Voorbereiding van mitochondriaal verrijkte fracties voor Metabole analyse in

Het algemene doel van het volgende experiment is het verkrijgen van verrijkte mitochondriale fracties die voldoende mitochondriale metabolieten opleveren voor metabolomische studies met behulp van drosophila melanogaster. Dit wordt bereikt door eerst een voldoende aantal vliegen te kweken om genoeg metabolieten te genereren voor mitochondriale verrijkte fracties. Als tweede stap worden de vliegen gehomogeniseerd in een glazen Teflon-downs homogenisator, die het celmembraan afbreekt zonder de integriteit van de mitochondriën aan te tasten.

Vervolgens worden de homogenaten onderworpen aan differentiële centrifugatie om verrijkte mitochondriale monsters te verkrijgen. De resultaten tonen aan dat met dit protocol uitgesproken mitochondriale metabole veranderingen werden gedetecteerd, die niet werden waargenomen bij een volledig op metabolomics gebaseerde analyse van mitochondriale verrijkte fracties en extracten van het hele dier. Het belangrijkste voordeel van deze procedure ten opzichte van een metabolomische analyse van de hele vlieg is dat de isolatie van mitochondriën voorafgaand aan de metabolomische analyse zorgt voor een verhoogde gevoeligheid en detectie van verschuivingen in mitochondriale metabolieten.

Om het experiment te beginnen, worden de ingrediënten voor het vliegenvoedsel op een warmteplaat verhit tot 90 °C. Roer het mengsel regelmatig totdat het homogeen en licht stroperig is. Verwijder het voedsel van de warmtebron en roer af en toe terwijl het voedsel afkoelt tot 80 °C; voeg vervolgens 0,2%TE decept methyl four hydroxy benzoate opgelost in 95%Ethanol toe. Verdeel het voedsel daarna in twee gelijke volumes.

Zorg ervoor dat de temperatuur van het voedsel is gedaald naar 50 °C en roer 1,1 ml 50 mM rapamycine opgelost in ethanol door het eerste volume en 1,1 ml onbehandelde ethanol door het tweede volume. Voor het verzamelen van volwassenen wordt een enkeltrapsregelaar gebruikt om zuivere koolstofdioxide uit een hogedruktank te leveren. Bij een continue stroom van vijf PS voorkom ik statische elektriciteit door een plastic buis te gebruiken om de koolstofdioxide naar een filterkolf van 500 ml te leiden, met slangetjes om de koolstofdioxide door water te laten borrelen.

Gebruik hiervoor een rubberen stop met één gat om de kolf af te sluiten. Verbind plastic slang van de zijdelingse opening van de kolf met een koolstofdioxidekussen om de larvendichtheid tijdens de ontwikkeling te regelen. Plaats 25 paren ouders in een kweekfles en laat hen gedurende 48 uur eitjes leggen.

Verwijder vervolgens de ouders om de eidichtheid te reguleren en herhaal deze stappen met de opkomende F1-nakomelingen om twee generaties van deze dichtheidscontrole te realiseren. Scheid na twee generaties onder dichtheidsgecontroleerde omstandigheden de vliegen op basis van geslacht, waarbij de vliegen niet langer dan 10 tot 15 minuten op het kussentje worden geplaatst. Laat de vliegen 24 uur lang herstellen van de anesthesie voordat ze in de experimentele omstandigheden worden geplaatst.

Wijs 300 vliegen per monster toe om voldoende metabolieten te genereren voor mitochondriale verrijkte fracties. Breng 150 vliegen over naar een zelfgemaakte kooi van één liter. Breng vervolgens de resterende 150 vliegen over naar een aparte kooi van één liter en zorg dat de kooien niet overbevolkt raken met meer dan 150 vliegen.

Gebruik zes replica-monsters per experimentele conditie en plaats de kooien bij 25 °C in een licht-donkercyclus van 12 uur om de kweek van drosophila te voltooien. Voorzie de vliegen elke twee of drie dagen van vers voedsel in een vial met 5 mL voedsel om de voedselkwaliteit gedurende in totaal 10 dagen te behouden. Start de isolatie door de vliegen vanuit één kooi over te brengen in een glazen Teflon-homogenisator gevuld met 1 mL gekoelde isolatiebuffer.

Plaats vervolgens een vijzel op ijs om de mitochondriën intact te houden en homogeniseer de vliegen met 15 slagen. Breng het homogenisaat zorgvuldig over naar een buisje van 1,5 milliliter zonder de stamper te draaien en centrifugeer het buisje 5 minuten bij 300 ×g bij 4 °C. Breng het supernatant over naar een ander buisje en centrifugeer het supernatant 10 minuten bij 6.000 ×g bij 4 °C om de mitochondriën te concentreren.

Gooi na centrifugatie het supernatant met de cytosolische fractie weg. Resuspendeer de pellet in 300 µL wasbuffer door herhaaldelijk op te zuigen en uit te pipetteren. Herhaal de vorige stappen voorzichtig voor de tweede centrifugeerronde.

Combine vervolgens de resuspendeerde pellets van beide kooien in een cryogene microcentrifugebuis en centrifugeer de gecombineerde pellets bij 6.000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en vries de pellet snel in met vloeibare stikstof. Bewaar de mitochondriaal verrijkte fracties tot slot bij -80 °C.

Deze western blot toont een verrijking van het mitochondriale membraantransporteiwit poin, dat dient als indicator voor de effectieve scheiding van mitochondriën in mitochondriale fracties. Het poin-eiwit is niet detecteerbaar in cytosolische fracties, terwijl het tubuline-eiwit, een cytosolisch microtubule-eiwit, niet wordt gedetecteerd in de mitochondriale fractie, wat wijst op een minimale contaminatie van cytosolische eiwitten. Principal component analyses (PCA) werden gegenereerd met behulp van de waarden uit de massaspectrometrie-analyse, die werden genormaliseerd naar de Bradford-eiwitconcentratie, log-getransformeerd en getrimd op basis van de minimaal waargenomen waarden voor elke verbinding.

PCA-plots werden gegenereerd met behulp van volledige metabolietenprofielen van native en gedisrupte vliegenstammen; mitochondriale DNA-metabolieten verkregen met een standaard whole fly-extract kunnen worden vergeleken via een PCA-plot van metabolieten in mitochondrie-verrijkte extracten. De metabolietenprofielen van het gehele organisme scheiden volledig langs PC-as twee en weerspiegelen de belangrijkste effecten van de rapamycinebehandeling. Er zijn slechts subtiele verschillen tussen de alternatieve M-T-D-N-A-genotypes.

In tegenstelling hiermee vertonen de metabolietprofielen van mitochondriale verrijkte extracten een scheiding tussen het native M mt DNA-genotype op normaal voer en de andere drie monsters: het native MTD NA op rapamycine en het alternatieve MTD NA op zowel normaal voer als rapamycine. Dit impliceert dat het effect van het alternatieve MTD NA de metabolietprofielen verschuift op een wijze die analoog is aan de effecten van een rapamycinebehandeling. Tijdens het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk en wordt aanbevolen om alle extracties op dezelfde dag uit te voeren, om de variabiliteit tussen replicaten te verminderen.

Ik raad aan om vooraf een plan op te stellen, de vials te labelen en de wachttijden tussen de replica's bij te houden om de kwaliteit van onze monsterpreparatie te verbeteren.