Name: Voorbereiding van mitochondriaal verrijkte fracties voor Metabole analyse in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Leer hoe je mitochondriaal verrijkte fracties isoleert uit Drosophila melanogaster voor metabole analyses. Deze methode verhoogt de gevoeligheid voor het detecteren van subtiele metabolische veranderingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Adelphi University faculteitsontwikkelingssubsidie en subsidie R15GM113156 van NIGMS toegekend aan EVC, subsidie R01GM067862 van NIGMS en subsidie R01AG027849 van NIA toegekend aan DMR.

1. Reagentia en oplossingen <ol><li> Voorbereiding van de vlieg voedsel en media <ol><li> Heat fly ingrediënten 11% suiker, 2% geautolyseerde gist, 5,2% maïsmeel, agar 0,79% w / v in water in een kookplaat ingesteld op 90 ° C. Regelmatig Roer tot een homogeen licht dichte mengsel is verkregen. Bereid een eindvolume van 550 ml vlieg voedsel voor een totaal van 100 flacons met 5 ml voedsel vliegen elk. </li><li> Verwijderen uit de verwarmingsbron, roeren tot het eten afgekoeld tot 80 ° C en voeg 0,2% tegosept-methyl-4-hydroxybenzoaat opgelost in 95% ethanol. </li><li> Verdeel het voedsel in twee gelijke volumes. Voeg 1,1 ml van 50 mM rapamycine opgelost in ethanol tot een volume en 1,1 ml ethanol aan het andere volume. Roer de rapamycine en ethanol oplossingen in het voedsel. Zorg ervoor dat de temperatuur daalt tot 50 ° C voor het toevoegen van drugs. </li></ol></li><li> Isolation Buffer <ol><li> Bereid 500 ml isolatie buffer [225 mM mannitol, 75 mM sucrose, 10 mM 3- (N &lt;/ em&gt; -morpholino) propaansulfonzuur (MOPS) en 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 2,5 mg / ml runderserumalbumine (BSA)] in water. </li><li> Stel de pH op 7,2 met behulp van natriumhydroxide. De aanvankelijke pH zal zuur zijn. </li><li> Gebruik steriele filter opslagflessen met een 0,22 urn poriegrootte oplossing te steriliseren en het op 4 ° C. </li></ol></li><li> Wash Buffer <ol><li> Bereid 500 ml wasbuffer [225 mM mannitol, 75 mM sucrose, 10 mM KCI, 10 mM Tris HCI en 5 mM KH 2 PO 4] in het water. </li><li> Stel de pH op 7,2 met behulp van natriumhydroxide. De aanvankelijke pH zal zuur zijn. </li><li> Gebruik steriele filter opslagflessen met een 0,22 urn poriegrootte oplossing te steriliseren en het op 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. grootbrengen van de Drosophila stammen <ol><li> Om larvale dichtheid controleren tijdens de ontwikkeling, plaats 25 paar van de ouders in een cultuur fles en hen in staat stellen om eieren te leggen voor 48 uur. </li> &lt;li&gt; Verwijder ouders na 48 uur tot ei dichtheid te regelen. </li><li> Herhaal de stappen 2,1 en 2,2 met de opkomende F1 nakomelingen, zodat twee generaties van deze controle dichtheid wordt bereikt. </li><li> Om volwassenen te verzamelen, verdoven de vliegen met behulp van kooldioxide (CO 2) en een apart geslacht. <ol><li> Gebruik een eentrapsregelaar geleverde pure CO 2 uit een hoge druk tank op een continue stroom van 5 psi. Om statische elektriciteit te voorkomen, gebruik plastic slang aan op de CO 2 te katalyseren in een 500 ml kolf met het filteren van water. </li><li> Gebruik een rubber stop met een opening aan de kolf af te dichten. Gebruik plastic slang aan de zijdelingse opening van de kolf verbinden met een CO 2 pad. </li><li> Plaats de vliegen in het pad niet meer dan 10-15 min. Toelaten om te herstellen van anesthesie gedurende 24 uur voordat u ze in experimentele omstandigheden. </li></ol></li><li> Om voldoende metabolieten voor mitochondriële verrijkte fracties te genereren, gebruiken 300 vliegen per monster. Hier, gebruiken vrouwen, maar Gender kunnen verschillen in andere experimenten. Transfer 150 vliegt naar een zelfgemaakte 1 L demografie kooi. Geven toegang tot 5 ml vlieg voedsel in een flacon. </li><li> Breng de resterende 150 vliegt naar een andere 1 L kooi. Niet kooien overpopulate met meer dan 150 vliegen. </li><li> Gebruik zes identieke monsters per experimentele conditie. Sinds hele dier extracten leveren meer metabolieten te genereren 1 monster van hele dier isoleert, overbrengen 50 vrouwelijke vliegt naar een kooi. Zoals voor de mitochondriale isolaten Gebruik zes identieke monsters per experimentele conditie. </li><li> Plaats kooien bij 25 ° C met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. </li><li> Zorg voor vers voedsel elke 2 of 3 dagen in een flacon met 5 ml van voedsel aan voedselkwaliteit te behouden. </li><li> Onderhouden vliegen op voedsel voor 10 dagen. Deze stap is nodig voor de behandeling rapamycine 7. Andere behandelingen of voorwaarden verschillen. </li></ol> 3. Isolatie van mitochondriaal Fracties <ol><li> Dump vliegt van de ene kooi (150 vliegen) in eenglazen teflon Dounce homogenisator wordt gevuld met 1 ml gekoelde isolatiebuffer. </li><li> Homogeniseren door het bewegen van de stamper omhoog en omlaag gedurende 15 slagen. Houd de mortel op het ijs om mitochondriën intact te houden. </li><li> Overdracht homogenaat een 1,5 ml buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Neem de bovenstaande vloeistof en centrifugeer bij 6000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C te verrijken voor mitochondriën. </li><li> Zoals de bovenstaande bevat de cytosolische fractie, gooi het supernatant of te gebruiken voor andere experimenten. Resuspendeer de pellet in 300 ui wasbuffer. </li><li> Herhaal de stappen 3,1-3,5 voor de tweede kooi. Combineer de geresuspendeerde pellets van beide kooien in een cryogene microcentrifugebuis. </li><li> Centrifugeer bij 6000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant en flash-bevriezen de pellet in vloeibare stikstof. </li><li> Bewaar de mitochondriale verrijkte fracties bij -80 ° C of lagere temperatuur. <ol><li> Als alternatief voor de hele dierlijke preparation, plaatst de volwassenen in een cryogene microcentrifugebuis. Flash-bevriezen de injectieflacon in vloeibare stikstof en opslag bij -80 ° volwassenen C of lagere temperatuur. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScheffler%2C+IE+%22Mitochondria+%28Scheffler%2C+Mitochondria%29%22">Mitochondria (Scheffler, Mitochondria)</a>. , Wiley-Liss. 484(2007).</li>
<li>Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria--a+nexus+for+aging%2C+calorie+restriction%2C+and+sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins.</a> Cell. 132 (2), 171-176 (2008).</li>
<li>Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pathology%3A+stress+signals+from+the+energy+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory.</a> Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).</li>
<li>Embley, T. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+evolution%2C+changes+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic evolution, changes and challenges.</a> Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).</li>
<li>Lane, N., , <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+N+%22Power%2C+Sex%2C+Suicide%3A+Mitochondria+and+the+Meaning+of+Life%22">Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life</a>. 368, Oxford University Press. USA. (2006).</li>
<li>Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial-nuclear+epistasis+affects+fitness+within+species+but+does+not+contribute+to+fixed+incompatibilities+between+species+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%3B+international+journal+of+organic+evolution%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila.</a> Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).</li>
<li>Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+increases+mitochondrial+efficiency+by+mtDNA-dependent+reprogramming+of+mitochondrial+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila.</a> Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).</li>
<li>Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%C3%97G%C3%97E+for+Lifespan+in+Drosophila%3A+Mitochondrial%2C+Nuclear%2C+and+Dietary+Interactions+that+Modify+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity.</a> PLoS genetics. 10 (5), e1004354(2014).</li>
<li>Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+statistical+models+of+metabolomic+data+reveals+different+metabolite+distribution+patterns+in+isonitrosoacetophenone-elicited+Nicotiana+tabacum+and+Sorghum+bicolor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22SpringerPlus%22%5BJournal%5D)">Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells.</a> SpringerPlus. 3, 254(2014).</li>
<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+Studies+Of+Mammalian+Tissues+I+.+Isolation+Of+Intact+Mitochondria+From+Rat+Liver+Some+Biochemical+Properties+Of+Mitochondria+And+Submicroscopic+Particulate+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material.</a> Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+isolated+in+nearly+isotonic+KCl+buffer%3A+focus+on+cardiolipin+and+organelle+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).</li>
<li>Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+mitochondrial+phenotyping+by+high+resolution+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics.</a> PloS one. 7 (3), e33020(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De meest kritische stappen in dit protocol zijn: 1) het grootbrengen genoeg vliegen in een overvloed aan ruimte. Het is zeer belangrijk om niet de demografie kooien met meer dan 150 vliegen per overpopulate; 2) het veranderen van het voedsel van de kooien vaak om voedsel concurrentie en voedingswaarde stress te vermijden; en 3) het handhaven van alle monsters bij 4 ° C om de integriteit te verzekeren tijdens de isolatie van de mitochondriale fractie. Het wordt ook aanbevolen om de isolatie buffer, het wassen buffer, en ...

Het doel van deze procedure is om verrijkte mitochondriale fracties die voldoende mitochondriale metabolieten opleveren voor metabolomics studies met behulp van Drosophila melanogaster ontwikkelen. In onze ervaring, metabolomics analyse met behulp van hele cellulaire extractie methoden zijn niet in staat om subtiele mitochondriale metaboliet veranderingen in Drosophila detecteren. Echter, mitochondriale fractionering vóór metabolomics analyse verhoogt de gevoeligheid voor mitochondriale metaboliet verschuivingen identificeren. Mitochondriën zijn cellulaire organellen verantwoordelijk voor 90% van de energie die de cellen nodig voor normale functie 1. De laatste jaren is erkend dat mitochondriën een veel dynamischer rol in cellulaire en organismale functie van alleen de productie van adenosine trifosfaat (ATP), en worden nu erkend als knooppunten voor de regulering van metabole homeostase 2,3. Mitochondriën zijn het resultaat van een proces waarin endosymbiotic distinct microbiële lijnen samengevoegd ~ 1,5 miljard jaar geleden 4. Zoals mitochondriën uitgegroeid tot ware organellen, werden genen van de endosymbiont opgenomen in de opkomende nucleaire genoom. Bij dieren vandaag ongeveer 1500 mitochondriale eiwitten nucleair gecodeerd terwijl 37 genen blijven de mtDNA, 13 die coderen voor mitochondriale eiwitten die subeenheden van het enzym complexen van oxidatieve fosforylering 5. Coördinatie tussen mitochondria en nucleaire compartimenten nodig om een ​​goede mitochondriale functie te behouden. Volgens de hieronder beschreven werkwijzen konden we mitochondriale metabole veranderingen in Drosophila als gevolg van manipulatie van de coördinatie van mitochondriale en nucleaire genoom te detecteren. Gebruikten we een stam van Drosophila waarin mtDNA van haar zus soorten D. simulans werd op een enkele D. geplaatst melanogaster nucleaire achtergrond 6. Deze &#39;verstoord&#39; mitonucleargenotype vergeleken met de &quot;natieve&quot; of co-geëvolueerde mitonuclear genotype van D. melanogaster dragen dezelfde nucleaire genoom met zijn inheemse D. melanogaster mtDNA. De D. en D. melanogaster simulans mtDNAs verschillen ~ 100 aminozuren en&gt; 500 synoniem substituties die mitonuclear communicatie 7,8 beïnvloeden. We gegenereerd hele fly extracten en mitochondriale verrijkte extracten metaboliet verschuivingen studeren in reactie op farmacologische stress. Hier laten we zien dat bij het ​​gebruik van mitochondriale verrijkte fracties op te sporen we duidelijke verschuivingen in het mitochondriaal metabolieten tussen de inheemse, co-geëvolueerd genotype dragen van de D. melanogaster mtDNAs en de verstoorde genotype dragen D. simulans mtDNA. In tegenstelling, de metaboliet verschillen tussen beide genotypes subtiele met normale werkwijzen die hele fly extract gebruiken. Daarom is deze werkwijze verschaft een weg te begrijpen hoe mtDNAs bemiddelen mitochondriale veranderingenreactie op verschillende drugs.

<table><tbody><tr><td>0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate</td><td>VWR</td><td>AAA14289</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792799</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morfolino) propaansulfonzuur (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38057&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES3098T-B7</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>CO2-pads om vliegen te verdoven</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>1 L kooi</td><td>Web Restaurant Store</td><td>999RD32</td><td></td></tr><tr><td>1 L kooideksel</td><td>Web Restaurant Store</td><td>999LRD</td><td></td></tr><tr><td>een glazen-teflon dounce homogenisator&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9661231</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>rapamycine&nbsp;</td><td>LC Laboratories&nbsp;</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td>anti-porine</td><td>MitoSciences</td><td>MSA03</td><td></td></tr><tr><td>anti-alfa tubuline</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>12G10</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>CO2-pad</td><td>Tritech Research, Inc</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>filterfles</td><td>enasco</td><td>SB08184M</td><td></td></tr><tr><td>rubber stopper</td><td>enasco</td><td>S08512M</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van mitochondriaal verrijkte fracties voor metabole analyse in<em&gt; drosophila</em

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Aangezien mitochondriën een rol spelen bij het metabolisme van aminozuren, koolhydraatmetabolisme en oxidatie van vetzuren, zijn defecten in de mitochondriale functie vaak schadelijk voor degenen die lijden aan deze complexe ziekten. Het detecteren van mitochondriale metabolische veranderingen is essentieel voor het begrijpen van mitochondriale stoornissen en mitochondriale reacties op farmacologische middelen. Hoewel mitochondriale stofwisseling centraal staat in metabole regulatie, kan de detectie van subtiele veranderingen in mitochondriale stofwisseling worden belemmerd door de oververtegenwoordiging van andere cytosolische metabolieten verkregen door extractie van hele organismen of hele weefsels.
Hier beschrijven we een isolatiemethode die uitgesproken mitochondriale metabolische veranderingen detecteerde in Drosophila die verschillend waren tussen hele vlieg- en mitochondrionrijke preparaten. Om de gevoeligheid van deze methode te illustreren, gebruikten we een set Drosophila met genetisch diverse mitochondriale DNA's (mtDNA) en stelden ze deze bloot aan het medicijn rapamycine. Met behulp van deze methode toonden we aan dat rapamycine mitochondriale stofwisseling wijzigt op een mitochondriale-genotype-afhankelijke manier. Deze veranderingen zijn echter veel duidelijker in metabolomics-studies wanneer metabolieten werden geëxtraheerd uit mitochondriale verrijkte fracties. In tegenstelling daarmee detecteerden extracten van hele weefsels alleen metabolische veranderingen gemedieerd door het medicijn rapamycine onafhankelijk van mtDNA's.

De protocol hierboven uitgelegd, voerden we metabolomic analyse van mitochondriale verrijkte fracties en hele dier extracten om het effect van het geneesmiddel rapamycine op uiteenlopende mtDNAs 7 testen. We geleverde 200 M van rapamycine door het oplossen van het geneesmiddel in de vlieg voedsel. Vliegen werden blootgesteld aan rapamycine gedurende 10 dagen. Metabolieten uit hele vlieg extracten en van mitochondriale extracten werden verkregen met behulp van gaschromatog...

Mitochondria spelen een centrale rol in de regulatie van metabolisme en homeostase. Subtiele veranderingen in mitochondriaal metabolisme die de fysiologie van organismen beïnvloeden, kunnen moeilijk te detecteren zijn in metabolomics-studies van hele organismen. Hier beschrijven we een isolatiemethode die de detectie van subtiele metabolische verschuivingen in Drosophila melanogaster verbetert.

Voorbereiding van mitochondriaal verrijkte fracties voor Metabole analyse in<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het verkrijgen van verrijkte mitochondriale fracties die voldoende mitochondriale metabolieten opleveren voor metabolomische studies met behulp van drosophila melanogaster. Dit wordt bereikt door eerst een voldoende aantal vliegen te kweken om genoeg metabolieten te genereren voor mitochondriale verrijkte fracties. Als tweede stap worden de vliegen gehomogeniseerd in een glazen Teflon-downs homogenisator, die het celmembraan afbreekt zonder de integriteit van de mitochondriën aan te tasten.Vervolgens worden de homogenaten onderworpen aan differentiële centrifugatie om verrijkte mitochondriale monsters te verkrijgen. De resultaten tonen aan dat met dit protocol uitgesproken mitochondriale metabole veranderingen werden gedetecteerd, die niet werden waargenomen bij een volledig op metabolomics gebaseerde analyse van mitochondriale verrijkte fracties en extracten van het hele dier. Het belangrijkste voordeel van deze procedure ten opzichte van een metabolomische analyse van de hele vlieg is dat de isolatie van mitochondriën voorafgaand aan de metabolomische analyse zorgt voor een verhoogde gevoeligheid en detectie van verschuivingen in mitochondriale metabolieten.Om het experiment te beginnen, worden de ingrediënten voor het vliegenvoedsel op een warmteplaat verhit tot 90 °C. Roer het mengsel regelmatig totdat het homogeen en licht stroperig is. Verwijder het voedsel van de warmtebron en roer af en toe terwijl het voedsel afkoelt tot 80 °C; voeg vervolgens 0,2%TE decept methyl four hydroxy benzoate opgelost in 95%Ethanol toe. Verdeel het voedsel daarna in twee gelijke volumes.Zorg ervoor dat de temperatuur van het voedsel is gedaald naar 50 °C en roer 1,1 ml 50 mM rapamycine opgelost in ethanol door het eerste volume en 1,1 ml onbehandelde ethanol door het tweede volume. Voor het verzamelen van volwassenen wordt een enkeltrapsregelaar gebruikt om zuivere koolstofdioxide uit een hogedruktank te leveren. Bij een continue stroom van vijf PS voorkom ik statische elektriciteit door een plastic buis te gebruiken om de koolstofdioxide naar een filterkolf van 500 ml te leiden, met slangetjes om de koolstofdioxide door water te laten borrelen.Gebruik hiervoor een rubberen stop met één gat om de kolf af te sluiten. Verbind plastic slang van de zijdelingse opening van de kolf met een koolstofdioxidekussen om de larvendichtheid tijdens de ontwikkeling te regelen. Plaats 25 paren ouders in een kweekfles en laat hen gedurende 48 uur eitjes leggen.Verwijder vervolgens de ouders om de eidichtheid te reguleren en herhaal deze stappen met de opkomende F1-nakomelingen om twee generaties van deze dichtheidscontrole te realiseren. Scheid na twee generaties onder dichtheidsgecontroleerde omstandigheden de vliegen op basis van geslacht, waarbij de vliegen niet langer dan 10 tot 15 minuten op het kussentje worden geplaatst. Laat de vliegen 24 uur lang herstellen van de anesthesie voordat ze in de experimentele omstandigheden worden geplaatst.Wijs 300 vliegen per monster toe om voldoende metabolieten te genereren voor mitochondriale verrijkte fracties. Breng 150 vliegen over naar een zelfgemaakte kooi van één liter. Breng vervolgens de resterende 150 vliegen over naar een aparte kooi van één liter en zorg dat de kooien niet overbevolkt raken met meer dan 150 vliegen.Gebruik zes replica-monsters per experimentele conditie en plaats de kooien bij 25 °C in een licht-donkercyclus van 12 uur om de kweek van drosophila te voltooien. Voorzie de vliegen elke twee of drie dagen van vers voedsel in een vial met 5 mL voedsel om de voedselkwaliteit gedurende in totaal 10 dagen te behouden. Start de isolatie door de vliegen vanuit één kooi over te brengen in een glazen Teflon-homogenisator gevuld met 1 mL gekoelde isolatiebuffer.Plaats vervolgens een vijzel op ijs om de mitochondriën intact te houden en homogeniseer de vliegen met 15 slagen. Breng het homogenisaat zorgvuldig over naar een buisje van 1,5 milliliter zonder de stamper te draaien en centrifugeer het buisje 5 minuten bij 300 ×g bij 4 °C. Breng het supernatant over naar een ander buisje en centrifugeer het supernatant 10 minuten bij 6.000 ×g bij 4 °C om de mitochondriën te concentreren.Gooi na centrifugatie het supernatant met de cytosolische fractie weg. Resuspendeer de pellet in 300 µL wasbuffer door herhaaldelijk op te zuigen en uit te pipetteren. Herhaal de vorige stappen voorzichtig voor de tweede centrifugeerronde.Combine vervolgens de resuspendeerde pellets van beide kooien in een cryogene microcentrifugebuis en centrifugeer de gecombineerde pellets bij 6.000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en vries de pellet snel in met vloeibare stikstof. Bewaar de mitochondriaal verrijkte fracties tot slot bij -80 °C.Deze western blot toont een verrijking van het mitochondriale membraantransporteiwit poin, dat dient als indicator voor de effectieve scheiding van mitochondriën in mitochondriale fracties. Het poin-eiwit is niet detecteerbaar in cytosolische fracties, terwijl het tubuline-eiwit, een cytosolisch microtubule-eiwit, niet wordt gedetecteerd in de mitochondriale fractie, wat wijst op een minimale contaminatie van cytosolische eiwitten. Principal component analyses (PCA) werden gegenereerd met behulp van de waarden uit de massaspectrometrie-analyse, die werden genormaliseerd naar de Bradford-eiwitconcentratie, log-getransformeerd en getrimd op basis van de minimaal waargenomen waarden voor elke verbinding.PCA-plots werden gegenereerd met behulp van volledige metabolietenprofielen van native en gedisrupte vliegenstammen; mitochondriale DNA-metabolieten verkregen met een standaard whole fly-extract kunnen worden vergeleken via een PCA-plot van metabolieten in mitochondrie-verrijkte extracten. De metabolietenprofielen van het gehele organisme scheiden volledig langs PC-as twee en weerspiegelen de belangrijkste effecten van de rapamycinebehandeling. Er zijn slechts subtiele verschillen tussen de alternatieve M-T-D-N-A-genotypes.In tegenstelling hiermee vertonen de metabolietprofielen van mitochondriale verrijkte extracten een scheiding tussen het native M mt DNA-genotype op normaal voer en de andere drie monsters: het native MTD NA op rapamycine en het alternatieve MTD NA op zowel normaal voer als rapamycine. Dit impliceert dat het effect van het alternatieve MTD NA de metabolietprofielen verschuift op een wijze die analoog is aan de effecten van een rapamycinebehandeling. Tijdens het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk en wordt aanbevolen om alle extracties op dezelfde dag uit te voeren, om de variabiliteit tussen replicaten te verminderen.Ik raad aan om vooraf een plan op te stellen, de vials te labelen en de wachttijden tussen de replica's bij te houden om de kwaliteit van onze monsterpreparatie te verbeteren.

preparation-mitochondrial-enriched-fractions-for-metabolic-analysis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In deze video laten wij u zien hoe de mitochondriale ademhalingsketen-complexen van menselijke embryonale stamcellen kunnen worden geanalyseerd met behulp van gel-activiteit assays.

Peilen naar Mitochondriale complexe activiteit in menselijke embryonale stamcellen

Beschrijven we een snelle en effectieve methode voor de zuivering van mitochondriën van de...

Zuivering van Mitochondriën uit gistcellen

Deze procedure laat zien hoe u te isoleren van de volwassen hersenen van muizen de mitochondriën-geassocieerde ER membranen of Mams en de glycosfingolipiden verrijkte microdomain fracties uit Mams en mitochondriale preparaten.

Mitochondriën-geassocieerde ER Membranen (eigen MTM) en glycosfingolipiden Verrijkt microdomeinen (GEM): Isolatie van Mouse Brain

Analyse van de structureel-functionele relatie van de mitochondriën is vereist voor een grondig begrip van de regulerende mechanismen van de functionele werking van mitochondriën. Specifieke methoden voor het bestuderen van de structuur en functie van mitochondriën in levende en gefixeerde Drosophila eierstokken worden in dit artikel beschreven en gedemonstreerd.

Het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in Drosophila Eierstokken

In dit protocol tonen we de toepassing van seriële-sectie Elektronentomografie ophelderen van mitochondriale structuur in Drosophila indirecte vlucht spier.

3D mitochondriale ultrastructuur van Drosophila indirecte vlucht spier geopenbaard door seriële-sectie Elektronentomografie

In dit document wordt een methode voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van hoge-resolutie respirometrie in permeabel thoraxes van Drosophila beschreven. Deze techniek vereist een minimale hoeveelheid weefsel in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-techniek en de verkregen resultaten meer fysiologisch relevant zijn.

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

Dit protocol wordt beschreven hoe voor te bereiden Drosophila larven op basis van GC-MS metabolomic analyse.

Voorbereiding van Drosophila larvale monsters van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS)-gebaseerd metabolomica

Presenteren we een protocol voor het meten van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Een metabole analyzer wordt gebruikt met een aangepast en geoptimaliseerd protocol. Micro-weefsel beperkingen werden zijn een essentieel onderdeel van dit protocol en ontworpen en gemaakt speciaal voor hun gebruik in deze analyse.

Metabole analyse van Drosophila melanogaster Larval en volwassen hersenen

Ondanks recente vooruitgang blijven veel mitochondriale gisteiwitten nog steeds met hun functies volledig onbekend. Dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode om de submitchondriale lokalisatie van eiwitten te bepalen, wat fundamenteel is geweest voor de opheldering van hun moleculaire functies.

Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.

Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays

Hier presenteren we een respirometrieprotocol met hoge resolutie om bio-energetica in PINK1B9-null mutante fruitvliegjes te analyseren. De methode maakt gebruik van het SUIT-protocol (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Analyse van de mitochondriale functie in een Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-mutant met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Leer hoe je mitochondriaal verrijkte fracties isoleert uit Drosophila melanogaster voor metabole analyses. Deze methode verhoogt de gevoeligheid voor het detecteren van subtiele metabolische veranderingen.

Voorbereiding van mitochondriaal verrijkte fracties voor Metabole analyse in

Meer video's verkennen