Ontcijferen en Imaging Pathogenese en Cording van Mycobacterium abscessus In zebravis embryo's
September 9th, 2015
Optisch transparante zebravis embryo's worden veel gebruikt om in realtime de interacties tussen pathogene micro-organismen en de aangeboren immuuncellen te bestuderen en te visualiseren. Micro-injectie van Mycobacterium abscessus, gecombineerd met fluorescentiebeeldvorming, wordt gebruikt om essentiële pathogene kenmerken zoals koordvorming in zebravis embryo's te onderzoeken.
Het algemene doel van deze procedure is om de virulentie van Mycobacterium abscessus-stammen te bestuderen en te vergelijken en de interacties tussen deze bacteriën en het aangeboren immuunsysteem van de gastheer in vivo te beschrijven met behulp van transparante zebravisembryo's. Dit wordt bereikt door eerst homogene bacteriële inocula voor te bereiden. Vervolgens worden de embryo's intraveneus geïnjecteerd met de bacteriesuspensies op 30 uur na bevruchting.
Om de rol van macrofagen in de infectiebestrijding nauwkeuriger te bestuderen, wordt een lipo choate-gebaseerde injectieprocedure gebruikt om macrofagendepleteerde embryo's te genereren. Ten slotte worden de geïnfecteerde embryo's voorbereid en geïmager met behulp van fluorescentie- en confocale microscopie om de progressie van de infectie te volgen. Uiteindelijk laten de resultaten die kunnen worden verkregen de specifieke interacties zien tussen de fluorescerende fagocytische cellen en M abscessus, hetzij als individuele basissen of als serpentijnachtige koorden in een transparant embryo.
Het belangrijkste voordeel van het gebruik van zebravissen boven andere diermodellen zoals muizen is dat het mogelijk maakt om het infectieproces in realtime te onderzoeken en om een beeld te krijgen van de specifieke interacties tussen microbacterium abscesses en microfagen of neutrofielen. Deze stap is een kritisch punt voor de volgende injectiedruk in zebravissen. Vanwege de hoge neiging van ruwe mycobacterium abscessus om grote aggregaten te vormen en codes te produceren, is een specifieke behandeling noodzakelijk om homogene en kwantitatief gecontroleerde inocula voorafgaand aan micro-injectie voor te bereiden.
Om m abscessus voor te bereiden, oogst exponentieel groeiende culturen van 150 vierkante centimeter weefselkweekflacons in 50 milliliter steriele plastic buisjes en centrifugeer bij 4.000 keer G en kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Gebruik één milliliter Middlebrook zeven H negen, aangevuld met de OADC-verrijking, plus tween 80, hierna zeven H negen medium genoemd, om de pellet en Eloqua te resuspenderen. 200 microliter van de bacteriesuspensies in 1,5 milliliter buisjes met een 26 gauge naald homogeniseer elke ALI quad van bacteriesuspensie 15 keer.
Gebruik vervolgens een waterbad om drie keer gedurende 10 seconden te sonificeren met tussenpozen van tien seconden. Voeg daartussen één milliliter zeven H negen medium toe en vortex kort, centrifugeer vervolgens bij 100 keer G gedurende drie minuten. Verzamel voorzichtig de mycobacteriën bevattende supernatanten om klontering te voorkomen en trek de homogene suspensies in een 50 milliliter steriele plastic buis.
Centrifugeer de suspensie bij 4.000 keer G gedurende vijf minuten en gebruik 200 microliter van zeven H negen medium om de pellet te resuspenderen. Bepaal het uiteindelijke bacteriële inoculum. Volgens het tekstprotocol is de visuele demonstratie van deze methode cruciaal omdat de stappen moeilijk te leren zijn omdat de precieze, zachte manipulatie van de injectie in zebravisembryo's onder de microscoop, evenals het verwerven van de micro-injectietechniek, tijd nodig hebben. Om micro-injectie van M abscessus uit te voeren bij ongeveer 24 uur. Post-bevruchting of HPF, gebruik pincetten om embryo's in een 100 millimeter petrischaal te coaten en houd ze op 28,5 graden Celsius.
Breng 30 48 HPF embryo's over naar een V-vormige positioneringskamer gevuld met 25 milliliter vissenwater bevattend 270 milligram per liter trica met een geklemde micro-lader tip. Leg de embryo's goed in de kanalen voor gemakkelijker manipulatie. Gebruik PBST met 0,05% tussen 80 om het microbacteriële inoculum te verdunnen tot de gewenste CFU die moet worden afgeleverd en voeg 10% fenolrood toe om een juiste injectie met een micro-lader tip te controleren.
Laad een micro-injectienaald met vijf tot tien microliter van het bacteriële inoculum. Verbind de micro-injectienaald in de houder van een micro manipulator verbonden met de injector en gebruik fijne pincetten om de bovenkant van de naald af te breken. Om een openingdiameter van vijf tot tien micrometer te verkrijgen.
Kalibreer het injectievolume door de micro-injectiedruk en tijd aan te passen. Meet vervolgens de diameter van een druppel die in het dooier van één embryo wordt uitgestoten om in de coddle-vene te micro-injecteren. Positioneer het embryo met de ventrale zijde naar de naald toe en plaats de naaldtip dicht bij de urogenitale opening.
En duw voorzichtig de punt van de naald in het embryo totdat deze net de coddle-vene regio doorboort. Lever vervolgens het gewenste volume bacteriesuspensie af, meestal één tot drie nanoliters met ongeveer 100 CFU's per nanoliter. Incubeer en bewaak de embryo's volgens het tekstprotocol om lipo Choate, depletie van macrofagen en embryo's bij 24 HP.Fate, de embryo's uit te voeren en ze over te brengen naar een injectieschaal gevuld met vissenwater met trica.
Richt ze vervolgens met de dorsale kant naar beneden. Na het vortexen van de liposome-geëncapselde clodronaatoplossing, laad de micro capillaire naald en kalibreer het injectievolume. Boor de coddle-vene regio zoals eerder aangetoond en injecteer twee tot drie liters oplossing.
Herhaal de injectie drie keer. Incubeer de embryo's bij 28,5 graden Celsius en gebruik fluorescentiemicroscopie om de juiste depletie van macrofagen te controleren vóór infectie. Zoals eerder in deze video is aangetoond, om kolonievormingseenheden of CFU's op het gewenste tijdstip te tellen.
Verzamel vijf embryo's per infectieconditie en breng elk embryo over in een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Cryo anesthetiseer de embryo's door incubatie op ijs gedurende 10 minuten na het euthanaseren van de embryo's met 300 tot 500 milligram per liter Trica. Gebruik steriel water om de embryo's twee keer in een nieuwe buis te wassen.
Vervolgens, na het verwijderen van water bij 2%Triton X 100 in één XPBS naar elk embryo, en gebruik een 26 gauge naald om het weefsel te homogeniseren voor volledige lysis. Gebruik na het centrifugeren van de suspensie één X-P-B-S-T om de pellet te resuspend
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van optisch transparante zebravisembryo's om de interacties tussen Mycobacterium abscessus en het aangeboren immuunsysteem te onderzoeken. Door gebruik te maken van fluorescentiebeeldvorming kunnen onderzoekers de dynamiek van infectie en immuunrespons in real time visualiseren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Immunologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Zebravisembryo's zijn een waardevol model voor het bestuderen van host-pathogeen interacties.
- Mycobacterium abscessus is een pathogene bacterie die aanzienlijke gezondheidsrisico's met zich meebrengt.
- Het begrijpen van de immuunrespons op deze pathogeen kan behandelingsstrategieën informeren.
- Fluorescentiebeeldvorming maakt real-time observatie van cellulaire interacties mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om de virulentie van verschillende Mycobacterium abscessus stammen te vergelijken.
- Om de interacties tussen deze bacteriën en het aangeboren immuunsysteem van de gastheer te beschrijven.
- Om de rol van macrofagen in het beheersen van de infectie te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van homogene bacteriële inocula.
- Intraveneuze injectie van bacteriële suspensies in zebravisembryo's 30 uur na bevruchting.
- Generatie van macrofaag-gedepleteerde embryo's met behulp van een lipochoate-gebaseerde injectieprocedure.
- Fluorescentie en confocale microscopie voor het beeldvormen van geïnfecteerde embryo's.
Belangrijkste resultaten
- Visualisatie van specifieke interacties tussen fluorescente fagocytische cellen en M. abscessus.
- Observatie van bacteriën in verschillende vormen, inclusief individuele bacillen en serpentine koorden.
- Inzichten in de dynamiek van de immuunrespons tijdens infectie.
- Demonstratie van de bruikbaarheid van zebravisembryo's in het bestuderen van bacteriële pathogenese.
Conclusies
- De studie benadrukt de effectiviteit van zebravisembryo's als model voor het onderzoeken van bacteriële infecties.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van host-pathogeen interacties.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze inzichten om therapeutische strategieën te ontwikkelen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-resolution imaging of Mycobacterium abscessus infection in zebrafish embryos enables direct visualization of host-pathogen interactions and immune evasion mechanisms. This model supports predictive confidence in target validation for innate immune pathways and de-risks early-stage anti-infective discovery. The approach informs portfolio decisions by clarifying the mechanistic basis of virulence and immune control in a vertebrate system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of innate immune responses to distinct bacterial phenotypes in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing macrophage-bacteria interactions and immune evasion strategies.
- Facilitates functional validation of immune targets implicated in infection control.
- Provides a vertebrate context for evaluating the impact of genetic or pharmacological perturbations.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, quantitative infection model for downstream screening of anti-infective agents.
- Delivers standardized readouts such as CFU enumeration and fluorescence-based bacterial burden.
- Enables multi-color imaging for multiplexed assessment of host and pathogen markers.
- Prepares validated biological systems for scalable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms by modeling chronic and acute infection phenotypes.
- Supports translational biomarker identification through real-time imaging of immune cell recruitment and pathogen evasion.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation in a whole-organism vertebrate model.
- De-risks advancement by clarifying the role of immune effectors in infection outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This zebrafish embryo infection model bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven testing of immune mechanisms and anti-infective strategies.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of immune cell involvement in infection control and virulence.
- Screening: Provides quantitative, reproducible outputs for comparing bacterial variants and intervention effects.
- Analytics: Enables statistical analysis of CFU counts and fluorescence intensity to assess infection dynamics.
- Translational Research: Models clinically relevant infection phenotypes and immune evasion strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, scalable platform for iterative target and pathway validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immune target validation and mechanistic understanding of infection.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible workflows for infection modeling and imaging.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying biological risk and target relevance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-infective programs based on mechanistic insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microinjection, and fluorescence imaging.
- Demands access to confocal microscopy and quantitative image analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of inoculum preparation and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different bacterial strains or immune cell markers.
- Practical limitations include technical learning curve and throughput constraints for large-scale studies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:35
Preparation of M. abscessus Inocula
3:20
Microinjection of Zebrafish Embryos
5:25
Generation of Macrophage-depleted Embryos
6:13
Bacterial Burden Quantification
7:16
Imaging M. abscessus-infected Embryos
8:34
Results: M. abscessus Infection in Zebrafish Embryos
10:03
Conclusion
