Name: In Situ Mapping van de mechanische eigenschappen van Biofilms per Particle volgen Microreologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Leer de visco-elastische eigenschappen van bacteriële biofilms meten via particle-tracking microrheologie. Deze niet-destructieve techniek biedt hoge ruimtelijke resolutie voor het bestuderen van biofilmmechanica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek wordt ondersteund door de National Research Foundation en het ministerie van Onderwijs van Singapore onder haar Research Centre of Excellence Programma, de Start-up Subsidies (M4330002.C70) van de Nanyang Technological University, en ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) van het ministerie van Onderwijs, Singapore. De auteurs danken Joey Yam Kuok Hoong voor deelname aan de demonstratie van dit protocol.

1. Biofilm Teelt <ol><li> Bereiding van bacteriële stammen <ol><li> 1 dag voor cultivatie biofilm bereiden planktonische bacterieculturen enten van 2 ml van de geschikte groeimedium uit bevroren bacteriecultuur. Gebruik Luria-bouillon medium (10 g L -1 NaCl, 10 g L -1 gistextract, en 10 g L -1 trypton) voor mucoïde P. aeruginosa en de Δ pel en Δ PSL defecte mutanten. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 200 rpm geschud. Verdun overnachtkweken tot een OD 600 van 0,40 met behulp van een spectrofotometer. </li><li> Monteer stroomcel instelling, die is eerder beschreven 14, bij voorkeur een mobiel station of een trolley die in de microscoop kamer kan worden gebracht voor het afbeelden van de stroomcel zonder demontage. </li><li> Bereid steriel groeimedium in 2 L of 5 L flessen voor elke stroom cel. Gebruik minimaal medium M9 (48 mM Na 2 HPO 4, 22 mmKH 2PO 4, 19 mM NH4Cl, 9 mM NaCl, 2 mM MgSO 4 en 0,1 mM CaCl 2) aangevuld met 0,04% glucose (gew / vol) en 0,2% (wt / vol) casaminozuren) voor P. aeruginosa stromen cel biofilms. </li><li> Aliquot fluorescerende microbolletjes in microcentrifugebuizen en spin in steriele H 2 O voor 5 min in centrifuge bij 9,391.2 g. Verwijder supernatant en resuspendeer in 1 ml kweekmedium met natriumazide (desinfectiemiddel) te verwijderen voorafgaand aan het toevoegen aan groeimedium in 2 L of 5 L medium flessen. LET OP: Verschillende maten van microsferen zijn er in verschillende concentraties en dienovereenkomstig moeten worden verdund tot instructies. Bijvoorbeeld, dispergeren 120 gl 1,0 urn diameter microsferen, 15 gl 0,5 urn diameter microsferen en 0,96 pl 0,2 urn diameter microsferen in 2 liter groeimedium tot 2,18 x 10 6 microsferen -1 ml voor elke deeltjesgrootte. </li><li> Hechten medium fles upstriem stroom cel en laat groeimedium te stromen door hele setup. Stop stroom en injecteer verdund nachts culturen in flow cel kamers. De bacteriën te hechten aan de ondergrond dekglaasje gedurende 1 uur alvorens verder stroom groeimedium bij een stroomsnelheid van ongeveer 5,5 x 10 -3 m sec -1 of 8 min met een peristaltische pomp. OPMERKING: Biofilms zijn meestal gekweekt bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 3-7 dagen. </li><li> Als alternatief voor de statische cultuur setup, verdunnen &#39;s nachts culturen 100-voudige in microcentrifugebuizen door het toevoegen van 10 pi&#39; s nachts cultuur 1 ml groeimedium met deeltjes. Verhoging van de deeltjesconcentratie in het groeimedium voor statische kweek ongeveer 500-voudig vergeleken met die voor stroming biofilms (bijvoorbeeld wassen en resuspenderen 600 ui 1,0 urn diameter bollen in 10 ml groeimedium) als stroomcel biofilms voortdurend aangevuld met deeltjes maar statische culturen niet. <ol><li> Voeg 2001; l verdund &#39;s nachts cultuur met deeltjes tot de kamers van 8 en dia&#39;s. Incubeer bij 37 ° C onder statische omstandigheden. Biofilms zijn meestal gekweekt voor 1 dag. Vervang groeimedium besteed dagelijks vers groeimedium met deeltjes als biofilm wordt geteeld voor meer dan 1 dag. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Microscopie <ol><li> Op dag 3 en 5, uit te schakelen stroom uit peristaltische pomp en breng stroom cel instellen in de microscopie kamer. Klem slang bij de ingang en uitgang van de stroom cel kamers om drift (een systematische fout veroorzaakt door veranderingen in het milieu) van stroom te voorkomen. Plaats de stroomcel naar de microscoop stadium van een rechtopstaande microscoop. OPMERKING: Gebruik een omgekeerde microscoop voor beeldvorming van microwells. </li><li> Met fluorescentiemicroscopie met 40X olie doel&#39;s van microsferen beweging ingebed in de biofilm op verschillende locaties (microkolonies en platte ongedifferentieerde lagen) en verschillende dagen (dag 3 en 5) te nementijd en ruimte onderzoeken. Neem kortere video&#39;s met een hogere framesnelheid om gebeurtenissen die zich binnen korte tijdschalen onderzoeken (bijvoorbeeld 1,5-3 min video&#39;s bij framerate van 25-50 frames per seconde voor snelle dynamiek), en langere video&#39;s met een lagere framerate op gebeurtenissen over langere tijd te onderzoeken schalen (bijv 15-30 min video&#39;s bij frame rate van 2,5-5 beelden / sec voor langzamere dynamiek). OPMERKING: Een video bevat gewoonlijk 5-10 deeltjes, en is meestal van 1,0-2,5 GB in bestandsgrootte. Grotere microkolonies kunnen meer deeltjes bevatten. Neem 5-10 video&#39;s voor elke categorie (bijvoorbeeld 5-10 video&#39;s van verschillende microkolonies en van verschillende lokaties in flat ongedifferentieerde lagen). De biofilm is een heterogene architectuur die kan bestaan ​​uit microkolonies, kanalen, holle ruimten en platte ongedifferentieerde lagen. </li><li> Besparen video&#39;s in de juiste formaat dat kan worden gelezen door Fiji / ImageJ (bijv czi, tif). </li><li> Controleer video&#39;s voor de drift door te bladeren door de afgewerkte video en observeren dat de deeltjes niet bewegen in dezelfde richting tegelijkertijd. Drift kan worden veroorzaakt door z-fase beweging stromen in de stroomcel, onbalans antivibratietafel, luchtdruk of temperatuurveranderingen. Correcte kleine drijven met behulp van post-processing technieken meestal voorzien microscoop software. Gooi alle video&#39;s waarin drift niet kunnen worden gecorrigeerd. Noteer de volgende parameters, die nodig zijn tijdens de Particle Tracking Analyse: Resolutie (px / um), aantal frames, duur. </li><li> Verwijder stroom cel uit microscoop podium en start peristaltische pomp te blijven cultiveren van de biofilm. </li></ol> 3. Particle Tracking Analyse <ol><li> Verkrijgen deeltje trajecten met behulp van de plug-in TrackMate in open source software (ImageJ). Download Fiji op <a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji.</a> Open de video die met Fiji en onder het Plugins menu, selecteer Tracking en TrackMate. </li><li> Controleer of de instellingen in th passene venster suggereert initiële kalibratie-instellingen om de video parameters passen zoals vastgelegd in stap 2.4. </li><li> Detecteren deeltjes in TrackMate behulp ImageJ. <ol><li> Selecteer &#39;log-detector&#39;, ingang deeltjesdiameter en drempelwaarde (bijvoorbeeld 1000). Blader door de video, terwijl klikken op &#39;Preview&#39; knop om te controleren of de paarse cirkels volgen de deeltjes in de hele video. Pas de diameter en drempelwaarden als noodzakelijk is: verhoging van de drempelwaarde als paarse kringen verschijnen in de lege ruimte. Verlaag de drempelwaarde als er niet voldoende deeltjes worden gedetecteerd. Klik op de volgende knop om detectie te voltooien de deeltjes. </li><li> Klik op de knop Volgende wanneer voorgesteld met de optie toe te voegen of te verwijderen deeltjes ontdekt in &#39;Initial thresholding&#39;, &#39;Selecteer een view&#39; en &#39;Selecteer een filter&#39; ramen te blijven, zonder aanpassing als eerste deeltje detectie was bevredigend. </li><li> Selecteer &#39;Simple LAP tracker&#39; in het optiop de bar van &#39;Selecteer een tracker methode&#39; window als deeltjes zelden verplaatsen van de focus op de biofilm en zijn gemakkelijk gevolgd. Gebruik de voorgestelde of lage koppeling en gap-closing max afstand waarden en klik op Volgende. </li><li> Controleer dat deeltje tracking is bevredigend door te bladeren door de video te zien dat deeltjes volgen getrokken door TrackMate tracks, en dat er geen ongewenste of ontbrekende tracks. Sla de verschillende filtering stappen. Ga naar het laatste venster &#39;Kies een actie&#39;. Selecteer &#39;Export tracks naar xml-bestand&#39; uit het drop down menu en klik op &#39;Uitvoeren&#39;. Kies een map om de tracks op te slaan. NB: Er zijn verschillende programma&#39;s beschikbaar in het publieke domein voor de analyse van deeltjes trajecten en het gebruik van Microreologie. msdanalyzer en TrackArt zijn voorbeelden van deeltjes volgen analyse programma&#39;s die in de Matlab-omgeving. </li></ol></li><li> Bereid Matlab om het deeltje trajecten in de XML-bestanden importeren door te selecteren in het menu vanMatlab Bestand&gt; Stel Pad ... en voeg de map scripts verkrijgbaar met de Fiji-pakket. </li><li> Om het deeltje trajecten met msdanalyzer te analyseren, te downloaden op de link naar het zip-bestand of het tar.gz bestand at <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol><li> Pak hetmsdanalyzer map 15 en zet het in een map die behoort tot de Matlab pad (bijvoorbeeld C: Documents and Settings &lt;Gebruikersnaam&gt; Mijn documenten Matlab). Start Matlab en inleiding van de analyser door te typen: ma = msdanalyzer (2, &#39;eh&#39;, &#39;sec&#39;) waarbij um en sec zijn de fysieke ruimte en tijd eenheden in de video. <ol><li> Importeer het deeltje trajecten door te typen: [tracks, md] = importTrackMateTracks (&#39;filename.xml&#39;, &#39;clipz&#39;;, &#39;Scalet&#39;) ma = ma.addAll (sporen); waarbij &#39;clipz&#39; verwijdert de z dimensie voor een 2D-video, en &#39;Scalet&#39;. </li><li> Plot van de trajecten op grafiek met behulp van: ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li> Bereken de SSA van de deeltjes met behulp van: ma = ma.computeMSD; ma.msd </li><li> Plot de MSA van elk deeltje: figuur ma.plotMSD </li><li> Combineer deeltje trajecten uit andere video&#39;s van dezelfde categery (bv deeltjes ingebed in wild-type microkolonies op dag 3) door het herhalen van 3.5.1.1 naar 3.5.1.4). </li><li> Plot het ensemble gemiddelde of het gemiddelde over alle bochten: ma.plotMeanMSD Wijzig de Y- en X-as van het lineair logaritmische schaal. Op lange vertraging tijden, het MSD bochten worden luidruchtig te wijten aan onvoldoende statistieken op langere tijdschalen. De MSD bochten kan ook sterk stijgen als gevolg van dynamische fouten. Deze gebieden van de curve kan worden verwijderd met het penseelaan het einde van de curve te selecteren en te kiezen voor &#39;borstelen&#39;&gt; &#39;Verwijder unbrushed&#39; in het menu Extra. </li></ol></li><li> Download Ezyfit bij <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> en voeg Ezyfit naar een map die behoren tot de Matlab pad (bijvoorbeeld C: Documents and Settings &lt;Gebruikersnaam&gt; Mijn documenten Matlab). Installeer de Ezyfit menu door te typen in Matlab werkruimte efmenu installeren. Herstart MATLAB met Ezyfit menu in de figuur venster. Breng de MSD bochten om de macht wet door het selecteren in het menu Ezyfit &#39;Show Fit&#39;&gt; &#39;Power&#39;&gt; &#39;a * x ^ n&#39; waren n is de geschatte diffusief exponent α. OPMERKING: msdanalyzer vereist de Curve Fitting Toolbox in Matlab voor het aanbrengen van MSD bochten. Ezyfit is een alternatief en gratis software die kan uitvoeren curve fitting. </li><li> Clear huidige deeltje trajecten en MSA nieuwe deeltje SSA op andere locaties of de tijd te berekenen: duidelijk </li&gt; <li> Na berekening van de verschillende gemiddelde MSD rondingen van deeltjes in medium (controle), en microkolonies en ongedifferentieerde gebieden van verschillende stammen, kopieer en plak de bochten in een grafiek te vergelijken. Monster stijfheid en verknopen toename met lagere MSD waarden. Platte bochten hebben een lagere α en het monster is elastischer dan steilere bochten met een hogere α. </li><li> Selecteer de bocht en ga naar &quot;Tools&quot; te kijken naar de gegevens statistieken, zoals de mediaan en bereik. De MSD van de kraal is evenredig met de kruip compliance, J (t) van het materiaal waarin de kraal is ingebed volgens de relatie <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> waarbij J = kruip compliance, d = deeltjesdiameter, k B = Boltzmann constante, T = temperatuur en t = tijd. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li>
<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+extracellular+polymeric+substances+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).</li>
<li>Chew, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Remodeling+of+Microbial+Biofilms+by+Functionally+Distinct+Exopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides.</a> mBio. 5 (4), (2014).</li>
<li>Irie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-produced+exopolysaccharide+is+a+signal+that+stimulates+biofilm+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).</li>
<li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psl+trails+guide+exploration+and+microcolony+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Nature. 497, 388-391 (2013).</li>
<li>Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine+and+PQS+mediated+subpopulation+interactions+involved+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation.</a> Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+differentiation+in+co-culture+biofilms+formed+by+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).</li>
<li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).</li>
<li>Bokranz, W., Wang, X., Tschäpe, H., Römling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+cellulose+and+curli+fimbriae+by+Escherichia+coli+isolated+from+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract.</a> J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).</li>
<li>Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+methods+for+characterisation+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microchim+Acta%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical methods for characterisation of biofilms.</a> Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).</li>
<li>Waigh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrheology+of+complex+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">Microrheology of complex fluids.</a> Rep Prog Phys. 68, 685-742 (2005).</li>
<li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-Tracking+Microrheology+of+Living+Cells%3A+Principles+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li>
<li>Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa.+and+Saccharomyces+cerevisiae.+Biofilm+in+Flow+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells.</a> J Vis Exp. , e2383(2011).</li>
<li>Tarantino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+and+IL-1+exhibit+distinct+ubiquitin+requirements+for+inducing+NEMO-IKK+supramolecular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures.</a> Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharides+serve+as+scaffold+of+biofilms+formed+by+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).</li>
<li>Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+starvation-induced+dispersion+in+Pseudomonas+putida+biofilms%3A+genetic+elements+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms.</a> Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).</li>
<li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li>
<li>Stoodley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+fluid+shear+and+AlCl3+on+the+material+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa.+PAO1+and+Desulfovibrio+sp.+EX265+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms.</a> Water Science & Technology. 43, 113-120 (2001).</li>
<li>Jäger-Zürn, I., Grubert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podostemaceae+depend+on+sticky+biofilms+with+respect+to+attachment+to+rocks+in+waterfalls%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls.</a> International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).</li>
<li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackArt%3A+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Microreologie is een nuttig instrument voor de lokale rheologische metingen in heterogene systemen, zoals microbiële biofilms. Het is een niet-destructieve techniek, zodat de real-time monitoring van reologische veranderingen binnen dezelfde biologische monster over meerdere tijdstippen. In dit protocol werd deeltjes volgen Microreologie toegepast op Pel en Psl exopolysaccharide mutanten om te onderzoeken hoe ze invloed hebben op de elasticiteit en effectieve verknoping van de biofilm matrix. PSL is voorstander van de o...

De meeste bacteriële cellen zijn in staat om zowel plankton (vrij levende) en oppervlak bevestigd (zittend) vormen van de groei 1 in dienst. In het oppervlak gehecht groeiwijze, bacteriële cellen scheiden en omsluiten zich in grote hoeveelheden extracellulaire polymere stoffen (EPS) biofilms te vormen. De EPS bestaat voornamelijk uit proteïnen, exopolysaccharide, extracellulair DNA en essentieel voor biofilmvorming 2. Het dient als een fysieke scaffold waarmee bacteriën kunnen gebruiken om ruimtelijk te differentiëren en beschermt de bacteriën tegen schadelijke omgevingsfactoren en gastheerreacties. Verschillende componenten van EPS hebben verschillende functies in biofilmvorming 3 en veranderingen in de expressie van EPS componenten drastisch verbouwen biofilm structuren 4. EPS componenten kunnen eveneens als signaalmoleculen 5, en recente studies is gebleken bepaalde EPS componenten interactie met microbiële cellen om de migratie en biofilm diff gidsdifferentiatie 6-8. Onderzoek naar de EPS sterk geavanceerde basis van de morfologische analyse van biofilms door mutanten in een bepaald deel van de EPS 9,10. Bovendien wordt de EPS gewoonlijk gekarakteriseerd op macroschaal (bulk karakterisering) 11. Morfologische analyse kan echter kwantitatief detail en bulk karakterisering, waarbij de gemiddelde waarden oplevert, verliest de details die in de heterogeniteit van de biofilm bestaat missen. Er is nu een stijgende trend op weg naar real-time karakterisering van de mechanische eigenschappen van EPS op micro-schaal. Dit protocol toont hoe particle tracking Microreologie kan de spatiotemporele effecten van matrixcomponenten Pel en Psl exopolysacchariden de visco-elasticiteit en effectieve vernetting van Pseudomonas aeruginosa biofilms 4 bepalen. Passieve Microreologie is een eenvoudige en goedkope rheology methode die de hoogste omzet ruimtelijke microrheological bemonstering van een materiaal date 12,13 bepaalt. In passieve Microreologie zijn sonde bolletjes in het monster geplaatst en hun Brownse beweging, gedreven door thermische energie (k B T) wordt gevolgd door video-microscopie. Meerdere deeltjes kunnen gelijktijdig worden gevolgd, en de tijdsafhankelijke coördinaten van de deeltjes na een conventionele random walk. Daarom, gemiddeld, de deeltjes blijven op dezelfde positie. De standaarddeviatie van de verplaatsingen en de gemiddelde kwadratische verplaatsing (MSD) van de deeltjes, niet nul. Sinds visceuze vloeistoffen vloeien, het deeltje MSD in een stroperige vloeistof lineair groeit naarmate de tijd vordert. In tegenstelling, de polymere verknoping in visco-elastische of elastische stoffen helpen om stroming te weerstaan, en deeltjes worden in beperkte verplaatsing, waardoor plateaus in de MSD curve (figuur 1A). Deze constatering volgt de relatie MSDαt <sup&gt; α, waarbij α de diffuse exponent die gerelateerd verhouding tussen elastische en visceuze bijdragen van de stof. Voor deeltjes bewegen in viskeuze vloeistoffen α = 1, in visco-elastische stoffen 0 &lt;α &lt;1, en ​​in elastische stoffen α = 0. De MSD kan ook worden gebruikt om de kruip compliance, die de neiging van het materiaal permanent vervormt dan berekent tijd en schat hoe gemakkelijk een materiaal spreads. De grootte, dichtheid en oppervlaktechemie van het deeltje is kritisch voor de juiste toepassing van microrheological experiment en worden gekozen met betrekking tot het bestudeerde systeem (in dit geval de polymeren van de biofilm matrix, zie figuur 1B). Ten eerste, het deeltje meet de reologie van de stof met structuren die veel kleiner is dan het deeltje zelf zijn. Als structuren van de stof van vergelijkbare schaal het deeltje, de beweging van de nominalekel wordt verstoord door de vorm en oriëntatie van de individuele structuren. Indien de structuren rond het deeltje veel kleiner, dit effect is klein en uitgemiddeld, die een homogene omgeving om de deeltjes (Figuur 1B). Ten tweede moet de dichtheid van het deeltje vergelijkbaar met het medium (1,05 g -1 ml voor watergedragen mediums) zodanig, dat bezinking vermeden en traagheidskrachten verwaarloosbaar. De meeste deeltjes met polystyreen roosters aan bovenstaande criteria voldoen. In het ideale geval bevat het deeltje niet communiceren met de polymeren van de biofilm matrix als rheologische interpretatie van deeltjes MSD geldt alleen als er beweging is willekeurig, gedreven door thermische energie en botsingen met substantie structuren. Dit kan worden waargenomen door te controleren of de probe deeltjes de neiging te binden of stuiteren van het oppervlak van een pre-volwassen biofilm. Ondanks het ontbreken van aantrekkingskracht van de biofilm, moet de deeltjes kunnen in de matrix worden opgenomen.Bovendien kan de fysiochemische heterogeniteit van de biofilm resulteren in verschillende deeltjes geschikter als probes in verschillende gebieden van de biofilm. Daarom moet deeltjes van verschillende grootte en oppervlaktechemie worden toegepast op de biofilm. Als zodanig, de deeltjes MSD kan nuttige informatie over verschillende componenten bijdragen aan de reologie en de verspreiding van de biofilm verschaffen. Bovendien is het gebruik van verschillende probes maakt het mogelijk om informatie te verkrijgen over de ruimtelijke fysisch heterogeniteit van de biofilm. Deze methode kan worden gebruikt om het effect te testen op antimicrobiële behandeling de mechanische eigenschappen van de biofilm of toepassing op gemengde species biofilms te onderzoeken hoe de mechanische eigenschappen van de biofilm worden veranderd van introductie van een andere soort. Deeltjes MSA kan ook nuttig zijn voor het karakteriseren van biofilm dispersie zijn. Dergelijke studies zou nuttig zijn in ons begrip van biofilms, mogelijk het verbeteren van biofilm behandelingen eennd engineering van biofilms voor nuttige activiteiten.

<table><tbody><tr><td>Fluorspheres</td><td>Invitrogen</td><td>F-8821</td><td>1,0 &#956;m rode fluorescente (580/605) microspheres met carboxylaat modificatie</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager M1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Epifluorescente microscoop</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive 07523-80</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td>Peristaltiekpomp</td></tr><tr><td>Flow Cell Chambers</td><td>Technische Universiteit van Denemarken</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bubble Trap</td><td>Technische Universiteit van Denemarken</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siliconen buis</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>3 mm buitendiameter, 1&nbsp;mm binnendiameter</td></tr><tr><td>Klare kunststof connectoren</td><td>Cole Parmer</td><td>06365-83</td><td>1/16 in. (1,588 mm)</td></tr><tr><td>Clips</td><td></td><td></td><td>Om buisjes vast te klemmen</td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Thermo Scientific&trade; Nunc&trade;</td><td>50 x 24 mm</td><td></td></tr><tr><td>Spuit 3 ml</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 &nbsp;G Naald</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &nbsp;L Opslag/Media Flessen</td><td>VWR&reg;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karren</td><td></td><td></td><td>Om biofilm opstelling te houden</td></tr></tbody></table>

in situ mapping van de mechanische eigenschappen van biofilms per particle volgen microreologie

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacteriecellen zijn in staat om aan het oppervlak gehechte biofilmgemeenschappen, bekend als biofilms, te vormen door zichzelf in extracellulaire polymere substanties (EPS) te omhullen. De EPS dient als een fysische en beschermende schaal die de bacteriecellen huisvest en bestaat uit een verscheidenheid aan materialen waaronder eiwitten, exopolisachariden en DNA. De samenstelling van de EPS kan veranderen, waardoor de mechanische eigenschappen van de biofilm worden hermodelleerd om zich verder te ontwikkelen of alternatieve biofilmstructuren, zoals streamers, te ondersteunen als reactie op omgevingssignalen. Desondanks zijn er weinig kwantitatieve beschrijvingen van hoe EPS-componenten bijdragen aan de mechanische eigenschappen en functie van biofilms. Reologie, de studie van de stroming van materie, is van bijzonder belang voor biofilms omdat veel biofilms in stromingsomstandigheden groeien en constant worden blootgesteld aan schuifspanning. Het biedt ook meting en inzicht in de verspreiding van de biofilm op een oppervlak. Hier wordt deeltjesvolg-microreologie gebruikt om de viscoëlasticiteit en effectieve verknopingsrollen van verschillende matrixcomponenten in verschillende delen van de biofilm tijdens ontwikkeling te onderzoeken. Deze aanpak stelt onderzoekers in staat om mechanische eigenschappen van biofilms op micro-schaal te meten, wat nuttige informatie zou kunnen opleveren voor het controleren en ontwerpen van biofilms.

De lokale visco-elastische eigenschappen van de biofilm in verschillende gebieden van de biofilm, waarbij de holten (gemiddeld boven de biofilm), vlakten (vlakke laag ongedifferentieerde cellen) en microkolonies (zie labels in figuur 2A) inclusief onderzocht. De tijdelijke veranderingen in de visco-elastische eigenschappen van de biofilm gedurende rijping van dagen 3-5 werden bepaald. De MSD van de deeltjes in de holtes werd gebruikt als een controle en vergelijkbaar met de MSD deeltjes in zuiver medium...

Deeltjesvolg-microreologie onderzoekt de viscoëlasticiteit van materialen. Hier wordt de techniek gebruikt om de viscoëlasticiteit, creep-compliantie en effectieve crosslinking-rollen van verschillende matrixcomponenten van een bacteriële biofilm te bepalen. De matrix bestaat uit polymere stoffen die door de bacteriën worden uitgescheiden en de componenten bepalen de structuur en mechanische eigenschappen van de biofilm.

In Situ Mapping van de mechanische eigenschappen van Biofilms per Particle volgen Microreologie

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Het algemene doel van deze methodologie is om aan te tonen hoe de werkelijke logische eigenschappen binnen de microdomeinen van heterogene flowcell- en statische biofilms kunnen worden gemeten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de ologie in het biofilmveld, zoals hoe specifieke componentmetrieken, verschillende soorten of verbindingen de biofilmneurologie beïnvloeden en het testen van de respons op fysieke kracht, zoals afschuiving. Dit is een niet-destructieve techniek met een hoge ruimtelijke resolutie, die kan worden uitgevoerd met apparatuur die standaard is voor biologische laboratoria.Nadat de overnight bacteriële culturen en benodigdheden en medium voor de opstelling van de flow cell zijn voorbereid volgens het tekstprotocol, worden fluorescente microsferen in steriel water in microcentrifugebuisjes overgebracht om het natriumazide te verwijderen. Centrifugeer de buisjes vijf minuten in een steriele omgeving, zoals een laminaire flowkast, verwijder het supernatant en gebruik één milliliter groeimedium om de microsferen opnieuw te suspenderen. Voeg vervolgens de microsferen toe aan de rest van het groeimedium voor de flow cell cultuur. Stel de f

in-situ-mapping-mechanical-properties-biofilms-particle-tracking

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Source: Kurz, D. L., et al. Microfluidic Platform to Study Bioclogging in Porous Media. J. Vis. Exp. (2022)The video demonstrates the use of a microfluidic device to study biofilm formation. A bacterial suspension is introduced into the microchannel, followed by incubation to allow biofilm development. Flow is then resumed, and pressure monitoring along with imaging is used to detect biofilm formation and pore blockage over time.

A Microfluidic Device for Real-Time Imaging and Pressure Tracking During Biofilm Formation

Dit document toont een originele methode gebaseerd op de afstandsbedieningsinrichting van magnetische deeltjes geënt in een bacteriële biofilm en de ontwikkeling van specifieke magnetische pincet meten in situ lokale mechanische eigenschappen van het complex levend materiaal gebouwd door micro-organismen aan grensvlakken.

Remote Magnetische Aansturing van Micrometrische Probes voor<em&gt; In situ</em&gt; 3D Mapping van bacteriële biofilm Fysische eigenschappen

Deeltjes volgen microrheology kunnen worden gebruikt om niet-destructieve kwantificeren en veranderingen in extracellulaire matrix mechanische eigenschappen in 3D tumormodellen ruimtelijk in kaart.

Longitudinale Meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D Tumor modellen met-Particle Tracking Microreologie

Biofilms hebben complexe interacties met hun omgeving. Om biofiel-omgevingsinteracties grondig te onderzoeken, presenteren we hier een reeks methoden om een heterogene chemische omgeving te creëren voor biofilmontwikkeling, om lokale stroomsnelheid te kwantificeren en om massatransport in en rond biofilmkolonies te analyseren.

Methoden voor het karakteriseren van de co-ontwikkeling van biofilm en Habitat Heterogeniteit

Dit artikel presenteert een methode voor het kweken van een biofilm voor in situ secundaire ion time-of-flight massaspectrometrie voor toewijzing van de chemische in haar gehydrateerd staat, ingeschakeld door een microfluidic-reactor, systeem voor analyse op de vloeibare vacuüm-Interface. De heer Shewanella oneidensis -1 met groene fluorescentie eiwit werd gebruikt als een model.

In Situ Karakterisatie van Shewanella oneidensis MR1 Biofilms door SALVI en ToF-SIMS

Het gebrek aan instrumenten voor het meten van de materiaaleigenschappen en spanning parameters in vivo kunnen valideren hun rol tijdens de ontwikkeling. Wij werkzaam atomaire kracht microscopie (AFM) en nanoparticle-tracking te kwantificeren van mechanische functies op de intact zebrafish embryo dooier cel tijdens epiboly. Deze methoden zijn betrouwbaar en breed toepasbaar vermijden opdringerig interventies.

AFM en Microrheology in de cel van de dooier Zebrafish de Embryo

Microbiële biofilms vormen complexe architecturen in interfasen en ontwikkelen tot zeer Schaalafhankelijke ruimtelijke patronen. Hier introduceren we een experimenteel systeem (hard-en software) voor het automatisch verwerven van 3D optische coherentie tomografie (OCT) datasets. Deze toolset maakt de niet-invasieve en Multi-Scale karakterisatie van biofilm morfogenese in ruimte en tijd mogelijk.

Geautomatiseerde 3D optische coherentie tomografie om biofilm morfogenese te Verheldoen over grote ruimtelijke weegschalen

Het protocol presenteert een complete workflow voor nano-indentatie-experimenten met zacht materiaal, inclusief hydrogels en cellen. Ten eerste zijn de experimentele stappen om krachtspectroscopiegegevens te verkrijgen gedetailleerd; vervolgens wordt de analyse van dergelijke gegevens gedetailleerd beschreven via een nieuw ontwikkelde open-source Python-software, die gratis te downloaden is van GitHub.

Experimentele en data-analyse workflow voor soft matter nano-indentatie

Dit artikel belicht de werkzaamheid van de optische coherentie-elastografie (OCE)-techniek bij het snel en niet-destructief karakteriseren van elastische eigenschappen van biofilm. We verduidelijken kritische OCE-implementatieprocedures voor nauwkeurige metingen en presenteren Young's moduluswaarden voor twee granulaire biofilms.

Kwantificering van elastische eigenschappen van omgevingsbiofilms met behulp van optische coherentie-elastografie

Dit artikel beschrijft de basisprocedures voor het uitvoeren van optische in kaart brengen van experimenten in de Langendorff-geperfuseerde konijn hart met behulp van het panoramische imaging systeem, en de dubbele (spanning en calcium) beeldvormende modaliteit.

Multiparametrische Optische kaart brengen van de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Leer de visco-elastische eigenschappen van bacteriële biofilms meten via particle-tracking microrheologie. Deze niet-destructieve techniek biedt hoge ruimtelijke resolutie voor het bestuderen van biofilmmechanica.

In Situ Mapping van de mechanische eigenschappen van Biofilms per Particle volgen Microreologie

Meer video's verkennen