Name: Methoden te remmen Bacteriële Pyomelanin Productie en Bepaal de overeenkomstige stijging van de gevoeligheid voor oxidatieve stress (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Leer hoe NTBC de pyomelanineproductie in bacteriën remt en de gevoeligheid voor oxidatieve stress verhoogt. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van antimicrobiële resistentie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Dara Frank en Carrie Harwood voor hun genereuze bijdrage van stammen. University of Wisconsin Milwaukee Research Foundation bezit octrooi nr. 8.354.451; met claims die zich in brede zin richten op het behandelen of remmen van de progressie van een infectie van een micro-organisme bij een patiënt door toediening van een 4-hydroxyfenylpyruvaat-dioxygenase-remmende verbinding zoals 2-[2-nitro-4-(trifluormethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedion (NTBC). Inventeurs zijn Graham Moran en Pang He. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Institutes of Health (R00-GM083147). De P. aeruginosa transposon mutantenbibliotheek van de Universiteit van Washington wordt ondersteund door NIH P30 DK089507.

1. Bereiding van Culture Media, antibiotica en 2- [2-nitro-4- (trifluormethyl) benzoyl] -1,3-cyclohexaandion (NTBC) <ol><li> Maken LB-bouillon (1% trypton, 0,5% gistextract, 0,25% NaCl in H 2 O) en de hoeveelheid in de juiste hoeveelheden. Steriliseren in autoclaaf. Bewaren bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 100 ml LB-agar (1% trypton, 0,5% gistextract, 0,25% NaCl, 1,5% agar in H 2 O) in 250 ml kolven. Steriliseren in autoclaaf en bewaar bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de agar wordt gesmolten voordat gieten in platen. OPMERKING: Flessen met 100 ml van LB agar platen 4 zal opleveren. De hoeveelheid LB agar kan worden aangepast om te corresponderen met het aantal platen nodig is voor de test. </li><li> Voeg PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16. Steriliseren in autoclaaf of filtratie en bewaar bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid het antibioticum voorraad oplossingen voor gentamicine, kanamycine, eend tobramycine. <ol><li> Bereid geschikt antibioticum voorraad concentraties voor P. aeruginosa stammen bevattende 100 mg / ml gentamicine, 30 mg / ml kanamycine en 10 mg / ml tobramycine. Los de antibiotica in water, filter steriliseren (0,2 urn) en bewaar bij 4 ° C. Verander de antibiotica en concentraties, afhankelijk van de onderzochte bacterie. </li></ol></li><li> Bereid de NTBC voorraad oplossingen. Los 10 mg NTBC in 400 ui DMSO. Dit levert een concentratie van 75,9 mM NTBC. Store NTBC voorraad oplossingen bij -20 ° C. Dooi oplossingen op kamertemperatuur indien nodig. LET OP: Verschillende bronnen van NTBC hebben verschillen in oplosbaarheid. Bepaal de juiste voertuig om de NTBC op basis van aanbevelingen van de fabrikant op te lossen en aan te passen stap 1.5 dienovereenkomstig. </li></ol> 2. NTBC Titraties bacteriestammen <ol><li> Opzetten overnacht kweken van de stammen te testen. Voeg 2 ml LB-bouillon bij 16 x 150 mm testbuiss (één per stam) en te enten met 1 geïsoleerde kolonie van elke stam. Incubeer overnacht bij 37 ° C onder beluchting op een weefselkweek rotator in een luchtincubator. </li><li> De volgende dag, voor te bereiden titraties van NTBC in LB bouillon. Gebruik een eerste bereik van 0 tot 900 uM NTBC omdat verschillende stammen verschillen in gevoeligheid voor NTBC. <ol><li> Voeg 1 ml LB-bouillon 4 tot 5 reageerbuizen (16 x 150 mm) per stam. </li><li> Voeg de NTBC voorraadoplossing (75,9 mM) aan de reageerbuizen (16 x 150 mm) bij een reeks concentraties. Zie tabel 1 voor NTBC concentraties en bijbehorende voorraadvolumes te voegen aan 1 ml LB-bouillon. </li></ol></li><li> Meet de OD 600 van de &#39;s nachts culturen. Was culturen alvorens OD 600 metingen op te heffen in de media pyomelanin. <ol><li> Was de culturen door centrifugeren 1 ml van de cultuur in een microcentrifuge bij 16.000 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant en eventuele losjes gepelleteerde cellen meteen micropipettor en resuspendeer de vaste cel pellet in 1 ml LB. </li></ol></li><li> Te enten titratie buizen bij OD 600 0,05. Bereken de hoeveelheid gewassen kweek nodig om de buizen te inoculeren. OPMERKING: Gebruik de gewassen culturen inentingen sinds pyomelanin mag niet aanwezig zijn. </li><li> Incubeer de buizen titratie gedurende ongeveer 24 uur bij 37 ° C onder beluchting met een weefselkweek rotator in een luchtincubator. </li><li> Fotograferen titratie buizen vergelijk pigment binnen en tussen stammen om de hoeveelheid NTBC vast te gebruiken voor microfoon en oxidatieve stress assays. Gebruik OD 600 metingen om de hoeveelheid pyomelanin bepalen celvrij kweeksupernatant en celdichtheid te bepalen. Opmerking: De OD 600 verhouding pyomelanin in kweeksupernatant van cellen kan worden berekend aan verschillen in pyomelanin productie na behandeling met NTBC kwantificeren. </li></ol> 3. Antibiotica Minimum Inhibitory concentratie (MIC) test in 96-well platen <ol><li> Opzetten overnacht kweken van de stammen te testen in LB met en zonder NTBC. NB: Dit protocol wordt beschreven met behulp van de vertegenwoordiger van 300 uM NTBC. Het passend NTBC te gebruiken wordt bepaald in stap 2.6. <ol><li> Voeg 300 pM NTBC tot 2 ml LB. Voeg een gelijk volume medium (DMSO) met 2 ml LB de niet NTBC toestand. </li><li> Met steriele tandenstokers, te enten buizen met een geïsoleerde kolonie van bacteriën. Zal er een cultuur met NTBC en één cultuur zonder NTBC voor elke stam zijn. Incubeer overnacht bij 37 ° C onder beluchting met een weefselkweek rotator in een luchtincubator. </li></ol></li><li> De volgende dag maken LB + NTBC en LB + DMSO meester oplossingen voor het opzetten van de MIC-test. Voeg NTBC bij een concentratie van 600 uM zoals dit wordt verdund tweevoudige bij entmateriaal wordt toegevoegd, hetgeen een eindconcentratie van 300 pM. <ol><li> Één antibi testenotic één stam, voeg 600 uM NTBC tot 2 ml LB en meng met de NTBC meester oplossing. Voeg een equivalent volume van het voertuig (DMSO) tot 2 ml LB en meng met de no NTBC meester oplossing. Met deze oplossingen voor het maken van antibiotische voorraadoplossingen en voor het opzetten van de verdunningsreeks in 96-wells platen. OPMERKING: De master oplossing formuleringen zullen extra oplossing om rekening te houden pipetteerfouten opleveren. De master oplossingen kan worden vergroot of verkleind zoals vereist afhankelijk van het aantal antibiotica en geteste stammen. </li></ol></li><li> Bereid het antibioticum oplossingen in de LB + NTBC of LB + DMSO meester oplossingen. Opmerking: De antibioticumconcentratie deze oplossingen moeten verdubbelen de uiteindelijke gewenste concentratie. Genoeg oplossing moet worden naar 100 pl over naar vier putjes in een 96-wells plaat. <ol><li> Bereid gentamicin +/- NTBC voorraad oplossing bij 64 ug / ml. Aan deze oplossing, voeg 0,288 gl gentamicine voorraad (100 mg / ml) tot 450pi LB + NTBC of LB + DMSO meester oplossing. OPMERKING: De maximale concentratie van gentamicine voor P. aeruginosa PAO1 is 32 ug / ml. </li><li> Maak de kanamycine +/- NTBC voorraad oplossing bij 256 ug / ml. Aan deze oplossing, voeg 3,84 ul van kanamycine voorraad (30 mg / ml) tot 450 pi LB + NTBC of LB + DMSO meester oplossingen. OPMERKING: De maximale concentratie van kanamycine voor P. aeruginosa PAO1 is 128 ug / ml. </li><li> Bereid tobramycine +/- NTBC stamoplossing 8 ug / ml. Aan deze oplossing, voeg 0,36 ul van tobramycine voorraad (10 mg / ml) tot 450 pi LB + NTBC of LB + DMSO meester oplossingen. NB: Voor P. aeruginosa PAO1, de maximale concentratie van tobramycine is 4 ug / ml. Opmerking: De antibiotica en concentraties kunnen worden aangepast voor de bacteriën te testen. </li></ol></li><li> Voeg 100 pi van elke 2x antibioticumoplossing vier wells in een 96-wells plaat. Plaats deze oplossingen in rij A. Voor example, gentamicine dient in A1 tot A4 geplaatst moeten kanamycine A5 worden geplaatst via A8 en A9 tobramycine dienen tot A12 worden geplaatst. Zie figuur 1A een schema van een 96-wells plaat ingesteld. OPMERKING: meerdere antibiotica kunnen worden getest in één plaat, maar slechts één stam moeten worden getest per plaat om de kans op kruisverontreiniging van andere stammen te elimineren. </li><li> Voeg 50 ul van de LB + NTBC of LB + DMSO stamoplossing rijen B tot H van de 96-well plaat. Zorg ervoor dat ene plaat is LB + NTBC en één plaat is LB + DMSO. Zie figuur 1A. <ol><li> Gebruik LB + NTBC voor de antibiotica in LB + NTBC. Gebruik LB + DMSO voor antibiotica in LB + DMSO. </li></ol></li><li> Met een micropipettor voeren tweevoudige seriële verdunningen van de antibiotica door de overdracht 50 ul van de oplossing van rij tot rij A B. Meng de oplossing, verandert de pipet tips, en breng 50 pl van de oplossing van rij B naar C. Herhaal voor rij de remaining rijen. Na verdunning van rij G, verwijderen 50 ul van de oplossing van die rij en teruggooi. Gebruik rij H als geen antibiotica controle voor de groei van bacteriën. Zie figuur 1B. OPMERKING: Elk goed in rijen A tot en met G bevat nu 50 ul van antibiotica in LB + NTBC of LB + DMSO bij 2X de uiteindelijke gewenste concentratie. Rij H bevat LB + NTBC of LB + DMSO zonder antibiotica. </li><li> Meet de OD 600 van de &#39;s nachts culturen. Was alle culturen alvorens OD 600 lezingen aan pyomelanin aanwezig in de media te elimineren. <ol><li> Was de culturen door centrifugeren 1 ml van de cultuur in een microcentrifuge bij 16.000 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant met een micropipettor en resuspendeer de celpellet in 1 ml LB. </li></ol></li><li> Verdun het &#39;s nachts culturen 2.75x10 5 CFU / ml in LB. OPMERKING: Stel dat een OD 600-eenheid is het equivalent van 1x10 9 CFU / ml voor P. aeruginosa. OD CFU / ml conversies worden different in andere bacteriën. </li><li> Voeg 50 ul van de verdunde bacteriecultuur op de juiste put. OPMERKING: culturen gekweekt in NTBC worden toegevoegd aan de putjes die NTBC en culturen gekweekt in DMSO worden toegevoegd aan de putjes met DMSO. Zie figuur 1B. <ol><li> Bacteriën toe te voegen aan drie putten voor elke stam en antibiotica concentratie. Voeg 50 ul van LB de vierde en om als controle voor bacteriële verontreiniging. Zie figuur 1B. </li><li> Gebruik een multi-channel micropipettor aan de putjes inoculeren. Zorg dat pipetpunten vlak bij de bodem van de wells bij het toevoegen inoculum om verontreiniging van aangrenzende wells te voorkomen. OPMERKING: bacteriecultuur toevoegen aan de putjes zal verdunnen het antibioticum en NTBC concentraties tweeledig. </li></ol></li><li> Bedek de 96-well platen met parafilm en incubeer ongeveer 24 uur bij 37 ° C. Incubeer 96 putjes statisch, in een lucht incubator. </li><li> Onderzoekende platen voor bacteriële groei in de putjes. De MIC is de laagste concentratie antibioticum waarbij geen bacteriegroei wordt waargenomen voor alle drie replicaten van elke stam. <ol><li> Visueel onderzoek van de plaat voor groei of gelezen met behulp van een plaat lezer ingesteld op OD600. </li></ol></li></ol> 4. Spot Plate Assay voor oxidatieve stress respons <ol><li> Opzetten overnacht kweken van de stammen te testen in LB met en zonder NTBC zoals beschreven in stap 3.1. </li><li> De volgende dag bereiden LB agarplaten met H 2 O 2 als oxidatieve stressor. Een reeks H 2 O 2 concentraties 0-1 mM is een goed uitgangspunt. <ol><li> Smelt de LB-agar kolven. Koel media tot ongeveer 50 ° C bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg H 2 O 2 direct aan het gekoelde medium naar de gewenste concentraties. Werveling flesjes te mengen. Zie tabel 2 voor de concentratie van H 2 O 2en volumes geconcentreerd H 2 O 2 toe te voegen. Deze waarden zijn gebaseerd op 100 ml van LB agar. </li><li> Giet platen onmiddellijk na het toevoegen van H 2 O 2 en vlam het oppervlak om luchtbellen te verwijderen. De opbrengst is 4 platen per 100 ml van LB agar. Markeer de platen met de H 2 O 2 concentratie. </li><li> Plaats de platen onbedekt in een biologisch stroomkap de ventilator lopen voor 30 minuten om overtollig vocht van de platen te verwijderen. OPMERKING: Gebruik de platen op dezelfde dag dat ze zijn voorbereid. Doet u dit niet kan resulteren in inconsistente gegevens. OPMERKING: oxidatieve stressoren zoals paraquat te vervangen H 2 O 2 in deze test. De gebruikte concentraties van andere oxidatieve stressoren kan anders zijn dan die voor H 2 O 2 zijn. </li></ol></li><li> Wassen en meten van de OD 600 van de overnachtcultures zoals beschreven in stap 3.7. </li><li> Normaliseren van de OD 600 van de nachtelijke cultures op de laagste waarde voor de set van stammen getest. P. aeruginosa heeft in het algemeen een OD600 van ongeveer 2,5 bij nacht gekweekt in LB + NTBC of LB + DMSO. <ol><li> Bepaal het kweekvolume nodig cultuur aan de laagste OD 600 verdund in een totaal volume van 1 ml. Bijvoorbeeld, als een cultuur heeft een OD 600 van 3 en de laagste OD 600 voor de verzameling van de stammen is 2,5, voert u de volgende berekening: (2.5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. 0,833 ml van de cultuur in een microfugebuis worden geplaatst. </li><li> Bereken de hoeveelheid LB + NTBC (300 uM) of LB + DMSO nodig cultuurvolume tot 1 ml te brengen. Bij het voorbeeld in stap 4.4.1, de hoeveelheid LB + NTBC of LB + DMSO toegevoegd aan de kweek zou 0,167 ml (1 ml totaal volume - 0,833 ml kweek). Maak voorraadoplossingen van LB + NTBC en LB + DMSO om voor deze verdunningen op basis van het volume nodig voor het verdunnen van alle stammen. </li><li> Meng de cultuur en LB + NTBC of LB + DMSO door vortexen. </li></ol></li><li> Culturen handhaven een constante concentratie van NTBC of DMSO, uitvoeren tienvoudige seriële verdunningen van de genormaliseerde overnachtcultures in PBS + NTBC of PBS + DMSO. <ol><li> Maak voorraad oplossingen van PBS + NTBC en PBS + DMSO. Voor een reeks verdunningen van een stam, meng 300 pM NTBC of een equivalent volume DMSO met PBS tot een totaal volume van 720 pl werd verkregen. Scale deze voorraden boven of naar beneden afhankelijk van het aantal stammen getest. </li><li> Label microcentrifuge buizen voor 10 -1 tot 10 -7 seriële verdunningen. Voeg 90 ul van PBS + NTBC of PBS + DMSO aan de geschikte buizen. Gebruik PBS + NTBC voor stammen gekweekt in LB + NTBC en gebruik PBS + DMSO voor stammen gekweekt in LB + DMSO. </li><li> Voeg 10 ul van cultuur aan de juiste 10 -1 verdunning buis. Meng door vortexen en breng 10 pl van de 10 -1 verdunning tot de 10 -2 verdunning buis. Herhaal dit totdat alle verdunningen perfo geweestrmed. Wijzigen pipet tips tussen verdunningen. </li></ol></li><li> Spot 5 pl van de 10 tot 10 -3 -7 verdunningen op LB + H 2 O 2 platen in duplo voor elke stam. Gebruik een pipet tip als plekken zijn bedekt van de meeste verdunde tot minst verdunde (10 -7 10 -3). Niet kantelen of kantelen van de plaat tot het vocht is opgedroogd in de plaat. </li><li> Incubeer de platen gedurende 24-48 uur bij 37 ° C (lucht incubator), afhankelijk van de stam. OPMERKING: P. aeruginosa PAO1 zal ruime kolonies op LB na 24 uur incubatie. Incubeer stammen tot ze kolonies ongeveer even groot als PAO1. </li><li> Fotografeer de platen met behulp van een CCD-camera boven een transluminator. Optioneel bewerken van de foto&#39;s voor het contrast en de gewassen op dezelfde grootte. Tel het aantal kolonies op elke plek op veranderingen in gevoeligheid voor oxidatieve stress te bepalen. </li></ol>

<ol><li>Rodriguez-Rojas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+hmgA++of+Pseudomonas+aeruginosa++to+pyomelanin+hyperproduction%2C+stress+resistance+and+increased+persistence+in+chronic+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection.</a> Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).</li>
<li>Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+cenocepacia++Produces+a+Pigment+with+Antioxidant+Properties+Using+a+Homogentisate+Intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate.</a> J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).</li>
<li>Schmaler-Ripcke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Pyomelanin%2C+a+Second+Type+of+Melanin%2C+via+the+Tyrosine+Degradation+Pathway+in+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).</li>
<li>Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+Function+of+Pyomelanin%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers+In+Tech%22%5BJournal%5D)">Properties and Function of Pyomelanin.</a> Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).</li>
<li>Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chemicals+to+melanins+re-examined%3A+adsorption+of+some+drugs+to+the+surface+of+melanin+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles.</a> Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).</li>
<li>Barza, M., Baum, J., Kane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+antibiotic+activity+in+vitro+by+synthetic+melanin%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin.</a> Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Melanin+on+Microbial+Virulence+and+Clinical+Resistance+to+Antimicrobial+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).</li>
<li>Arias-Barrau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Homogentisate+Pathway%3A+a+Central+Catabolic+Pathway+Involved+in+the+Degradation+of+L-Phenylalanine%2C+L-Tyrosine%2C+and+3-Hydroxyphenylacetate+in+Pseudomonas+putida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida.</a> J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).</li>
<li>Ernst, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+mosaicism+is+conserved+but+not+unique+in+Pseudomonas+aeruginosa++from+the+airways+of+young+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis.</a> Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).</li>
<li>Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+tyrosine+degradation+in+Vibrio+cholerae++The+strain+ATCC+14035+as+a+prokaryotic+melanogenic+model+of+homogentisate-releasing+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+B+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).</li>
<li>Hunter, R. C., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Putative+ABC+Transporter%2C+HatABCDE%2C+Is+among+Molecular+Determinants+of+Pyomelanin+Production+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).</li>
<li>Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NTBC+treatment+of+the+pyomelanogenic+Pseudomonas+aeruginosa++isolate+PA1111+inhibits+pigment+production+and+increases+sensitivity+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress.</a> Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).</li>
<li>Kavana, M., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+%284-Hydroxyphenyl%29pyruvate+Dioxygenase+with+the+Specific+Inhibitor+2-%5B2-Nitro-4-%28trifluoromethyl%29benzoyl%5D-1%2C3-cyclohexanedione%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione.</a> Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).</li>
<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+minimum+inhibitory+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Determination of minimum inhibitory concentrations.</a> J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).</li>
<li>Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+melanin-overproducing+transposon+mutants+of+Pseudomonas+putida+F6%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6.</a> FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Roy-Burman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+protein+secretion+is+associated+with+death+in+lower+respiratory+and+systemic+Pseudomonas+aeruginosa+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections.</a> J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).</li>
<li>Jacobs, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).</li>
<li>Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanogenesis+in+dermatophyte+species+in+vitro++during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection.</a> Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).</li>
<li>Khajo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+Melanized+Cryptococcus+neoformans+Lethal+Dose+Gamma+Irradiation+Involves+Changes+in+Melanin%27s+Chemical+Structure+and+Paramagnetism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism.</a> PLoS ONE. 6, e25092(2011).</li>
<li>Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from:
	 
 <a target="_blank" href="http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm">http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm</a> (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De NTBC-titratiemethode die in dit protocol wordt beschreven, stelt de gebruiker in staat om te bepalen of NTBC de productie van pyomelanine in bacteriën kan verminderen of elimineren, en om de vereiste concentratie NTBC te bepalen. De meest cruciale stap in de NTBC-titratietest is het bepalen van het bereik van NTBC-concentraties die in de test moeten worden gebruikt. Verschillende stammen van P. aeruginosa hebben verschillende gevoeligheden voor NTBC, en laboratoriumstammen kunnen gevoeliger zijn voor NTBC dan...

Pseudomonas aeruginosa is een Gram-negatieve bacterie die een verscheidenheid aan pigmenten produceert, waaronder pyomelanine, een roodbruin pigment dat bescherming biedt tegen oxidatieve stress1-4 en een verscheidenheid aan verbindingen bindt, inclusief aminoglycoside-antibiotica5-7. De productie van pyomelanine wordt veroorzaakt door een defect in de tyrosine-katabolismeroute4,8, hetzij door deleties of mutaties van het gen dat codeert voor homogentisine 1,2-dioxygenase (HmgA)1,9 of door onevenwichtigheden in de verschillende enzymen in de route10. Homogentisine hoopt zich op door inactivering van HmgA en wordt uitgescheiden en geoxideerd om pyomelanine te vormen11. De productie van pyomelanine kan worden afgeschaft of verminderd op een dosisafhankelijke manier door behandeling met het herbicide 2-[2-nitro-4-(trifluormethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexaandion (NTBC)12, dat 4-hydroxyfenylpyruvaatdioxygenase (Hpd) in de tyrosine-katabolismeroute remt13. Hpd is vereist voor de vorming van homogentisine en daarom pyomelanine11.
We beschrijven in detail drie technieken die belangrijk waren in onze studies van NTBC-behandeling van pyomelanine producerende stammen van P. aeruginosa. Deze technieken omvatten titratie van NTBC om de concentraties te bepalen die pyomelanineproductie in laboratorium- en klinische pyomelanine producerende stammen zullen afschaffen of verminderen, bepaling van de minimale remmingsconcentratie (MIC) van antibiotica wanneer bacteriën worden behandeld met NTBC en de resulterende gevoeligheid voor oxidatieve stress met NTBC-behandeling.
De titratietest die we ontwikkelden dient twee doelen. Ten eerste zal de test de gebruiker toestaan ​​om te bepalen of NTBC pyomelanineproductie in de bestudeerde bacterie kan afschaffen of verminderen en bij welke concentraties. Dit zal de gebruiker in staat stellen om de gevoeligheid voor NTBC te bepalen, aangezien verschillende bacteriestammen verschillende gevoeligheden voor deze verbinding kunnen hebben, zoals waargenomen in P. aeruginosa12. Ten tweede zal de NTBC-titratietest de gebruiker in staat stellen om de juiste concentratie NTBC te bepalen die in volgende assays moet worden gebruikt, zoals antibioticum-MIC en oxidatieve stressresponsassays, als het doel is om pyomelanineproductie af te schaffen of te verminderen en de effecten van pigmentreductie te bepalen.
De titratietest werkt omdat er een zichtbaar verschil in pyomelanineproductie te zien is in stammen behandeld met NTBC en de verschillen in pyomelanineproductie dosisafhankelijk zijn12. Bovendien kan deze techniek worden toegepast op het onderzoek van andere verbindingen die pigmentproductie in bacteriën kunnen elimineren of versterken.
Antibioticum-MIC's worden gebruikt om de gevoeligheid van bacteriën voor antibiotica te bepalen. Er zijn verschillende methoden om MIC's te bepalen, waaronder agarverdunningsplaten en bouillonverdunningen14. Bouillonverdunningen kunnen worden uitgevoerd in kleine reageerbuisjes of in een 96-wells microtiterplaat. De microtiterplaatmethode voor MIC-bepaling zoals hier beschreven, zal de gebruiker in staat stellen om een ​​breed scala aan antibiotica te testen met behulp van een minimum aan middelen. De test biedt reproduceerbaarheid evenals flexibiliteit in het aantal antibiotica en stammen dat met deze methode wordt getest. Bovendien, met de opname van NTBC in de test, kan de gebruiker bepalen of eliminatie of vermindering van pyomelanineproductie de gevoeligheid voor antibiotica bij pyomelanine-producerende bacteriën verandert.
De bacteriële reactie op oxidatieve stress kan op verschillende manieren worden getest. De meest gebruikelijke methoden die worden beschreven, zijn ofwel levensvatbare tellingen van bacteriën die gedurende een bepaalde tijd aan oxidatieve stress zijn blootgesteld1, ofwel oxidatieve stress schijfdiffusie-assays15. Deze methoden hebben de neiging om hoge concentraties oxidatieve stressoren te gebruiken om de effecten van oxidatieve stress bij bacteriën te onderzoeken en de resultaten kunnen behoorlijk variëren tussen biologische replica's. De levensvatbare tellingtest heeft ook de neiging om meer agarplaten te gebruiken dan de andere methoden. De spotplate-test die we beschrijven, gebruikt lage concentraties H2O2 en stelt de gebruiker in staat om de oxidatieve stressrespons van meerdere stammen te testen met behulp van een minimum aan platen. De test is ook consistent reproduceerbaar tussen technische en biologische replica's. Aangezien pyomelanine betrokken is bij resistentie tegen oxidatieve stress, stelt de opname van NTBC in de test de gebruiker in staat om de effecten van eliminatie van pyomelanineproductie op oxidatieve stressresistentie te bepalen.

<table><tbody><tr><td>2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0269-50mg</td><td>Ook wel nitisinone genoemd.&nbsp; Oplosbaar in DMSO.</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td>30 wt. % in H2O.&nbsp; Gestabiliseerd.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gold Bio</td><td>G-400-100</td><td>Oplosbaar in H2O.&nbsp; Filter steriliseren.</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Oplosbaar in H2O.&nbsp; Filter steriliseren.</td></tr><tr><td>Tobramycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>Oplosbaar in H2O.&nbsp; Filter steriliseren.</td></tr></tbody></table>

methoden te remmen bacteriële pyomelanin productie en bepaal de overeenkomstige stijging van de gevoeligheid voor oxidatieve stress

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanine is een extracellulair roodbruin pigment dat wordt geproduceerd door verschillende bacteriële en schimmelsoorten. Dit pigment is afgeleid van de tyrosine-katabolismeroute en draagt bij aan een verhoogde resistentie tegen oxidatieve stress. De productie van pyomelanine in Pseudomonas aeruginosa wordt op dosisafhankelijke wijze verminderd door behandeling met 2-[2-nitro-4-(trifluormethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexaandion (NTBC). We beschrijven een titratiemethode met behulp van meerdere concentraties van NTBC om de concentratie van het medicijn te bepalen die de pyomelanineproductie in bacteriën zal verminderen of afschaffen. De titratiemethode heeft een gemakkelijk kwantificeerbaar resultaat, een zichtbare vermindering van pigmentproductie met toenemende concentraties van het medicijn. We beschrijven ook een microtiterplaatmethode om de minimale remmingsconcentratie (MIC) van antibiotica in bacteriën te meten. Deze methode gebruikt een minimum aan middelen en kan eenvoudig worden opgeschaald om meerdere antibiotica in één microtiterplaat voor één bacteriestam te testen. De MIC-test kan worden aangepast om de effecten van niet-antibiotische verbindingen op bacteriële groei bij specifieke concentraties te testen. Ten slotte beschrijven we een methode voor het testen van bacteriële gevoeligheid voor oxidatieve stress door H2O2 in agarplaten op te nemen en meerdere verdunningen van bacteriën op de platen aan te brengen. Gevoeligheid voor oxidatieve stress wordt aangegeven door verminderingen in het aantal kolonies en de grootte voor de verschillende verdunningsreeksen op platen met H2O2 vergeleken met een controle zonder H2O2. De oxidatieve stress spot plate assay gebruikt een minimum aan middelen en lage concentraties van H2O2. Belangrijk is dat het ook een goede reproduceerbaarheid heeft. Deze spot plate assay zou kunnen worden aangepast om de gevoeligheid van bacteriën voor verschillende verbindingen te testen door de verbindingen in agarplaten op te nemen en de resulterende bacteriële groei te karakteriseren.

NTBC titraties De NTBC titraties werden gebruikt om te bepalen of NTBC kon pyomelanin productie te verminderen in P. aeruginosa, en ook de concentratie van NTBC elimineert of vermindert pyomelanin produktie voor extra assays identificeren. Er kunnen variaties in het niveau van pyomelanin geproduceerd in verschillende herhalingen, maar algemene trends constant blijft. De NTBC titratie assay kan ook worden aangepast om andere verbindingen die pigment productie in andere bacte...

Bacterieel pyomelanine-productie resulteert in verhoogde resistentie tegen oxidatieve stress en virulentie. We rapporteren over technieken die kunnen worden gebruikt om de remming van pyomelanine-productie te bepalen en de resulterende toename in gevoeligheid voor oxidatieve stress bij bacteriën te meten, evenals om de minimale remmingsconcentratie (MIC) van antibiotica te bepalen.

Methoden te remmen Bacteriële Pyomelanin Productie en Bepaal de overeenkomstige stijging van de gevoeligheid voor oxidatieve stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

De algemene doelen van de volgende experimenten zijn het bepalen van de effecten van NTBC op de productie van P melanin en de gevoeligheid voor oxidatieve stress, evenals de minimale inhiberende concentraties (MIC's) van antibiotica. Dit wordt bereikt door NTBC aan bacteriële culturen toe te voegen om in een tweede stap de concentratie te bepalen die de productie van p melanin vermindert. Bacteriële culturen worden behandeld met NTBC en antibiotica, waardoor de gebruiker kan bepalen of NTBC-behandeling een effect heeft op de antibiotica-MIC's.Na de bepaling van de MIC's worden de met NTPC behandelde culturen blootgesteld aan waterstofperoxide om de gevoeligheid voor oxidatieve stress vast te stellen. De resultaten van de NTPC-behandeling tonen aan dat de behandeling van genische bacteriën met NTPC leidt tot een vermindering van de pigmentproductie en een toename van de gevoeligheid voor oxidatieve stress, terwijl er geen effect is op de antibiotica-MIC's, respectievelijk gebaseerd op spotplates voor de respons op oxidatieve stress en microtiter-MIC-assays. Het belangrijkste voordeel van de spotplate-techniek voor oxidatieve stress ten opzichte van bestaande methoden, zoals kweekbar

methods-to-inhibit-bacterial-pyomelanin-production-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a spot plate assay tailored to assess the oxidative stress responses of bacterial strains. Some strains produce pyomelanin, an antioxidant pigment. Conversely, strains treated with a test agent, leading to reduced pyomelanin production, exhibit increased susceptibility to oxidative stress, resulting in decreased cell viability compared to pyomelanin-producing strains.

A Spot Plate Assay for Evaluating Oxidative Stress Responses in Bacterial Strains

This video demonstrates a microtiter plate-based method for determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of test antibiotics against bacteria. Upon adding a suspension of the bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa to a microtiter plate containing serial dilutions of a test antibiotic, and an inhibitor of the production of pyomelanin by the bacteria, the optical density of the wells is measured to compute the minimum inhibitory concentration of the antibiotic, and the impact of the...

A Microtiter Plate Method to Assess the Minimum Inhibitory Concentration of an Antibiotic

Dit manuscript beschrijft het gebruik van genetisch-gecodeerde fluorogenic verslaggevers in een toepassing voor live-cel imaging voor de behandeling van xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve stress. Deze experimentele aanpak biedt ongeëvenaarde Spatio resolutie, gevoeligheid en specificiteit terwijl het vermijden van veel van de tekortkomingen van conventionele methoden voor de detectie van toxicologische oxidatieve stress.

Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren

Het doel van dit protocol is spectrophotometrically trans-plasma membraan elektronentransport met behulp van extracellulaire elektronen acceptoren controleren en analyseren van enzymatische interacties die bij deze extracellulaire elektronen acceptoren optreden kunnen.

Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes

We beschrijven drie experimentele methoden voor de evaluatie van de activiteit van de verdikking van chemische stoffen in vitro: kwantificering van 1) cellulaire tyrosinase-activiteit en 2) melanine inhoud, en 3) meting van melanine door cellulaire melanine kleuring en beeld-analyse.

Kwantificering van hypopigmentatie activiteit In Vitro

Het doel van dit protocol is om voorbijgaande in vivo productie van niet-dodelijke niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de huid van muizen te induceren, waardoor fysiologische reacties in het weefsel verder worden bevorderd.

Stimulatie van stamcelniches en weefselregeneratie in muizenhuid door schakelbare protoporfyrine IX-afhankelijke fotogeneratie van reactieve zuurstofsoorten in situ

Dit protocol beschrijft de beoordeling van de subcellulaire compartimentspecifieke redox-status in de cel. Een redoxgevoelige fluorescerende sonde maakt een handige ratiometrische analyse in intacte cellen mogelijk.

Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten

We presenteren een protocol voor de ontwikkeling en het gebruik van een oxidatieve stress-model door retinale pigmentepitheelcellen te behandelen met H2O2, waarbij celmorfologie, levensvatbaarheid, dichtheid, glutathion en UCP-2-niveau worden geanalyseerd. Het is een nuttig model om het antioxiderende effect te onderzoeken van eiwitten die worden uitgescheiden door getransfecteerde cellen om neuroretinale degeneratie te behandelen.

Inductie en analyse van oxidatieve stress in doornroosje Transposon-getransfecteerde menselijke retinale pigmentepitheelcellen

Hier presenteren we een protocol om pathogene bacteriën te inactiveren met reactieve zuurstofsoorten geproduceerd tijdens fotolyse van flavine mononucleotide (FMN) onder blauwe en violette lichtbestraling van lage intensiteit. FMN-fotolyse is aangetoond als een eenvoudige en veilige methode voor sanitaire processen.

Inactivatie van pathogenen via zichtbaar-licht fotolyse van riboflavine-5′-fosfaat

Een gestandaardiseerd protocol voor het induceren van voortijdige veroudering in HNM met behulp van tBHP, gestandaardiseerde protocollen voor het analyseren van belangrijke senescentiemarkers, waaronder groeistop, SA-β-galactosidase-activiteit en SASP-factoren.

Een gestandaardiseerd protocol voor het induceren van door stress veroorzaakte voortijdige veroudering in primaire menselijke melanocyten met behulp van tert-butylhydroperoxide

Leer hoe NTBC de pyomelanineproductie in bacteriën remt en de gevoeligheid voor oxidatieve stress verhoogt. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van antimicrobiële resistentie.

Methoden te remmen Bacteriële Pyomelanin Productie en Bepaal de overeenkomstige stijging van de gevoeligheid voor oxidatieve stress (Video) | JoVE Journal

Methoden te remmen Bacteriële Pyomelanin Productie en Bepaal de overeenkomstige stijging van de gevoeligheid voor oxidatieve stress

Meer video's verkennen