou aanzienlijke gevolgen in gebieden, variërend van biomaterialen onderzoek naar de regeneratieve geneeskunde.

De voorspelbaarheid van Watson-Crick baseparing is toegestaan ​​dynamische DNA nanotechnologie te voorschijn als een programmeerbare manier om moleculaire apparaten te ontwerpen met dynamische eigenschappen 1,2. Met name DNA strengverplaatsing - een programmeerbare, competitieve hybridisatie reacties - heeft bewezen een krachtig mechanisme voor engineering van DNA dynamische systemen. In een DNA-streng verdringingsreactie, een inkomende oligonucleotide verdringt een eerder gebonden &quot;output&quot; streng van een complementaire bindingspartner. Meerdere dergelijke reacties kunnen aan elkaar worden gekoppeld in meerdere stappen reactiecascades met een hoge mate van controle over de volgorde en timing van afzonderlijke reactiestappen 3. DNA strengvervanging cascades zijn gebruikt voor digitale en analoge moleculaire schakelingen 4-7, omschakelbaar nanostructuren 8-10, autonome moleculaire motoren 11-15 en non-covalente katalytische versterkers 13,16-21 maken. Bovendien DNA apparaten met strengverplaatsing reacties kunnen worden gesimuleerd en ontworpen voor uiteenlopende toepassingen met behulp van computer-assisted design software 22-24. Momenteel, chemisch gesynthetiseerd DNA fungeert als het belangrijkste materiaal voor DNA nanotechnologie. Echter, fouten in het DNA syntheseproces en de resulterende onvolmaakte oligonucleotiden, wordt aangenomen dat de prestaties van dynamische DNA inrichtingen te beperken door het veroorzaken foutieve nevenreacties. Bijvoorbeeld, &quot;lek&quot; reacties kunnen resulteren in het vrijkomen van een uitgang oligonucleotide zelfs in afwezigheid van een reactie trekker. Dergelijke effecten zijn het duidelijkst in autokatalytische reactiecascades waar zelfs een minimale hoeveelheid aanvankelijke lekkage uiteindelijk leidt tot volledige activatie van de cascade 19,20. Omgekeerd reacties vaak niet het verwachte niveau van activering bereikt omdat sommige componenten niet leiden, zelfs in aanwezigheid van de beoogde invoer 7,25. Om de prestaties te maken DNA-gebaseerdenanodevices vergelijkbaar hun biologische eiwit gebaseerde tegenhangers, moet een dergelijke fout modi drastisch verminderd. Bacteriële plasmiden of andere biologische DNA zou kunnen dienen als een relatief goedkope bron van zeer zuiver DNA voor nanotechnologie toepassingen. Grote hoeveelheden DNA kan worden gegenereerd door replicatie in bacteriën en de intrinsieke capaciteiten proeflezen van levende systemen garanderen de zuiverheid van het verkregen DNA. In feite hebben een aantal recente papers het potentieel nut van biologische DNA voor nanotechnologie toepassingen 21,26-28. Echter, de volledig dubbelstrengs karakter plasmide DNA dusver verboden het gebruik als materiaal voor het maken dynamische DNA inrichtingen, die typisch bestaan ​​uit meerdere oligonucleotiden en bevatten zowel dubbelstrengs en enkelstrengs domeinen. In een recent artikel 29 dit probleem werd aangepakt en een nieuwe DNA-poort architectuur die bestaat voornamelijk uit nicked dubbelstrengs DNA (ndsDNA) was introducerend. Belangrijker is, kunnen systemen ndsDNA poorten zijn ontworpen dat de door enige formele chemische reactie netwerk (CRN) 29 dynamiek te realiseren. ndsDNA poorten kan dus worden gebruikt, in beginsel dynamische systemen oscillaties en chaos, bistabiliteit en geheugen, Booleaanse logica of algoritmische 30-38 gedrag vertonen creëren. Bijvoorbeeld, Ref. 29 vertoonde een drie-reactie CRN een moleculaire implementatie van een &quot;consensus&quot; protocol, een soort gedistribueerde computer algoritme 29,39,40 voorzien. Dit werk eerste toonde een nieuwe toepassing voor de CRN formalisme als een &quot;programmeertaal&quot; voor het snel synthetiseren van functionele moleculaire systemen (Figuur 1A). Hier wordt een gedetailleerd protocol voor het afleiden ndsDNA gates uit plasmide-DNA voorzien. Eerste is een herziening van de reeks ontwerpproces. Daarna volgt een uitleg over hoe de synthetische oligonucleotiden diede poort sequenties worden gekloneerd in plasmiden en de sequentie geverifieerd en geamplificeerd via bacteriekweek. Vervolgens wordt getoond hoe ndsDNA poorten kunnen worden afgeleid van de plasmiden door enzymatische behandeling (zie figuur 2). Tenslotte wordt een werkwijze voor het testen gate gedrag via fluorescentie kinetiek assays beschreven. Reactiemechanisme Als voorbeeld, het protocol staat de katalytische chemische reactie A + B-&gt; B + C. De soort A, B en C (&quot;signaal&quot;, figuur 1B) Alle corresponderen met een ander enkelstrengs DNA-molecuul. De sequenties van deze moleculen zijn volledig onafhankelijk en de strengen niet met elkaar reageren direct. De sequenties van alle signalen twee verschillende functionele domeinen, namelijk subsequenties die samenwerken in strengverplaatsing reacties: 1) een korte toehold domein (labels ta, tb, tc) die wordt gebruikt voor de initiatie van strengverplaatsing reaction, en 2) een lange domein (labels a, b, c) de identiteit signaal bepaalt. Interacties tussen signaal strengen worden gemedieerd door ingekerfd dubbelstrengs DNA (ndsDNA) poort complexen (genoemd lid van AB en vork BC) en hulpstoffen enkelstrengs species (&lt;tr r&gt;, &lt;b tr&gt;, &lt;c tb&gt; en &lt;i tc &gt;). De formele reactie A + B-&gt; B + C wordt uitgevoerd door een reeks van strengverplaatsing reactiestappen, waarbij elke reactiestap bloot een steunpunt voor een volgende reactie (Figuur 1B). In dit voorbeeld zijn de signalen A en B aanvankelijk vrij in oplossing terwijl signaal C is gebonden aan de vork gate. Na afloop van de reactie B en C in oplossing. Meer in het algemeen signalen die zijn gebonden aan een poort zijn inactief terwijl signalen die vrij zijn in oplossing actief, dat wil zeggen, ze kunnen deelnemen aan een strengverplaatsing reactie alseen ingang. Het tijdsverloop van de reactie wordt gevolgd met gebruik van een fluorescerende reporter strategie (figuur 1C). In eerder werk 29, werd aangetoond dat dit reactiemechanisme realiseert niet alleen de juiste stoïchiometrie ook de kinetiek van de beoogde reactie.

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td><td>NEB</td><td>M0531S</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>PstI-HF</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth, Modified</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0918-250G</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Hispeed Maxi-prep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>Nb.BsrDI</td><td>NEB</td><td>R0648L</td><td></td></tr><tr><td>Nt.BstNBI</td><td>NEB</td><td>R0607L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double-stranded Genomic Blocks</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorolog-3 Fluorimeter</td><td>Horiba/Jobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Quartz Cells&nbsp;</td><td>Starna</td><td>23-5.45-S0G-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Backbones</td><td>BioBrick</td><td>E0240-pSB1A2</td><td>High copy number plasmid met Ampicillin-resistentie. De volgorde kan worden gevonden op http://parts.igem.org</td></tr></tbody></table>

plasmide afkomstig dna strand displacement gates uitvoeringsbesluit chemical reaction networks

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA-nanotechnologie vraagt grote hoeveelheden zeer zuiver DNA als engineeringmateriaal. Plasmide-DNA zou aan deze behoefte kunnen voldoen omdat het met hoge nauwkeurigheid wordt gerepliceerd, gemakkelijk kan worden geamplificeerd door middel van bacteriële cultuur en onbeperkt kan worden opgeslagen in de vorm van bacteriële glycerolvoorraden. Echter, de dubbelstrengs aard van plasmide-DNA heeft tot nu toe het efficiënte gebruik ervan voor de constructie van DNA-nanostructuren of apparaten die typisch enkelstrengs of vertakte domeinen bevatten, belemmerd. In recent werk werd gevonden dat geniste dubbelstrengs DNA (ndsDNA) strengverdringingspoorten kunnen worden afgeleid van plasmide-DNA. Hieronder volgt een protocol dat details hoe deze ndsDNA-poorten efficiënt in plasmiden kunnen worden gecodeerd en kunnen worden afgeleid van de plasmiden door middel van een klein aantal enzymatische verwerkingsstappen. Ook gegeven is een protocol voor het testen van ndsDNA-poorten met behulp van fluorescentiekinetische metingen. NdsDNA-poorten kunnen worden gebruikt om willekeurige chemische reactienetwerken (CRN's) te implementeren en bieden zo een weg naar het gebruik van de CRN-formalisme als een prescriptieve moleculaire programmeertaal. Om deze technologie te demonstreren, wordt een meerstappenreactiecascade met katalytische kinetiek geconstrueerd. Verder wordt aangetoond dat door plasmide afgeleide componenten beter presteren dan identieke componenten die zijn samengesteld uit synthetisch DNA.

Dit protocol beschrijft een methode voor het afleiden van DNA-strengverplaatsingspoorten vanuit plasmiden en het testen ervan met behulp van fluorescentie-kinetische metingen. De poorten kunnen modulair worden samengesteld tot meercomponentensystemen om het gedrag van formele chemische reactienetwerken (CRN) te benaderen, wat een nieuw gebruik van CRN's als moleculaire programmeertaal aantoont.

Plasmide afkomstig DNA Strand Displacement Gates Uitvoeringsbesluit Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

Het algemene doel van deze procedure is om DNA-strandverplaatsingspoorten af te leiden van bacteriële plasmiden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een bacterieel plasmide gebruikt als een zeer zuivere bron om robuuste DNA-poorten te genereren. Het demonstreren van deze procedure zal mijn collega's Sam Dip en ik zijn Om te beginnen massaal te produceren en vervolgens DNA-poorten te isoleren door DNA-isolatiekits te gebruiken zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol en in overeenstemming met de instructies van de fabrikant volgens ellucian.Meet de concentratie van plasmide-DNA met behulp van standaardtechnieken. Bewerk vervolgens het DNA door vier eenheden van het restrictie-enzym PV U2 HF toe te voegen voor elke milligram van het plasmide. Voeg vervolgens twee equivalenten volumes ijskoud absoluut ethanol toe aan het monster.Incubeer het mengsel gedurende minimaal één uur bij min 80 graden Celsius om het DNA te laten bezinken. Pel het bezonken DNA vervolgens door het monster gedurende 30 minuten te centrifugeren bij 10.000 tot 14.000 keer G en nul graden Celsius. Verwijder de SNAT en voeg 1000 microliter van 95% ethanol op kamertemperatuur toe aan het monster.Keer vervolgens het monster 10 tot 15 keer om, centrifugeer vervolgens het monster gedurende 10 minuten bij 10.000 tot 14.000 keer G en vier graden Celsius. Wanneer u klaar bent, verwijdert u het supernatant en laat u het DNA 10 tot 20 minuten op een werkbank drogen. Wees voorzichtig bij het verwijderen van het supernatant van het bezonken DNA om het pellet niet te verstoren, anders zal de opbrengst aanzienlijk verminderen.Eenmaal droog, suspendeert u het DNA-pellet in maximaal 200 microliter nuclease-vrij water en mengt u door middel van een vortex. Het toevoegen van meer dan 200 microliter water zal het monster over het algemeen verdunnen voor gebruik. Bij kinetische experimenten meet u het opnieuw gesuspendeerde DNA met behulp van een spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant.Voeg vervolgens vier eenheden van het knippenzym M-B-B-S-R-D toe per één microgram plasmide en voeg het bijbehorende enzymbuffer toe. Incubeer het monster gedurende één uur bij 65 graden Celsius om de gewrichten te verteren. Bewerk vervolgens de vorkgaten door acht eenheden van het knippenzym NT BST mb toe te voegen per één microgram plasmide en de bijbehorende enzymbuffer.Incubeer het monster gedurende één uur bij 55 graden Celsius. Om de fluorescerende reporters eerst Resus te bereiden, schorsen en kwantificeren de monsters zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Meng vervolgens 10 microliter van de reporters'bodemstreng met 13 microliter van de topquecher-streng in tris-acetaat EDTA-buffer met 12,5 millimolair magnesium.Om ervoor te zorgen dat alle flora, vier gelabelde strengen worden gekwantificeerd, moet een 30% overschot van de quencher-gelabelde streng worden toegevoegd. Bewerk vervolgens het reporter C-complex met behulp van een thermische cycler. Koel het monster van 95 graden Celsius tot 20 graden Celsius af met een snelheid van één graad Celsius per minuut.Wanneer u klaar bent, bewaart u het monster bij vier graden Celsius na kalibratie. Begin met de fluorescentiemetingen door de temperatuurregelaar eerst in te stellen op 25 graden Celsius terwijl de temperatuur stabiliseert. Stel de juiste parameters in voor kinetische metingen in de data-acquisitiesoftware.Nadat u de software voor de spectrale fluorimeter hebt geopend, stelt u de gleufbreedte in op 2,73 nanometer voor zowel de excitatie- als emissiemonochroom. Stel vervolgens de integratietijd in op 10 seconden voor elke 62e tijdstip en stel de totale meettijd in op 24 uur. Stel tot slot de excitatie- en emissiegolflengten in om overeen te komen met de flora-bos die in het experiment wordt gebruikt.Voeg vervolgens 410,2 microliter nuclease-vrij water en 52,8 microliter 10 extra's acetaat EDTA-buffer met 125 millimolair magnesium toe aan een synthetische kwartscel. Voeg ook twee microliter van 300 millimolair poly T-strengen toe en schud vervolgens de synthetische kwartscel gedurende 10 tot 15 seconden. Voeg vervolgens negen microliter van de reporterstringen toe bij 10 micromolair en zes microliter van elke hulpstring bij 10 micromolair.Voeg vervolgens 45 microliter van zowel de gewrichten als de vorkgaten toe bij één micromolair en meng de oplossing voorzichtig door het minstens 20 keer op en neer te pipetten. Voeg tenslotte negen microliter 10% natriumdoductalsulfaat toe om een eindconcentratie van 0,15% SDS te bereiken, meng de reactie voorzichtig door het minstens 20 keer op en neer te pipetten en plaats onmiddellijk de synthetische kwartcellen in de kamer van de spectra-fluter en start de kinetische meting. Voeg na vijf minuten meting drie microliter van de inputstrengen toe.Voeg 10 micromolair toe aan de synthetische kwartscel. Terwijl het data-acquisitieprogramma is onderbroken, meng de reactie voorzichtig door het minstens 20 keer op en neer te pipetten en sluit vervolgens het lichtdeksel en ga door met het opnemen van de reactiekinetiek totdat deze stabiel is. De kinetiekgegevens voor de plasma-afgeleide poorten en de gesynthetiseerde poorten worden hier in de experimenten weergegeven.De concentratie van signaalstreng A is vast terwijl de hoeveelheid van het katalytische signaal B wordt gevarieerd. Signaal C wordt gebruikt om de voortgang van de reactie af te lezen zonder onderbreking. De katalytische cyclus-omzet wordt gedefinieerd als de hoeveelheid signaal C die voor elke katalysator B wordt geproduceerd op een bepaald tijdstip.Voor een ideaal katalytisch systeem zou dit omzetgetal lineair met de tijd moeten toenemen en onafhankelijk zijn van de hoeveelheid katalysator, zolang het substraat niet beperkend is. Hier wordt waargenomen dat het gesynthetiseerde systeem veel eerder afwijkt van de ideale lineaire toename van de omzet dan het plasma-afgeleide systeem, wat wijst op sequestratie van de katalysator door een ongewenste nevenreactie. De

plasmid-derived-dna-strand-displacement-gates-for-implementing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

DNA-origami is een krachtige methode voor het vervaardigen van nauwkeurige nanoschaal objecten door de zelf-assemblage van DNA-moleculen programmeren. Hier beschrijven we hoe origami DNA kan worden gebruikt om een ​​robot robot kan voelen biologische signalen en reageren door vormverandering vervolgens doorgegeven aan een gewenst effect te ontwerpen.

Het ontwerpen van een Bio-responsieve Robot van DNA Origami

De synthese van aangepaste plasmiden is arbeidsintensief en tijdrovend. Dit protocol beschrijft het gebruik van Gibson-assemblage-klonering om de werk en duur van de procedure voor aangepaste DNA-klonering te verminderen. Het beschreven protocol produceert ook betrouwbare getagde eiwitconstructies voor zoogdierexpressie tegen vergelijkbare kosten als de traditionele cut-and-paste DNA-klonering.

Generatie van plasmide vectoren die-FLAG tagged eiwitten onder de verordening van de Mens elongatiefactor-1α Promoter Met behulp van Gibson Vergadering

Hier, wordt een geautomatiseerde workflow voor het uitvoeren van modulaire DNA "apparaat" vergadering met behulp van een modulaire klonen DNA vergadering methode op vloeistof aangestuurde robots gepresenteerd. Het protocol maakt gebruik van een intuïtieve softwaretool voor het genereren van vloeibare handler selectielijsten voor combinatorische DNA apparaat bibliotheek generatie, waaruit we met behulp van twee vloeibare behandeling platforms.

Geautomatiseerde robot Liquid Handling samenstel van modulaire DNA voorzieningen

Dit artikel presenteert een reeks protocollen voor het ontwikkelen van gemanipuleerde cellen en gefunctionaliseerde oppervlakken die het mogelijk maken synthetisch gemanipuleerde E. coli te beheersen en te manipuleren programmeerbare materiaal oppervlakken.

Met behulp van synthetische biologie levende cellen Engineer die interface met programmeerbare Materials

We beschrijven het gedetailleerd protocol voor ontwerp, simulatie, NAT-lab experimenten en analyse voor een herconfigureerbare DNA accordeon rek van 6 bij 6 mazen.

Ontwerp en de synthese van een accordeon herconfigureerbare DNA-Rack

Op een ondergrond, die kan worden gebruikt voor het uitvoeren van cel-vrije gen expressie experimenten op biochips beschrijven we een eenvoudige lithografische procedure voor de immobilisatie van gen-lengte DNA moleculen.

Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie

Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van hoe ik) een zelfreplicerende vector met behulp van de cyanogate modulaire kloon Toolkit, II), introduceren de vector in een cyanobacterial gastheer door conjugatie, en III) karakteriseren transgene cyanobacteriën stammen met behulp van een plaat lezer of flow cytometrie.

Genetische modificatie van cyanobacteriën door conjugatie met behulp van de CyanoGate modulaire kloon Toolkit

Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde, stapsgewijze handleiding te bieden voor het assembleren van multi-gen constructies met behulp van het modulaire kloonsysteem op basis van Golden Gate klonen. Het geeft ook aanbevelingen over kritieke stappen om een optimale montage te garanderen op basis van onze ervaringen.

Snelle assemblage van multigenconstructies met behulp van modulair klonen van golden gate

We beschrijven de engineering van een nieuw DNA-gebonden T7-RNA-polymerase om in vitro transcriptiereacties te reguleren. We bespreken de stappen voor eiwitsynthese en karakterisering, valideren proof-of-concept transcriptionele regulatie en bespreken de toepassingen ervan in moleculaire computing, diagnostiek en moleculaire informatieverwerking.

DNA-gebonden RNA-polymerase voor programmeerbare in vitro transcriptie en moleculaire berekening

CRISPR-Cas-systemen en anti-CRISPR-eiwitten werden geïntegreerd in het schema van Booleaanse poorten in Saccharomyces cerevisiae. De nieuwe kleine logische circuits toonden goede prestaties en verdiepten het begrip van zowel op dCas9/dCas12a gebaseerde transcriptiefactoren als de eigenschappen van anti-CRISPR-eiwitten.

Gene digitale circuits op basis van CRISPR-Cas-systemen en anti-CRISPR-eiwitten

In vivo assemblage is een ligatie-onafhankelijke kloneringsmethode die berust op intrinsieke DNA-reparatie-enzymen in bacteriën om DNA-fragmenten te assembleren door homologe recombinatie. Dit protocol is zowel tijd- als kosteneffectief, aangezien er weinig reagentia nodig zijn en de kloonefficiëntie kan oplopen tot 99%.

Gebruik van in vivo assemblage voor zeer efficiënte plasmideconstructie

Leer DNA-strandverplaatsingspoorten afleiden uit bacteriële plasmiden en testen met fluorescentiekinetiek. Deze methode genereert robuuste poorten met minder circuitlek dan gesynthetiseerde alternatieven.

Plasmide afkomstig DNA Strand Displacement Gates Uitvoeringsbesluit Chemical Reaction Networks

Meer video's verkennen