Protocol voor drie-dimensionale confocale Morfometrische Analyse van Astrocytes
11 december 2015
Astrocyten in het CZS veranderen hun functionele en structurele eigenschappen als reactie op schadelijke stimuli. Dit rapport presenteert een protocol voor de beoordeling van de driedimensionale morfologie van astrocyten in zieke toestanden of na therapeutische interventies.
Het algemene doel van deze procedure is om de morfologie van astrocyten te beoordelen door drie dimensionale beelden van astrocyten te analyseren die zijn verkregen via confocale microscopie. Deze methode kan worden gebruikt om morfologische veranderingen te evalueren die kunnen optreden in verschillende celtypen, zowel onder pathologische omstandigheden als gevolg van een interventiestrategie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat veel parameters die geassocieerd worden met de cellulaire architectuur gelijktijdig bestudeerd kunnen worden.
Dr. Mariam Bodel zal deze procedure demonstreren. Na de bereiding van de coupes voor immunohistochemische kleuring worden de coupes gedeparaffiniseerd door ze twee keer gedurende 10 minuten onder te dompelen in xyleen. Incubeer de coupes na het wassen gedurende 10 minuten in elk van 99,8%, 95% en 70% ethanol om de coupes te rehydreren. Incubeer de coupes in een 1:1500 verdunning van een primair antilichaam-oplossing tegen glial fibrillary acidic protein (GFAP) bij vier graden Celsius gedurende de nacht in PBS.
Was na de incubatie de coupes drie keer gedurende vijf minuten in PBS. Incubeer de objectglazen vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur met een oplossing van een alkalische fosfatase-geconjugeerd secundair antilichaam in een verdunning van 1:100. Was de coupe opnieuw drie keer gedurende vijf minuten in PBS, minder dan 30 minuten voor gebruik.
Voeg één druppel rode chromogeenoplossing toe aan drie milliliter substraatbuffer. Incubeer elk objectglas in 100 µL van deze oplossing gedurende 15 tot 20 minuten in het donker. Was de objectglazen vervolgens 3 keer gedurende vijf minuten in PBS.
Kleur tot slot de kernen met DPI, verdund één op 500 in PBS. Breng één tot twee druppels Antifa-medium aan op het coupesectie en dek dit onmiddellijk af met een dekglas. Incubeer de objectglazen gedurende 24 tot 48 uur bij vier graden Celsius vóór de microscopie om de afsluiting te waarborgen.
Om te beginnen met confocale microscopie, plaatst u een objectglas op de microscooptafel en selecteert u het 63 x objectief. Klik na het openen van de acquisitiesoftware op 'smart setup' in het acquisitietabblad en selecteer de juiste set van vieren. Hier worden dappy en Alexa, floor 5 55 gebruikt.
Klik vervolgens op best signal en daarna op apply. Klik daarna op set exposure zodat de computer de optimale belichtingsparameters kan bepalen. Om de afbeelding te optimaliseren, opent u het venster channels en schakelt u de afbeelding over naar live. Pas indien nodig de focus aan.
Klik vervolgens op één au om het pinhole te optimaliseren en pas de gain aan voor de beste intensiteit. Stel tot slot de digitale gain in tussen twee en drie. Stop na deze optimalisatie het live-beeld en open het venster voor de acquisitiemodus.
Pas de kadergrootte aan door op X bij Y te klikken en selecteer 10 24 bij 10 24. Kies daarnaast een lage snelheid. Open vervolgens het tabblad voor middeling en selecteer een getal dat groter is dan of gelijk is aan vier.
Klik vervolgens op de knop 'snap' en sla de vastgelegde 2D-afbeelding op. Om 3D-beeldvorming in te stellen, opent u het tabblad 'smart setup' en vinkt u het item 'ZS stack' aan, waardoor het venster 'Zs stack' wordt geopend. Om de eerste en laatste posities voor de Z-stap in te stellen, klikt u opnieuw op 'live' en stelt u de focus in op de bovenste positie van de astrocyten.
Klik eerst op 'set first'. Pas nu de focus aan naar de laagste positie van de astrocyten en klik op 'set last', stop vervolgens de live-weergave. Kies daarna het interval door op 'optimal' te klikken.
Stel hier het aantal coupes in, waarbij het interval 1,01 micrometers is. Klik ten slotte op start, experiment, en sla de beelden op zodra de scan is voltooid. Neem daarnaast een 2D-beeld op met een 10 x of 20 x objectief.
Voor metingen van de fluorescentie-intensiteit selecteert u de rechthoek- of cirkeltool in het beeldvenster en markeert u een gebied voor meting om het volume en het oppervlak van het soma-cellichaam en het territorium van de astrocytenkern te kwantificeren. Transfer de 3D-beelden naar een geschikt analyseprogramma, zoals Velocity 6.1 in de analysesoftware. Maak een nieuwe bibliotheek aan en sleep alle beelden naar de linker grijze kolom.
Selecteer één 3D-afbeelding en schakel een van de verworven kanalen van belang in, zoals dapi. Pas voor nucleaire metingen de helderheid handmatig aan om het contrast te optimaliseren. Selecteer nu het menu tools.
Kies voor 'make volume' om één 3D-afbeelding te genereren uit de Zack-afbeeldingen. Open het bewerkingsmenu en klik op 'properties'. Controleer of de X-, Y- en Z-eigenschappen worden weergegeven.
Kies vervolgens de tool voor handmatige ROI-selectie uit de werkbalk. Teken met de geselecteerde tool een lijn rond de met DPI gelabelde nucleus om het volume en het oppervlak van de astrocytenkern te meten. Meet vervolgens, opnieuw met de tool voor handmatige ROI-selectie, het volume en het oppervlak van de gehele astrocyten door een lijn rond het soma te trekken, waarbij het oppervlak van alle vertakkingen wordt gevolgd.
Klik op het meetmenu bovenaan het afbeeldingsvenster, sleep 'find objects' naar de bovenkant van het venster en geef populatie één een beschrijvende naam, selecteer de bijbehorende kleur en klik op 'measure', waardoor er een nieuw venster wordt geopend. Kies in dit nieuwe venster volume of oppervlakte als parameter en klik op oké.
Om de gegevens op te slaan, klikt u op het meetmenu en selecteert u het item 'meting maken'. Selecteer in het venster een nieuw meetitem. Voer een bestandsnaam voor de gegevens in en klik op ok.
Exporteer ten slotte de meetgegevens naar een geschikt softwarepakket om statistische analyses uit te voeren en datagraphieken te genereren. Hier vergeleken onderzoekers astrocyten in gefixeerd hersenweefsel van ratten die waren behandeld met amyloïde bèta 1-40 of met amyloïde bèta 1-40 en Ian. Injectiebehandeling met het amyloïde proteïne resulteerde in astrocyten met dikkere en langere vertakkingen.
Deze astrocyten van met Ian behandelde dieren vertoonden een stervorm met korte en dunne uitlopers. Bij met Ian behandelde ratten was daarnaast een verminderde GFAP-positieve fluorescentie van astrocyten in de hersencoupjes waarneembaar. De morfometrische analyse van specifieke astrocytenvolumes onthulde dat het volume van de astrocytenkern, het cellichaam, de gehele astrocyt en het astrocytengebied waren afgenomen bij behandeling met Ian in vergelijking met behandeling met enkel amyloïd.
Zodra deze afbeelding is beheerst, kan de analysetechniek in enkele minuten per cel worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de structuur met hoge precisie te markeren. Het is raadzaam om het handmatig markeren van de betreffende structuur te oefenen voordat het experiment na de ontwikkeling wordt gestart.
Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de celbiologie, histologie en pathologie om de structuur van een cel in een gezonde of pathologische setting te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het meten van 12 verschillende parameters voor een enkele cel aan de hand van 3D-beelden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit rapport presenteert een protocol voor het beoordelen van de astrocytenmorfologie in drie dimensies met behulp van confocale microscopie. De methode evalueert morfologische veranderingen in astrocyten onder pathologische omstandigheden of na therapeutische interventies.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Pathologie
Achtergrond
- Astrocyten in het CZS vertonen veranderingen als reactie op schadelijke stimuli.
- Het begrijpen van de morfologie van astrocyten is cruciaal voor het bestuderen van diverse neurologische aandoeningen.
- Dit protocol maakt gelijktijdige analyse van meerdere parameters van de cellulaire architectuur mogelijk.
- Confocale microscopie levert driedimensionale beelden met een hoge resolutie.
Doel van de studie
- Om de morfologie van astrocyten onder pathologische omstandigheden te beoordelen.
- Om de effecten van therapeutische interventies op de structuur van astrocyten te evalueren.
- Om een betrouwbaar protocol voor morfologische analyse te ontwikkelen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van objectglazen voor immunohistochemische kleuring.
- Deparaffinering van coupes met xyleen.
- Rehydratatie van coupes via oplossingen van ethanol in oplopende concentraties.
- Incubatie met GFAP-primair antilichaam voor de identificatie van astrocyten.
Belangrijkste resultaten
- Demonstratie van morfologische veranderingen in astrocyten.
- Identificatie van structurele wijzigingen als reactie op interventies.
- Validatie van het protocol voor toekomstige studies.
Conclusies
- Het protocol beoordeelt de morfologie van astrocyten op effectieve wijze.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de rollen van astrocyten bij pathologie van het CZS.
- Toekomstige toepassingen kunnen therapeutische strategieën voor neurologische aandoeningen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Kwantitatieve beoordeling van de astrocytenmorfologie maakt mechanistische risicoreductie mogelijk bij de validatie van neurodegeneratieve targets door structurele veranderingen te koppelen aan therapeutische interventies. Deze 3D confocale morfometrische benadering ondersteunt het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door multiparametrische read-outs te leveren die pathway-specifieke gliale responsen weerspiegelen. De methode verbetert de translationele continuïteit van in vitro of in vivo modellen naar preklinische besluitvorming via gestandaardiseerde, reproduceerbare imaging-workflows.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt de therapeutische hypothese door de structurele remodellering van astrocyten in reactie op amyloïd bèta en interventiestrategieën te kwantificeren.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via multiparametrische analyse van gliale reactiviteit, waardoor mechanistische ambiguïteit bij target-engagement in het centraal zenuwstelsel wordt verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door baseline- en interventie-geïnduceerde morfologische fenotypes vast te stellen.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via kwantitatieve morfometrische outputs met 12 parameters die geschikt zijn voor adaptatie naar high-content screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziektebeelden door reactieve astrogliose te modelleren in met amyloïde blootgesteld rattenbreinweefsel, wat aansluit bij translationele biomarker-paden bij neurodegeneratie.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door longitudinale tracking van structurele veranderingen in astrocyten onder verschillende behandelingscondities mogelijk te maken.
Integratie van pipeline en workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetest tot lead-identificatie, door kwantitatieve gliale morfologiedata te leveren die de doelwitselectie en het verminderen van risico's bij signaalpaden ondersteunen.
- Ontdekkingsbiologie: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing, pathway-verduidelijking of biologische risicoreductie ondersteunt via structurele fenotypering van astrocyten in pathologische contexten en bij interventies.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid, reproduceerbaarheid of kwantitatieve output, indien ondersteund door het artikel via gestandaardiseerde 3D-imaging en multiparametrische analyse.
- Analytiek: Benadrukt metingen, read-outs of statistische output die teams helpen om condities te vergelijken, waaronder volume, oppervlakte, vertaktingslengte, aantal, fluorescentie-intensiteit en dichtheid.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming, uitsluitend wanneer de bron dit ondersteunt via ziekterelevante modellering van astrocytenreactiviteit.
- Herbruikbaarheid binnen organisaties: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek, door middel van gestandaardiseerde imaging- en analyseprotocollen die toepasbaar zijn op verschillende celtypen en condities.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Betere go/no-go beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in confocale microscopie, immunohistochemische kleuring en 3D-beeldanalyse.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een confocale microscoop met Z-stack-mogelijkheden en 3D-analysesoftware zoals Volocity.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams met betrekking tot kleuringsprotocollen, beeldvormingsparameters en consistentie van morfometrische metingen.
- Overwegingen voor adaptatie over verschillende modelsystemen, waaronder in vivo en in vitro astrocytenpreparaten van diverse soorten.
- Praktische beperkingen ondersteund door het bronmateriaal, waaronder de noodzaak van nauwkeurige handmatige structuurmarkering en optimalisatie van beeldinstellingen voor de signaal-ruisverhouding.
