Ontcijferen en Imaging Pathogenese en Cording van Mycobacterium abscessus In zebravis embryo's
9 september 2015
Optisch transparante zebravis embryo's worden veel gebruikt om in realtime de interacties tussen pathogene micro-organismen en de aangeboren immuuncellen te bestuderen en te visualiseren. Micro-injectie van Mycobacterium abscessus, gecombineerd met fluorescentiebeeldvorming, wordt gebruikt om essentiële pathogene kenmerken zoals koordvorming in zebravis embryo's te onderzoeken.
Het algemene doel van deze procedure is om de virulentie van Mycobacterium abscessus-stammen te bestuderen en te vergelijken en de interacties tussen deze bacteriën en het aangeboren immuunsysteem van de gastheer in vivo te beschrijven met behulp van transparante zebravisembryo's. Dit wordt bereikt door eerst homogene bacteriële inocula voor te bereiden. Vervolgens worden de embryo's intraveneus geïnjecteerd met de bacteriesuspensies op 30 uur na bevruchting.
Om de rol van macrofagen in de infectiebestrijding nauwkeuriger te bestuderen, wordt een lipo choate-gebaseerde injectieprocedure gebruikt om macrofagendepleteerde embryo's te genereren. Ten slotte worden de geïnfecteerde embryo's voorbereid en geïmager met behulp van fluorescentie- en confocale microscopie om de progressie van de infectie te volgen. Uiteindelijk laten de resultaten die kunnen worden verkregen de specifieke interacties zien tussen de fluorescerende fagocytische cellen en M abscessus, hetzij als individuele basissen of als serpentijnachtige koorden in een transparant embryo.
Het belangrijkste voordeel van het gebruik van zebravissen boven andere diermodellen zoals muizen is dat het mogelijk maakt om het infectieproces in realtime te onderzoeken en om een beeld te krijgen van de specifieke interacties tussen microbacterium abscesses en microfagen of neutrofielen. Deze stap is een kritisch punt voor de volgende injectiedruk in zebravissen. Vanwege de hoge neiging van ruwe mycobacterium abscessus om grote aggregaten te vormen en codes te produceren, is een specifieke behandeling noodzakelijk om homogene en kwantitatief gecontroleerde inocula voorafgaand aan micro-injectie voor te bereiden.
Om m abscessus voor te bereiden, oogst exponentieel groeiende culturen van 150 vierkante centimeter weefselkweekflacons in 50 milliliter steriele plastic buisjes en centrifugeer bij 4.000 keer G en kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Gebruik één milliliter Middlebrook zeven H negen, aangevuld met de OADC-verrijking, plus tween 80, hierna zeven H negen medium genoemd, om de pellet en Eloqua te resuspenderen. 200 microliter van de bacteriesuspensies in 1,5 milliliter buisjes met een 26 gauge naald homogeniseer elke ALI quad van bacteriesuspensie 15 keer.
Gebruik vervolgens een waterbad om drie keer gedurende 10 seconden te sonificeren met tussenpozen van tien seconden. Voeg daartussen één milliliter zeven H negen medium toe en vortex kort, centrifugeer vervolgens bij 100 keer G gedurende drie minuten. Verzamel voorzichtig de mycobacteriën bevattende supernatanten om klontering te voorkomen en trek de homogene suspensies in een 50 milliliter steriele plastic buis.
Centrifugeer de suspensie bij 4.000 keer G gedurende vijf minuten en gebruik 200 microliter van zeven H negen medium om de pellet te resuspenderen. Bepaal het uiteindelijke bacteriële inoculum. Volgens het tekstprotocol is de visuele demonstratie van deze methode cruciaal omdat de stappen moeilijk te leren zijn omdat de precieze, zachte manipulatie van de injectie in zebravisembryo's onder de microscoop, evenals het verwerven van de micro-injectietechniek, tijd nodig hebben. Om micro-injectie van M abscessus uit te voeren bij ongeveer 24 uur. Post-bevruchting of HPF, gebruik pincetten om embryo's in een 100 millimeter petrischaal te coaten en houd ze op 28,5 graden Celsius.
Breng 30 48 HPF embryo's over naar een V-vormige positioneringskamer gevuld met 25 milliliter vissenwater bevattend 270 milligram per liter trica met een geklemde micro-lader tip. Leg de embryo's goed in de kanalen voor gemakkelijker manipulatie. Gebruik PBST met 0,05% tussen 80 om het microbacteriële inoculum te verdunnen tot de gewenste CFU die moet worden afgeleverd en voeg 10% fenolrood toe om een juiste injectie met een micro-lader tip te controleren.
Laad een micro-injectienaald met vijf tot tien microliter van het bacteriële inoculum. Verbind de micro-injectienaald in de houder van een micro manipulator verbonden met de injector en gebruik fijne pincetten om de bovenkant van de naald af te breken. Om een openingdiameter van vijf tot tien micrometer te verkrijgen.
Kalibreer het injectievolume door de micro-injectiedruk en tijd aan te passen. Meet vervolgens de diameter van een druppel die in het dooier van één embryo wordt uitgestoten om in de coddle-vene te micro-injecteren. Positioneer het embryo met de ventrale zijde naar de naald toe en plaats de naaldtip dicht bij de urogenitale opening.
En duw voorzichtig de punt van de naald in het embryo totdat deze net de coddle-vene regio doorboort. Lever vervolgens het gewenste volume bacteriesuspensie af, meestal één tot drie nanoliters met ongeveer 100 CFU's per nanoliter. Incubeer en bewaak de embryo's volgens het tekstprotocol om lipo Choate, depletie van macrofagen en embryo's bij 24 HP.Fate, de embryo's uit te voeren en ze over te brengen naar een injectieschaal gevuld met vissenwater met trica.
Richt ze vervolgens met de dorsale kant naar beneden. Na het vortexen van de liposome-geëncapselde clodronaatoplossing, laad de micro capillaire naald en kalibreer het injectievolume. Boor de coddle-vene regio zoals eerder aangetoond en injecteer twee tot drie liters oplossing.
Herhaal de injectie drie keer. Incubeer de embryo's bij 28,5 graden Celsius en gebruik fluorescentiemicroscopie om de juiste depletie van macrofagen te controleren vóór infectie. Zoals eerder in deze video is aangetoond, om kolonievormingseenheden of CFU's op het gewenste tijdstip te tellen.
Verzamel vijf embryo's per infectieconditie en breng elk embryo over in een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Cryo anesthetiseer de embryo's door incubatie op ijs gedurende 10 minuten na het euthanaseren van de embryo's met 300 tot 500 milligram per liter Trica. Gebruik steriel water om de embryo's twee keer in een nieuwe buis te wassen.
Vervolgens, na het verwijderen van water bij 2%Triton X 100 in één XPBS naar elk embryo, en gebruik een 26 gauge naald om het weefsel te homogeniseren voor volledige lysis. Gebruik na het centrifugeren van de suspensie één X-P-B-S-T om de pellet te resuspend
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van optisch transparante zebravissenembryo's om de interacties tussen Mycobacterium abscessus en het aangeboren immuunsysteem te onderzoeken. Door middel van fluorescentie-imaging kunnen onderzoekers de dynamiek van de infectie en de immuunrespons in real-time visualiseren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Immunologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Zebravisembryo's zijn een waardevol model voor het bestuderen van gastheer-pathogeeninteracties.
- Mycobacterium abscessus is een pathogene bacterie die aanzienlijke gezondheidsrisico's met zich meebrengt.
- Inzicht in de immuunrespons op dit pathogeen kan bijdragen aan behandelstrategieën.
- Fluorescentie-imaging maakt real-time observatie van cellulaire interacties mogelijk.
Doel van de studie
- Om de virulentie van verschillende Mycobacterium abscessus-stammen te vergelijken.
- Om de interacties tussen deze bacteriën en het aangeborene immuunsysteem van de gastheer te beschrijven.
- Om de rol van macrofagen bij het beheersen van de infectie te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van homogene bacteriële inocula.
- Intraveneuze injectie van bacteriële suspensies in zebravissenembryo's op 30 uur na bevruchting.
- Genereren van macrofaag-gedepleteerde embryo's met behulp van een op lipochocaat gebaseerde injectieprocedure.
- Fluorescentie- en confocale microscopie voor beeldvorming van geïnfecteerde embryo's.
Belangrijkste resultaten
- Visualisatie van specifieke interacties tussen fluorescerende fagocytaire cellen en M. abscessus.
- Observatie van bacteriën in verschillende vormen, waaronder individuele bacillen en serpentijnvormige koorden.
- Inzichten in de dynamiek van de immuunrespons tijdens infectie.
- Demonstratie van het nut van zebravissenembryo's bij het bestuderen van bacteriële pathogenese.
Conclusies
- De studie benadrukt de effectiviteit van zebravisembryo's als model voor het onderzoeken van bacteriële infecties.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van interacties tussen gastheer en pathogeen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze inzichten om therapeutische strategieën te ontwikkelen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Hoge-resolutie beeldvorming van Mycobacterium abscessus-infectie in zebravissenembryo's maakt directe visualisatie van gastheer-pathogeeninteracties en mechanismen van immuunontwijking mogelijk. Dit model ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij de validatie van targets voor aangeboren immuunroutes en vermindert de risico's bij vroege fasen van anti-infectieuze drug discovery. De benadering informeert portfoliobeslissingen door de mechanistische basis van virulentie en immuuncontrole in een gewerveld systeem te verduidelijken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt ondervraging van aangeboren immuunresponsen op verschillende bacteriële fenotypen in vivo mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door macrofaag-bacterie-interacties en strategieën voor immuunontwijking te visualiseren.
- Faciliteert functionele validatie van immuuntargets die betrokken zijn bij infectiebeheersing.
- Biedt een gewervelde context voor het evalueren van de impact van genetische of farmacologische perturbaties.
Screening & assayontwikkeling
- Stelt een reproduceerbaar, kwantitatief infectiemodel vast voor downstream screening van anti-infectieuze middelen.
- Levert gestandaardiseerde readouts zoals CFU-enumeratie en fluorescentie-gebaseerde bacteriële belasting.
- Maakt multi-color imaging mogelijk voor multiplexe beoordeling van gastheer- en pathogeenmarkers.
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op schaalbare evaluatie van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekte-relevante mechanismen door chronische en acute infectie-fenotypes te modelleren.
- Ondersteunt de identificatie van translationele biomarkers via real-time imaging van immuuncelrekrutering en pathogeenevasie.
- Biedt continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie in een model van een volledig organisme van een gewervelde.
- Verlaagt de risico's bij verdere ontwikkeling door de rol van immuuneffectoren in infectie-uitkomsten te verduidelijken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit infectiemodel met zebravisembryo's slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek door hypothese-gedreven toetsing van immuunmechanismen en anti-infectieuze strategieën mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt het toetsen van nulhypothesen met betrekking tot de betrokkenheid van immuuncellen bij infectiebeheersing en virulentie.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor het vergelijken van bacteriële varianten en interventie-effecten.
- Analytics: Maakt statistische analyse van CFU-tellingen en fluorescentie-intensiteit mogelijk om infectiedynamiek te beoordelen.
- Translational Research: Modelleert klinisch relevante infectiefenotypes en strategieën voor immuunontwijking.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar, schaalbaar platform voor iteratieve validatie van targets en pathways.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van immuuntargets en het mechanistische begrip van infecties.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare workflows voor infectiemodellering en beeldvorming.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door biologische risico's en targetrelevantie te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van anti-infectieve programma's mogelijk op basis van mechanistische inzichten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van zebravissen, microinjectie en fluorescentie-imaging.
- Vereist toegang tot confocale microscopie en infrastructuur voor kwantitatieve beeldanalyse.
- Maakt standaardisatie van inoculumpreparatie en imagingprotocollen tussen teams noodzakelijk.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende bacteriële stammen of immuuncelmarkers.
- Praktische beperkingen omvatten de technische leercurve en doorvoercapaciteitsbeperkingen voor grootschalige studies.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:35
Preparation of M. abscessus Inocula
3:20
Microinjection of Zebrafish Embryos
5:25
Generation of Macrophage-depleted Embryos
6:13
Bacterial Burden Quantification
7:16
Imaging M. abscessus-infected Embryos
8:34
Results: M. abscessus Infection in Zebrafish Embryos
10:03
Conclusion
