Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

Het algemene doel van deze microscopietechniek is om eiwitten en eiwitinteracties te visualiseren op de schaal van enkele moleculen en nanometer. Dus deze methode kan ons helpen om enkele belangrijke vragen op het gebied van de biologie te beantwoorden, zoals moleculaire interacties in oncogeen signaleringsprocessen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gevoelig is, specifiek en biedt het resoluties van enkele moleculen en nanometer.

Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Dr. Tahan, een senior onderzoeker verbonden aan mijn laboratorium. Na het klonen van RAs en RAF R-B-D-P-A-M Cherry een fragmenten in virale deeltjes verpakken en het infecteren van U2 OS cellen volgens het tekstprotocol. Om een monster voor beeldvorming voor te bereiden, ongeveer 5,5 keer 10 tot de vierde stabiele expressiecellen per put van een achtputs glazen bodem kamerplaat in 350 microliter fenolroodvrij DMEM. Gebruik vers paraaldehyde met glutaraldehyde om de cellen te fixeren en vervang het fixeermiddel met PBS of beeldvormingsbuffer, vortex 100 nanometer goudpartikels en voeg 35 microliters per put toe voor het volgen van de driftfase tijdens beeldvorming.

Nader de microscoop en zet de 405 en 561 nanometer lasers aan, houd de sluiters op dit moment gesloten, zorg ervoor dat de 561 nanometer dichroische spiegel en notchfilter op hun plaats zijn. Open de beeldverwervingssoftware. Zet de E-M-C-C-D camera aan en laat deze afkoelen en stel de belichtingstijd in op 100 milliseconden en de E-M-C-C-D versterking op een geschikte waarde.

Voeg immersieolie toe aan het objectief en bevestig het monster op de microscooptafel. Breng vervolgens met behulp van brightfield of de 561 nanometer laser het monster scherp voor beeldvorming van RAs en andere membraaneiwitten. Gebruik een 60 x APO chromat turf objectief met een numerieke apertuur van 1,49 en breng de microscoop in turf configuratie.

Pas de excitatielaser aan zodat deze gecentreerd is bij het raken van de achterste apertuur van het turf objectief, wat ervoor zorgt dat de laser wordt afgebogen wanneer deze de dekglasbuffer bereikt. Blijf de laserincidentiepositie aanpassen totdat de kritische hoek is bereikt en de laser wordt teruggekaatst. Zoek naar een cel om te beelden met verschillende goudpartikels in beeld.

Stel vervolgens een gebied van interesse in dat de cel of een deel ervan en de goudpartikels omvat voor het geval er al voldoende activering plaatsvindt vanwege hoge expressieniveaus. Begin met beeldverwerving met de 405 nanometer laser uit en de 561 laser aan. Anders, zet de 405 nanometer laser aan op de laagste fabrieksvermogensinstelling en verhoog deze geleidelijk tot er tientallen moleculen per frame zijn of zodat enkele moleculen goed gescheiden zijn.

Terwijl de gegevensverwerving doorgaat, verhoog geleidelijk het vermogen van de 405 nanometer laser om de spotdichtheid ongeveer constant te houden. Ga door met beeldverwerving totdat de hoge 4 0 5. Vermogen niet meer geïnitieerd wordt.

Activeringsgebeurtenissen eindigen om beelden te verwerken. Download de beeldverwerkingssoftware. Open MATLAB en laad de WFI read software.

Bekijk de onbewerkte beeldsequentie en bepaal het gebied van interesse of ROI, selecteer het gebied van de stack om te worden verwerkt door met de linkermuisknop te klikken en een vak om het gewenste gebied te slepen. Als het gebied van interesse niet werd verkleind tijdens de verwerving, selecteer een kleiner gebied om de berekeningstijd te verminderen om een gebied te deselecteren en het hele frame te verwerken, klik met de rechtermuisknop ergens in de afbeelding ernaast om een set fiduciaire markeringen te definiëren, zoals goudpartikels geabsorbeerd op het dekglas die goed geïsoleerd, uniform en van vorm zijn en gedurende de hele beeldafbeelding aanwezig zijn. Begin met het selecteren van een kandidaat goudpartikel door met de linkermuisknop op zijn afbeelding te klikken en een klein vak eromheen te slepen.

Onder deeltje volgen, klik op de knop volgen. Er verschijnt een grafiek die de positie van het geselecteerde goudpartikel over de stack van beelden toont en de mate van drift weergeeft. Herhaal dit proces om zoveel mogelijk goudpartikels te volgen en bepaal welke deeltjes samen volgen. Ideaal.

De algehele drift is op de orde van 0,1 pixel op zijn hoogst, een voor een. Selecteer de goudpartikels die samen zijn gevolgd en klik onder deeltje volgen op de knop marker toevoegen.

Er verschijnt een groen kruis dat aangeeft dat het deeltje is toegevoegd als marker en zal worden gebruikt om te corrigeren voor drift. Pas de sigma-bereikssmoothing en de drempelwaarde naar behoefte aan door de waarde lichtjes te wijzigen. Klik op de knop deeltje zoeken om de instellingen te testen en bekijk visueel de verwerkte deeltjes, zoals de PAM cherry een moleculen die relatief rond en helder zijn, zullen worden omringd en degene die dat niet zijn, zullen worden weggelaten.

Om met het verwerken van de beelden te beginnen, klik op de knop cord-bestand maken en sla het bestand op onder een gewenste naam om de beelden na te verwerken en de palm afbeelding te renderen. Start het palm pakket in MATLAB, laad het dot core bestand dat zojuist is gemaakt. Een grof gerenderde afbeelding verschijnt in het afbeeldingsvak naast de controle knoppen.

Sorteer de individuele coördinaten met behulp van de volgende typische waarden. Voor PAM Cherry een, frame combineren is gelijk aan acht. Combineren afstand in nanometer is gelijk aan 100 minimum RMS is gelijk aan vier.

Minimum fit goodness is gelijk aan 0,25 en max excentriciteit is gelijk aan 1,4. Klik op de knop sorteren om een nieuwe set samengestelde coördinaten te genereren die klaar zijn voor het renderen van hoge resolutie afbeeldingen. Voer waarden in voor de juiste weergave van de uiteindelijke afbeelding, zoals de grootte van de ruwe pixels zoals eerder bepaald, de gewenste kenmerkgrootte in de weergegeven afbeelding, die normaal gesproken op een waarde iets hoger dan de gemiddelde lokalisatie is ingesteld, en de pixels grootte zoals