Analyse van Yersinia enterocolitica Effector Translocatie in gastheercellen met behulp van beta-lactamase Effector Fusions

Het algemene doel van het volgende experiment is om de translocatie van effectorproteïnen in gastheercellen te meten via het vernia type drie secretiesysteem. Dit wordt bereikt door heela-cellen te incuberen met yersinia-mutanten die effector TEM een beta-lactamase-fusies tot expressie brengen om translocatie van effectorfusies in de HELOC-cellen mogelijk te maken. Als tweede stap worden de geïnfecteerde HELOC-cellen geladen met een door cellen penetrerende fret-reporterverbinding, die door cellulaire estro wordt verwerkt tot de geladen, fluorescerende CCF vier en daardoor in de cel wordt vastgehouden.

Vervolgens resulteert de splitsing van CCF vier door de getranslozeerde beta-lactamase in verstoring van fre, die wordt geregistreerd door laserscanningmicroscopie om donor- en acceptorfluorescentie-intensiteiten te analyseren. De resultaten tonen verschillende hoeveelheden getranslozeerde effector TEM een beta-lactamase-fusie op basis van verschillende kinetieken van stijging van de donorfluorescentie. Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de intercellulaire verwerking van de CCF vier-verbinding een zeer specifiek en gevoelig hulpmiddel biedt voor het meten van translocatie.

De methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van bacteriële pathogenese, zoals hoe translocatie wordt verfijnd tijdens de interactie van bacteriën en gastheercellen één dag vóór infectie. Inoculeer drie afzonderlijke flacons met drie milliliter LB-medium en de benodigde antibiotica met één kolonie van elk van de getransformeerde stammen van Y enterocolitica, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Bereid ook platen met heela-cellen de dag voor infectie door 15.000 cellen in 200 microliter kweekmedium in negen putjes van een 96-wellplaat te zaaien. Incubeer de cellen op de dag van infectie in een 5%CO2-incubator bij 37 graden Celsius.

Inoculeer twee milliliter van de overnachtelijke cultuur in 40 milliliter vers lb-medium zonder antibiotica. Incubeer de bacteriën gedurende 90 minuten bij 37 graden Celsius in een shaker bij 180 RPM's. Dit zal na 90 minuten expressie van het type drie secretiesysteem induceren, breng de culturen over in een vers buisje en bewaar de culturen op ijs.

Vanaf dit punt centrifugeer de culturen gedurende 10 minuten bij 5.000 G en vier graden Celsius om de bacteriën te pellen. Spuit het pellet vervolgens opnieuw op in twee tot drie milliliter ijskoud PBS, verdun de bacteriesuspensie tot een concentratie van 800 miljoen kolonievormende eenheden per milliliter en plaats de culturen vervolgens op ijs.

Bepaal vervolgens de corresponderende optische dichtheid van elke cultuur. Voeg 3,5 microliter van de bacteriesuspensie van elke stam toe aan verschillende putjes van de voorbereide 96. Wel plaat en meng door het medium twee keer voorzichtig te pipetteren, laat de bacteriën sedimenteren op de cellen bij een infectiemotiliteit van ongeveer 100 bacteriën per cel.

Voer een tijdsverloop uit door infecties te starten met intervallen van 30 minuten en houd de cellen in een 5%CO2-kamer bij 37 graden Celsius. Na elke infectie, 90 minuten na de eerste infectie, zuigt u voorzichtig het medium af zonder enige van de hela-cellen te verwijderen. Voeg vervolgens 50 microliter PBS toe met 20 microgram per milliliter chlooramfenicol en 2,5 millimolair pronisch.

Dit stopt de expressie van effectoren en vermindert de export van CCF vier. Om microscopie voor te bereiden, zorg voor continue onderdompeling door onderdompeling medium naar de bodem van de putjes te verspreiden, met behulp van een ene milliliter spuit. Vermijd het vasthouden van luchtbellen in het onderdompeling medium.

Breng vervolgens de 96-wellplaat op het microscoopplatform en lokaliseer geschikte plekken voor latere analyse in elk. Wel voltooi deze stap binnen 10 minuten. Voeg vervolgens 70 microliter CF 4:00 AM-laadoplossing toe aan elk. Wel.

Incubeer de plaat gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Zuig vervolgens de laadoplossing af en voeg 100 microliter PBS toe met 20 microgram per milliliter chlooramfenicol en 2,5 millimolair pronisch. Begin vervolgens snel met microscopie.

Plaats een 20-voudige vergroting met hoge numerieke apertuur onderdompeling objectief en open de detectoropening naar 2,5 airy-eenheden en breng de 96-wellplaat over in de confocale laserscanningfase. Kies vervolgens hoge gevoeligheid galliumarsenidefosfaatdetectoren met gelijktijdig actieve donor- en acceptorkanalen. Acht bitdiepte drievoudig framegemiddelde en exciteer met 10% van een 405 nanometer diodelaser.

Om correcte kwantificering te garanderen, stel de detectorversterking van beide kanalen in op dezelfde waarde en vermijd verzadigde pixels. Activeer vervolgens het doorgelaten licht en controleer opnieuw de representatieve gezichtsvelden in elke, wel pas aan en bewaar de posities indien nodig met behulp van een gecalibreerde automatische fase. Stel ten slotte de tijdsverloop in op twee minuten, de duur op twee uur en begin met het verkrijgen van beelden.

Na beeldverwerving importeer de dataset in software die aritmetische berekeningen van pixelmatrices toestaat. Trek de achtergrond af in beide kanalen met behulp van dezelfde offset door eerst op menu te klikken en vervolgens naar beeldverwerking te gaan en baselineaftrekking te selecteren. Selecteer vervolgens elk kanaal en voer de baselinewaarde in.

Corrigeer de doorschijning van het donorkanaal, kanaal een in het acceptorkanaal kanaal twee met de vooraf bepaalde correctiefactor, waardoor een nieuw kanaal kanaal twee prime tot dit doel wordt gemaakt. Klik op het menu en selecteer vervolgens beeldverwerking gevolgd door kanaalrekenkunde en voer de absolute waarde van kanaal twee in, afgetrokken door punt 33 keer. Kanaal een daarna, verwijder kanaal twee en zorg ervoor dat het doorschijning gecorrigeerde Acceptorkanaal blijft als het nieuwe kanaal twee.

Maak vervolgens een nieuw kanaal met de hier getoonde operatie om de relatieve fret-coëfficiënt te bepalen. Ga vervolgens terug naar he