Protocol voor drie-dimensionale confocale Morfometrische Analyse van Astrocytes
11 december 2015
Astrocyten in het CZS veranderen hun functionele en structurele eigenschappen als reactie op schadelijke stimuli. Dit rapport presenteert een protocol voor de beoordeling van de driedimensionale morfologie van astrocyten in zieke toestanden of na therapeutische interventies.
Het algemene doel van deze procedure is om de morfologie van astrocyten te beoordelen door driedimensionale beelden van astrocyten te analyseren die zijn verkregen via confocale microscopie. Deze methode kan worden gebruikt om morfologische veranderingen te evalueren die kunnen optreden in verschillende celtypen, hetzij bij pathologische omstandigheden of als gevolg van een interventiestrategie. Het grote voordeel van deze techniek is dat veel parameters die verband houden met cellulaire architectuur tegelijkertijd kunnen worden bestudeerd.
Dr. Mariam Bodel zal deze procedure demonstreren Na de voorbereiding van slides voor immunohistochemische kleuring, worden de parize-secties gedurende 10 minuten tweemaal ondergedompeld in xyleen. Incubeer de slides gedurende 10 minuten in elk van de 99,8%95% en 70% ethanol om de secties te rehydreren na het wassen. Incubeer de slides in een een-op-1500 verdunning van glial fibrillair zuur eiwit of GFAP primaire antilichaamoplossing bij vier graden Celsius gedurende de nacht.
Na incubatie, was de secties in PB S3 keer gedurende vijf minuten. Bewaar de slides vervolgens met een een-op-100 alkalische fosfatase geconjugeerde secundaire antilichaamoplossing gedurende één uur op kamertemperatuur. Was de sectie opnieuw in PB S3 keer gedurende vijf minuten, minder dan 30 minuten voor gebruik.
Voeg een druppel rode chromogeenoplossing toe aan drie milliliter substraatbuffer. Bewaar elke slide gedurende 15 tot 20 minuten in het donker in 100 microliter van deze oplossing. Was vervolgens de slides in PB S3 keer gedurende vijf minuten.
Vervolgens kleuren de kernen met DPI verdund tot een-op-500 in PBS. Breng een tot twee druppels Antifa-medium aan op de sectie en verzegel deze onmiddellijk met een dekglas. Bewaar de slides gedurende 24 tot 48 uur bij vier graden Celsius voor microscopie om verzegeling te garanderen.
Om confocale microscopie te starten, plaatst u een slide op het microscoopplatform en selecteert u het 63 x objectief. Nadat de acquisitiesoftware is geopend, klikt u op smart setup in het acquisitietab en selecteert u de juiste vloer van viers. Hier worden dappy en Alexa, vloer 5 55 gebruikt.
Klik vervolgens op beste signaal, gevolgd door toepassen. Klik vervolgens op blootstelling instellen om de computer de optimale belichtingsparameters te laten bepalen Om het beeld te optimaliseren, opent u het kanaalvenster en schakelt u het beeld naar live. Pas de focus indien nodig aan.
Klik vervolgens op één au om de pinhole te optimaliseren, pas de versterking aan voor de beste intensiteit. Stel ten slotte de digitale versterking tussen twee en drie. Na deze optimalisatie, stopt u het livebeeld en opent u het acquisitiemodusvenster.
Pas de framegrootte aan door op X bij Y te klikken en selecteer 10 24 bij 10 24. Kies ook een langzame snelheid. Open vervolgens het gemiddelde tabblad en selecteer een getal dat groter is dan of gelijk is aan vier.
Klik vervolgens op de snapknop en sla het vastgelegde 2D-beeld op. Om 3D-beeldvorming in te stellen, opent u het smart setup-tab en markeert u het ZS-stack-item, waardoor het Zs-stackvenster wordt geopend. Om de eerste en laatste posities voor de Zack in te stellen, klikt u opnieuw op live en past u de focus aan op de bovenste positie van de astrocyt.
Klik op eerste instellen. Pas nu de focus aan op de laagste positie van de astrocyt en klik op laatste instellen, en stop vervolgens de liveweergave. Kies vervolgens het interval door op optimaal te klikken.
Om het aantal plakjes hier in te stellen, is het interval 1,01 micrometer. Klik ten slotte op starten, experimenteren en sla de beelden op zodra het scannen is voltooid. Verkrijg ook een 2D-beeld met behulp van een 10 x of 20 x objectief.
Voor fluorescentie-intensiteitsmetingen, selecteer de rechthoek- of cirkeltool in het beeldvenster en markeer een gebied voor meting om het volume en het oppervlak van de astrocytenkern, soma-cellichaam en territorium te kwantificeren. Breng de 3D-beelden over naar een geschikt analysesoftwareprogramma, zoals Velocity 6.1 in de analysesoftware. Maak een nieuwe bibliotheek aan en sleep alle afbeeldingen naar de linkergrijze kolom.
Selecteer een 3D-afbeelding en schakel een van de verkregen kanalen van belang in, zoals dapi. Voor nucleaire metingen, pas de helderheid handmatig aan om het contrast te optimaliseren. Selecteer nu het menu gereedschappen.
Kies volume maken en maak een enkele 3D-afbeelding van de Zack-afbeeldingen. Open het bewerkingsmenu en klik op eigenschappen. Zorg ervoor dat de X, Y en Z-eigenschappen worden weergegeven.
Kies vervolgens de freehand ROI-tool uit de werkbalk. Gebruik het geselecteerde gereedschap om een lijn rond de DPI-gelabelde kern te tekenen om het volume en het oppervlak van de astrocytenkern te meten. Gebruik opnieuw de freehand ROI-tool om het volume en het oppervlak van de hele astrocyt te meten door een lijn rond de soma te tekenen volgens het oppervlak van alle takken.
Klik op het meetmenu bovenaan het beeldvenster, sleep objecten vinden naar de bovenkant van het venster en geef een beschrijvende naam aan populatie één, selecteer de bijbehorende kleur en klik op meten, waardoor een nieuw venster wordt geopend. Kies in dit nieuwe venster volume of oppervlakte als parameter en klik op oké.
Om de gegevens op te slaan, klikt u op het meetmenu en selecteert u meetitem maken. Selecteer een nieuw meetitem in het venster. Voer een bestandsnaam in voor de gegevens en klik op oké.
Exporteer ten slotte de meetgegevens naar een geschikt softwarepakket om statistische analyses uit te voeren en gegevensplots te genereren. Hier vergelijken onderzoekers astrocyten in vast hersenweefsel van ratten die werden behandeld met amyloïde bèta één 40 of met amyloïde bèta één 40 en Ian. Behandeling met het amyloïde-eiwit resulteerde in astrocyten met dikkere en langere takken.
Deze astrocyten van met Ian behandelde dieren vertoonden een stellaatvorm met korte en
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit rapport presenteert een protocol voor het beoordelen van astrocytenmorfologie in drie dimensies met behulp van confocale microscopie. De methode evalueert morfologische veranderingen in astrocyten onder pathologische omstandigheden of na therapeutische interventies.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Pathologie
Achtergrond
- Astrocyten in het CZS vertonen veranderingen als reactie op schadelijke stimuli.
- Het begrijpen van astrocytenmorfologie is cruciaal voor het bestuderen van verschillende neurologische aandoeningen.
- Dit protocol maakt gelijktijdige analyse van meerdere cellulaire architectuurparameters mogelijk.
- Confocale microscopie biedt hoogwaardige driedimensionale beelden.
Doel van de studie
- Om astrocytenmorfologie in zieke omstandigheden te beoordelen.
- Om de effecten van therapeutische interventies op astrocytenstructuur te evalueren.
- Om een betrouwbaar protocol voor morfologische analyse te ontwikkelen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van slides voor immunohistochemische kleuring.
- Deparaffinisatie van secties met behulp van xyleen.
- Rehydratie van secties door gegradeerde ethanoloplossingen.
- Incubatie met GFAP primaire antilichaam voor astrocytenidentificatie.
Belangrijkste resultaten
- Demonstratie van morfologische veranderingen in astrocyten.
- Identificatie van structurele veranderingen als reactie op interventies.
- Validatie van het protocol voor toekomstige studies.
Conclusies
- Het protocol beoordeelt effectief astrocytenmorfologie.
- Bevindingen dragen bij aan het begrijpen van astrocytenrollen in CZS-pathologie.
- Toekomstige toepassingen kunnen therapeutische strategieën voor neurologische aandoeningen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of astrocyte morphology enables mechanistic de-risking in neurodegenerative target validation by linking structural changes to therapeutic interventions. This 3D confocal morphometric approach supports predictive confidence in early discovery by providing multiparametric readouts that reflect pathway-specific glial responses. The method enhances translational continuity from in vitro or in vivo models to preclinical decision-making through standardized, reproducible imaging workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by quantifying astrocyte structural remodeling in response to amyloid beta and intervention strategies.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiparametric analysis of glial reactivity, reducing mechanistic ambiguity in CNS target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline and intervention-induced morphological phenotypes.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through quantitative 12-parameter morphometric outputs suitable for high-content screening adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by modeling reactive astrogliosis in amyloid-exposed rat brain tissue, aligning with translational biomarker pathways in neurodegeneration.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal tracking of astrocyte structural changes across treatment conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification by providing quantitative glial morphology data that informs target selection and pathway de-risking.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through structural phenotyping of astrocytes in pathological and intervention contexts.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article via standardized 3D imaging and multiparametric analysis.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including volume, surface area, branch length, number, fluorescence intensity, and density.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it via disease-relevant astrocyte reactivity modeling.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through standardized imaging and analysis protocols applicable across cell types and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy, immunohistochemical staining, and 3D image analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including confocal microscope with Z-stack capability and 3D analysis software such as Volocity.
- Cross-team standardization requirements for staining protocols, imaging parameters, and morphometric measurement consistency.
- Adaptation considerations across model systems including in vivo and in vitro astrocyte preparations from various species.
- Practical limitations supported by source material including the need for precise manual structure marking and optimization of imaging settings for signal-to-noise ratio.
