Name: Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Leer BiFC-PALM-microscopie om eiwit-eiwitinteracties te visualiseren op nanometerschaal in U2OS-cellen. Deze methode biedt enkelvoudige-molecuulresolutie voor oncogen signaalonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Drs. Steven Chu en Joe W. Gray voor nuttige discussies, Henry Marr voor zijn initiële werk aan het BiFC-PALM project, en Alexis Shoemaker voor haar technische assistentie. Dit werk wordt ondersteund door opstartfondsen aan X.N. van OHSU. Het onderzoek in het Nan laboratorium werd ook ondersteund door NIH 5U54CA143836-05, de Damon Runyon Cancer Research Foundation, de M. J. Murdock Charitable Trust en de FEI-onderneming.

<ol><li>Braun, P., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+protein-protein+interactions%3A+From+egg-white+to+complex+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks.</a> Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).</li>
<li>Lasserre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raft+nanodomains+contribute+to+Akt%2FPKB+plasma+membrane+recruitment+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation.</a> Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li>
<li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29%3A+a+5-year+update+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives.</a> Biotechniques. 53, 285-298 (2012).</li>
<li>Lingwood, D., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Rafts+As+a+Membrane-Organizing+Principle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle.</a> Science. 327 (5961), 46-50 (2009).</li>
<li>Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+nanoswitches+generate+high-fidelity+Ras+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivated+Localization+Microscopy+with+Bimolecular+Fluorescence+Complementation+%28BiFC-PALM%29+for+Nanoscale+Imaging+of+Protein-Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells.</a> PloS one. 9 (6), e100589(2014).</li>
<li>Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking+photoactivated+localization+microscopy+for+mapping+single-molecule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics.</a> Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).</li>
<li>Shyu, Y. J., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+complementation%3A+an+emerging+tool+for+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research.</a> Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).</li>
<li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+human+cell+lines+with+Tetracycline-inducible+%28Tet-on%29+shRNA+or+cDNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.+March%22%5BJournal%5D)">Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression.</a> J. Vis. Exp. March. (73), e50171(2013).</li>
<li>Robida, A. M., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+of+inducible+protein+interactions%3A+effects+of+factors+affecting+protein+folding+on+fluorescent+protein+fragment+association%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association.</a> J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+biosensors+based+on+dimerization-dependent+fluorescent+protein+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange.</a> Nat. Methods. 12 (3), (2015).</li>
<li>Seidman, C. E., Struhl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Coligan, J. E., et al. Appendix 4, 4D(2001).</li>
<li>Morrison, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+frozen+bacterial+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preparing frozen bacterial stocks.</a> Curr. Protoc. Immunol. Coligan, J. E., et al. Appendix 3, Appendix 3M(2001).</li>
<li>Campeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+viral+system+for+expression+and+depletion+of+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells.</a> PloS One. 4 (8), e6529(2009).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).</li>
<li>Deschout, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precisely+and+accurately+localizing+single+emitters+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).</li>
<li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li>
<li>Chenouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+comparison+of+particle+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).</li>
<li>Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+intracellular+diffusive+states+and+transition+rates+from+single-molecule+tracking+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data.</a> Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+and+tracking+of+protein%E2%80%93protein+interactions+in+sub-diffraction+cellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space.</a> Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).</li>
<li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+reveals+structural+features+of+EB1+in+microtubule+plus-end+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking.</a> Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

BiFC is een veelgebruikte techniek voor het opsporen en visualiseren van PPI in cellen geweest, terwijl PALM is een recente single molecule superresolutiemicroscopie techniek die nanoschaal beeldvorming van intacte biologische monsters mogelijk maakt. De combinatie van BiFC met PALM bereikt selectieve beeldvorming van PPI&#39;s in een cel met nanometer ruimtelijke resolutie en single molecule gevoeligheid. BiFC-PALM breidt het nut van beide technieken, en zoals aangetoond in dit werk toont grote belofte in het openbaren...

Eiwit-eiwit interacties (PPI) zijn van fundamenteel belang voor de biologie 1 en zijn strak gereguleerd via spatiotemporele mechanismen heel veel tijd en lengteschalen. Studies on cell signaling op het celmembraan, bijvoorbeeld, zijn dynamische, nanoschaal ruimtelijke compartimenten specifieke PPI en cellulaire processen 2 vergemakkelijken geopenbaard. Vandaar dat de mogelijkheid om protonpompremmers in biologische systemen sonde met voldoende ruimtelijke en temporele resolutie, hoge specificiteit en hoge gevoeligheid is de sleutel tot het bereiken van een mechanistisch begrip van de biologie. Bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) is één van de weinige bestaande instrumenten voor het visualiseren van PPI&#39;s in een cel met subcellulaire resolutie en live-cell compatibiliteit 3-5. De techniek is relatief eenvoudig en omvat splitsing van een fluorescentie-eiwit in twee niet-fluorescerende fragmenten; wanneer genetisch gelabeld twee interagerende eiwitten enin de nabijheid komt, kunnen de fragmenten reconstrueren tot een volledig fluorescent eiwit vormen, waarbij fluorescent signaal. Indien juist ontworpen, mag BiFC probes niet spontaan reconstitueren in afwezigheid van protonpompremmers. Als zodanig zal het fluorescentiesignaal in een BiFC assay alleen voordoen in aanwezigheid van protonpompremmers, die directe visualisatie van protonpompremmers met hoge specificiteit mogelijk maakt. Bijkomende voordelen van het gebruik van fluorescentie als uitlezing zijn hoge gevoeligheid, subcellulaire resolutie, en compatibiliteit met hoge doorvoer en hoge gehalte screeningstesten, onder anderen. Om deze voordelen is een aantal BiFC probes op basis van verschillende bovenliggende fluorescente proteïnen ontwikkeld. Zoals in alle andere detectietechnieken gebaseerd op conventionele lichtmicroscopie echter de ruimtelijke resolutie van BiFC beperkt tot ~ 250 nm door diffractie van licht. Dit maakt het een uitdaging om de regulering van de PPI&#39;s bestuderen op nanoschaal, die, zoals eerder gezinspeeld en geïllustreerd door lipid rafts 6 and Ras nanoclusters 7, is een kritische lengte schaal om het begrijpen van vele cellulaire processen zoals signalering. BiFC is gecombineerd met fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) 8,9 om deze limiet in de ruimtelijke resolutie te overwinnen voor het afbeelden van PPI 10. PALM is een recente superresolutiemicroscopie techniek die de diffractielimiet in fluorescentie beeldvorming door middel van stochastische activering en subdiffractive lokalisatie van enkele fluorescerende moleculen omzeilt. In elke cyclus activatie, een fluorescent molecuul geeft een paar honderd tot een paar duizend fotonen en geeft aanleiding tot een enkel beeld molecule op de detector. Terwijl het beeld buigingsbegrensde (~ 250 nm breed), het zwaartepunt kan worden bepaald met een veel hogere nauwkeurigheid, typisch in de orde van 10-50 nm afhankelijk van het aantal gedetecteerde fotonen. Door het activeren en het lokaliseren van elke fluorescerende moleculen in het monster, kan een hoge resolutie worden gereconstrueerd. Performed op levende cellen, enkel molecuul volgen (smt-) PALM verdere vergunningen overname van duizenden eiwit diffusie trajecten van een enkele cel 11. Belangrijk PALM gebruikt gespecialiseerde fluorescente probes zoals activeerbare fluorescente eiwitten (PA-KP) stochastische activatie bereiken. Aangezien zowel BiFC en PALM gebruik fluorescerende eiwitten, werden zij gecombineerd door het splitsen PAmCherry1, een veelgebruikte PA-FP voor PALM, in twee fragmenten tussen aminozuren 159 en 160. Het BiFC systeem op basis van split PAmCherry1 toont lage achtergrond signaal van spontane reconstructie van de twee fragmenten. Bij genetisch gelabeld met een paar interagerende eiwitten, de twee fragmenten (RN = residuen 1-159; RC = Met + residuen 160-236) efficiënt gereconstitueerd volledige PAmCherry1 eiwitten ook bij 37 ° C en zonder incubatie bij lagere temperaturen ontstaan, waardoor is niet het geval voor andere BiFC paren 12, zoals de ouder mCherry 13. Furthermoopnieuw, de opgeloste PAmCherry1 eiwit behield de fotofysische eigenschappen van de moedermaatschappij PAmCherry1, zoals hoge contrast ratio, medium foton opbrengst, en snel fotoactivatie, onder anderen, die kritisch zijn voor accurate single molecule lokalisatie en hoge-resolutie PALM beeldvorming zijn. In dit protocol, het gebruik van BiFC-PALM voor beeldvorming van Ras-Raf interacties in U2OS cellen door het gebruik van split PAmCherry1 (figuur 1A) wordt beschreven. De eerste stap is om de constructen te ontwerpen voor expressie fusieproteïnen tussen PAmCherry1 fragmenten (dat wil zeggen, RN en RC) en de eiwitten van belang. In theorie, voor elk paar kandidaateiwitten (A en B) zijn er acht paren fusie-eiwitten te onderzoeken: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; en A-RC / B-RN. Deze werkwijze kan vaak worden vereenvoudigd door rekening te houden met de structurele of biochemische eigenschappen van de kandidaat eiwitten. Bij Ras, het eiwitpost-translationeel gemodificeerd aan het C-terminale CAAX box (C = Cys; A = alifatisch; X = elk), waarna de AAX motief wordt afgesplitst. Vandaar RN of RC kan alleen worden gefuseerd aan de N-terminus van Ras; dit vermindert het aantal fusieproteïne paren vier (Figuur 1B). Voor Raf, de Ras-bindend domein (RBD; resten 51-131) wordt gebruikt en kan worden gelabeld aan beide zijden. Deze vier fusion configuraties werden gegenereerd: RN-KRAS / RC-Raf RBD; RN-KRAS / Raf RBD-RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; en RC-KRAS / Raf RBD-RN. Bovendien zal de linker tussen de fragmenten en de eiwitten van belang te worden overwogen. Een flexibele linker van ongeveer tien aminozuren wordt vaak gebruikt omdat het voldoende vrijheid complementatie optreden. Een dergelijke linker is (GGGGS) x2, maar er zijn vele anderen die met succes zijn toegepast, met inbegrip van willekeurige sequenties gegenereerd uit een meervoudige kloneringsplaats (MCS) 14. De lengte van de linkers moet mogelijk worden geoptimaliseerd DependinG van de grootte van de eiwitten van belang en de oriëntaties in de omgang. De PAmCherry1 fragmenten worden opgenomen in een kleine klonen backbone met flankerende MCSs (zie Materials List). Genen van belang kan worden ingebracht via de restrictieplaatsen of een ligatie onafhankelijke methode. Na kloneren en sequentieverificatie, wordt de expressiecassette overgebracht in een expressievector onder toepassing van een recombinase reactie, een klonen met hoge betrouwbaarheid en hoge efficiency. Vervolgens worden de resulterende expressieconstructen getransfecteerd in de doelwitcellijn of, indien een stabiele cellijn is gewenst, verpakt in lentivirus voor het infecteren van de doelcellijn. Transiënte transfectie maakt een snelle validatie van de BiFC configuraties, maar potentiële problemen worden aangehouden. Transfectie met behulp van chemicaliën vaak benadrukt de cellen, wat resulteert in hoge autofluorescentie; terwijl het gebruik van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) Micrpy kan deze achtergrond signaal te verzachten door het beperken van de verlichting volume, TIRF ideaal wanneer de PPI&#39;s vinden plaats op de celmembraan. Bovendien transiënte transfecties leiden vaak tot hoge niveaus van eiwitexpressie, ver boven die van de endogene eiwitten die artefacten in het detecteren van de PPI kan veroorzaken. Daarom wordt aanbevolen dat stabiele cellijnen worden vastgesteld na een passende BiFC configuratie is vastgesteld door de eerste testen. Stabiele cellijnen hebben ook het potentieel voor afstembare expressie via doxycycline inductie 15. Na infectie worden cellen geselecteerd met antibiotica, meestal puromycine en neomycine, één voor elk construct. De volgende stappen voor de monstervoorbereiding, beeldacquisitie en data-analyse wordt in detail beschreven in de protocollen. Bij deze benadering worden de vorming van clusters op nanoschaal BiFC-PALM beelden van Ras-Raf RBD routinematig waargenomen (Figuur 2A &lt;/ strong&gt;). Consequent, SMT-PALM trajecten van Ras-Raf RBD vertonen een heterogene verdeling in de diffusie staten (figuur 2B-D). Deze resultaten suggereren dat Ras-Raf-complexen bestaan ​​meerdere toestanden op het celmembraan, vermoedelijk als monomeren en clusters, met potentiële biologische implicaties. Dit werk demonstreert de kracht van BiFC-PALM selectieve beeldvorming van protonpompremmers in cellen met nanometer ruimtelijke resolutie en gevoeligheid single molecule, die moeilijk te verkrijgen met gebruikelijke BiFC fluorescentie co-lokalisatie of fluorescentie-energieoverdracht (FRET) zijn. Bij het ontwerpen van BiFC experimenten en interpretatie van de resultaten, is het belangrijk in het achterhoofd dat de BiFC proces onomkeerbaar is in de meeste gevallen, waaronder split PAmCherry1 te houden. Wanneer de twee fragmenten samen en vormen een volledige PAmCherry1 eiwit, de koppeling tussen de twee fragmenten, en daarmee de PPI permanent wordt. Dit beperkt het gebruik van BiFC en BiFC-PALM toezicht op de dynamiek van de protonpompremmers (bijv bindingskinetiek en niet de diffusie dynamiek van het eiwit complex eenmaal is gevormd) en soms zelfs kan leiden tot mislocalisatie van de PPI complexen. Een bijkomende factor om te overwegen bij het ontwerpen BiFC PALM-experimenten is de vertraging in rijpingsproces chromofoor die inherent is aan fluorescente proteïnen. Zodra twee eiwitten interageren en de FP fragmenten samenkomen, ze meestal te hervouwen in de orde van seconden (rust van 60 seconden voor EYFP 3). Latere chromofoor rijping en fluorescerend signaal voort in de orde van minuten. Terwijl de fluorescentie detecteerbaar kan zijn binnen 10 minuten na oplossen van split-Venus, een snel vouwen YFP-variant, de half-time voor de rijping in het algemeen vaak rond 60 min 16. Split-PAmCherry1 werd waargenomen op vergelijkbare tarieven. Vandaar BiFC en BiFC-PALM zijn slechte keuzes voor het monitoren van real-time PPI kinetiek; andere methods, zoals FRET en een recent ontwikkelde afhankelijke dimerisatie fluorescent eiwit 17, kunnen meer geschikt voor dit doel.

<table><tbody><tr><td>Microscope frame</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo TIRF 60x H</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>561 nm laser</td><td>Opto Engine</td><td>MGL-FN-561</td><td></td></tr><tr><td>405 nm laser</td><td>Coherent</td><td>CUBE-405 50mW</td><td></td></tr><tr><td>561 nm dichroic mirror</td><td>Semrock</td><td>&nbsp;Di01-R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>561 nm filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/45-25</td><td></td></tr><tr><td>405/561 nm notch filter</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/568-25</td><td></td></tr><tr><td>Temperature and CO2 controlled stage</td><td>Tokai Hit</td><td>INUBG2ATW-PLAM</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS</td><td>Addgene</td><td>60545</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS</td><td>Addgene</td><td>60546</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.2-DEST</td><td>Life Technologies</td><td>12489-019</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-DEST</td><td>Addgene</td><td></td><td>http://www.addgene.org/Eric_Campeau/</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-531</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion HD Cloning</td><td>Clontech</td><td>639649</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase</td><td>Life Technologies</td><td>11791</td><td></td></tr><tr><td>Vira Power Lentivirus Packaging</td><td>Life Technologies</td><td>K497500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE Transfection Reagent</td><td>Roche</td><td>13873800</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Chambered Coverglass</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409</td><td>#1.5 glass bottom dishes</td></tr><tr><td>U2OS cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>293T/17 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with phenol red</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DMEM no phenol red</td><td>Life Technologies</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Leibovit's L-15, no phenol red</td><td>Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Reduced serum medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>Lentiviral concentrator</td><td>Clontech</td><td>631231</td><td></td></tr><tr><td>Retroviral concentrator</td><td>Clontech</td><td>631455</td><td></td></tr><tr><td>10 cm culture dish</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6-well culture plate</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>Calbiochem</td><td>345812</td><td>Neomycin</td></tr><tr><td>Doxycyline</td><td>Fisher</td><td>BP2653</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Hydroxide</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>100 nm gold particles</td><td>BBI Solutions</td><td>EM.GC100</td><td></td></tr><tr><td>Molecular grade water</td><td>Life Technologies</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Midiprep kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>0.6 ml microcentrifuge tubes</td><td>Fisher</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td>Fisher</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polypropylene round-bottom tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>14 ml polypropylene round-bottom tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube</td><td>GeneMate</td><td>C-3328-1</td><td></td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Competent cells</td><td>Life Technologies</td><td>C4040</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fotogeactiveerde localization microscopie met bimoleculaire fluorescentie complementatie (bifc-palm)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Eiwit-eiwit interacties (PPI's) zijn belangrijke moleculaire gebeurtenissen in de biologie. Het blijft echter een uitdaging om PPI's met voldoende resolutie en gevoeligheid in cellen te visualiseren, omdat de resolutie van conventionele lichtmicroscopie beperkt is tot ongeveer 250 nm door diffractie. Door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM), kunnen PPI's in cellen worden gevisualiseerd met gevoeligheid voor enkele moleculen en een ruimtelijke resolutie van nanometer. BiFC is een veelgebruikte techniek voor het visualiseren van PPI's met fluorescentiecontrast, die het splitsen van een fluorescent eiwit in twee niet-fluorescente fragmenten omvat. PALM is een recente superresolutie microscopietechniek voor het beeldvormen van biologische monsters op de nanometer- en enkele molecuulschaal, die fototransformeerbare fluorescente sondes gebruikt, zoals fotoactiveerbare fluorescente eiwitten (PA-FP's). BiFC-PALM werd gedemonstreerd door het splitsen van PAmCherry1, een PA-FP compatibel met PALM, vanwege zijn monomere aard, goede helderheid voor enkele moleculen, hoge contrastverhouding en bruikbaarheid voor stoichiometrische metingen. Wanneer gesplitst tussen aminozuren 159 en 160, kan PAmCherry1 worden gemaakt tot een BiFC-sonde die efficiënt reconstitueert bij 37 °C met hoge specificiteit voor PPI's en lage niet-specifieke reconstituuring. De Ras-Raf-interactie wordt gebruikt als voorbeeld om te laten zien hoe BiFC-PALM helpt om interacties op nanometerschaal en met resolutie voor enkele moleculen te onderzoeken. Hun diffusie kan ook worden gevolgd in levende cellen met behulp van single molecule tracking (smt-) PALM. In dit protocol worden factoren besproken waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van de fusie-eiwitten voor BiFC-PALM, worden stapreparatie, beeldverwerving en data-analysestappen uitgelegd, en worden enkele voorbeeldresultaten getoond. BiFC-PALM biedt hoge ruimtelijke resolutie, specificiteit en gevoeligheid, en is een nuttige tool voor het bestuderen van PPI's in intacte biologische monsters.

De BiFC-PALM getoonde voorbeeld is Kras G12D mutant interactie met de Ras-bindend domein (RBD) van craf (Figuur 1A). Zoals besproken werden de RN of RC fragmenten niet gelabeld aan de C-terminus van Ras omdat de membraanlokalisatie en dus de biologische activiteit van Ras zou verstoren. Dit verminderde de mogelijke combinaties 8-4 (Figuur 1B). Elk van deze vier combinaties werd ingebracht in cellen met behulp U2OS lentivirale infectie. De cellen werden vastgesteld zoals beschreven in he...

Eiwit-eiwit-interacties worden in cellen met een ruimtelijke resolutie van nanometer gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM). Hier wordt het gebruik van BiFC-PALM beschreven voor het beeldvormen van Ras-Raf-interacties in U2OS-cellen voor het visualiseren van de nanoschalige clustervorming en diffusie van individuele Ras-Raf-complexen.

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Het algemene doel van deze microscopietechniek is het visualiseren van eiwitten en eiwitinteracties op enkelmolecuul- en nanometerschaal. Deze methode kan ons dus helpen bij het beantwoorden van enkele kernvragen in de biologie, zoals moleculaire interacties in oncogene signaleringsprocessen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze sensitief en specifiek is en enkelmolecuul- en nanometerresolutie biedt.De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Tahan, een senior onderzoeksmedewerker in mijn laboratorium. Na het klonen van RAs en RAF R-B-D-P-A-M Cherry one fragmenten, het verpakken hiervan in virale deeltjes en het infecteren van U2 OS-cellen volgens het tekstprotocol, wordt een monster voor beeldvorming voorbereid. Plaats ongeveer 5,5 × 10⁴ cellen met stabiele expressie per putje van een achtputjes glazen bodem chamber slide in 350 µL fenolroodvrij DMEM. Gebruik vers paraldehyde met glutaraldehyde om de cellen te fixeren. Na het vervangen van het fixatief door PBS of imagingbuffer, worden 100 nm gouddeeltjes gevortext en wordt er 35 µL per putje toegevoegd om de drift van de tafel tijdens de beeldvorming te volgen.Ga naar de microscoop en schakel de 405 en 561 nanometer lasers in terwijl de shutters op dit punt gesloten blijven; controleer of de 561 nanometer dichroïsche spiegel en notchfilter zijn geplaatst. Open de software voor beeldacquisitie. Zet de E-M-C-C-D camera aan, laat deze afkoelen en stel de belichtingstijd in op 100 milliseconden en de E-M-C-C-D gain op een geschikte waarde.Breng immersie-olie aan op het objectief en bevestig het monster op de objecttafel van de microscoop. Breng vervolgens het monster in focus voor het afbeelden van RA's en andere membraaneiwitten, gebruikmakend van ofwel brightfield of de 561 nanometer laser. Gebruik een 60 x APO chromat turf-objectief met een numerische apertuur van 1.49 en breng de microscoop in de turf-configuratie.Stel de excitatielaser zo in dat deze decentrisch invalt op de achteropening van het turf-objectief, waardoor de laser zal afbuigen wanneer deze het grensvlak van het dekglas bereikt. Blijf de positie van de invallende laser aanpassen totdat de kritieke hoek is bereikt en de laser wordt teruggekaatst. Zoek een cel om te beelden waarin meerdere gouddeeltjes zichtbaar zijn.Stel vervolgens een region of interest in die de cel of een deel daarvan omsluit, evenals de gouddeeltjes, in het geval dat er al voldoende activatie plaatsvindt door hoge expressieniveaus. Start de acquisitie met de 405 nanometer laser uit en de 561 laser aan. Schakel anders de 405 nanometer laser in op de laagste fabrieksinstelling voor het vermogen en verhoog dit geleidelijk totdat er tientallen moleculen per frame aanwezig zijn of zodanig dat individuele moleculen goed van elkaar gescheiden zijn.Terwijl de gegevensverwerving doorgaat, dient het vermogen van de 405 nanometer laser geleidelijk te worden verhoogd om de spotdichtheid ongeveer constant te houden. Ga door met de beeldverwerving totdat een hoog 405-vermogen geen nieuwe initiatie meer veroorzaakt.Activatiegebeurtenissen worden beëindigd om afbeeldingen te verwerken. Download de software voor beeldbewerking. Open MATLAB en laad de WFI-leessoftware.Bekijk de ruwe beeldsequentie en bepaal het interessegebied of ROI; selecteer het deel van de stack dat verwerkt moet worden door met de linkermuisknop te klikken en een kader rond het gewenste gebied te slepen. Als het interessegebied tijdens de acquisitie niet is verkleind, selecteer dan een kleiner gebied om de rekentijd te verkorten. Om een selectie ongedaan te maken en het volledige frame te verwerken, klikt u met de rechtermuisknop ergens in het beeld. Definieer vervolgens een set fiduciaire markers, zoals goudnanodeeltjes geadsorbeerd op het dekglas, die goed geïsoleerd zijn, een uniforme vorm hebben en aanwezig zijn in het gezichtsveld gedurende de gehele beeldstack. Begin met het selecteren van een kandidaat-gouddeeltje door met de linkermuisknop op het beeld te klikken en een klein kader eromheen te slepen.Klik onder partikeltracking op de knop track. Er verschijnt een grafiek die de positie van het geselecteerde goudpartikel over de stapel afbeeldingen weergeeft, wat de mate van drift illustreert. Herhaal dit proces om zoveel mogelijk goudpartikels te volgen en stel vast welke partikels samen bewegen. Idealiter.De totale drift is maximaal 0,1 pixel, één voor één. Selecteer de goudpartikels die samen en onder partikeltracking zijn gevolgd. Klik op de knop om een markering toe te voegen.Er verschijnt een groen kruis ter indicatie dat het deeltje als marker is toegevoegd en zal worden gebruikt om voor drift te corrigeren. Pas het sigma-bereik, het smoothing-bereik en de drempelwaarde naar behoefte aan door de waarde licht te wijzigen. Klik op de knop 'find particle' om de instellingen te testen en inspecteer visueel de verwerkte deeltjes; deeltjes zoals PAM cherry-moleculen die relatief rond en helder zijn, worden omkaderd, terwijl deeltjes die dat niet zijn, worden weggelaten.Om met de verwerking van de beelden te beginnen, klikt u op de knop 'make cord file' en slaat u het bestand op onder een gewenste naam om de beelden na te bewerken en het palm-beeld te renderen. Start het palm-pakket in MATLAB en laad het zojuist aangemaakte dot core-bestand. Een grof gerenderd beeld verschijnt in het beeldscherm naast de bedieningsknoppen.Sorteer de individuele coördinaten met behulp van de volgende typische waarden. Voor PAM Cherry één is het aantal combineerframes gelijk aan acht. De combineerafstand in nanometers is 100 en de minimale RMS is vier.De minimale fit-goodness is 0.25 en de maximale excentriciteit is 1.4. Klik op de sorteerknop om een nieuwe set gecureerde coördinaten te genereren die klaar zijn voor het renderen van beelden met een hoge resolutie. Voer waarden in voor een correcte rendering van het uiteindelijke beeld, zoals de ruwe pixelgrootte zoals eerder bepaald, de gewenste kenmerkgrootte in het gerenderde beeld, die normaal gesproken wordt ingesteld op een waarde die iets hoger is dan de gemiddelde lokalisatie, en de pixelgrootte, bijvoorbeeld 10 nanometers.Klik voor de gerenderde afbeelding op de renderknop om de afbeelding van de handpalm te genereren. Gebruik vervolgens de plus- en min-vergrotingspictogrammen in de werkbalk van het figurevenster om in en uit te zoomen om individuele moleculen in levende cellen te volgen. Behandel het weefselkweekoppervlak en zaai de cellen uit zoals eerder in deze video beschreven.Zorg ervoor dat het dekglas de juiste dikte heeft voor de microscopie-opstelling. Nadat de cellen zijn doorgesneden en alle behandelingen en incubaties die nodig zijn voor het experiment zijn uitgevoerd, plaatst u de kweekschaal in een onstage-incubator. Laat de schaal enkele minuten op de tafel rusten totdat de temperatuur en de CO2-concentratie bij deze stap gestabiliseerd zijn. Blokkeer de lasers.Indien CO2-controle niet beschikbaar is, stap dan vlak voor de beeldvorming over op een CO2-onafhankelijk medium, zoals Leibovitz's L 15, om de achtergrondfluorescentie te verlagen; neem vervolgens beelden op zoals eerder gedemonstreerd, waarbij een passende belichtingstijd wordt ingesteld om een goede signaal-ruisverhouding te garanderen zonder verlies van tijdresolutie. Het BFC-paar in deze figuur is de KRAS G 12 D mutant die interacteert met het Ras-bindende domein of RBD van CRAF. Elk van de vier hier getoonde combinaties werd via lentivirale infectie in U2 OS-cellen geïntroduceerd; cellen met twee van de configuraties vertoonden sterke positieve BFC-signalen, geïdentificeerd door de abrupte toename van fluorescentie wanneer de 405 nanometer laser werd ingeschakeld vanwege de fotoactivatie van het gereconstitueerde BFC PAM Cherry one, zoals hier gedemonstreerd met dezelfde experimentele instellingen als bij het oorspronkelijke PAM Cherry one.Er werd een sterk BFC-signaal gegenereerd na infectie met RN R en RAF RBD RC. Hierbij duiden RN en RC respectievelijk op het n- en C-terminale fragment van PAM Cherry one; wanneer er wordt ingezoomd, zijn individuele moleculen en hun ruimtelijke distributie op nanoschaal duidelijk zichtbaar in dit experiment, waarbij single molecule tracking palm werd uitgevoerd om diffusietrajecten van individuele RA's te verkrijgen. RAF RBD-complexen onder continue belichting met 561 nanometer en 405 nanometer lasers. Individuele PA m cherry one moleculen st.Schakelen aan en een paar frames volhouden voordat ze overgaan in donkere toestanden, waarbij werd vastgesteld dat ze ofwel immobiel of mobiel waren. Deze plot van opnames van meerdere moleculen illustreert duidelijk beide typen trajecten. Dezelfde heterogene verdeling van diffusietoestanden kan worden afgeleid uit het histogram van de molecuulverplaatsing tussen opeenvolgende frames Mass mastered.Deze techniek kan in één tot drie weken worden uitgevoerd, afhankelijk van of de constructen transient worden getransfecteerd of stabiel worden geëxpresseerd, mits dit correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om controles voor te bereiden, zoals mutante Putins die de interactie missen volgens deze procedure. Andere methoden, zoals een clusteranalyse, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe de proteïne-interacties ruimtelijk zijn georganiseerd in de cel?Voor celtracking in het laboratorium kan, als evaluatieve basis, single particle tracking worden uitgevoerd om diffusietoestanden en de transitiekansen na de ontwikkeling ervan te bepalen. Deze techniek wordt in ons lab binnen het veld van de kankerbiologie gebruikt om RA-gedreven interacties, evenals de homo- en heteromerisatie van HER-familiereceptoren in menselijke tumorcellen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een biopsiepalm-protocol ontwerpt en implementeert om een eiwitinteractie van belang te onderzoeken.Vergeet niet dat het werken met antivirale middelen en tumorcellen extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen, zoals de standaard protocollen voor biologische veiligheid, moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

photoactivated-localization-microscopy-with-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De subcellulaire lokalisatie van eiwitten is belangrijk bij het bepalen van de spatio-temporele regulatie van cell signaling. We beschrijven hier bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) als een eenvoudige methode voor het bewaken van de ruimtelijke interacties van eiwitten in de cel.

Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie

This video describes BiFC-PALM ― a combination of photoactivated localization microscopy and bimolecular fluorescence complementation ― to assess protein-protein interactions. BiFC involves the fusion of two fluorescent protein fragments with two interacting proteins of interest. When the two proteins interact, the fragments are brought into proximity, which allows the two parts to come together and reconstitute a functional fluorescent protein. The fluorescence of a single fluorophore is...

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

We beschrijven een super-resolutie beeldvorming methode om de structurele organisatie van de bacteriële FtsZ-ring, een essentieel inrichting voor celdeling sonde. Deze methode is gebaseerd op kwantitatieve analyses van fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) beelden en kan worden toegepast op andere bacteriële cytoskeleteiwitten.

Super-resolution Imaging van de bacteriële Division Machinery

We demonstreren het gebruik van fluorescentie foto activerings lokalisatie microscopie (FPALM) om gelijktijdig meerdere soorten fluorescerend gelabelde moleculen binnen cellen af te beelden. De beschreven technieken leveren de lokalisatie op van duizenden tot honderdduizenden individueel fluorescent gelabelde eiwitten, met een precisie van tientallen nanometer binnen enkele cellen.

Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) in combinatie met single-molecule-tracking maakt directe observatie en kwantificering van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen.

Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking

Vorming van eiwitcomplexen in vivo kan worden gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie complementatie. Interactie partners gefuseerd aan complementaire delen van fluorescente labels en tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren, waardoor een opnieuw fluorescentiesignaal op nabijheid van de twee eiwitten.

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

PI (4,5) P2 regelt diverse cellulaire functies, maar de nanoschaal organisatie in de cel plasmamembraan wordt slecht begrepen. Etikettering PI (4,5) P2 met een dubbele-color fluorescent probe gefuseerd met het Pleckstrin homologie domein beschrijven we een nieuwe benadering voor het bestuderen PI (4,5) P2 ruimtelijke verdeling in het plasmamembraan op nanometerschaal .

Single-molecule Super-resolutie beeldvorming van fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat in het plasmamembraan met Novel Fluorescerende Probes

We presenteren een protocol voor de toepassing van interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM), een 3-dimensionale single-molecule lokalisatie super resolutie microscopie methode, aan de beeldvorming van het actine cytoskelet in hechtende zoogdiercellen. Deze aanpak maakt het mogelijk op basis van licht visualisatie van nanoschaal structurele kenmerken die anders onopgelost zouden blijven door middel van conventionele diffractie beperkt optische microscopie.

Driedimensionale Super resolutie microscopie van de F-actine filamenten door interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM)

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Conventionele BODIPY conjugaten kunnen worden gebruikt voor live-cel single-molecule lokalisatie microscopie (SMLM) door de exploitatie van hun tijdelijk vormende, rood verschoven grond staat dimers. We presenteren een geoptimaliseerd SMLM-protocol om subcellulaire neutrale lipiden en vetzuren in levende zoogdier- en gistcellen op nanoscopische lengteschaal te volgen en op te lossen.

Conventionele BODIPY Conjugates voor Live-Cell Super-Resolution Microscopie en Single-Molecule Tracking

De vorming van een goed sarcomerenetwerk is belangrijk voor de rijping van iPSC-afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een super resolutie-gebaseerde aanpak die het mogelijk maakt voor de kwantitatieve evaluatie van de structurele rijping van stamcel afgeleide cardiomyocyten, ter verbetering van de cultuuromstandigheden ter bevordering van de ontwikkeling van het hart.

Analyseren van de α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocyten Using Single Molecule Localization Microscopy

Leer BiFC-PALM-microscopie om eiwit-eiwitinteracties te visualiseren op nanometerschaal in U2OS-cellen. Deze methode biedt enkelvoudige-molecuulresolutie voor oncogen signaalonderzoek.

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

Meer video's verkennen