Methoden te remmen Bacteriële Pyomelanin Productie en Bepaal de overeenkomstige stijging van de gevoeligheid voor oxidatieve stress

De algemene doelen van de volgende experimenten zijn het bepalen van de effecten van NTBC op de productie van P melanin en de gevoeligheid voor oxidatieve stress, evenals de minimale inhiberende concentraties (MIC's) van antibiotica. Dit wordt bereikt door NTBC aan bacteriële culturen toe te voegen om in een tweede stap de concentratie te bepalen die de productie van p melanin vermindert. Bacteriële culturen worden behandeld met NTBC en antibiotica, waardoor de gebruiker kan bepalen of NTBC-behandeling een effect heeft op de antibiotica-MIC's.

Na de bepaling van de MIC's worden de met NTPC behandelde culturen blootgesteld aan waterstofperoxide om de gevoeligheid voor oxidatieve stress vast te stellen. De resultaten van de NTPC-behandeling tonen aan dat de behandeling van genische bacteriën met NTPC leidt tot een vermindering van de pigmentproductie en een toename van de gevoeligheid voor oxidatieve stress, terwijl er geen effect is op de antibiotica-MIC's, respectievelijk gebaseerd op spotplates voor de respons op oxidatieve stress en microtiter-MIC-assays. Het belangrijkste voordeel van de spotplate-techniek voor oxidatieve stress ten opzichte van bestaande methoden, zoals kweekbare tellingen en schijfdiffusie-assays, is dat er lagere concentraties waterstofperoxide kunnen worden gebruikt in plaats van de hoge concentraties waterstofperoxide die in andere assays worden gehanteerd. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn aan onze methode voor het bepalen van antibiotica-MIC's problemen ondervinden omdat een gebrek aan precisie in de pipetteertechniek variabiliteit tussen replica's introduceert.

Deze variabiliteit kan het moeilijk maken om de antibiotica MIC nauwkeurig te bepalen. Bereid één dag vóór de MIC-assay culturen van de te testen stammen in LB met en zonder.

2,2-nitro-4-tri-ethylbensoyl-1,3-cyclohexanedion, of NTBC. Deze demonstratie maakt gebruik van een representatief niveau van 300 µM NTBC. De titratiemethode voor het bepalen van de juiste concentratie NTBC wordt beschreven in de protocoltekst; incubeer de culturen overnacht bij 37 °C met beluchting en ga de volgende dag verder.

Maak LB plus NTBC en LB plus DMSO-stamoplossingen voor de MIC-assay om één antibioticum voor één stam te testen; voeg 600 µM NTBC toe aan 2 mL LB en meng dit. Om de NTBC-stamoplossing te maken, wordt NTBC toegevoegd in een concentratie van 600 µM, aangezien deze tweevoudig zal worden verdund wanneer het inoculum wordt toegevoegd.

Voeg voor een eindconcentratie van 300 micromolair een gelijk volume van het vehikel DMSO toe aan twee milliliter LB en meng dit om de NO NTBC-stamoplossing te maken. Deze twee stamoplossingen worden gebruikt voor het maken van antibioticumvoorraadoplossingen en voor het opzetten van de verdunningsreeks in 96-wells platen. Bereid vervolgens de antibioticumoplossingen in de LB plus NTBC- of LB plus DMSO-stamoplossingen.

Bereid de Gentamycine plus of minus NTBC-stamoplossing in een concentratie van 64 µg/ml. Maak de KANAMYCINE plus of minus NTBC-stamoplossing in een concentratie van 256 µg/ml. Bereid de tobramycine plus of minus NTB-stamoplossing in een concentratie van 8 µg/ml.

Nadat de tweevoudige antibioticumoplossingen zijn bereid, worden 100 µL van elke antibioticumoplossing in vier putjes in rij A van een 96-wellplaat aangebracht. Zo dient gentamycine in put 1 tot en met 4 te worden geplaatst, kanamycine in 5 tot en met 8, en tobramycine in 9 tot en met 12. Voeg 50 µL van de LB plus NTBC- of LB plus DMSO-masteroplossing toe aan de rijen B tot en met H van de 96-wellplaat; zorg ervoor dat één plaat LB plus NTBC bevat en één plaat LB plus DMSO. Voer met een micropipet tweevoudige seriële verdunningen van de antibiotica uit door 50 µL van de oplossing van rij A naar rij B over te brengen. Meng de oplossing, vervang de pipetpunten en breng 50 µL van de oplossing van rij B naar rij C over. Herhaal dit voor de resterende rijen na het verdunnen van rij G. Verwijder 50 µL van de oplossing uit die rij en gooi deze weg.

Gebruik rij H als controle zonder antibioticum voor bacteriële groei. Haal de overnight-culturen op nadat alle culturen zijn gewassen om lanine in het medium te elimineren. Meet de OD 600 van de culturen en verdun de overnight-culturen in lb met behulp van een meerkanaals micropipet.

Voeg 50 µL van de verdunde bacteriële cultuur toe aan de betreffende putjes. Voeg bacteriën toe aan drie putjes voor elke stam en antibioticaconcentratie. Voeg 50 µL LB toe aan het vierde putje om als controle voor bacteriële contaminatie te dienen.

Dek de 96-wellplaten af met Parafilm en incubeer deze de volgende dag gedurende ongeveer 24 uur bij 37 graden Celsius. Inspecteer de platen visueel op bacteriële groei in de wells. De MIC is de laagste antibioticaconcentratie waarbij voor alle drie de replica's van elke stam geen bacteriële groei wordt waargenomen.

Om deze procedure te starten, worden overnight-culturen opgesteld van de te testen stammen in LB, met en zonder NTBC, zoals eerder beschreven voor de volgende dag. Bereid LB APL's voor die waterstofperoxide bevatten als oxidatieve stressfactor. Smelt eerst de LB agro-kolven en koel het medium op kamertemperatuur af tot ongeveer 50 °C.

Voeg vervolgens waterstofperoxide in de gewenste concentraties direct toe aan het gekoelde medium. Draai met de fles om een reeks waterstofperoxideconcentraties van nul tot één te mengen. Millimolair is een goed startpunt.

Giet de platen onmiddellijk uit en vlam het oppervlak om bellen te verwijderen. De opbrengst is vier platen per 100 milliliters LB-agar. Markeer de platen met de waterstofperoxideconcentratie.

Plaats de platen onafgedekt in een biologische laminaire flowkast met de ventilator aan gedurende 30 minuten om overtollig vocht uit de platen te verwijderen. De platen moeten op dezelfde dag worden gebruikt. Terwijl de platen drogen, worden de was- en meetstappen voorbereid.

De OD 600 van de overnight-culturen wordt genormaliseerd naar de laagste OD 600-waarde van de set geteste stammen. Bepaal hiervoor het volume cultuur dat nodig is om de cultuur te verdunnen tot de laagste OD 600 in een totaalvolume van één milliliter. Als een cultuur bijvoorbeeld een OD 600 van 3 heeft en de laagste OD 600 voor de set stammen 2,5 is, voer dan de volgende berekening uit, wat resulteert in 0,833 milliliter als het benodigde cultuurvolume; breng vervolgens 0,833 milliliter van de cultuur over in een microcentrifugeebuis.

Bereken vervolgens de hoeveelheid LB plus NTBC of LB plus DMSO die nodig is om het cultuurvolume aan te vullen tot één milliliter. In dit voorbeeld zou de hoeveelheid 0,167 milliliter zijn; meng dit door te vortexen om de culturen op een constante concentratie NTBC of DMSO te houden. Voer een tienvoudige seriële verdunning uit van de genormaliseerde overnight-culturen in PBS plus NTBC of PBS plus DMSO. Maak stockoplossingen van PBS plus NTBC en PBS plus DMSO, waarbij de hoeveelheid wordt opgeschaald of afgeschaald afhankelijk van hoeveel stammen er worden getest. Meng voor één set verdunningen voor één stam 300 micromol NTBC of een equivalent volume DMSO met PBS tot een totaal volume van 720 microliters. Voeg 90 microliters PBS plus NTBC of PBS plus DMSO toe aan de juiste microcentrifugeebuisjes, gelabeld voor de seriële verdunning van 10⁻¹ tot 10⁻⁷.

Voeg 10 µL cultuur toe aan de overeenkomstige 10⁻¹ verdunningsbuis, meng door te vortexen en breng 10 µL van de 10⁻¹ verdunning over naar de 10⁻² verdunningsbuis. Vervang de pipetpunten tussen de verdunningen en herhaal dit proces tot alle verdunningen zijn uitgevoerd. Spot vijf µL van de 10⁻³ tot 10⁻⁷ verdunningen in dubbeltoestanden op LV + waterstofperoxide platen.

Gebruik voor elke stam één pipetpunt. Als de stippen van meest verdund naar minst verdund worden geplaatst, mag de plaat niet gekanteld of geschuifd worden totdat de vloeistof in de plaat is opgedroogd. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 24 tot 48 uur, afhankelijk van de stam.

Zodra er kolonies van voldoende grootte zijn verschenen, worden de platen gefotografeerd met een CCD-camera boven een transluminator. NTBC-titraties werden gebruikt om vast te stellen of NTBC in staat was de productie van p-melanine in p-aerogen te verminderen en om de concentratie NTBC te bepalen die de productie van p-melanine elimineert of reduceert voor gebruik in aanvullende assays, zoals hier wordt getoond. NTBC verminderde de productie van PY-melanine op een dosisafhankelijke wijze bij producenten van p-melanine, maar had geen effect op de pigmentproductie in stammen die geen p-melanine produceren.

Deze tabel toont de resultaten van de MIC-assay voor verschillende P. aerogen stammen, behandeld met en zonder NTBC en diverse antibiotica; de MIC's werden genoteerd als de laagste antibioticaconcentratie die de bacteriële groei remde. De NTBC-behandeling had geen effect op de antibioticum-MIC's voor de geteste stammen. Een spot plate assay voor de oxidatieve stressrespons werd uitgevoerd op P. aerogen melanine-producerende en niet-melanine-producerende stammen, behandeld met en zonder NTBC.

De plaat met nul millimol waterstofperoxide toonde aan dat alle stammen correct waren verdund en er werd een toegenomen gevoeligheid voor oxidatieve stress waargenomen wanneer PIO-melanine-producerende bacteriën werden behandeld met NTBC; stammen die geen PIO-melanine produceren waren gevoeliger voor oxidatieve stress dan stammen die p-melanine produceren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe de effecten van NTBC-behandeling op de PIO-melanineproductie kunnen worden bepaald door de gevoeligheid voor oxidatieve stress en antibiotica-MIC's te testen.