Name: Cryosectioning Methode voor Microdissection van Murine colonslijmvlies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Leer een cryosectioning-methode voor microdissectie van murine colonslijmvlies om cryptbasis- en oppervlakte-epitheelcellen te isoleren. Deze snelle, goedkope techniek levert hoogwaardige monsters voor gen- en eiwitexpressieanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door National Institutes of Health (DK55679 en DK59888 aan A.N.). Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core van het Winship Cancer Institute omvattende kankercentrumsubsidie, P30CA138292, en de Crohn's and Colitis Foundation of America Carrièreontwikkelingsprijs aan C.T.C. en Fellowship Award aan A.E.F.

Experimenten gebruikte C57BL / 6-muizen tussen 10 en 12 weken oud. Alle procedures met dieren werden beoordeeld en door de Emory University Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd en werden uitgevoerd volgens de National Institutes of Health criteria. 1. Experimentele Setup <ol><li> Stel de cryostaat <ol><li> Equilibreren cryostaat tot -20 ° C, waaronder het microtoom blad en chucks (zeer voorzichtig rond het mes!). </li><li> Vul een lege cryomold met oktober (optimale snijtemperatuur compound) en equilibreren tot -20 ° C (~ 30 min). Verwijder de bevroren oktober uit de mal en plaats deze op de boorkop met vloeibare oktober Plaats het blok / boorkop in de microtoom arm en laat de oktober gedurende 10 min in te stellen. </li><li> Stel de cryostaat tot 10 micrometer per sectie en scheren de oktober blok totdat het plat. Terug de microtome arm weg van het blad door enkele centimeters. Op dit moment niet het mes of boorkop voor de rest van de exper passenrimentele. </li></ol></li><li> Bereid de scheermesjes: Bereid 2 scheermesjes per monster. Met behulp van een metalen bestand, doffe de sharped rand van de messen. Verwijder vervolgens de aluminium flens met een tang. </li><li> Pre-chill een Pyrex gerecht of een ander plat oppervlak op droog ijs. </li><li> Bereid een dissectie schotel met 10-15 dissectie pinnen. Een 10 cm weefselkweekplaat 50% gevuld met silicone worden volstaan. Voeg 5 ml Hanks buffer bij kamertemperatuur. </li></ol> 2. Dissectie van distale Colonic Tissue <ol><li> Plaats muizen in een afgesloten kamer en euthanaseren muizen door isofluraan inademing en cervicale dislocatie, spuit dan 70% ethanol op de buik en thorax 12. </li><li> Voeg een kleine insnijding in de huid van het abdomen met een schaar en een insnijding aan de peritoneale holte bloot te leggen. Vergelijkbare procedures kunnen worden gevonden hier 12 beschreven. </li><li> Snijd de dikke darm op de anus en plagen elkaar het mesenterium tot de dikke darm is gratis. </li><li> Uitsnijden een distaal colonsegment tussen 0 en 6 cm vanaf de anus. Hier is de crypte diepte ~ 150 urn (zie Figuur 1B). Opengesneden de dikke darm in de lengte met een schaar en verwijder de fecale inhoud. </li><li> Pin het weefsel aan de dissectie schaal met het mucosale oppervlak naar boven. Rek het weefsel via dissectie pinnen op een silicium schotel in Hanks buffer en laat even 10 minuten bij kamertemperatuur (Figuur 1C). Dit verwijdert plooien van het weefsel en kan de spierlagen te ontspannen. </li></ol> 3. Mount Tissue op de cryostaat voor Snijden <ol><li> Schuif een scheermesje onder het gewenste deel van het weefsel en giet de Hanks buffer. Voeg een scheermesje naar de top, het maken van een sandwich. Snijd het weefsel segment en verwijder de pinnen. Breng de scheermesje / weefsel sandwich droog ijs. Laat het weefsel te bevriezen (5-10 min, figuur 1D). </li><li> Pick up the razor / weefsel sandwich en laat het licht opwarmen door het plaatsen van een vinger op de top blade (mucosale kant naar boven. Dit oriënteert het weefsel, zodat de basale spierlagen eerst worden doorgesneden.). Scheid de sandwich en snijd de randen van het weefsel segment. Snijd een tissue segment van ongeveer 0,5 cm x 1 cm. Randgebieden hebben de neiging te krullen, waardoor de seriële secties verschillende weefsellagen bevatten. Merk op dat over-snijden is beter dan onder-snijden, zodat het zekere voor het onzekere. </li><li> Laat het weefsel tot het ijs bovenop het weefsel begint te smelten verwarmen. Op dit punt snel en zorgvuldig op het weefsel in het LGO-blok in de cryostaat. </li><li> Verwijder het mes door een vinger over het monster. De warmte-overdracht zal u toelaten om het mes te verwijderen zonder verstoring van het weefsel. </li><li> Coat het weefsel met oktober en evenwicht voor 5 min. Knip secties 10 urn (figuur 1E, F). Inspecteer de secties tot de crypten worden gezien. Plaats gedeelten in een 1,5 ml buizen of op objectglaasjes. </li><li> Voor de analyse van mRNA of eiwit, plaats thij monsters in buizen met 5 crypte-base, 5 overgangs- en 5 oppervlak secties per buis. Voor RNA verzameling voeg 1 ml commercieel isolatie reagens en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Voer RNA zuivering volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik 5-10 ug totaal RNA voor cDNA generatie. </li><li> Voor eiwitzuivering, voeg 0,5 ml RIPA koude lysisbuffer (plus proteaseremmers) per 5 secties. Ultrasone trillingen 3 keer met een 70% cyclus op ijs. <ol><li> Samples Naar SDS-PAGE laadbuffer (Laemmli buffer) en geïncubeerd bij 100 ° C gedurende 10 min. Onder monsters aan SDS PAGE en overdracht, blokkeren vervolgens in 5% melk / PBS gedurende 2 uur. Voer western blot-analyse gevolgd door incubatie met KLF4 antilichamen (1: 500) O / N bij 4 ° C. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal development and differentiation.</a> Exp Cell Res. 317, 2702-2710 (2011).</li>
<li>Humphries, A., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+crypt+organization+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Colonic crypt organization and tumorigenesis.</a> Nat Rev Cancer. 8, 415-424 (2008).</li>
<li>Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%3A+is+it+really+just+another+break+in+the+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease: is it really just another break in the wall.</a> Gut. 56, 6-8 (2007).</li>
<li>Bjerknes, M., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+isolation+of+intact+epithelium+from+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine.</a> Anat Rec. 199, 565-574 (1981).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Rand, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+depletion+dissociates+and+activates+heterodimeric+notch+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric notch receptors.</a> Mol Cell Biol. 20, 1825-1835 (2000).</li>
<li>Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+by+Transmission+of+Mechanical+Stress+through+Epithelial+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues.</a> Cancer Microenviron. 5, 29-38 (2012).</li>
<li>Lechner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+pattern+of+laser+microdissected+colonic+crypts+of+adenomas+with+low+grade+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gene expression pattern of laser microdissected colonic crypts of adenomas with low grade dysplasia.</a> Gut. 52, 1148-1153 (2003).</li>
<li>Reizel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+stem+cell+and+crypt+dynamics+exposed+by+cell+lineage+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Colon stem cell and crypt dynamics exposed by cell lineage reconstruction.</a> PLoS Genet. 7, e1002192(2011).</li>
<li>Kosinski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+patterns+of+human+colon+tops+and+basal+crypts+and+BMP+antagonists+as+intestinal+stem+cell+niche+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15418-15423 (2007).</li>
<li>Tamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pit+pattern+and+three-dimensional+configuration+of+isolated+crypts+from+the+patients+with+colorectal+neoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Pit pattern and three-dimensional configuration of isolated crypts from the patients with colorectal neoplasm.</a> J Gastroenterol. 37, 798-806 (2002).</li>
<li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+dendritic+cells+and+macrophages+from+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e4040(2012).</li>
<li>Laukoetter, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAM-A+regulates+permeability+and+inflammation+in+the+intestine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo.</a> J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).</li>
<li>Neumann, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+commensal+bacteria+and+regional+Wnt+gene+expression+in+the+proximal+versus+distal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Gut commensal bacteria and regional Wnt gene expression in the proximal versus distal colon.</a> Am J Pathol. 184, 592-599 (2014).</li>
<li>Capaldo, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokine-induced+tight+junction+remodeling+through+dynamic+self-assembly+of+claudins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokine-induced tight junction remodeling through dynamic self-assembly of claudins.</a> Mol Biol Cell. 25, 2710-2719 (2014).</li>
<li>Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+an+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make an intestine.</a> Development. 141, 752-760 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

De moleculaire mechanismen dikke epitheelcel proliferatie en differentiatie slecht begrepen. Dit omvat hiaten in ons begrip van de cellulaire signalering omgeving van het stamcelcompartiment aan de onderkant van de colon epitheliale crypten. Er is ook een toenemende belangstelling voor de processen die enterocyt differentiatie ten grondslag liggen. Bijvoorbeeld, beter begrip van in vivo differentiatie nodig is als een benchmark voor studies gericht op de productie van in vitro primaire intestinale systemen 16. De bovenstaande procedure bevat een aantal stappen die extra aandacht nodig hebben. Ten eerste, het verwijderen van de randen rond het bevroren weefsel segment (zoals besproken in paragraaf 3.2) is vereist als het weefsel randen krullen tijdens dissectie en invriezen. Het niet deze randen resultaat bewegen een gemengde populatie van oppervlakte- en crypte base cellen. Montage van het weefsel op een pre-gekoelde, genivelleerd oktober blok is ook essentieel. TZijn protocol kan naar andere delen van het distale colon worden aangepast door het veranderen van het aantal secties in elke pool. Bijvoorbeeld, zoals getoond in figuur 1B, mucosale crypte lengte varieert tussen 150-300 pm. Daarom, bij het bestuderen van het gebied tussen 4 cm-6 cm van de anus, het aantal onderdelen moet worden verhoogd van 15 tot 30. Belangrijk is dat dit protocol niet aanbevolen aan het proximale colon (7 cm-9 cm) als gevolg van vouwen ( plicae obliquae) die zich uitstrekken in het lumen waardoor het onmogelijk aparte ondergrond en crypte-base cellen door seriële snijden. Seriële coupes technieken gebruikt om crypt-base bestuderen en oppervlakte epitheliale celpopulaties bij de mens. Echter, ons protocol voegt extra stappen die vereist zijn vanwege de kleine omvang van murine weefsel. Wij stellen voor dat de bovenstaande protocol zal zorgen voor het onderzoek van de crypte-base en oppervlak epitheliale cel populatie in genetisch handelbaar muis systemen. Inderdaad, samengevoegd secties Yield hoogwaardige eiwitten en RNA geschikte downstream-analyse. Toekomstige toepassingen kan de studie van de cel signaalroutes of chromatine immunoprecipitatie bevatten. Er moet echter worden opgemerkt dat, evenals een aantal van de alternatieve werkwijzen die hierboven zijn beschreven, het resulterende hoofdstukken wordt een mengsel van epitheel- en interstitiële lamina propria cellen. Concluderend, de hier beschreven protocol verschaft een snelle, hoge opbrengst voor de analyse van moleculaire processen in ruimtelijk afzonderlijke gebieden van het murine colon mucosa.

De colon epitheel is een sterk regeneratief weefsel, met ingezeten stamcellen aanvullen van het weefsel om de paar dagen 1. Dit proces van regeneratie vereist het handhaven van een proliferatieve stamcelcompartiment. Na verloop van tijd, de nieuw geproduceerde dochtercellen verliezen hun proliferatieve potentie en migreren naar het luminale oppervlak van de darmen. Samenvalt met de migratie, stamcellen differentiëren in mature-barrière vormen enterocyten of slijm produceren slijmbekercellen. Niet van differentiëring programma wordt verondersteld bij te dragen aan epitheliale barrière gecompromitteerd zoals wordt waargenomen bij inflammatoire darmziekten en darmkanker 2,3. Studie van de bovenstaande werkwijzen zal methoden voor het isoleren crypt-base en oppervlak celpopulaties vereisen. Meerdere methoden bestaan, elk met unieke voordelen en nadelen. Huidige werkwijzen voor het isoleren van darmepitheelcellen omvatten chelating middelen en mechanische dissociatie, resulterend in de isolatie van hele crypten, epitheelvellen of enkele cellen, afhankelijk van experimentele omstandigheden 4,5. Dit zijn hoge opbrengst methoden, nog veranderingen in intercellulaire signalering gerapporteerd onder deze omstandigheden die niet de eigen omgeving 6,7 kunnen vertegenwoordigen. Lasermicrodissectie zorgt voor de verzameling ruimtelijke verschillende materiaal, maar behaalt laag moleculair opbrengst 8,9. In humaan dikke darmweefsel, zijn periodieke horizontale cryosectioning werkwijzen ontwikkeld 10. Echter, muizen slijmvliezen zijn onbetaalbaar klein voor directe bestemming van deze techniek. Bij mensen intestinale crypte lengte (de afstand tussen de crypte-base en huidcellen) in de dikke darm varieert tussen 100-1000 pm ~ 11. In muizen, crypt lengten tussen ~ 50-300 micrometer (zie figuur 1A). De geringe omvang van muizen crypten vormt een uitdaging voor de isolatie van deze twee celpopulaties met behulp van bestaande protocollen. We beschrijven nu een goedkope, hoge opbrengst methode voor het isoleren van crypte-base en oppervlakte epitheliale celpopulatie in muriene darmweefsel. Weefsel geoogst op deze wijze kunnen dan worden geanalyseerd door een aantal standaard downstreamtoepassingen, zoals immunofluorescentie kleuring, RT-PCR (Real Time-Polymerase Chain Reaction) of western blotting.

<table><tbody><tr><td>Microtoom</td><td>Leica Biosystems, Nussloch Germany</td><td>CM 1510-3</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ real time PCR detector</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 510&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Confocale microscoop</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>cryo-mold</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4557</td><td>25mmx20mmx5mm</td></tr><tr><td>Microtoomblad met hoog profiel</td><td>Leica Biosystems, Nussloch Duitsland</td><td>818</td><td></td></tr><tr><td>GEM industriële messen</td><td>American Safety Razor Blades</td><td>62-0314</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard siliconen elastomeer basis</td><td>Dow Corning, Midland MI</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>27 1/2 g naald</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>305109</td><td>pinnen voor dissectie</td></tr><tr><td>TRizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Antilichaam ZO-1</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>187430</td><td></td></tr><tr><td>Antilichaam KLF4</td><td>Cell Signaling</td><td>4038S</td><td></td></tr><tr><td>Antilichaam mGAPDH</td><td>Sigma</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Antilichaam secundair Alexa-conjugaat</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>488 anti-konijn</td></tr><tr><td>Antilichaam secundair HRP-conjugaat</td><td>Jackson</td><td>111/115-001-003</td><td>konijn/muis&nbsp;</td></tr><tr><td>Topro-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>HANKs gebalanceerde zoutbuffer</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>RIPA lysis buffer</td><td></td><td></td><td>50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate</td></tr><tr><td>primer TBP 3'</td><td></td><td></td><td>GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA</td></tr><tr><td>primer TBP 5'</td><td></td><td></td><td>GATGACTGCAGCAAATCGCTT</td></tr><tr><td>primer KLF4 3'</td><td></td><td></td><td>TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA</td></tr><tr><td>primer KLF4 5'</td><td></td><td></td><td>ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT</td></tr></tbody></table>

cryosectioning methode voor microdissection van murine colonslijmvlies

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Het colonic mucosale weefsel biedt een vitale barrière voor luminale antigenen. Deze barrière bestaat uit een monolaag van eenvoudige kolomvoriale epitheliale cellen. Het colonic epitheel wordt dynamisch vernieuwd en epitheliale cellen worden gegenereerd in de stamcelbevattende crypts van Lieberkühn. Voorlopercellen, geproduceerd in de crypt-basen, migreren naar het luminale oppervlak, waarbij ze een proces van cellulaire differentiatie ondergaan voordat ze in het darmlumen worden afgestoten. Om deze processen op moleculair niveau te bestuderen, hebben we een eenvoudige methode ontwikkeld voor de microdissectie van twee ruimtelijk verschillende regio's van het colonic mucosa; de proliferatieve crypt-zone en de gedifferentieerde oppervlakte-epitheliale cellen. Ons doel is om specifieke crypt- en oppervlakte-epitheliale celpopulaties van muis colonic mucosa te isoleren voor de isolatie van RNA en eiwit.

Colon weefsel secties werden verwerkt voor histologische beoordeling en H &amp; E kleuring 13. Een traditioneel dwarsdoorsnede aanzicht van het slijmvlies wordt gezien in figuur 2A. Basale gebieden bevatten de muscularis externa, bestaat voornamelijk van de circulaire muscularis. Uitgaande naar het lumen, de muscularis mucosa blijkt naast de crypte-base epitheelcellen, overgangscellen in het midden van het weefsel, en tenslotte oppervlak celpopulaties staan ​​de darmlumen. De seriële snijden hier beschreven methode houdt een zodanige oriëntatie dat de longitudinale en circulaire muscularis eerst worden aangetroffen (figuur 2B), gevolgd door de muscularis mucosa (figuur 2C). Let op het uiterlijk van de niet-spier interstitiële cellen in de linkerbovenhoek van de afbeelding. Voor de hieronder beschreven downstream analyse worden spieren gedeelten verwijderd. De volgende paragrafen bevatten epitheliale cellen en bindweefsel (lamina propria), Uitgaande van de crypte-base cellen (Figuur 2D). Let op de afwezigheid van een centraal lumen in de meeste van de crypten, die donkerder vanwege de dicht gepakte kernen. Deze lagen bevatten het proliferatieve compartiment. De overgangsregeling cellen lijken zo dicht opeengepakte klieren met prominente centrale lumen (figuur 2E). Tenslotte oppervlak celpopulaties een onregelmatige structuur met gebieden van de epitheliale monolaag bekeken en vlak (figuur 2F). Seriële secties zoals hierboven beschreven kunnen ook worden verwerkt voor immunofluorescentie labeling en confocale microscopie (zoals hier beschreven 14). Figuur 2G toont geïsoleerd crypten gefixeerd en permeabel gemaakt in 100% methanol en daarna gekleurd voor kernen (blauw) en de cel-cel junction eiwit Zonula occludens 1 (ZO-1, groen). In de traditionele snijden oriëntatie, kunnen crypte en het oppervlak cel tegelijkertijd bekeken worden (figuur 2G </strong&gt;). Merk op dat de ZO-1 junctionele vlek lijnen het lumen van de colon crypte. Deze Z0-1 bekleding van het lumen kan ook worden gezien in serie coupes monsters van transitional celpopulaties, in het midden van de cirkelvormige klieren (figuur 2G). Enhanced ZO-1 kleuring wordt gezien in oppervlakte celpopulaties (figuur 2I en J). Verschillende differentiatiefactoren is bekend dat expressie in een tijdruimtelijke wijze langs de crypte-grond as. Dit omvat de transcriptiefactor Krüppel-achtige factor 4 (KLF4), waarvan bekend is verrijkt in oppervlakte celpopulaties. Gewone snijden werkwijzen wordt KLF4 gevonden in de kernen van de holte gericht oppervlak celpopulaties (Figuur 2K). We speculeerden ook dat KLF4 mRNA voornamelijk zou worden uitgedrukt in het oppervlak cel populaties. Om dit te testen, werden seriële secties verzameld en gegroepeerd in oppervlaktewater, overgangs- en crypte-base monsters. Subsequently, RNA werd geoogst onder toepassing van standaard Trizol extractie, een extra zuivering door RNeasy kolom en DNAse behandeling. RNA werd uit 5 samengevoegd opeenvolgende secties, die opleverde tussen 5-10 ug totaal RNA per monster. Deze monsters werden daarna onderworpen aan semi-kwantitatieve real time PCR voor zowel KLF4 en een referentie-gen, TATA box bindend eiwit 1 (TBP-1) (Figuur 2L) 14. Zoals getoond in figuur 2L, in normaal op TBP-1, huidcellen bleken te drukken tot 8 maal de KLF4 mRNA dat tot expressie in cryptcellen. Ook werden KLF4 eiwit niveaus gevonden ruimtelijke regelgeving langs de crypte-oppervlak as vertonen. Seriële secties werden verzameld zoals hierboven beschreven en vervolgens geïncubeerd in lysisbuffer gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Dit leverde tussen 200-250 ug eiwit per monster. Monsters werden vervolgens onderworpen analyse met SDS-PAGE (Figuur 2M) 15. Zoals getoond in figuur 2M, KLF4 pProtein niveaus zijn dramatisch hoger in oppervlak celpopulaties. Bovenstaande resultaten tonen het vermogen van dit protocol om grote hoeveelheden oppervlak crypte epitheelcellen isoleren van de murine colon mucosa. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig1.jpg" /> Figuur 1: (A) schematische weergave van murine colon mucosa en uitwendige spierlagen. Onze methode is gericht op discrete oppervlak cel en crypte-base celpopulaties verzamelen door serial cryosectioning (10 urn elk). De uitwendige spierlagen worden verwijderd. (B) Crypt hoogte varieert over de lengte van het colon (afstand tussen de crypte-base en oppervlaktelagen). Gegevenspunten geven individuele crypte metingen en symbolen biologische repliceert (n = 4). (C) Colon segmenten verzameld, doorsneden en gespeld op een silicium ontleden schotel. (D) een tissue segment ongeveer 3 cm van de anus wordt geperst tussen twee scheermesjes en bevroren op droog ijs. (E) Weefsel wordt daarna aangebracht op een vooraf verdiepingen oktober block. (F) Weefsel secties verwijderd en visueel geïnspecteerd. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig2.jpg" /> Figuur 2:. Representatieve gegevens (A) darmweefsel gekleurd met hematoxyline-eosine in doorsnede toont de cirkelvormige muscularis (cm), de muscularis mucosa (mm), crypt-base cellen overgangscellen en huidcellen. (B - C) colon spieren lagen. (D) Crypt-base cellen. Let op de afwezigheid van een centraal lumen. (E) Transitional cellen. (F) Oppervlakte cellen. (G) Immunofluorescentiekleuring van geïsoleerde colon crypten. ZO-1 (groen) en kernen (blauw) worden waargenomen in doorsnede. (HOI) ZO-1 en de nucleaire kleuring in overgangs- en huidcellen. (J) vergrote weergave van ZO-1 kleuring. (K) KLF4 (groen) is verrijkt in oppervlakte celpopulaties. (L) real-time PCR beoordeling van KLF4 mRNA niveaus tussen de drie compartimenten. (M) Western blot analyse van KLF4 eiwitniveaus in deze celpopulaties.

Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het isoleren van ruimtelijk verschillende muis colonische epitheliale oppervlaktecellen van de onderliggende crypt-basiscellen.

Cryosectioning Methode voor Microdissection van Murine colonslijmvlies

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Het algemene doel van deze procedure is om twee ruimtelijk verschillende regio's van het colon te microdissecteren: de proliferatieve K-cryptzone en de gedifferentieerde oppervlakkige epitheelcellen. Dit wordt bereikt door eerst het colon van de muis te verwijderen. De tweede stap is om het weefsel tussen twee metalen platen te bevriezen.Vervolgens wordt het weefsel gemonteerd op een vooraf genivelleerd OCT-blok. De laatste stap is het snijden van het weefsel in een cryostaat met intervallen van 10 micron. Ten slotte worden real-time PCR of Western blot gebruikt om veranderingen in gen- en eiwitexpressie aan te tonen.Het voordeel van onze techniek is dat deze snel en goedkoop is en een hoge opbrengst aantoont. Onze procedure is uitgevoerd door Christian Garner Schmidt, een technicus in onze groep. Alle procedures met dieren zijn beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Emory University en zijn uitgevoerd volgens de criteria van de National Institutes of Health.Nadat de cryostaat zoals gebruikelijk is ingesteld, worden de cryostaatmessen en de houders geëquilibreerd naar -20 °C. Vul vervolgens een lege cryovorm met optimal cutting temperature compound en equilibreer deze naar -20 °C. Dit zal ongeveer 30 minuten duren.Verwijder het bevroren OCT uit de mal en bevestig het aan de houder met vloeibaar OCT. Plaats de houder in de arm van de microtoom en laat het OCT 10 minuten uitharden. Stel de cryostaat in op 10 micron per sectie en scheer het OCT-blok af tot het vlak is, terwijl u de arm van de microtoom enkele centimeters van het mes af beweegt.Bereid vervolgens per monster twee scheermesjes voor door met een metalen vijl de scherpe rand van de mesjes te stompen. Verwijder daarna de aluminium flens met een pincet. Bereid een kweekschaal van 10 centimeter voor, voor de helft gevuld met siliconen en voorzien van 10 tot 15 dissectienaalden.Voeg vijf milliliters kamertemperatuur hanks buffer toe aan de schaal nadat de muis is geëuthanaseerd volgens goedgekeurde methoden en een distaal colonsegment tussen nul en zes centimeter vanaf de anus is uitgesneden. Gebruik een schaar om te knippen. Open het colon in de lengte en verwijder de fecale inhoud.Zet het weefsel vast op de siliconen dissectieschaal met Hank's buffer, waarbij het slijmvliesoppervlak naar boven is gericht. Rek het weefsel uit met behulp van de dissectiepennen. Laat het weefsel vervolgens 10 minuten rusten bij kamertemperatuur om plooien in het weefsel te verwijderen en om de spierlagen te laten ontspannen.Nadat het weefsel heeft gerust, verwijdert u alle pinnen behalve de eindpinnen. Schuif een scheermesje onder het gewenste weefselsegment en giet vervolgens de hanks-buffer af. Plaats een ander scheermesje aan de bovenzijde om een sandwich te vormen.Snijd het weefselsegment door en verwijder de eindpinnen. Verplaats de weefselsandwich tussen de scheermesjes naar droogijs. Laat het weefsel vijf tot 10 minuten invriezen.Pak de sandwich van scheermesjes en weefsel op en laat deze licht opwarmen door een vinger op het bovenste mesje te plaatsen. Scheid de sandwich en snijd langs de randen van het weefselsegment. Snijd een weefselsegment van ongeveer 0,5 centimeter bij één centimeter.Laat het weefsel opwarmen tot het ijs bovenop het weefsel begint te smelten. Druk het weefsel op dat moment snel en voorzichtig in het OCT-blok. Plaats in de cryostaat een vinger over het monster.De warmteoverdracht stelt u in staat om het mes te verwijderen zonder het weefsel te verstoren. Bedek het weefsel met OCT en laat het vijf minuten equilibreren. Snijd vervolgens secties van 10 microns.Plaats de coupes op een objectglas en inspecteer deze visueel totdat de crypten zichtbaar zijn. Plaats de coupes in buisjes van 1,5 milliliter of op objectglazen. Deze afbeelding toont colonweefsel gekleurd met hematoxyline en eosine in een traditionele dwarsdoorsnede, waarbij de circulaire muscularis is aangeduid als cm.De muscularis mucosa, aangeduid als MM, de cellen van de cryptbasis, de transitiecellen en de oppervlaktecellen zijn duidelijk zichtbaar. Deze afbeelding toont de circulaire muscularis na seriële sectie. Naarmate we richting de oppervlaktecellen gaan, is de muscularis mucosa zichtbaar.Deze afbeelding toont h- en D-gekleurde crypt-basaalcellen bij een hogere vergroting. Let op de afwezigheid van een centraal lumen. Hier zijn transitionele cellen te zien en deze afbeelding toont de oppervlaktecellen.De volgende afbeeldingen tonen de immunofluorescente kleuring van geïsoleerde colone crypten, waarbij is gekleurd voor het cel-celverbindingseiwit. Zonula occludens-1 of ZO-1 verschijnt groen en de kernen, die blauw verschijnen, zijn in dwarsdoorsnede geobserveerd. De transitionele cellen en oppervlaktcellen worden hier getoond na seriële sectiering.Verschillende differentiatiefactoren worden op spatiotemporele wijze tot expressie gebracht langs de as van het crypte-oppervlak. Hiertoenoe behoort de transcriptiefactor KLF4, in het groen weergegeven, die verrijkt is in oppervlaktecelpopulaties wanneer bekeken in dwarsdoorsnede; seriële doorsneden maken real-time PCR-beoordeling van KLF4-mRNA-niveaus tussen de drie compartimenten mogelijk. Tot slot demonstreert deze western blot de niveaus van het KLF4-eiwit in deze celpopulaties.Vergeet niet dat werken met microtoommesjes extreem gevaarlijk kan zijn, wees dus extra voorzichtig wanneer u deze procedure uitvoert.

cryosectioning-method-for-microdissection-of-murine-colonic-mucosa

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we demonstrate a technique to isolate whole crypts from a mouse’s small intestine. The isolated whole crypts can be used to propagate long-lived and self-renewing 3D organoids in vitro.

Intestinal Crypts Isolation: A Method to Isolate Whole Crypts from Small Intestine of Murine Model

Er is een toenemende belangstelling voor het begrijpen van de immunologische functies van specifieke subpopulaties van cellen in platen van Peyer (PP), de primaire inductieve plaatsen van darm-geassocieerd lymfeweefsel. Hier schetsen we parallel protocollen voor de voorbereiding van PP enkele cel voorbereidingen voor flowcytometrische analyse en PP cryocoupes voor immunokleuring.

Isoleren En Immunokleuring Lymfocyten en dendritische cellen uit Patches Murine Peyer

De myofibro is een invloedrijke stromale cellen van het maagdarmkanaal die belangrijk zijn fysiologische processen reguleert zowel in normale als ziektebeelden. We beschrijven een techniek die voor de isolatie van primaire myofibroblasten van zowel muis als humaan colon weefsel, dat kan worden gebruikt voor in vitro experimenten.

Isolatie van Primaire Myofibroblasten van Mouse and Human Colon Tissue

Het gebruik van een eenvoudig apparaat om muizendarmen te snijden en ‘op te rollen’ om snel gehele preparaten te bereiden, wordt beschreven.

Een eenvoudig apparaat om snel te bereiden Whole Bergen van de muis Darm

Opeenvolgende cryo-secties verzameld histologische toepassingen en verrijking van RNA voor genexpressie metingen met aangrenzende gebieden van een enkele muis skeletspier schakelen. Hoogwaardige RNA wordt verkregen 20-30 mg samengevoegd vriescoupes en metingen worden direct vergeleken verschillende applicaties.

Cryosectioning aaneengesloten Regio&#39;s van een enkele muis skeletspieren voor Gene Expression en histologische Analyses

Het doel van dit protocol is het verkrijgen van hoge-integriteit RNA monsters van darmen ganglia geïsoleerd van nietgefixeerde, vers gereseceerd menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM). Dit protocol omvat voorbereiding van monsters van menselijke intestinale weefsels, cryosectioning, ethanolbevattend kleuring en uitdroging, LCM, flash-bevroren en RNA extractie.

Optimalisatie van Laser-Capture Microdissection voor de isolatie van darmen Ganglia van menselijk weefsel vers bevroren

Enterochromaffin (EG) cellen bestaan uit een kleine subset van gastro-intestinale epitheliale cellen. EG cellen zijn elektrisch prikkelbaar en vrij serotonine, nog moeilijkheden in kweken en het identificeren van de EG cellen hebben beperkte fysiologische studies. De methode die hier gepresenteerd wordt een primaire cultuur model vatbaar voor onderzoek van afzonderlijke cellen van de EG vastgesteld door electrofysiologie.

Hele cel electrofysiologie van primaire gekweekte lymfkliertest Enterochromaffin cellen

Gebrek aan standaardisatie voor lymfkliertest bewerking vermindert de kwaliteit van lymfkliertest histopathologisch analyse ten opzichte van menselijke specimens. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van histopathologisch onderzoek van lymfkliertest ontstoken en uninflamed Colon weefsels te tonen van de haalbaarheid van robotic systemen routinematig gebruikt voor het verwerken en menselijke specimens te embedding.

Met behulp van Robotic systemen te verwerken en Embed Colon lymfkliertest monsters voor histologisch Analyses

Het doel van dit protocol is het isoleren van mononucleaire cellen die zich in de lamina propria van de dikke darm bevinden door enzymatische vertering van het weefsel met collagenase. Dit protocol maakt een efficiënte isolatie van mononucleaire cellen mogelijk, wat resulteert in een enkelvoudige celsuspensie die op zijn beurt kan worden gebruikt voor robuuste immunophenotypering.

Isolatie van lamina propria mononucleaire cellen van Murine Colon met behulp van Collagenase E

Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de procedure om colonoscopisch geleide knijpbiopten bij muizen te induceren en wondsluiting in realtime te volgen. Daarnaast zijn er methoden voor de bereiding van weefsels voor histologische, immunohistochemische en moleculaire analyses van het wondbed.

Colonoscopische geleide pinch-biopsieën bij muizen uitvoeren en daaropvolgende weefselveranderingen evalueren

Het huidige protocol beschrijft het opzetten van een murine colon organoïde systeem om de activiteit en werking van colonstamcellen te bestuderen in een claudin-7 knock-out model.

Driedimensionale cultuur van Murine Colonic Crypts om de intestinale stamcelfunctie ex vivo te bestuderen

Leer een cryosectioning-methode voor microdissectie van murine colonslijmvlies om cryptbasis- en oppervlakte-epitheelcellen te isoleren. Deze snelle, goedkope techniek levert hoogwaardige monsters voor gen- en eiwitexpressieanalyse.

Cryosectioning Methode voor Microdissection van Murine colonslijmvlies

Meer video's verkennen