Analyse van de ontwikkelingslanden Tooth Germ Innervatie behulp van microfluïdische co-cultuur apparaten

Het algemene doel van deze procedure is om te laten zien hoe de ontwikkelende nervus trigeminus-ganglia en tandkiemen kunnen worden geïsoleerd en samen kunnen worden gekweekt. Dit wordt bereikt door eerst de microfluïdische apparaten te steriliseren, te monteren en te coaten. De tweede stap is het disseceren van de nervus trigeminus-ganglia en tandkiemen uit een specifiek ontwikkelingsstadium van de betreffende muis.

Vervolgens worden de nervus trigeminus-ganglia en de tandkiemen in de microfluïdische apparaten geplaatst en gecocultiveerd. De laatste stap is het fixeren van de cellen en het kleuren ervan middels immunofluorescentie. Ten slotte wordt microscopie gebruikt om het innervatiepatroon te tonen dat het resultaat is van de cocultuur.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals conventionele cocultures, is dat deze methode de coculture van verschillende organen en weefsels mogelijk maakt, waarbij elk in zijn eigen optimale kweekmedium wordt gehouden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van kunstmatige innovatie, zoals de rol van verschillende moleculen bij tandinnovatie en de regel van innovatie bij de tandontwikkeling. Begin met het autoclaveren van de dissectie-instrumenten, waaronder een microdissectiepincet en een schaar.

Steriliseer vervolgens een batch glazen dekglasjes van 24 millimeter bij 24 millimeter door deze gedurende 24 uur bij 37 °C op een orbitale schudder in een oplossing van 1 M zoutzuur te plaatsen. Was de dekglasjes daarna drie keer met steriel gedestilleerd water, gevolgd door drie spoelingen in 99% ethanol en droog ze in een steriele flowhood. Zodra ze droog zijn, schakelt u het UV-licht van de hood gedurende 30 minuten in. Bewaar de dekglasjes vervolgens in 70% ethanol tot ze nodig zijn.

Gebruik vervolgens steriele pincetten om de microfluïdische apparaten voor axon-isolatie voorzichtig uit hun verpakking te halen en plaats ze met een steriele biopsiepons van één millimeter in een steriele Petrischaal. Maak in de apparaten voor elk monster één gat, ter hoogte van de kweekkamers.

Zorg ervoor dat u niet te dicht bij de microsleuven ponst, omdat deze door de druk beschadigd kunnen raken. Steriliseer vervolgens de apparaten door ze onder te dompelen in 70% ethanol, waarbij u erop let dat alle ingesloten lucht wordt verwijderd.

Verwijder vervolgens de apparaten uit de ethanol en droog deze volledig onder een steriele laminaire flowkast. Verwijder daarnaast de dekglasjes uit de 70% ethanol-oplossing en laat ze drogen onder de steriele flowkast. Wacht minimaal drie uur voordat u verdergaat.

Plaats elk dekglas in een well van een zes-wells plaat. Plaats vervolgens het microfluïdische apparaat op het dekglas en druk voorzichtig maar stevig aan met de pincet om een volledige hechting tussen het isolatieapparaat en het glazen dekglas te bewerkstelligen. Pipetteer daarna 150 µL poly-D-lysine (0,1 mg/mL) in elk van de kweekkamers.

Plaats de microfluïdische apparaten vervolgens vijf minuten in een vacuüm om alle lucht uit de kamers te verwijderen. Als er nog steeds lucht in de kamers zichtbaar is, wordt de poly-D-lysine-oplossing opnieuw in de kamers aangebracht.

Incubeer de apparaten een nacht met poly-D-lysine bij 37 °C. Was de kamers de volgende dag drie keer met steriel gedestilleerd water en vul de kamers vervolgens met 150 µL lamin-werkoplossing van 5 µg/mL en incubeer deze een nacht bij 37 °C. Bereid daarna het medium voor de trigeminale ganglia en tandkiemculturen voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Reinig het dissectiegebied en het stereoomscope met 70% ethanol en leg de dissectie-instrumenten klaar na de opoffering. Dissecteer de huid rond de onderbuik van een drachtige muis met embryo's in stadium E 14.5 tot E 17.5. Open vervolgens voorzichtig de buikholte met een schaar.

Lokaliseer de uterus, verwijder deze en plaats deze in een buis gevuld met ijs. Disseceer de embryo's uit met koud PBS en plaats ze individueel in een nieuwe Petrischaal gevuld met ijskoud PBS. Zodra alle embryo's uit de extra-embryonale weefsels zijn verwijderd, worden ze met een schaar gedecapiteerd.

Scheid de onderkaak van de rest van de kop met behulp van microdissectieschaaren, waarbij u er zorg voor draagt dat de nervus trigeminus-ganglia niet beschadigd raken. Plaats de kop vervolgens op een gekoelde glazen dissectie-petrischaal. Gebruik een pincet om de huid en de schedel te verwijderen.

Plaats vervolgens een pincet onder het cephalon en til dit op. Om het cephalon en het cerebellum te verwijderen, lokaliseert u de trigeminusganglia en gebruikt u het pincet en dissectienaalden om de trigeminusganglia van de nervi trigemini te scheiden en de ganglia schoon te maken. Bewaar deze in koud PBS door dissectienaalden als messen te gebruiken.

Verwijder de tong en de huid rondom de kaak. Scheid de linker- en rechterkaakhelft door langs de middellijn van de kaak te snijden. Lokaliseer vervolgens de tandkiemen en isoleer deze met dissectienaalden; na dissectie van de nervus trigeminusganglia en de tandkiemen wordt de laminine uit de microfluïdische apparaten verwijderd en worden de kamers gevuld met 200 µL van de respectievelijke media.

Breng de gedissecteerde trigeminusknoppen en tandkiemen met een pincet voorzichtig over naar de gaten die met een biopsietpons zijn gemaakt. Zorg ervoor dat de tandkiemen niet blijven drijven, maar zinken tot ze de dekglasjes raken. Kweek de monsters in een incubator bij 37 °C en 5% koolstofdioxide.

Vervang het kweekmedium elke 48 uur gedurende 10 dagen. Verwijder eerst het medium door de pipet naar de buitenkant van de wells te richten. Voeg vervolgens, tijdens de kweekperiode, het verse voorverwarmde medium toe aan de zijde van de wells die tegenover de kamers ligt.

Beeld de coculturen op elk gewenst tijdstip in met behulp van lichtmicroscopie. Was na de cultivatieperiode de kamers door 150 µL PBS in één put per kamer te pipetteren en de PBS door de kamers te laten stromen. Herhaal dit wasproces in totaal drie keer na de laatste wasbeurt.

Verwijder de PBS en fixeerde de monsters door 150 µL 4% paraformaldehyde in PBS in één put per kamer te pipetteren en dit door te laten stromen naar de andere kamer. Incubeer het apparaat 15 minuten bij kamertemperatuur. Was de kamers vervolgens twee keer met PBS en ga verder met verdere analyses, zoals immunofluorescente kleuring en beeldvorming van de uitgroei.

Tijdens de co-cultuur vertakken neurieten vanuit de trigeminusganglia vanuit hun cultuurcompartiment en strekken ze zich uit naar het ontwikkelende tandkiem. Bij een hogere vergroting zijn de neurieten te zien die zich door de axonale kamers en de microgroeven in het microfluïdische apparaat uitstrekken. De voortgang van de zenuwgroei kan in de tijd worden gevolgd om de innovatieve ontwikkeling te beschrijven.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals RNA-analyse of proteïnisatie, worden uitgevoerd om bijvoorbeeld veranderingen in genexpressie of eiwitsecretie in de doelweefsels na innovatie te bestuderen.