Met behulp van confocale Analyse

Het algemene doel van deze methodologie is om de secretie en diffusie van fluorescentieel gelabelde liganden in een intact epitheel te visualiseren met behulp van expressie in xip pos lavis. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de totstandkoming van morfogenen gradiënten die essentieel zijn voor de specificatie van cellinies tijdens de vroege embryonale ontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige methode is om de distributie van liganden in een intact epitheel te visualiseren.

Een essentieel onderdeel van het protocol is het genereren van biologisch actieve liganden die normaal worden verwerkt en uitgescheiden en in staat zijn een respons op te wekken in ontvangende cellen, ondanks de aanwezigheid van een fluorescent label. Confocale microscopie is een ideale methode om de lokalisatie van fluorescent gelabelde eiwitten binnen driedimensionale weefsels te bestuderen; het gebruik van onafhankelijke lasers en detectoren maakt een zuivere analyse binnen deze complexe weefseltypen mogelijk en zorgt ervoor dat robuuste gegevens kunnen worden verzameld. Nadat de mRNA-coating voor fluorescent gelabelde liganden is gegenereerd en XUS lavis-embryo's zijn verkregen volgens het beschreven protocol, injecteert u het mRNA, samen met een lineage-tracer zoals membraan-RFP, in een enkele cel in het 16- tot 32-celstadium. Indien gewenst kan een modulator samen met een fluorescent ligand en de lineage-marker worden co-geïnjecteerd om de effecten ervan te analyseren.

Soms is het nuttig om ook een naburige cel te injecteren. Hier wordt een tweede cel geïnjecteerd naast de eerder geïnjecteerde cel. Eén cel wordt geïnjecteerd met mRNA's die coderen voor het GFP-gelabelde ligand en een lineage-tracer zoals membrane RFP, terwijl de andere cel wordt geïnjecteerd met mRNA's die coderen voor de modulator en een andere lineage-tracer zoals membrane cerulean. Plaats de embryo's in een incubator van 12,5 °C en kweek ze verder. Wanneer de embryo's de volgende dag stadium acht hebben bereikt, vulden we de met 1% agarose gecoate schaaltjes met NAM 2 en transfereren we de embryo's met een afgesneden glaspipet en wolfraamnaalden.

Disseceer cirkelvormige explantaten uit de dierpool van geïnjecteerde en controle-embryo's, waarbij u erop let dat er geen mesoderm wordt meegenomen. Plaats de dierlijke explantaten in Petri-schalen van 55 millimeter, gecoat met 1% agarose, en cultiveer de embryo's gedurende vier uur om de fluorescerende eiwitten te laten rijpen om reliëf te genereren. Breng twee lagen PVC-isolatietape aan op microscopiepreparaten en druk deze volledig plat.

Snijd een rechthoek van 14 bij 10 millimeter uit de tape voor het monteren van dierlijke caps. Pipetteer vervolgens twee afzonderlijke druppels NM 2 op de reliëfplaat. Breng daarna met een afgeknipt P 20-tip maximaal 15 dierlijke explantaten over naar elke plaat en oriënteer de X-explantaten met een pincet zodanig dat de apicale zijde naar boven is gericht.

Kras met een diamantpen een glazen dekglas en breek dit om een kleiner dekglas te maken. Om het reliëfpreparaat te voorzien van een dekglas, wordt een glazen dekglas voorzichtig op het reliëfpreparaat geplaatst met behulp van een gebogen naald van 19 gauge. Hierdoor wordt de apicale laag van de animal cap-cellen samengedrukt.

Gebruik nagellak om het preparaat in het donker gedurende 20 minuten te laten drogen en beeldvorm binnen vier tot zes uur. Om gezonde animal caps te garanderen, moeten de animal caps correct georiënteerd zijn in de aangepaste slides en vervolgens onder de dekglasjes. Breng ze voorzichtig op de slides aan.

Het is essentieel om niet te veel nagellak te gebruiken om de objectglazen af te dichten, omdat dit ervoor zorgt dat de tape gaat rimpelen en de afsluiting van het objectglas later zal breken. Zodra u de techniek beheerst, zult u ongeveer 25 embryo's moeten injecteren om 20 goede animal caps per conditie waar u in geïnteresseerd bent te verkrijgen. Deze kunnen de volgende dag vervolgens geanalyseerd worden met confocale microscopie.

Gebruik voor de beeldvorming een objectief met lage vergroting om X explan te lokaliseren. Schakel vervolgens over naar een 63 x 1,4 olie-objectief voor beeldvorming met een hogere resolutie. Schakel de benodigde lasers in, waaronder 405 voor MIAN, 488 voor GFP en 561.

Optimaliseer voor MRFP de laservermogens zodat alle fluoroforen gedetecteerd kunnen worden. Gebruik de array van 32 detectoren terwijl de benodigde hoeveelheid voltage en gain tot een minimum wordt beperkt, gebruik vervolgens de Lambda-modus en selecteer de lasers van 405 nanometers, 488 en 561 nanometer. Om een breder gezichtsveld mogelijk te maken, zoomt u uit op het beeld naar 0,6 x.

Stel vervolgens de framegrootte in op de gewenste afbeeldingsgrootte. Dit biedt voldoende resolutie voor de analyse; stel de middeling in op vier tot acht om de signaal-ruisverhouding te verhogen en optimaliseer het pinhole voor deze dataset. Eén area unit werd gebruikt voor de 561 nanometer laser, samen met 405, 488 en 561.

Dichroïsche spiegels verzamelen het licht dat wordt uitgezonden door membraan-Saru, GFP en membraan-RFP. In dit experiment werd licht verzameld om ongeveer elke 10 nanometer van 415 tot 720 nanometer. Voer de beeldanalyse uit volgens het tekstprotocol dat hier wordt getoond; dit is de distributie van GFP-getagd sonic hedgehog in een animal cap X-explantaat onder controlecondities; sonic hedgehog GFP wordt uitgescheiden en diffundeert buiten het gebied dat de geïnjecteerde mRNA's tot expressie brengt.

Echter, in aanwezigheid van de modulator, SULF 1, is de distributie van Sonic Hedgehog GFP verder beperkt. En in dit monster zijn slechts enkele foci van Sonic Hedgehog GFP zichtbaar op korte afstand van de kloon cellen die het produceert. Deze figuur toont de karakterisering van twee fluorescerend gelabelde Wnt-liganden geïnjecteerd in cellen zoals hier aangegeven; zowel Wnt 8A als Wnt 11B-H-A-E-G-F-P accumuleren op het membraan van animal cap-cellen, waarbij Wnt 8A-H-A-E-G-F-P efficiënter accumuleert dan Wnt 11B. Deze figuur toont de distributie van Wnt 8A-H-A-E-G-F-P tot expressie gebracht in een kloon cellen gemarkeerd met membraangebonden Cerulean.

Het fluorescentie-gelabelde ligand wordt waargenomen terwijl het wegdiffundeert van de broncellen naar de omliggende cellen van het epitheel. Beeldanalyse-software wordt gebruikt om gegevens te extraheren over de distributie van fluorescentie-gelabelde wind-liganden in meerdere experimentele monsters, zoals hier getoond. De afstand tot de mem Saru-uitdrukkende kloon en het niveau van GFP-fluorescentie worden gemeten om het bereik van de wind-diffusie en de vorm van de gradiënt te bepalen.

Na het meten van de distributie van een ligand kan de output van een signaleringspad ook worden beoordeeld door dit protocol te combineren met een andere assay om de respons van de ontvangende cellen te monitoren. Op deze manier kunt u proberen het drempelbereik van een morfogen te bepalen.