A-Label gratis Techniek voor de ruimte en tijd Imaging van Single Cell afscheiding

Het algemene doel van het volgende experiment is om eiwitsecretie van individuele cellen te meten met hoge temporele en ruimtelijke resolutie. Dit wordt bereikt door middel van litografisch fabriceren van gouden plasmonische Nanosensoren op glazen dekselglasjes voor de label-free beeldvorming van secreties van enkele cellen. Als tweede stap wordt de sensorchip gereinigd en bedekt met de zelf-geassembleerde monolaag en vervolgens gefunctionaliseerd met liganden die een hoge affiniteit hebben voor de uitgescheiden analytische eiwitmoleculen.

Vervolgens worden cellen geïntegreerd op de gefunctionaliseerde sensorchips om hun secreties in ruimte en tijd te meten. De resultaten laten zien dat eiwitsecreties van individuele cellen zowel ruimtelijk als tijdelijk kunnen worden gekarteerd zonder de noodzaak voor labeling. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van intercellulaire communicatie, zoals hoe paracriene en autocriene signaalroutes de celmobiliteit beheersen.

Om deze procedure te beginnen, deponeert u een 10 nanometer chroom dunne film op eerder gereinigde dekselglasjes door elektronenbundelverdamping om ladingeffecten te voorkomen tijdens het patternen en beeldvorming van nanostructuren. Na deze spin, de eerste laag van bi-layer resist bestaande uit ethyllactaat, methylmethacrylaat copolymer op 2000 RPM gedurende 45 seconden. Bak vervolgens het substraat op 150 graden Celsius na het laten afkoelen van het substraat tot kamertemperatuur.

Spin de tweede laag van polymethylmethacrylaat op 3000 RPM gedurende 45 seconden en bak het substraat op 150 graden Celsius. Pattern. De bi-layer resist met behulp van elektronenbundel lithographie of EBL. Ontwikkel met isopropyl alcohol of IPA methyl isobutyl keton, of MIBK in een twee tot één verhouding en spoel af met IPA.

Verwijder chroom van het ontwikkelde gebied van nanostructuren via natte etsen met CR zeven etsen gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur en spoel vervolgens in gedeïoniseerd, gedistilleerd water. Deponeer een titanium goud film op het substraat met behulp van de elektronenbundel evaporator na de goud depositie. Lift off de copolymer bi-layer. Resist door het substraat gedurende vier uur in aceton te weken.

Inspecteer vervolgens het substraat met behulp van een scanning elektronenmicroscoop om de vorm en grootte van de nanostructuur te bevestigen. De resulterende nanostructuren zijn typisch gescheiden door een pitch van 300 nanometer. 20 bij 20 arrays van nanostructuren worden 30 micrometer van centrum tot centrum geplaatst.

Met voldoende ruimte voor cel beeldvorming, zal een typische chip 300 arrays bevatten. Verwijder het resterende chroom van het substraat via natte rand door gebruik te maken van CR zeven etsen gedurende 60 seconden bij kamertemperatuur. Spoel vervolgens het substraat in gedeïoniseerd gedistilleerd water.

Inspecteer vervolgens een subset van arrays met behulp van de atoomkrachtmicroscoop voor de verificatie van grootte en uniformiteit. Deze gepatternde glazen dekselglasjes kunnen meerdere keren worden gebruikt, zolang de juiste reinigingsprocedures worden gevolgd voor het reinigen en regenereren van de gelokaliseerde oppervlakteplasma en resonantie of LSPR chips. Plasma as met een vermogen van 40 watt in een 300 milli tot mengsel van 5% waterstof en 95% argon gedurende 45 seconden.

Functionaliseer het gouden oppervlak en de nanostructuren onmiddellijk na plasma assen. Door de chip in een twee componenten ethanol thiol oplossing te dompelen die bestaat uit een drie tot één verhouding van SPO en SPC. Laat de chip overnacht in de thiol oplossing om een zelf-geassembleerde monolaag te vormen, spoel hem af met ethanol en droog met stikstofgas laad de LSPR chip binnen een op maat gemaakte microfluïdische houder door de chip op een aluminium onderdeel te plaatsen.

Vervolgens legt u de chip tussen dit onderdeel en een siliconen pakking en een doorzichtige plastic bovenstuk met behulp van vier schroeven om de samenstelling te klemmen. Voor een typische SPC gebaseerde thiol toepassing, druppelcoat 300 microliters van een een op een mengsel van 133 millimolar EDC en 33 millimolar NHS in gedeïoniseerd gedistilleerd water om de carboxyl groepen van de SPC thiol component te activeren. Wacht 10 minuten, spoel het oppervlak handmatig met 10 millimolar PBS en koppel de geactiveerde carboxyl groep met de ligand van belang door 300 microliters van de ligand oplossing te druppelcoaten.

Na het wachten van een uur en het spoelen van het oppervlak met 10 millimolar PBS druppelcoat, 300 microliters van 0,1 molaire ethanolamine in PBS op de chip om niet-specifieke binding te minimaliseren. Wacht 10 minuten, was de ethanolamine met PBS bevattend 0,005%tussen 20 of PBST 20. Plaats vervolgens een kwarts stuk bovenop de chip om schommelingen in de gegevens gerelateerd aan een veranderende meniscus te verminderen.

Houd de chip vochtig met PBST 20 buffer tijdens het monteren op de microscoop. Bevestig de microfluïdische buis aan de samenstelling en laat buffer stromen tot een stabiele toestand is bereikt. Plaats vervolgens de LSPR chip samenstelling stevig in de verwarmde stage steun.

De optische opstelling voor deze methode wordt hier getoond. Het licht van de halogeenlamp wordt door een 593 nanometer lange pas filter geleid om golflengten te elimineren, die niet bijdragen aan de nano plasmonische respons. Het licht wordt vervolgens lineair gepolariseerd en het monster wordt beschenen via een 40 x 1,4 numerieke apertuur objectief voor de excitatie van de plasmonische gouden nanostructuren.

Het verstrooide licht wordt verzameld door het objectief en geleid door een gekruiste polarisator om het achtergrondsignaal van het glazen substraat te verminderen. Een 50 50 straaldooser wordt in de verzamelde lichtbaan geplaatst voor gelijktijdige spectroscopische en beeldvormingsanalyse. Laat de samenstelling en microscoop ten minste twee uur gelijkwaardig worden voordat u de chip uitlijnt met behulp van de joystick zodat de centrale array is uitgelijnd met de glasvezel voor spectroscopie.

Na het kweken en pelleteren van hybride DOMA cellen door centrifugatie, oogst ze vervolgens en test voor levensvatbaarheid voordat u ze introduceert op de LSPR chips. Introduceer vervolgens 50 microliters van de cel oplossing handmatig op de LSPR chips met een micropipet.