Name: Early Viral Entry testsystemen voor de identificatie en evaluatie van antivirale verbindingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Leer hoe je vroege virale entry-testsystemen gebruikt voor de identificatie en evaluatie van antivirale verbindingen. Dit protocol maakt gebruik van luciferase-assays en HUH 7.5-cellen om mechanismen van virale entry-remming te onderzoeken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie wordt ondersteund door financiering van het Taipei Medical University Hospital (102TMU-TMUH-19) en het Ministerie van Wetenschap en Technologie van Taiwan (MOST103-2320-B-038-031-MY3).

Let op: Zorg ervoor dat alle procedures waarbij celcultuur en virusinfectie worden uitgevoerd in gecertificeerde bioveiligheid kappen, dat geschikt is voor de bioveiligheid niveau van de monsters worden behandeld zijn. Voor het beschrijven van de protocollen wordt Gaussia luciferase reporter-gelabeld HCV als model virus 32. In het kader van de representatieve resultaten zijn de verbindingen chebulagic acid (ChLA) en punicalagin (PUG) worden gebruikt als kandidaat antivirale middelen die virale glycoproteïne interacties met celoppervlak glycosaminoglycanen richten tijdens de vroege virale binnenkomst stap 31. Heparine, waarvan bekend is te interfereren met de komst van veel virussen 30,31,33,34, wordt gebruikt als een positieve controlebehandeling in dergelijke context. Voor eenvoudige achtergrond op virologie technieken, verspreiding van virussen, bepaling van de virustiter, en expressie van infectieuze dosis in plaque-vormende eenheden (PFU), richten eenheden (FFU), of een veelvoud van infectie (MOI), de lezer is redoeld referentie 35. Voorafgaande voorbeelden en geoptimaliseerde omstandigheden voor virussen in de representatieve resultaten wordt verwezen naar referenties 30-32,36-39 alsmede gegevens in tabel 1, figuur 1A en figuur 2A weergegeven. 1. Cel Cultuur, Compound Voorbereiding en Compound cytotoxiciteit <ol><li> Groeien de respectievelijke cellijn voor virusinfectie systeem te analyseren (tabel 1). Voor HCV, groeit de Huh-7,5-cellen in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 200 U / ml penicilline G, 200 ug / ml streptomycine, en 0,5 ug / ml amfotericine B. </li><li> Bereid de testverbindingen en controles met behulp van hun respectievelijke oplosmiddelen: bijvoorbeeld oplossen ChLA en PUG in dimethylsulfoxide (DMSO); heparine bereiden in steriel dubbel gedestilleerd water. Voor alle volgende verdunningen, gebruiken cultuur media. Opmerking: De laatste concentrantsoen van DMSO in de test verbinding behandelingen minder dan 1% in de experimenten; 1% DMSO wordt opgenomen als een negatieve controle behandeling in de assays voor vergelijking. </li><li> Bepaal de cytotoxiciteit van de testverbindingen (bijv ChLA en PUG) op de cellen van de virale infectie door een cellevensvatbaarheid bepalen reagens zoals XTT (2,3-bis [2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl] -5-fenylamino) carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide): <ol><li> Voor HCV, zaad Huh-7,5-cellen in een 96-putjes plaat (1 x 10 4 cellen per putje) en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator O / N om een monolaag te verkrijgen. </li><li> Breng DMSO control (1%) en toenemende concentraties van de testverbindingen ChLA en PUG (ex. 0, 10, 50, 100 en 500 uM) aan de kweekputjes in drievoud. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 72 uur, vervolgens het medium in de plaat weggooien en was de cellen met 200 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tweemaal. </li><li> Voeg 100 ul van assaying oplossing van de XTT-gebaseerde in vitro toxicologie assay kit aan elk putje en incubeer de platen bij 37 ° C gedurende nog 3 uur tot XTT laten formazanproductie. </li><li> Bepaal de absorptie met een microplaat reader bij een test golflengte van 492 nm en een referentie golflengte van 690 nm. </li><li> Bereken het percentage overlevende cellen met de volgende formule: levensvatbaarheid van de cellen (%) = At ​​/ Al x 100%, waarbij &quot;in&quot; en &quot;Al&quot; naar de absorptie van de testverbindingen en oplosmiddelcontrole (ex 1% DMSO. ) behandelingen, respectievelijk. Bepaal de concentratie van 50% cellulaire cytotoxiciteit (CC50) van de testverbindingen in analytisch software zoals GraphPad Prism volgens het protocol van de fabrikant. </li></ol></li></ol> 2. Uitlezing van virale infectie Opmerking: Het uitlezen van virale infectie is afhankelijk van het virus wordt gebruikt en kunnen werkwijzen zoals plaque assays of mea betrekkensuring reporter signalen van reporter-gelabeld virussen. Werkwijze voor het detecteren van reporter-HCV-infectie op basis van het luciferase reporter-activiteit wordt hieronder beschreven. <ol><li> Verzamel de supernatanten van de geïnfecteerde putjes en verduidelijkt bij 17.000 xg in een microcentrifuge gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Meng 20 pl supernatant proef 50 ui luciferase substraat tegen de Gaussia luciferase assay kit en direct te meten met een luminometer volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Express HCV infectiviteit als log 10 relatieve lichteenheden (RLU) voor het bepalen van virale remming (%) en bereken de 50% effectieve concentratie (EC50) van de testverbindingen tegen HCV-infectie via algoritmen van GraphPad Prism software volgens het protocol van de fabrikant. </li></ol> 3. Viral Inactivering Assay Opmerking: Voorbeelden van incubatieperiode en virale dosis voor verschillende virussen eenre weergegeven in figuur 1A. Hogere concentraties van het virus kan ook getest worden door verhoging van de MOI / PFU. <ol><li> Seed Huh-7,5-cellen in een 96-putjes plaat (1 x 10 4 cellen per putje) en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator O / N om een monolaag te verkrijgen. </li><li> Incubeer de test verbindingen of controles (uiteindelijke concentraties zijn: ChLA = 50 uM; PUG = 50 uM; heparine = 1000 ug / ml; DMSO = 1%) met het HCV-deeltjes bij 37 ° C (Figuur 1A, &#39;Long-Term&#39; ) in een 1: 1 ratio. Bijvoorbeeld, een 100 ul virus inoculum bevattende 1 x 10 4 FFU, voeg 100 ul van een 100 uM ChLA werkverdunning; Dit levert ChLA behandeling bij een uiteindelijke concentratie van 50 uM. </li><li> Verdun de virus-drug mengsel &quot;subtherapeutische&quot; (effectief) concentratie van de testverbindingen. Bijvoorbeeld, de ineffectieve concentratie ChLA en PUG tegen HCV is 1 uM 31; daaromDit vereist een 50-voudige verdunning van het virus-drug mengsel dat kan worden bereikt met 9,8 ml basismedium (celcultuur medium met 2% FBS). Opmerking: De verdunning tot subtherapeutische concentraties voorkomt significante interactie tussen de proefverbindingen en de gastheercel oppervlak en maakt onderzoek behandelingseffect op het celvrije virions. Merk op dat deze verdunning is afhankelijk van de antivirale dosis respons van de testverbindingen tegen de specifieke virale infectie, en voor het uitvoeren van deze specifieke test 31 bepaald. </li><li> Ter vergelijking, meng het virus met de test verbindingen en onmiddellijk te verdunnen (geen incubatietijd) tot sub-therapeutische concentratie voorafgaand aan de infectie (Figuur 1A, &#39;korte termijn&#39;). </li><li> Voeg 100 ul van de verdunde HCV-geneesmiddelmengsel op de Huh-7,5 celmonolaag (de hoeveelheid virus is nu 1 x 10 2 FFU; uiteindelijke MOI = 0,01) en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C om virale toestaanadsorptie. </li><li> Naar aanleiding van de infectie, verwijder de verdunde inocula en voorzichtig wassen van de putjes met 200 pl PBS tweemaal. Opmerking: Voer het wassen voorzichtig opheffen van de cellen te voorkomen. </li><li> Breng 100 pi basaal medium aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 72 uur. </li><li> Analyseer de resulterende infectie door testen van het supernatans van luciferaseactiviteit zoals beschreven in &quot;2. Uitlezing van de virale infectie &#39;. </li></ol> 4. Viral Attachment Assay Opmerking: Voorbeelden van incubatieperiode en virale dosis voor verschillende virussen zijn opgenomen in figuur 2A, &#39;Bijlage&#39;. Hogere concentraties van het virus kan ook getest worden door verhoging van de MOI / PFU. <ol><li> Seed Huh-7,5-cellen in een 96-putjes plaat (1 x 10 4 cellen per putje) en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator O / N om een monolaag te verkrijgen. </li><li> Pre-chill de celmonolagen in platen bij 4 ° C for 1 uur. </li><li> Co-behandeling van de cellen met HCV inoculum (MOI = 0,01) en testverbindingen en controles (uiteindelijke concentraties: ChLA = 50 uM; PUG = 50 uM; heparine = 1000 ug / ml; DMSO = 1%) bij 4 ° C gedurende 3 hr. Bijvoorbeeld, een 90 ul virus inoculum bevattende 1 x 10 2 FFU, voeg 10 ul van een 500 uM ChLA werkverdunning; Dit levert ChLA behandeling bij een uiteindelijke concentratie van 50 uM en een infectie met HCV bij MOI = 0,01 op de cel monolaag. Opmerking: Het is belangrijk om het experiment uit te voeren bij 4 ° C heeft, aangezien het virus binden maar uitsluit ingang die het meest efficiënt optreedt bij 37 ° C. Voer de toevoeging van virus en testverbindingen op ijs en de daaropvolgende incubatie op 4 ° C koelkast zodat de temperatuur op 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant en voorzichtig wassen van de monolaag met 200 ul ijskoude PBS tweemaal. Opmerking: Voer het wassen voorzichtig opheffen van de cellen te voorkomen &lt;./ li&gt; <li> Breng 100 pi basaal medium aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 72 uur. </li><li> Analyseer de resulterende infectie door testen van het supernatans van luciferaseactiviteit zoals beschreven in &quot;2. Uitlezing van de virale infectie &#39;. </li></ol> 5. Virale Entry / Fusion Assay Opmerking: Voorbeeld van de incubatietijd en virale dosis voor verschillende virussen worden in figuur 2A &#39;Entry / Fusion&#39; genoemd. Hogere concentraties van het virus kan ook getest worden door verhoging van de MOI / PFU. <ol><li> Seed Huh-7,5-cellen in een 96-putjes plaat (1 x 10 4 cellen per putje) en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator O / N om een monolaag te verkrijgen. </li><li> Pre-chill de cel monolagen in platen bij 4 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Infecteren de cellen met HCV (MOI = 0,01) bij 4 ° C gedurende 3 uur. Gebruik bijvoorbeeld een 100 ul virusinoculum met 1 x 10 2 FFU. Opmerking: Voer de additie van het virale inoculum op ijs en de daaropvolgende incubatie op 4 ° C koelkast de temperatuur op 4 ° C, waarbij de virale binding, maar niet inreisvergunningen handhaven. </li><li> Verwijder het supernatant en voorzichtig wassen van de cel monolagen met 200 ul ijskoude PBS tweemaal. Opmerking: Voer het wassen voorzichtig opheffen van de cellen te voorkomen. </li><li> Behandel de putjes met de testverbindingen en controles (uiteindelijke concentraties: ChLA = 50 uM; PUG = 50 uM; heparine = 1000 ug / ml; = 1% DMSO) en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur. Bijvoorbeeld, voeg 10 ul van een 500 uM ChLA werkverdunning tot 90 ul van de media, mengen, en behandel de putten; Dit levert ChLA behandeling bij een uiteindelijke concentratie van 50 uM. Opmerking: De verschuiving van 4 ° C tot 37 ° C maakt nu het virale entry / samensmelting en maakt derhalve de beoordeling van het effect testverbindingen &#39;op deze bepaalde stap. </li><li> Zuig het geneesmiddel-bevattende supernatant en verwijder niet-geïnternaliseerdeextracellulaire virussen door ofwel wassen met 200 gl citraat buffer (50 mM natriumcitraat, 4 mM kaliumchloride, pH 3,0) of PBS. Breng 100 pi van het basismedium vóór incubatie bij 37 ° C gedurende 72 uur. </li><li> Analyseer de resulterende infectie door testen van het supernatans van luciferaseactiviteit zoals beschreven in &quot;2. Uitlezing van de virale infectie &#39;. </li></ol>

<ol><li>Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+vaccines%3A+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">HIV vaccines: progress to date.</a> Drugs. 71, 387-414 (2011).</li>
<li>Rothman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+to+dengue+virus%3A+a+tale+of+original+antigenic+sin+and+tropical+cytokine+storms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms.</a> Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).</li>
<li>Sung, H., Schleiss, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+current+status+of+cytomegalovirus+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Update on the current status of cytomegalovirus vaccines.</a> Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).</li>
<li>Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+development+of+preventive+and+therapeutic+vaccines+for+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus.</a> J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).</li>
<li>Wright, M., Piedimonte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+prevention+and+therapy%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future.</a> Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).</li>
<li>Christou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+bacterial+and+viral+zoonotic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">The global burden of bacterial and viral zoonotic infections.</a> Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).</li>
<li>Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+socio-ecology+of+zoonotic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">The socio-ecology of zoonotic infections.</a> Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).</li>
<li>Grais, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measles+vaccination+in+humanitarian+emergencies%3A+a+review+of+recent+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Confl+Health%22%5BJournal%5D)">Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice.</a> Confl Health. 5, 21(2011).</li>
<li>Gautret, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+viral+respiratory+tract+infections-environmental+risk+factors+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission.</a> Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).</li>
<li>Sampathkumar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle+East+respiratory+syndrome%3A+what+clinicians+need+to+know%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know.</a> Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).</li>
<li>Burd, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+Virus%3A+a+Clear+and+Present+Danger%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ebola Virus: a Clear and Present Danger.</a> J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).</li>
<li>Bishop, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+and+Emerging+Treatment+Options+for+Ebola+Virus+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease.</a> Ann Pharmacother. , (2014).</li>
<li>Arduino, P. G., Porter, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+and+perioral+herpes+simplex+virus+type+1+%28HSV-1%29+infection%3A+review+of+its+management%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management.</a> Oral Dis. 12, 254-270 (2006).</li>
<li>Mitrasinovic, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+structure-based+design+of+the+influenza+A+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors.</a> Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).</li>
<li>Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+acting+antivirals+against+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Directly acting antivirals against hepatitis C virus.</a> J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).</li>
<li>Haqqani, A. A., Tilton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+inhibitors+and+their+use+in+the+treatment+of+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection.</a> Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).</li>
<li>Melby, T., Westby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Exp+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of viral entry.</a> Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).</li>
<li>Vanderlinden, E., Naesens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+antiviral+strategies+to+interfere+with+influenza+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry.</a> Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).</li>
<li>Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+targeted+therapeutics%3A+a+new+era+of+anti-herpes+simplex+virus-1+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics.</a> Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).</li>
<li>Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatitis+C+virus+life+cycle+as+a+target+for+new+antiviral+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies.</a> Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).</li>
<li>Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New-generation+screening+assays+for+the+detection+of+anti-influenza+compounds+targeting+viral+and+host+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions.</a> Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).</li>
<li>Kilianski, A., Baker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+antiviral+screening+against+coronaviruses%3A+developing+virus-specific+and+broad-spectrum+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors.</a> Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).</li>
<li>Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerases+of+hepatitis+C+viruses+and+flaviviruses%3A+structural+and+mechanistic+insights+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development.</a> Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).</li>
<li>Frey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+cell-cell+fusion+induced+by+the+envelope+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 69, 1462-1472 (1995).</li>
<li>Tscherne, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-+and+temperature-dependent+activation+of+hepatitis+C+virus+for+low-pH-triggered+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry.</a> J Virol. 80, 1734-1741 (2006).</li>
<li>Madan, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+umbrellas%3A+a+novel+class+of+candidate+topical+microbicides+to+prevent+human+immunodeficiency+virus+and+herpes+simplex+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections.</a> J Virol. 81, 7636-7646 (2007).</li>
<li>Haywood, A. M., Boyer, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+and+temperature+dependence+of+influenza+virus+membrane+fusion+at+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH.</a> J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).</li>
<li>Haywood, A. M., Boyer, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sendai+virus+membrane+fusion%3A+time+course+and+effect+of+temperature%2C+pH%2C+calcium%2C+and+receptor+concentration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration).</a> Biochemistry. 21, 6041-6046 (1982).</li>
<li>Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+cells+by+Sindbis+virus+at+low+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Infection of cells by Sindbis virus at low temperature.</a> Virology. 362, 461-467 (2007).</li>
<li>Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolyzable+tannins+%28chebulagic+acid+and+punicalagin%29+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> J Virol. 85, 4386-4398 (2011).</li>
<li>Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiol. 13, 187(2013).</li>
<li>Marukian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-produced+hepatitis+C+virus+does+not+infect+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells.</a> Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).</li>
<li>Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfated+polysaccharides+are+potent+and+selective+inhibitors+of+various+enveloped+viruses%2C+including+herpes+simplex+virus%2C+cytomegalovirus%2C+vesicular+stomatitis+virus%2C+and+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+ChemotheR%22%5BJournal%5D)">Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus.</a> Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).</li>
<li>Barth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+binding+of+hepatitis+C+virus+envelope+glycoprotein+E2+requires+cell+surface+heparan+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+CheM%22%5BJournal%5D)">Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate.</a> J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+Virology%22">Principles of Virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Brown, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+caspase-dependent+apoptosis+in+antibody-enhanced+dengue+virus+infection+of+human+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells.</a> J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+host+responses+to+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29+following+intranasal+administration+of+a+Protollin-adjuvanted%2C+epitope-enhanced+recombinant+G+protein+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine.</a> J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).</li>
<li>Isaacson, M. K., Compton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus+glycoprotein+B+is+required+for+virus+entry+and+cell-to-cell+spread+but+not+for+virion+attachment%2C+assembly%2C+or+egress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress.</a> J Virol. 83, 3891-3903 (2009).</li>
<li>Leonard, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measles+virus+blind+to+its+epithelial+cell+receptor+remains+virulent+in+rhesus+monkeys+but+cannot+cross+the+airway+epithelium+and+is+not+shed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed.</a> J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).</li>
<li>Ciesek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+tea+polyphenol%2C+epigallocatechin-3-gallate%2C+inhibits+hepatitis+C+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry.</a> Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).</li>
<li>Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saikosaponin+b2+is+a+naturally+occurring+terpenoid+that+efficiently+inhibits+hepatitis+C+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry.</a> J Hepatol. 62, 541-548 (2015).</li>
<li>Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+methods+for+influenza+antiviral+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Screening methods for influenza antiviral drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).</li>
<li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+virus+inhibitors+by+influenza+A+virus+specific+reporter+cell+based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening.</a> Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen concurrentie-belangen bestaan.

In dit rapport werden de methoden beschreven om antivirale verbindingen te identificeren en evalueren op basis van een mechanistische benadering van het ontleden van de vroege virale binnenkomstgebeurtenissen. Specifiek maakten de assays het mogelijk om het effect van testverbindingen op vrije virusdeeltjes, virale binding en virale binnenkomst/fusie te onderzoeken. Kritische stappen werden geïmplementeerd om het effect van het medicijn op de specifieke fase van de vroege virale binnenkomst duidelijk te evalueren. Bijvoorbeeld, in de ‘virale inactiveringstest’, voorkomt het verdunnen van het virus-geneesmiddelmengsel tot subtherapeutische concentratie significante interactie tussen de testverbinding en het oppervlak van de gasthercelk door de ‘titratieverwijdering’ van het medicijn. Dit zorgt ervoor dat het remmende effect dat wordt waargenomen op de daaropvolgende infectie van de gasthercelk te wijten is aan een directe interactie tussen de testverbinding en de celvrije virionen, in plaats van een effect van de testverbinding op het gasthercelmembraan of membraangebonden moleculen, inclusief virale receptoren30. Evenzo, de temperatuurverschuiving tussen 4 °C (die virusbinding toestaat maar geen binnenkomst) en 37 °C (die virusbinnenkomst/fusie vergemakkelijkt) in de ‘virale bindingstest’ en ‘virale binnenkomst/fusietest’ zijn cruciaal om het effect van de testverbinding op elk van deze specifieke gebeurtenissen te bepalen. Dit is mogelijk vanwege de temperatuurgevoeligheid van omhulde virussen tijdens deze stappen in de infectie24-29. Het is daarom belangrijk dat de tests worden uitgevoerd bij de aangegeven temperatuur om de nauwkeurigheid van de resultaten te garanderen; bijvoorbeeld door het experiment op ijs uit te voeren om de temperatuur op 4 °C te houden en door het monster direct in een 37 °C incubator te plaatsen voor de temperatuurverschuiving. Bovendien helpt het gebruik van negatieve (bijv. DMSO-oplosmiddel voor de bereiding van geneesmiddelen) en positieve (bijv. heparinebehandeling) controles ook om de nauwkeurigheid van de tests verder te bevestigen. De bruikbaarheid en toepasbaarheid van dergelijke methoden is aangetoond in veel antivirale onderzoeken26,30,31,40,41. Merk op dat heparine, hoewel het als controle is opgenomen voor alle drie de tests in de context van de representatieve resultaten, meestal de initiële virusbinding blokkeert in plaats van de daaropvolgende fusie/binnenkomststap (zoals weerspiegeld door de gegevens in Figuur 2). Er kunnen ook aanvullende controles worden gebruikt, zoals neutraliserende antilichamen gericht tegen het virus (voor virale inactiveringstest), antilichamen die de celoppervlaktereceptoren voor het virus maskeren (voor virale bindingstest) en membraanfusieremmende middelen (voor virale fusie/binnenkomsttest). 
De assays die in dit rapport worden beschreven, die specifiek zijn voor de vroege stadia van de virale infectie, zijn nuttig in termen van toepassing als secundaire tests om het werkingsmechanisme van kandidaatgeneesmiddelen uit primaire screeningstests te karakteriseren, die doorgaans breder gericht zijn op de virale infectie. Alternatief kunnen ze ook worden opgenomen in primaire screeningstests als men specifiek op zoek is naar remmers van vroege virale binnenkomst, inclusief virusinactiverende middelen, virale bindingsantagonisten en remmers voor virale binnenkomst/fusie. In dit geval maakt hun gebruik een meer gerichte en nauwkeurige schermanalyse mogelijk voor de identificatie van mechanisme-specifieke antivirale kandidaten, wat op zijn beurt de downstream-geneesmiddelontwikkeling zou versnellen. 
Het gebruik van celgebaseerde assays bij het identificeren van antivirale middelen biedt verschillende belangrijke voordelen in vergelijking met biochemische assays, waaronder het onthullen van mogelijke off-targeteffecten (zoals cytotoxiciteit) en het toevoegen van fysiologische relevantie aan de bioactiviteit van de geteste middelen42. Deze kwesties zijn belangrijke overwegingen bij het beslissen of een kandidaatmiddel van waarde is voor voortzetting in volgende fasen van de geneesmiddelontwikkeling. Evenzo, de vroege virale binnenkomstspecifieke assays die in dit rapport worden beschreven, maken onderzoek van het effect van het medicijn op de verschillende virale binnenkomstfase op cellulair niveau mogelijk, en meer specifiek in de context van een authentieke virale infectie in vitro. De resultaten die uit dergelijke assays worden verkregen, zouden daarom helpen de antivirale werkzaamheid van de testverbindingen beter te voorspellen en ook potentieel ongewenste off-targeteffecten tegen de gasthercelk te identificeren. Een potentiële beperking is echter dat een in vitro celgebaseerde assay mogelijk niet volledig de werkelijke in vivo binnenkomststap weerspiegelt in de context van een natuurlijke virale infectie. Desondanks dienen de in dit protocol gepresenteerde assays als een analytisch platform voor mechanisme-gebaseerde identificatie en evaluatie van nieuwe antivirale middelen.
De ontwikkeling van reportervirussen of reportercelsystemen om de hoeveelheid virale infectie te kwantificeren heeft de celgebaseerde screening en evaluatie van antivirale middelen aanzienlijk vergemakkelijkt. Voorbeelden zijn het gebruik van recombinante virussen die een reportergen dragen of door middel van recombinante menselijke cellijnen die een reportergen bevatten dat wordt aangedreven door de specifieke viruspromoter31,43. In dit rapport kan de infectie van luciferase-gelabelde HCV gemakkelijk worden gemonitord door de reporter signaal te kwantificeren, waardoor de gegevensanalyse wordt vergemakkelijkt. Door deze nuttige reporter-gebaseerde hulpmiddelen op te nemen, kunnen de hier beschreven vroege virale binnenkomst assays essentieel worden aangepast in een high-throughput formaat voor mechanisme-gebaseerde screening van kleine molecuulbibliotheken.
Kortom, er werd een protocol beschreven voor assays die de vroege virale binnenkomst ontleden als middel om mechanisme-specifieke antivirale verbindingen te identificeren en evalueren. Dergelijke assays zouden nuttig zijn voor het ontdekken van nieuwe antagonisten/remmers voor virale binnenkomst en zouden helpen de reikwijdte van antivirale middelen voor ontwikkeling als profylactisch en/of therapeutische behandelingen uit te breiden.

Virale infecties vormen een constante bedreiging voor de volksgezondheid en een belangrijke oorzaak van epidemische ziekten, morbiditeit en sterfgevallen wereldwijd. Specifieke controlemethoden tegen virale infecties omvatten vaccinontwikkeling en antivirale therapieën. Terwijl vaccininspanningen succesvol zijn gebleken bij het immuniseren tegen verschillende virussen, blijven veel virale pathogenen zonder beschermend vaccin, waaronder denguevirus (DENV), humaan cytomegalovirus (HCMV), hepatitis C-virus (HCV), humaan immunodeficiëntievirus (HIV) en respiratoir syncytieel virus (RSV)1-5. Antivirale middelen spelen daarentegen een belangrijke rol bij de behandeling van deze virale infecties wanneer profylactische vaccins niet beschikbaar zijn. Tot op heden zijn er echter slechts weinig goedgekeurde en kosteneffectieve antivirale geneesmiddelen beschikbaar in vergelijking met het aantal virale pathogenen dat de volksgezondheid bedreigt. Belangrijker nog, door een toename in wereldwijde reizen en snelle urbanisatie, wordt de situatie verergerd door de risico's van epidemische uitbraken van opkomende/opnieuw opkomende virale infecties die worden geïntroduceerd in niet-inheemse gebieden6. Recente uitbraken veroorzaakt door het ernstige acute respiratoire syndroom (SARS) virus, influenzavirussen (H1N1, H5N1, H3N2 en H7N9), DENV, West-Nijlvirus (WNV), mazelenvirus (MV), Midden-Oosten respiratoir syndroom (MERS) virus en Ebolavirus6-12 zijn enkele voorbeelden die de noodzaak van ontwikkeling van antivirale middelen weerspiegelen wanneer immunisatie en/of therapieën niet beschikbaar zijn. Bovendien is er altijd een potentieel risico op het genereren van geneesmiddelresistente infecties met momenteel gebruikte antivirale middelen. Daarom is de continue ontwikkeling en uitbreiding van het bereik van antivirale middelen voor deze opkomende/opnieuw opkomende virale infecties noodzakelijk om betere beheerstrategieën te bieden en de volksgezondheid te beschermen.
De meeste antivirale therapieën bestaan uit direct werkende antivirale middelen (DAA's) die zich richten op een specifiek virologisch eiwit of cofactor dat belangrijke stappen in de virale levenscyclus mediëert. Bijvoorbeeld, het nucleoside-analoog Acyclovir remt herpesvirus DNA-polymerase, proteaseremmers Boceprevir en Telaprevir antagoniseren de HCV NS3, en Oseltamivir en Zanamivir zijn neuraminidaseremmers die de afgifte van influenzavirusdeeltjes uit geïnfecteerde cellen blokkeren13-15. Er zijn echter zeer weinig goedgekeurde virale toegangsremmers, inclusief Enfuvirtide, dat zich richt op HIV gp41 om fusie te voorkomen, en Maraviroc, dat het HIV co-receptor CCR5 blokkeert, waardoor virale toegang wordt voorkomen16. Het verkennen van nieuwe antagonisten/remmers voor virale toegang zou kunnen helpen bij het leveren van aanvullende therapeutischa voor profylactisch of therapeutisch gebruik, zoals in combinatie met andere antivirale middelen met een ander werkingsmechanisme om virale infecties beter te behandelen17-19.
Identificatie van antivirale middelen kan structureel begeleide geneesmiddelontwikkeling en op screening gebaseerde strategie voor kandidaat-geneesmiddelen omvatten. Methoden voor het beoordelen van de antivirale activiteit van testmiddelen omvatten biochemische assays van enzymatische activiteit en evaluatie door celgebaseerde systemen20-23. In celgebaseerde systemen kan de virale levenscyclus worden ontleed in verschillende stadia van infectie, zoals toegangsgebeurtenissen (aanhechting, fusie, ontsluiting), de replicatiefase (virale genoomreplicatie en eiwittranslatie) en virionuittreding (assemblage, rijping en afgifte). Omdat de assays kunnen worden aangepast om elk specifiek stadium te onderzoeken met behulp van verschillende hulpmiddelen en methoden, maakt deze aanpak de identificatie/onderzoek mogelijk van potentiële kandidaat-antivirale middelen met een specifiek werkingsmechanisme dat zich richt op het specifieke stadium dat wordt geanalyseerd. Om bijvoorbeeld het effect van geneesmiddelen specifiek op de vrije virusdeeltjes vóór binding aan de gastheercel te analyseren, kan een 'virale inactiveringstest' worden uitgevoerd. In deze test wordt het virus toegestaan om te incuberen met het testgeneesmiddel en vervolgens verdund om het geneesmiddel te titeren voordat het een celmonolaag infecteert. Aanvullende stappen zoals virale aanhechting en entree/fusiestadia kunnen ook afzonderlijk worden geanalyseerd, door de temperatuur tijdens de infectie te veranderen. Voor veel omhulde virussen wordt virale entree/fusie aan het gastheercelmembraan sterk vergemakkelijkt bij 37 °C, maar wordt meestal voorkomen bij 4 °C, wat de virusbinding niet beïnvloedt24-29. Ten slotte zou het gebruik van reportervirussen of celsystemen deze studies kunnen vergemakkelijken en een hoogdoorvoeranalyse mogelijk maken.
We hebben eerder de celgebaseerde aanpak toegepast en de vroege entree van verschillende omhulde virussen ontleed voor de onderzoek van antivirale verbindingen die mogelijk virale toegang antagoniseren30,31. Hierin worden de verschillende gebruikte methoden beschreven, waaronder virale inactivering, virale aanhechting en virale entree/fusie-assays.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>In vitro toxicology assay kit, XTT-based</td><td>Sigma</td><td>TOX2</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>Thermo Scientific</td><td>89087-320</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002420</td><td></td></tr><tr><td>BioLux Gaussia luciferase assay kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300L&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Promega</td><td>GloMax-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate, dihydrate</td><td>Sigma</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr></tbody></table>

early viral entry testsystemen voor de identificatie en evaluatie van antivirale verbindingen

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Celgebaseerde systemen zijn nuttig voor het ontdekken van antivirale middelen. Het dissecteren van de virale levenscyclus, met name de vroege entreestadia, maakt een mechanistische benadering mogelijk om antivirale middelen te identificeren en evalueren die zich richten op specifieke stappen van de virale entree. In dit rapport worden de methoden voor het onderzoeken van virale inactivering, virale hechting en virale entree/fusie als antivirale assays voor dergelijke doeleinden beschreven, waarbij hepatitis C-virus als model wordt gebruikt. Deze assays zouden nuttig moeten zijn voor het ontdekken van nieuwe antagonisten/remmers voor vroege virale entree en helpen om de reikwijdte van kandidaat-antivirale middelen voor verdere medicijnontwikkeling uit te breiden.

In figuur 1 is de &quot;virale inactivatie assay werd uitgevoerd om te onderzoeken of twee specifieke natuurlijke verbindingen ChLA en PUG verschillende omhulde virussen in celvrije toestand kunnen inactiveren en voorkomen daaropvolgende infectie. De cytotoxiciteit en antivirale dosis-respons van deze verbindingen zijn voor het uitvoeren van de mechanistische studie 31 bepaald. De virussen werden voorbehandeld met testverbindingen en vervolgens de virus-drug mengsels werden verdund tot subtherapeutische concentraties voor enting op de betreffende cel monolaag per virussysteem. Zoals getoond in figuur 1, zowel ChLA en PUG bleek interactie met de celvrije virions, wat resulteert in onomkeerbare effecten die de cel monolaag beschermd tegen daaropvolgende infectie. De twee test-verbindingen bereikt een bijna 100% remming tegen HCMV, HCV en DENV-2, terwijl een 60-80% blok werd waargenomen tegen MV en RSV. Deze resultaten Suggest dat ChLA en PUG hebben directe invloed op deze vrije virusdeeltjes door het inactiveren van hen en het neutraliseren van hun besmettelijkheid. In figuur 2, de bevestiging en invoer / fusion assays werden uitgevoerd om het effect van ChLA en PUG staand tegen deze vroege virale binnenkomst gerelateerde gebeurtenissen van HCMV, HCV, DENV-2, MV en RSV. Zowel ChLA en PUG effectief voorkomen binding van de onderzochte virussen op de respectieve gastheercel zoals door remming op de resulterende virale infectie (figuur 2, &#39;Bijlage&#39;: licht grijze balken). Het remmende effect op virus attachment door beide verbindingen was vergelijkbaar met HCMV (figuur 2B), HCV (figuur 2C), DENV-2 (Figuur 2D) en RSV (figuur 2F), variërend van 90 - 100%. Anderzijds, PUG bleek effectiever dan ChLA tegen MV binding (figuur 2E) te zijn, waarbij de remming vanaf de two verbindingen variëren tussen 50 - 80%. De controlebehandeling heparine, waarvan bekend is dat de instroming van veel virussen, remde ook de bevestiging van HCMV, DENV-2, RSV, ad MV blokkeren, maar was minder efficiënt tegen HCV. De daaruit voortvloeiende &#39;viral entry / fusion-test&#39; onderzocht of ChLA en PUG behielden hun activiteit tijdens het virus entry / fusion fase (figuur 2, &#39;Entry / Fusion&#39;: donker grijze balken). Pas wanneer beide ChLA en PUG waargenomen effectief beïnvloeden het virale entry / smelttrap van de onderzochte virussen (Figuur 2B - F), waarbij een 50 - 90% beschermend effect op de respectievelijke cel monolaag. Heparine ook krachtig geremd invoer / fusion in DENV-2 en RSV-infecties, maar was minder effectief tegen HCMV, HCV, en MV (&lt;40% remming gemiddeld). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Virus </td><td> Cel Type </td></tr><tr><td> HCMV </td> &lt;td&gt; HEL </td></tr><tr><td> HCV </td><td> Huh-7.5 </td></tr><tr><td> DENV-2 </td><td> Vero </td></tr><tr><td> MV </td><td> CHO-SLAM </td></tr><tr><td> RSV </td><td> HEp-2 </td></tr></tbody></table> Tabel 1:. Gastheercel type voor virusinfectie Het gebruikte celtype voor elk viraal infectiesysteem in de representatieve resultaten beschreven aangegeven. Verdere details met betrekking tot de cellen zijn te vinden in referentie 31. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig1.jpg" /> Figuur 1. Inactivatie van virale infecties door de testverbindingen ChLA en PUG Verschillende virussen werden behandeld met de testverbindingen gedurende een lange periode. (Gedurende 1,5 - 3 uur voor titratie lichtgrijze staven) of korte (direct verdund; donkergrijs bars) bij 37 ° C bij een verdunning tot subtherapeutische concentratiestie en daaropvolgende analyse van besmetting van de respectieve gastheercellen. (A) Schema van het experiment (links getoond) met de laatste virusconcentratie (PFU / well of MOI), langdurige virus-drug incubatieperiode (i), en daaropvolgende incubatietijd (ii) aangegeven voor elk virus in de tabel rechts. Analyses voor (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, en (F) RSV worden in elke extra paneel. De resultaten worden uitgezet tegen de DMSO negatieve controle behandeling van virusinfecties en de getoonde data zijn gemiddelden ± standaardfouten van het gemiddelde (SEM) van drie onafhankelijke experimenten. Dit cijfer is aangepast uit referentie 31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig2.jpg" /> Figuur 2. Evaluatie van antivirale activiteiten van de testverbindingen ChLA en PUG tegen virussen bevestiging en invoer / fusion. (A) De experimentele procedure virusconcentratie (PFU / well of MOI) en het tijdstip van toevoeging en behandeling met testverbindingen (i, ii, iii) worden voor elk virus in de schema&#39;s en de bijbehorende tabellen. In virus attachment analyse (lichtgrijze staven), monolagen van verschillende celtypes was voorgekoeld bij 4 ° C gedurende 1 uur, vervolgens co-behandeling met deze virussen en testverbindingen bij 4 ° C (1,5 - 3 uur; i) voor het wassen van de ent en de testverbindingen voor daaropvolgende incubatie (37 ° C, ii) en onderzoek van virusinfectie. In virusingang / fusion analyse (donker grijze balken), geënte celmonolagen waren voorgekoeld bij 4 ° C gedurende 1 uur en daarna geprikkeld met deze virussen bij 4 ° C gedurende 1,5 - 3 uur (i). Cellen werden vervolgensgewassen en behandeld met de testverbindingen tegen incubatieperiode (ii) waarbij de temperatuur werd verschoven naar 37 ° C om het virale entry / samensmelting vergemakkelijken. Aan het einde van de incubatie werden extracellulaire virussen verwijderd door een citraatbuffer (pH 3,0) of PBS wast en de cellen werden verder geïncubeerd (iii) voor de analyse van virusinfectie. Resultaten voor (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, en (F) RSV worden in elke extra paneel. Gegevens worden uitgezet tegen de DMSO negatieve controle behandeling van virusinfecties en worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. Dit cijfer is aangepast uit referentie 31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier presenteren we een protocol dat specifieke stappen van de virale binnenkomst onderzoekt om nieuwe antivirale middelen te identificeren en te evalueren.

Early Viral Entry testsystemen voor de identificatie en evaluatie van antivirale verbindingen

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Het algemene doel van deze procedure is om het antivirale effect van testverbindingen op specifieke stappen van de vroege virale entry te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de gastheercellen uit te zaaien voor de virale infectie. De tweede stap is het uitvoeren van de virale infectie en de behandelingen met de testverbindingen op verschillende tijdstippen en temperaturen.Vervolgens worden de met het geneesmiddel behandelde inocula weggewassen en worden de cellen bedekt met basaal medium. De laatste stap is het incuberen van de cellen. Uiteindelijk wordt de virale infectiviteit geanalyseerd om de invloed van de testverbindingen op de vroege stappen van de virale enterie tijdens de virale infectie te bepalen.Een luminometer wordt bijvoorbeeld gebruikt om de luciferase-activiteit in de cel te beoordelen na infectie door een reportervirus. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een meer op mechanismen gebaseerde aanpak mogelijk maakt bij het identificeren van antivirale middelen, in het bijzonder die gericht zijn op de virale entry. Begin met het bereiden van voorraadoplossingen van de testverbindingen, trilogyzuur of CHLA en PUNIC collageen of PUG in DMSO; los heparine voor een positieve controle op in steriel dubbel gedestilleerd water om de gastheercellen voor de assay-cultuur voor te bereiden.Menselijke hepatocarcinoom-HUH 7.5-cellen gedurende een nacht in vers DMAM aangevuld met FBS en antibiotica. Vergeet niet om gedurende het gehele experiment de procedures voor biosafety level twee te volgen om de cytotoxiciteit van de testverbindingen te testen. Behandel de cellen met toenemende concentraties CHLA of PUG van 0 tot 500 micromolar verdund in basaal medium, of 1% DMSO als negatieve controle, en incubeer de cellen vervolgens gedurende 72 uur bij 37 graden Celsius in een celkweekincubator.Verwijder het medium en was de cellen tweemaal met 200 µL PBS. Voeg vervolgens 100 µL XT T assay-reagens toe en incubeer dit gedurende drie uur bij 37 °C. Gebruik daarna een microplate reader om de absorbentie bij 492 nm te bepalen met een referentiegolflengte van 690 nm.Bereken het percentage levensvatbaarheid aan de hand van een gegeven formule op basis van deze waarden. Bepaal de 50% cellulaire cytotoxiciteitsconcentraties voor elke verbinding. Begin vervolgens met de assay voor virale inactivatie.Eerste plaat, 1 × 10⁴ cellen per well. Incubeer de cellen in een 96-well plaat bij 37 °C met 5% CO2 gedurende de nacht zodat ze kunnen hechten voor infectie. Bereid Gaia-luciferase-reporter-getagde hepatitis C-virus- of HCV-partikels voor zoals beschreven in het tekstprotocol.Meng in een steriele buis 100 µL van 100 µM CHLA of PUG met 100 µL van 10⁴ focus-vormende eenheden (FFU) HCV voor een positieve controlemengeling. Meng HCV met heparine bij een eindconcentratie van 1000 µg/mL.Incubeer gedurende drie uur bij 37 °C. Verdun na drie uur het mengsel van virus en verbinding 50-voudig met 9,8 ml basaal medium bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens een nieuw mengsel van virus en verbinding en verdun dit mengsel onmiddellijk in basaal medium voor het incubatiemonster van nul uur.Verwijder het incubatiemedium van de cellen en voeg in triplicaat 100 µL van de verdunde virus-drugoplossing per well toe. De oplossing bevat nu 10² FFU per well. Incubeer gedurende drie uur bij 37 °C en 5% CO2 om virale infectie van de cellen mogelijk te maken. Verwijder na incubatie de virale suspensie uit de wells en was de cellen voorzichtig twee keer met 200 µL PBS.Incubeer de cellen gedurende 72 uur in 100 µL basaal medium voor virale replicatie en afgifte van de luciferase-reporter in het supernatant. Verzamel vervolgens het supernatant uit de culturen en microcentrifugebuisjes en centrifugeer dit gedurende vijf minuten bij 17 000 ×g bij 4 °C. Om celresten te verwijderen, mengt u 20 µL van elk supernatant met 50 µL Gaussia luciferase assay-reagens en meet u de luminescentie van de luciferase-reporteractiviteit in een luminometer.Volgens de instructies van de fabrikant voor de plaat voor de virale adhesie-assay worden 1 × 10⁴ cellen per put in een 96-wells plaat gezaaid en overnight geïncubeerd voor celadhesie. Koel de volgende ochtend de 96-wells plaat met de cellaag gedurende één uur af tot 4 °C.Bereid de testverbindingen en het virusmengsel op ijs. Bijvoorbeeld, H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1%DMSO of positieve controle HCV Heparine-oplossingen met 10² FFU virus. Aspireer voor elke behandeling het medium voorzichtig uit de kweekputjes.Voeg vervolgens onmiddellijk in drievoud 100 µL van het virus-testverbindingmengsel toe aan de wells, waarbij u erop let dat de temperatuur niet stijgt. Incubeer de plaat drie uur in een koelkast bij 4 °C. Virusdeeltjes zullen bij 4 °C hechten aan het celoppervlak, maar zullen niet worden geïnternaliseerd.Aspireer vervolgens de supernatanten. Was de cellen voorzichtig tweemaal met 200 µL ijskoude PBS, voeg 100 µL basaal medium toe aan elke well en incubeer deze vervolgens gedurende 72 uur bij 37 °C.Ten slotte, voor het kwantificeren van de afgifte van de luciferase-reporter uit de geïnfecteerde cellen. Verzamel het supernatant uit elke monsterput en voer de Gaussian Luciferase assay uit voor het bepalen van de virale fusie en entry. Koel de celkweekplaat een uur lang voor op 4 °C.Verwijder na de overnacht-incubatie voor celadhesie het bestaande medium uit de wells en infecteer de cellen op ijs met 10² FFU HCV. Incubeer de plaat gedurende drie uur bij 4 °C. Was de cellen voorzichtig tweemaal met 200 µL ijskoud PBS om het niet-geadsorbeerde virus te verwijderen.Behandel de cellen vervolgens op ijs met de testverbindingen opgelost in basaal medium, of met basaal medium met 1% DMSO als controle, en incubeer de plaat gedurende drie uur bij 37 °C. Dit maakt het mogelijk om het effect van de testverbindingen op de virale entry te beoordelen, wat plaatsvindt bij 37 °C. Aspireer het medium en was de niet-geïnternaliseerde virussen tweemaal met 200 µL citraatbuffer of PBS.Voeg 100 µL basaal medium per putje toe en incubeer gedurende nog eens 72 uur bij 37 °C. Verzamel het supernatant en voer de Gaussian Luciferase-assay uit, zoals eerder aangetoond, om de vrijgekomen luciferase-reporter te detecteren. Hier zijn de effecten van de testverbindingen op HCV. Bij activatie werd het virus nul of drie uur vóór de infectie geïncubeerd met de testverbindingen.Het percentage remming van de virale infectie is uitgezet voor elke behandeling. De negatieve controle met DMSO vertoont geen remming. CHLA vertoont een hoge remming bij contact, na een incubatietijd van nul uur, alsofmede na de langere incubatie van drie uur.Aanvullende resultaten met een andere test. Verbinding PUG wordt hier getoond; door dit algemene experimentele ontwerp aan te passen, wordt aangetoond dat CHLA en PUG bovendien de infectiviteit van het menselijk cytomegalovirus of HCMV in embryonale longfibroblasten remmen. Het effect van CHLA en PUG op de binding van HCV wordt hier getoond.Ter herinnering: de cellen werden geïncubeerd met het virus in de aanwezigheid of afwezigheid van de testverbindingen bij 4 °C, waarna het ongebonden virus werd verwijderd en de cellen werden geïncubeerd bij 37 °C voor infectie door het virus. De gearceerde balken tonen het effect van C-H-L-A-P-U-G of heparine op de entry van HCV in de cellen. Let op dat in dit geval de virale hechting eerst werd uitgevoerd bij 4 °C.Nadat het niet-gebonden virus was verwijderd, werden de cellen voor virale entry geïncubeerd met testverbindingen bij 37 °C. In het geval van HCMV vertoont de infectie van embryonale longfibroblasten bij behandeling met CHLA of PUG een sterke remming van de virale hechting en virale entry. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de stappen bij de aangegeven temperatuur moeten worden uitgevoerd, aangezien dit de nauwkeurigheid van de resultaten beïnvloedt.

early-viral-entry-assays-for-identification-evaluation-antiviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the viral inactivation assay, showcasing the evaluation of the impact of antiviral agents on viral particles.

Assessing the Effectiveness of an Antiviral Test Compound through a Viral Inactivation Assay

This video demonstrates a viral attachment assay for screening antiviral compounds. Using genetically modified hepatitis C virus and luciferase, it assesses inhibitory effects on viral attachment, as indicated by lower light intensity in co-treated wells compared to wells treated with the virus alone.

A Viral Attachment Assay for Screening of Antiviral Compounds

This video demonstrates an assay to evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry into host cells and fusion with the endosome. The cells are incubated at a low temperature and then infected with HCV. The low temperature permits viral binding to host cells but inhibits internalization via endocytosis. The test antiviral compound is added, and the cells are incubated at physiological temperature. This shift to a higher temperature facilitates viral entry and allows...

An Assay to Evaluate the Effect of Test Compounds on Viral Entry and Fusion in Host Cells

This video demonstrates the method to perform a plaque assay using a virus obtained from infected porcine cornea. The porcine cornea is used to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

Determining Antiviral Efficacy of Experimental Drugs Through a Plaque Assay

Drie assays, zoals de cytopathische effect (CPE) gebaseerde bepaling, dosis-respons assay en tijd-van-toevoeging (ToA) assay ontwikkeld, geoptimaliseerd, gevalideerd en toegepast op nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus (BTV) identificeren alsmede zoals het bepalen van de mogelijke mechanisme-van-actie (MoA) voor nieuw geïdentificeerde antivirale middelen.

Testsystemen voor de identificatie van nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus

In vitro assays om virusreplicatie te meten zijn sterk verbeterd door de ontwikkeling van recombinante RNA-virussen tot expressie luciferase of andere enzymen die in staat bioluminescentie. Hier hebben we detail een high-throughput screening pijplijn dat dergelijke recombinante stammen van mazelen en chikungunya virussen breed-spectrum antivirale middelen te isoleren van chemische bibliotheken combineert.

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

Hier beschrijven we cellulaire cytotoxiciteit en ronde infectiviteitsassays die zorgen voor een snelle en nauwkeurige screening van verbindingen om hun cellulaire cytotoxiciteit (CC50) bepalen en IC 50-waarden tegen WT en resistente HIV-1.

Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers

De eerste stap in de arenavirus levenscyclus is het hechten van virale deeltjes aan gasthercellen. We rapporteren een kwantitatief (q)RT-PCR-gebaseerde test voor ultragevoelige detectie en kwantificering van arenavirus-hechtingsgebeurtenissen.

Zeer gevoelige test voor het meten van arenavirus-cel Attachment

Het doel van het protocol is het illustreren van de verschillende assays met betrekking tot virale vermelding die kan worden gebruikt om kandidaat-virale invoer remmers te identificeren.

Gebruik van virale vermelding testen en moleculaire docking analyse voor de identificatie van antivirale kandidaten tegen Coxsackievirus A16

In dit werk beschrijven we de protocollen die worden gebruikt in op replicon gebaseerde en virale enzymgebaseerde testen om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie in een screeningsformaat met hoge doorvoer.

Antivirale testen met hoge doorvoer om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie

Dit artikel beschrijft de methodologie voor het genereren van SARS-CoV-2 pseudotype-deeltjes met behulp van een luciferase-reportersysteem en het gebruik ervan om intreeremmers te identificeren. Deze protocollen worden aangetoond met behulp van twee verschillende entry-inhibitors: een recombinant humaan ACE2-Fc fusie-eiwit en de kleinmolecuulverbinding arbidool.

Procedures voor de identificatie van SARS-CoV-2 ingangsremmers als potentiële antivirale middelen met MLV-gebaseerde pseudovirussen

Leer hoe je vroege virale entry-testsystemen gebruikt voor de identificatie en evaluatie van antivirale verbindingen. Dit protocol maakt gebruik van luciferase-assays en HUH 7.5-cellen om mechanismen van virale entry-remming te onderzoeken.

Early Viral Entry testsystemen voor de identificatie en evaluatie van antivirale verbindingen

Meer video's verkennen