Analyse van de ontwikkelingslanden Tooth Germ Innervatie behulp van microfluïdische co-cultuur apparaten
August 14th, 2015
Co-cultures vertegenwoordigen een waardevolle methode om de interacties tussen zenuwen en doelweefsels en organen te bestuderen. Microfluïdische systemen maken co-cultiveren van ganglia en hele zich ontwikkelende organen of weefsels in verschillende kweekmedia mogelijk, waardoor ze een waardevol hulpmiddel vormen voor de in vitro studie van de interactie tussen neuronen en hun doelwitten.
Het algemene doel van deze procedure is om te laten zien hoe de zich ontwikkelende trigeminal ganglia en tandkiemen geïsoleerd en gezamenlijk gekweekt kunnen worden. Dit wordt bereikt door eerst het steriliseren, monteren en coaten van de microfluïdische apparaten. De tweede stap is het dissecteren van trigeminal ganglia en tandkiemen van een specifiek ontwikkelingsstadium in de muis van belang.
Vervolgens worden de trigeminal ganglia en de tandkiemen in de microfluïdische apparaten geplaatst en gezamenlijk gekweekt. De laatste stap is om de cellen te fixeren en ze te kleuren met behulp van immunofluorescentie. Uiteindelijk wordt microscopie gebruikt om het innervatiepatroon te laten zien dat het resultaat is van gezamenlijke kweek.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek van bestaande methoden, zoals conventionele gezamenlijke kweek, is dat deze methode de gezamenlijke kweek van verschillende organen en weefsels toelaat, elk in hun eigen optimale kweekmedium. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van kunstmatige innovatie, zoals de rol van verschillende moleculen bij tandvernieuwing en de regel van innovatie bij tandontwikkeling. Begin met het autoclaven van dissectiewerktuigen, waaronder een paar microdissectiepincetten en een paar schaar.
Vervolgens steriliseert u een partij glasdekjes van 24 millimeter bij 24 millimeter door ze 24 uur lang in een oplossing van één molair zoutzuur te plaatsen op een orbitale schudder bij 37 graden Celsius. Was vervolgens de dekjes drie keer met steriel gedestilleerd water, gevolgd door drie spoelingen in 99%Ethanol, droog ze onder een steriele flowhood zodra ze droog zijn, zet het UV-licht van de hood aan gedurende 30 minuten. Bewaar vervolgens de dekjes in 70%ethanol totdat ze nodig zijn.
Gebruik vervolgens steriele pincetten om de axonisolatie microfluïdische apparaten voorzichtig uit hun verpakking te verwijderen en plaats ze in een steriele petrischaal met behulp van een steriele 1 millimeter biopsie punch. Maak in de apparaten een gat voor elk monster. In overeenstemming met de kweekkamers.
Wees voorzichtig om niet te dicht bij de microgroeven te prikken, omdat deze door de druk kunnen worden beschadigd. Steriliseer vervolgens de apparaten door ze in 70%ethanol te laten dompelen. Zorg ervoor dat alle opgesloten lucht wordt verwijderd.
Verwijder vervolgens de apparaten uit de ethanol en droog ze volledig onder een steriele flowhood. Verwijder ook de dekjes uit de 70%ethanol-oplossing en laat ze onder de steriele flowhood drogen. Wacht minimaal drie uur voordat u verdergaat.
Plaats elk dekje in een putje binnen een zes-putjesplaat. Plaats vervolgens het microfluïdische apparaat op het dekje en druk voorzichtig maar stevig met de pincetten om volledige hechting tussen het isolatieapparaat en het glazen dekje mogelijk te maken. Pipet vervolgens 150 microliter 0,1 milligram per milliliter poly D lycine in elk van de kweekkamers.
Plaats vervolgens de microfluïdische apparaten vijf minuten onder vacuüm om alle lucht uit de kamers te verwijderen. Als er nog lucht in de kamers te zien is. Herhaal de poly D lycine-oplossing in de kamers.
Incubeer de apparaten met poly de lysine een nacht bij 37 graden Celsius. Was de kamers drie keer met steriel gedestilleerd water en vul de kamers vervolgens met 150 microliter vijf microgram per milliliter lamin werkoplossing en incubeer ze een nacht bij 37 graden Celsius. Reparaat vervolgens media voor de trigeminal ganglia en tandkiemculturen zoals beschreven in het begeleidende tekstprotocol.
Reinig het dissectiegebied en de stereoscoop met ethanol 70% en plaats de dissectie-instrumenten na het offeren. Dissekteer de huid rond de onderbuik van een zwangere muis met muis embryo's van stadium E 14,5 tot E 17,5. Open vervolgens voorzichtig de buik met schaar.
Lokaliseer de baarmoeder, verwijder deze en plaats deze in een buis gevuld met ijs. Koud PBS dissecteert de embryo's en plaatst ze afzonderlijk in een nieuwe petrischaal gevuld met ijskoud PBS. Zodra alle embryo's zijn verwijderd uit de extra-embryonale weefsels, onthoofdt u ze met schaar.
Separeer de onderkaak van de rest van het hoofd met behulp van microdissectie, schaar, zorg ervoor dat u de trigeminal ganglia niet beschadigt. Neem vervolgens het hoofd en plaats het op een gekoelde dissectieglas petrischaal. Gebruik pincetten om de huid en de schedel te verwijderen.
Plaats vervolgens pincetten onder de cephalon en til op. Om de cephalon en de cerebellum te verwijderen, lokaliseert u de trigeminal ganglia en gebruikt u de pincetten en dissectienaalden om de trigeminal ganglia te scheiden van de trigeminal zenuwen en de ganglia schoon te maken. Bewaar ze in koud PBS met dissectienaalden als messen.
Verwijder de tong en de huid rond de kaak. Scheid de linker en rechter hemi-kaken door langs de middenlijn van de kaak te snijden. Lokaliseer vervolgens de tandkiemen en isoleer ze met dissectienaalden na dissectie van de trigeminal ganglia en tandkiemen, verwijder de laminine van de microfluïdische apparaten en vul de kamers met 200 microliter van de respectieve media.
Gebruik pincetten om de gedissekteerde trigeminal ganglia en tandkiemen voorzichtig over te brengen naar de gaten die met een biopsie punch zijn gemaakt. Zorg ervoor dat de tandkiemen niet blijven zweven en dat ze zinken totdat ze contact maken met de dekjes. Kweek de monsters in een incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.
Ververs het kweekmedium elke 48 uur gedurende 10 dagen om het medium te verversen. Verwijder eerst het medium door de pipet naar de buitenkant van de putjes te richten. Voeg vervolgens het verse voorverwarmde medium toe aan de zijkant van de wels die zich tegenover de kamers bevindt tijdens de kweekperiode.
Beeld de gezamenlijke kweek op elk moment af met behulp van lichtmicroscopie. Na de kweekperiode, was de kamers door 150 microliter PBS in één put
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel demonstreert een methode voor het isoleren en co-cultiveren van zich ontwikkelende trigeminusganglia en tandkiemen met behulp van microfluïdische apparaten. De aanpak maakt het mogelijk om neuronale interacties met doelweefsels te bestuderen in een gecontroleerde omgeving.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Ontwikkelingsbiologie
- Microfluïdica
Achtergrond
- Co-cultures zijn essentieel voor het bestuderen van zenuw-doelinteracties.
- Microfluïdische systemen vergemakkelijken het co-cultiveren van verschillende weefsels.
- Het begrijpen van innervatiepatronen is cruciaal voor ontwikkelingsstudies.
- Deze methode biedt inzichten in neuronale ontwikkeling en weefselinteracties.
Doel van het onderzoek
- Om trigeminusganglia en tandkiemen te isoleren en co-cultiveren.
- Om de crosstalk tussen neuronen en hun doelweefsels te onderzoeken.
- Om innervatiepatronen te visualiseren door middel van microscopie.
Gebruikte methoden
- Steriliseren en coaten van microfluïdische apparaten.
- Dissectie van trigeminusganglia en tandkiemen uit muizenembryo's.
- Plaatsen van weefsels in microfluïdische apparaten voor co-cultuur.
- Fixatie en immunofluorescentiekleuring van cellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle co-cultuur van trigeminusganglia en tandkiemen.
- Visualisatie van neuronale innervatiepatronen.
- Demonstratie van de interacties tussen zenuwen en doelweefsels.
- Inzichten in de ontwikkelingsprocessen van neuronale targeting.
Conclusies
- Microfluïdische co-cultures zijn effectief voor het bestuderen van neuronale interacties.
- Deze methode kan het begrip van zenuwontwikkeling bevorderen.
- Toekomstige studies kunnen op deze bevindingen voortbouwen om andere weefselinteracties te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding nerve-target tissue interactions is critical for de-risking developmental biology hypotheses in therapeutic discovery. This microfluidic co-culture method enables controlled, long-term studies of innervation patterns, supporting mechanistic validation in organogenesis models. The approach provides a reproducible platform for evaluating molecular mediators of tissue development, with direct relevance to target validation and phenotypic screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuronal influence on tooth germ morphogenesis and cytodifferentiation.
- Operational Value: Supports functional target validation by isolating nerve-tissue crosstalk in a defined microenvironment.
- Predictive Value: Facilitates assessment of molecular mediators (e.g., guidance cues, trophic factors) that modulate developmental pathways.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a standardized co-culture system for quantitative analysis of neurite outgrowth and tissue response.
- Reproducibility: Maintains stable tissue viability and native innervation patterns over extended culture periods (up to 10 days).
- Scalability: Compatible with microfluidic multiplexing for parallel condition testing in drug discovery settings.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models developmental processes applicable to congenital disorders affecting craniofacial and neural development.
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage mechanistic insights with preclinical validation of nerve-dependent tissue regeneration.
- Risk Mitigation: Reduces ambiguity in target mechanism by enabling direct observation of neuronal influence on epithelial-mesenchymal interactions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery pipelines by providing a controlled system to validate neuronal targets prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the role of specific molecules in nerve-guided tissue development.
- Screening: Generates quantitative imaging outputs (neurite trajectory, branching density) for compound or genetic perturbation analysis.
- Analytics: Enables morphometric and fluorescence-based readouts to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects developmental mechanisms to regenerative strategies in craniofacial tissue engineering.
- Enterprise Reuse: Platform adaptable to other neuron-target tissue pairs (e.g., sympathetic ganglia and heart, enteric nerves and gut).
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanisms by reducing reliance on inferential in vivo models.
- Operational Value: Standardizes co-culture conditions, minimizing variability from serum batch or media incompatibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target engagement in developmental pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated nerve-tissue interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, sterile tissue dissection, and immunofluorescence microscopy.
- Depends on access to embryonic tissue sources and sterile culture infrastructure (CO2 incubator, laminar flow hood).
- Necessitates standardization of poly-D-lysine and laminin coating protocols for consistent surface adhesion.
- Adaptation to other tissue systems may require optimization of chamber geometry and media composition.
- Practical limitations include device clogging risk and the need for medium exchange without disrupting tissue positioning.
